Facultad de Qumica

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Spain

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DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA VEGETAL

Y BIOLOGIA MOLECULAR

PRACTICAS DE BIOQUIMICA

PRACTICA 1.2. CINETICA ENZIMATICA

Ensayo de actividad de la fosfatasa alcalina: Vmax

La fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIP) es una glucoprotena (PM = 138.000)

con un 12 % (p/p) de carbohidrato, y a la vez una metaloenzima que tiene dos subunidades

idnticas con 2 Mg++ y 1 Zn

++ cada una de ellas. La funcin fisiolgica de la enzima es

hidrolizar, a pH alcalino, el enlace fosfoster de compuestos orgnicos fosforilados, liberando

fosfato inorgnico (Pi):

R-O-PO3= + H2O R-OH + HPO4

= (Pi)

Como sustrato de esta enzima utilizaremos un compuesto artificial, el p-nitrofenil-fosfato

(NPP), que puede ser reconocido por la enzima puesto que posee una estructura orgnica a la

que se encuentra unido el grupo fostato:

NO2-C6H6-O-PO3= + H2O NO2-C6H6-OH + HPO4

=

El nitrofenol absorbe caractersticamente a 410 nm, siendo el coeficiente de extincin 16 mM-1

x cm-1. Esto nos permite seguir cuantitativamente su aparicin en el transcurso de la reaccin

enzimtica. Por otra parte, el otro producto de la reaccin (Pi) ejerce un efecto inhibidor sobre

la enzima, lo que permite detener su accin en cualquier momento sin ms que aadir una

concentracin suficientemente alta del propio fosfato.

El ensayo de actividad lo iniciaremos por adicin de una alcuota de la preparacin

enzimtica (V ml) a una disolucin de sustrato en tampn Tris-HCl 100 mM (pH 8)

conteniendo MgCl2.6H2O 1 mM y ZnCl2 0,1 mM, que suministra el pH alcalino necesario

para la reaccin, la fuerza inica adecuada y los cofactores apropiados (tampn de trabajo en

lo sucesivo) Tras incubar la mezcla de ensayo a la temperatura idnea (30 C) durante un

cierto tiempo (t min), la reaccin se para por la adicin de fosfato potsico (K2HPO4)

concentrado (1 M). Los micromoles de nitrofenol (n moles) se calculan a partir de la ley de

Lamber-Beer, teniendo en cuenta el volumen final de la mezcla de ensayo (V ml):

A = E x L x C

A = Absorbancia

E = Coeficiente de extincin (16 mM-1 x cm

-1 a 410 nm)

C = Concentracin (mM)

L = Paso de luz (1 cm)

n (moles) = C (moles/ml) x V (ml) = '16xV

A

A partir de los valores obtenidos se puede calcular la actividad enzimtica:

Actividad (U) = t

n =

txxV

A 1'

16 (

16

'Vxt

A

)

Actividad (U/ml) = )(

)(

mlV

UActividad

Si el ensayo se ha realizado a saturacin de sustrato y en condiciones ptimas, la actividad

obtenida es la Vmax. Las condiciones estndar de ensayo son las siguientes:

NPP 1,5 mM en el tampn de trabajo..................................................................3ml

Fosfatasa alcalina (suspensin de 20 g protena/ml en el tampn de trabajo)...0,1 ml

(Incubar 15 min a 30 C)

K2HPO4 1 M .......................................................................................................0,5 ml

y se lee la absorbancia a 410 nm frente a un blanco (ensayo sin preparacin enzimtica o

ensayo parado a tiempo cero).

Formacin de producto con el tiempo de reaccin y con la cantidad de enzima

Para la aparicin de producto con el tiempo seguir el siguiente protocolo:

Reactivo Blanco 1 2 3 4 NPP 1,5 mM (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Fosfatasa alcalina (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Incubacin a 30 C (min) 0 5 10 15 20 K2HPO4 1 M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

A410 nm 0

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos (1-4) frente al blanco. Representar los

valores de absorbancia obtenidos (ordenada) frente al tiempo de incubacin (abscisa). Calcular

la actividad enzimtica en U, U/ml y U/mg protena. Calcular tambin la actividad molar o

nmero de recambio en min-1 (kcat) y el tiempo de ciclo cataltico.

Para ver el efecto de la concentracin de enzima sobre la velocidad de reaccin

(aparicin de producto en funcin de la cantidad de enzima) seguir el siguiente protocolo:

Reactivo Blanco 1 2 3 4 NPP 1,5 mM (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Tampn de trabajo (ml) 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Fosfatasa alcalina (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Incubar 5 min a 30 C K2HPO4 1 M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

A410 nm 0

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos (1-4) frente al blanco. Representar la

actividad de la enzima en U (ordenada) frente a la cantidad de preparacin enzimtica (ml)

usada en cada tubo (abscisa). Calcular el valor de la pendiente de la recta obtenida y explicar

su significado.

Clculo de la Km para el nitrofenolfosfato y de la Ki para el fosfato

Seguir el siguiente protocolo para el clculo de la Km para el nitrofenolfosfato:

Reactivo B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5 B6 6 NPP 1 mM (ml) 2,5 2,5 1,5 1,5 0,5 0,5 0,1 0,1 0 0 0 0 NPP 25 M (ml) 0 0 0 0 0 0 0 0 2,5 2,5 1,5 1,5

Tampn de trabajo (ml) 0,6 0,5 1,6 1,5 2,6 2,5 3,0 2,9 0,6 0,5 1,6 1,5 Fosfatasa alcalina (ml) 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 Incubar 15 min a 30 C K2HPO4 1 M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

A410 nm 0 0 0 0 0 0

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos(1-6) frente a su respectivo blanco.

Calcular la velocidad de la reaccin enzimtica (moles/min) para cada una de los

concentraciones de sustrato utilizadas (806, 484, 161, 32, 20 y 12 M respectivamente ) y

hacer la representacin de dobles inversos. Calcular Km y Vmax.

Seguir el siguiente protocolo para el clculo de la Ki para el fosfato:

Reactivo B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5 B6 6 NPP 1 mM (ml) 2,5 2,5 1,5 1,5 0,5 0,5 0,1 0,1 0 0 0 0 NPP 25 M (ml) 0 0 0 0 0 0 0 0 2,5 2,5 1,5 1,5 K2HPO4 5 mM (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Tampn de trabajo (ml) 0,5 0,4 1,5 1,4 2,5 2,4 2,9 2,8 0,5 0,4 1,5 1,4 Fosfatasa alcalina (ml) 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 Incubar 15 min a 30 C K2HPO4 1 M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

A410 nm 0 0 0 0 0 0

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos(1-6) frente a su respectivo blanco.

Calcular la velocidad de la reaccin enzimtica (moles/min) para cada una de los

concentraciones de sustrato utilizadas (806, 484, 161, 32, 20 y 12 M respectivamente) y

hacer la representacin de dobles inversos. Deducir el tipo de inhibicin y calcular la Ki para

el fosfato, as como el porcentaje de inhibicin para la concentracin de fosfato utilizada (160

M) y para una concentracin de sustrato 32 M.

Temperatura ptima y estabilidad trmica de la enzima: clculo de la energa de

activacin (Ea) y del tiempo de vida media (T1/2)

Para calcular la temperatura ptima seguir el siguiente protocolo:

Reactivo B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5 B6 6 B7 7

NPP 1,5 mM (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Tampn de trabajo (ml) 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0

Fosfatasa alcalina (ml) 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1

Incubar 10 min (C) 20 20 30 3 0 40 40 50 50 60 60 70 70 80 80

K2HPO4 1 M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

A410 nm 0 0 0 0 0 0 0

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos (1-7) frente al blanco. Representar la

actividad de la enzima en U (ordenada) frente a la temperatura (abscisa) para deducir la

temperatura ptima. Calcular la energa de activacin (Ea) a partir de la representacin de

Arrhenius.

Para calcular el tiempo de vida media (T1/2) incubar la preparacin enzimtica a 60 C y

realizar el ensayo estndar cada 15 min:

Reactivo B 1 2 3 4 5 NPP 1,5 mM (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Tampn de trabajo (ml) 0,1 0 0 0 0 0 Fosfatasa alcalina (mlmin) 0 0,10 0,115 0,130 0,145 0,160 Incubar 10 min a 30 C K2HPO4 1 M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

A410 nm 0 (100%)

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos (1-5) frente al blanco. Representar el

porcentaje de actividad residual de la enzima el log de dicho porcentaje (ordenada) frente al

tiempo de incubacin (abscisa) para deducir T1/2 y la constante de inactivacin kd a 60 C.

Comprobar la estabilidad de la enzima a 0-4C durante 24 h.

Reactivos y material especfico necesario

-Preparacin enzimtica (fosfatasa alcalina de intestino de ternera de Roche-Biomol, Grado II,

Ref. 108 162, 100 mg-10 ml) diluda 500 veces en el tampn de trabajo: 12 x 10 ml (240 l en

120 ml).

-Nitrofenil fosfato disdico hexahidratado (Ref. 71770 de Fluka) 1,5 mM en el tampn de

trabajo: 2 dispensadores de 0-5 ml (668 mg en 1.200 ml).

-Tampn de trabajo (Tris-HCl 100 mM, pH 8, conteniendo MgCl2.6H2O 1 mM y ZnCl2 0,1

mM): 12 x 40 ml.

Trizma Base [Tris(hidroximetil)aminometano] (Ref. T-1503 de Sigma)

Acido clorhdrico (Ref. 84418 de Fluka)

Cloruro de magnesio hexahidratato (Ref. 31413 de Fluka)

Cloruro de zinc (Ref. 31650 de Fluka)

-Fosfato potsico dibsico (Ref. 60356 de Fluka) 1 M: dispensador de 0-1 ml (174,18 g en

1.000 ml).

-K2HPO4 5 mM en el tampn de trabajo: 12 x 3 ml (217,73 mg en 250 ml).

-NPP 1 mM en el tampn de trabajo: 12 x 25 ml (200 ml de NPP 1,5 mM en 300 ml).

-NPP 25 M en el tampn de trabajo: 12 x 25 ml (5 ml de NPP 1,5 mM en 300 ml).

-Pipetas automticas (12 de 1 ml y 12 de 200 l).

-12 gradillas.

-Tubos de ensayo (12 x 25).

-Baos (4).

-Relojes cronmetros (12).

-Colormetros (3).

TRIS-HCL 1 M ( pH 8): 121,14 g ---------(HCl 37 % y H2O)-------- 1 l .

TAMPON DE TRABAJO: 500 ml Tris-HCl 1 M (pH 8) --------- 5 l, conteniendo 1,02 g de

MgCl2.6H2O y 68,14 mg de ZnCl2.