Facultad de Qumica C/Profesor garca Gonzlez, 1

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PRCTICAS DE BIOQUMICA

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA VEGETAL Y BIOLOGIA MOLECULAR

PRCTICA 1. 3. ELECTROFORESIS ANALTICA DE PROTENAS EN GEL DE

POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) Protocolo de Laemli, UK (1970) Nature 227: 680-685

Soluciones para la electroforesis:

A. 30 % (p/v) acrilamida

0,45 % (p/v) bisacrilamida (para el gel separador)

Disolver en agua, filtrar y almacenar en fro protegida de la luz.

B. 25 % (p/v) acrilamida

2,5 % (p/v) bisacrilamida (para el gel empaquetador)

Preparar igual que A.

C. Tris-HCl 1,875 M, pH 8,8 (22,7 g/ 100 ml)

D. Tris-HCl 0,6 M, pH 6,8 (3,63 g / 50 ml)

E. 10 % (p/v) SDS

F. 10 % (p/v) persulfato amnico (AMPS) en agua, recin preparado.

G. Tampn de electroforesis: Para 4 l (pH 8,3)

4,0 g SDS

12,12 g Trizma base

57,6 g glicina

H. 5 x tampn de muestras

1 g SDS

5 g sacarosa

5 ml Tris-HCl 0,6 M, pH 6,8

1 ml azul de bromofenol (2,5 mg/ml)

Completar con agua destilada hasta 9 ml y dividir en alcuotas de 0,45 ml para congelar.

Antes de usar descongelar y aadir 50 l -mercaptoetnol

I. TEMED (solucin comercial)

Procedimiento de la electroforesis

1. Preparar las placas limpindolas previamente con etanol.

2. Preparar y aplicar un gel sellante en la base de las placas, como precaucin para evitar derrames:

Solucin A: ................... 2 ml

Solucin F:.................... 50 l

TEMED......................... 6 l

3. Preparar el gel separador al 12 % de acrilamida en un vasito de precipitado:

Solucin A ..................... 12 ml

Solucin C...................... 6 ml

Agua destilada................ 11,6 ml

Solucin E ..................... 0,3 ml

TEMED.......................... 18 l

Solucin F...................... 0,15 ml

Rellenar con esta disolucin el contenido entre las placas hasta aproximadamente 4 cm del extremo

superior.

Cubrir con una finacapa de 2-butanol y esperar la polimerizacin durante al menos 30 min*.

Eliminar el butanol y lavar con agua destilada varias veces la parte superior, dejando escurrir tras el

ltimo lavado.

4. Preparar el gel empaquetador ("stacking gel")

Solucin B ....................... 1,7 ml

Solucin D........................ 1,0 ml

Agua destilada.................. 7,2 ml

Solucin E........................ 0,1 ml

TEMED............................ 10 l

Solucin F........................ 50 l

Aplicar entre las placas hasta prcticamente el extremo superior.

Introducir el peine para las muestras inmediatamente procurando evitar burbujas.

Dejar polimerizar al menos durante 30 min*. Retirar el paine y lavar exhaustivamente con agua destilada, cubriendo finalmente con tampn de

electroforesis.

5. Tratamiento de muestras y patrones:

a) Preparar las muestras conteniendo:

120 l de extractos crudos + 30 l de 5 x tampn de muestras

40 l (10 g) de protenas purificadas + 10 l 5x tampn de muestras (H)

10 l stock 10 Bio-Rad (20 g) + 30 l tampn extraccin + 5xtampn de muestras (H)

. (Nunca sobrepasar un volumen final de muestra de 150 l).

b) Hervir durante 5 min

c) Centrifugar si hubiese precipitados antes de cargar a la electroforesis.

6. Aplicar las muestras y patrones y correr la electroforesis; primero a 50 mA hasta que toda la protena ha

penetrado en los geles, y despus al mnimo de corriente (10 mA para dos placas) toda la noche hasta

que el azul de bromofenol alcance el fondo del gel.

7. Tincin de las protenas en el gel:

a) Sumergir el gel durante 30 min en una solucin de azul de Coomassie R-250 al 0,1 % (p/v), disuelto

en 10 % (v/v) de actico y 45 % (v/v) metanol, con agitacin suave.

b) Desteir en 10 % de actico y 25 % de etanol (v/v), con agitacin suave, haciendo varios cambios de

lquido.

8. Observar las bandas de protena, comparando las diferentes muestras entre s, especialmente los extractos

crudos con las preparaciones de protena purificada. Tratar de identificar las protenas ms abundantes

en cada extracto, y las cadenas polipeptdicas que se expresan diferencialmente en los extractos de hojas

y races, por un lado, y hojas y tallos, por otro. Estimar el peso molecular de la protena purificada as

como de la banda ms abundante del extracto crudo mediante el clculo de sus respectivos Rf , y la

interpolacin del mismo en la representacin grfica del logaritmo del peso molecular de las bandas

correspondientes a las protenas patrones respecto a sus respectivos Rf :

Banda Mr log Mr (cm) Rf = / 0 Miosina 200.000

-galactosidasa 116.250

Fosforilasa b 97.400

Seroalbmina(BSA) 66.200

Ovalbmina 45.000

Anhidrasa carbnica 31.000

Inhibidor de tripsina 21.500

Lisozima 14.400

Aprotinina 6.500

Azul de bromofenol - 1

Protena purificada

Protena ms

abundante extractos

Otras protenas de

expresin diferente

en hojas, races y

tallos

*Preparacin de los extractos proteicos y determinacin de la concentracin de protena presente

Mientras las distintas fases del gel polimerizan, se aprovechar para preparar los extractos crudos que sern

utilizados como muestras de la siguiente forma:

1. Tomar una muestra vegetal de aproximadamente 0,25 g (hojas), 0,5 g (tallos), 1,0 g (races) de la planta

Lotus japonicus; y colocarla en un mortero de porcelana.

2. Aadir al mortero una pequea cantidad de nitrgeno lquido y triturar en presencia de nitrgeno lquido

hasta convertir la muestra en un polvo fino.

3. Aadir 1 ml de tampn de extraccin fro (50 mM Tris-HCl, pH 7,5 + 0,5 mM EDTA + 14 mM -

mercaptoetanol) y transferir el homogenado a un tubo eppendorf. Lavar el mortero con 0,5 ml de

tampn de extraccin fro y juntar en el tubo anterior.

4. Centrifugar la muestra durante 15 min a mxima velocidad, para obtener los sobrenadantres (extractos

crudos), que se mantienen en hielo.

5. Determinacin de la cantidad de protena presente en ambos extractos por el mtodo de Bradford:

a) Dilur una alcuota de cada extracto:

para hojas y tallos 20 veces(100 l en 2 ml de agua)

para races 10 veces (100 l en 1 ml de agua)

b) Preparar tubos para las muestras, patrones y blancos de acuerdo con el siguiente esquema:

Blanco Patrn 1 Patrn 2 Patrn 3 Patrn 4 Extracto

diludo

Agua destilada 0,8 ml 0,78 ml 0,75 ml 0,72 ml 0,7 ml 0,7 ml

Patrn Seroalbmina bovina

(BSA, 0,1 g/l)

- 25 l 50 l 75 l 100 l -

extracto diludo 1:20 - - - - - 100 l

reactivo de Bradford 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

c) Determinar la absorbancia a 595 nm y calcular la concentracin de protena de la muestra

interpolando en la recta calibrado de la protena patrn.

Patrn 1 Patrn 2 Patrn 3 Patrn 4 Extracto

A595