Práctica N°2. TINCIÓN GRAM Y MANEJO DE MICROSCOPIO (2)

7/25/2019 Prctica N2. TINCIN GRAM Y MANEJO DE MICROSCOPIO (2)

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UNIVERSIDAD CATLICA ANDRS BELLO GUAYANAEscuela de Ingeniera Ci!il

"anual de #r$c%icasLa&'ra%'ri' Ingeniera Sani%aria

FORMA: P-GC-01/6VIGENCIA REVISION No.

CDIGO

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VIGENCIA REVISIN NNnnnnN No.

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LICPIS-02

Tinci(n Gra) * )ane+' del )icr'sc',i' (,%ic'

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1. INTRODUCCIN

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con

el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio

que la rodea. El modo ms simple de aumentar el contraste es con la utilizacin de

colorantes. Si se desea simplemente aumentar el contraste de las clulas para la microscopa,

son suficientes los procedimientos que usan un solo colorante llamado de tincin simple. Sinembaro, a menudo se utilizan mtodos que no tien de iual modo todas las clulas,

denominado tincin diferencial.!no muy usado en microbioloa es la tincin "ram.

#asndose en su reaccin a la tincin de "ram, las bacterias pueden dividirse en dos rupos$

rampositivas y ramneativas. Esta tincin tiene ran importancia en ta%onoma bacteriana

ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias. Las

bacterias "rampositivas tienen una pared celular mas ruesa

mientras que las "ramneativas tienen una pared celular ms delada, siendo la primera

teida por cristal violeta y luol, mientras la seunda es teida por la safranina. &ediante esta

tcnica de tincin se pueden diferenciar las bacterias de tipo "ramneativas 'se tien de color

rosado( y "rampositivas 'se tien de color morado(.

)ay casos donde los microoranismos rampositivos pueden presentar respuestas

variables en ciertas condiciones 'son ramlbiles(.

*or e+emplo, los cultivos vie+os de alunas bacterias rampositivas, pierden la propiedad de

retener el cristal violeta, y en consecuencia se tien por la safranina apareciendo como

ramneativas. nloo efecto se produce en ocasiones por cambio en el medio del

oranismo, o por lieras modificaciones en la e+ecucin de la tcnica. *or este motivo, es

preciso atenerse, en la prctica, al procedimiento establecido.

*ara e%plicar el mecanismo de la tincin de ram se -an propuesto varias -iptesis

fundadas en la naturaleza qumica de las paredes celulares de los microoranismos.

qu se pueden ver las diferencias estructurales y qumicas de los dos tipos de pared

bacteriana$


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*ared "ram

capa densa y uniforme de /00 a 100 (

licopptido '203 del peso seco(

*ared "ram 4

capa interna delada de /0 a 50

cubierta por capas e%ternas de densidad

menor(

lipopolisacridos

lipoprotenas

protenas

licopptido '603 del peso seco(

En el laboratorio de Sanitaria los desec-os que se eneran son desec-os qumicos y

biolicos porque estn constituidos o provienen de la reaccin de sustancias qumicas. Los

desec-os que no son pelirosos a la salud y7o al ambiente se recolectan y se vierten en el

desa8e que descara a la planta de tratamiento de aua de la !niversidad9 previo tratamiento

mnimo de neutralizacin u otro, cuando as se requiera, mientras que los desec-os con

caractersticas de pelirosos 'se:n ;ecreto mbiental /.


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;iferenciar morfolicamente los rupos de bacterias, "ramneativos de los

"rampositivos, mediante la tincin de "ram

!so del microscopio como -erramienta para la diferenciacin de bacterias

"rampositivas de las "ramneativas.

Efectuar una adecuada estin de desec-os peliros enerados en el laboratorio$

recoleccin, tratamiento y disposicin final.

>ecolectar los desec-os enerados de las soluciones preparadas durante la

prctica.

?ratar 'cuando sea factible( los desec-os enerados del proceso para su

disposicin final.

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1 Equipos y !"#$i!%

&icroscopio

*ortaob+etos

sas de cultivo

&ec-ero

@psulas de *etri

?ubos de ensayo.

3.2 R#!&"i'os( M#)ios )# Cu%"i'o

@ultivo de bacterias, levaduras, vino ariado.

@ristal violeta '6 de cristal violeta en 600 cc de aua destilada(.

Luol '6 de iodo en / de ioduro potsico en 600 cc de aua destilada(.

lco-ol de A2B 'decolorante(

Safranina Cuscina bsica '6 de Safranina bsica en 600 cc de aua destilada(.


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ceite de inmersin.

*. MANIPULACIN DE SUSTANCIA +U,MICAS.

Los alumnos debern utilizar bata de laboratorio, afas de proteccin y en caso de

requerirse, uantes durante el tiempo de permanencia en el laboratorio.

La manipulacin de cidos concentrados debe efectuarse dentro de la campana de

e%traccin, para evitar salpicaduras que puedan afectar a usted mismo o a sus

compaeros.

ntes de usar un reactivo qumico o una solucin lea cuidadosamente la etiqueta para

identificar el contenido y en los sinos de pelirosidad que parecen en los frascos.

?ome e%actamente la cantidad necesaria del reactivo a utilizar y no de+e destapados los

frascos ni aspires su contenido.

Los cidos y las bases fuertes -an de mane+arse con muc-a precaucin, ya que la

mayora son corrosivos y, si caen sobre la piel o la ropa, pueden producir -eridas y

quemaduras importantes.

Evite el contacto de las manos con los o+os y otras mucosas mientras realiza los

anlisis.

Si tiene que mezclar al:n cido 'por e+emplo, cido sulf:rico( con aua, aade el cido

sobre el aua, nunca al contrario, pues el cido Dsaltara y podra provocarle

quemaduras en la cara y los o+os.

El alumno que este manipulando el mec-ero no deber usar uantes y deber tener

cuidado al manipular el porta ob+etos, evitando quemaduras.

Fo ba+es la lente mientras estas mirando por el microscopio, porque puedes olpear el

portaob+eto y romperlo o romper la lente.

Lvese las manos con +abn despus de tocar cualquier producto qumico.


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-. IDENTIICACIN DE PELI/ROS 0 MEDIDAS DE PRIMEROS AUXILIOSDE LOS REACTIVOS +UE SE UTILIARN EN LA PRACTICA

R#!&"i'os P#%i4$o P$i#$os !u5i%ios

So%u&i67 )#S!8$!7i7!

Sustancia altamente

inflamable.

Co7"!&"o &o7 %os o9os aclarar con abundanteaua.

T$!s i7:!%!&i67tomar aire fresco.Co7"!&"o &o7 %! pi#%aclare con abundante aua,elimine la ropa contaminada.

T$!s i74#s"i67 beba aua 'm%imo / vasos(,evite el vmito 'peliro de perforacin(. Si ocurre

cualquiera de los casos anteriores acuda al mdico

'muestre la etiqueta(.

So%u&i67 )#C$is"!% Vio%#"!

Sustancia altamente

inflamable.

Co7"!&"o &o7 %os o9oslave con abundante auamanteniendo abierto el parpado 'mnimo 60

minutos(. T$!s i7:!%!&i67tomar aire fresco.Co7"!&"o &o7 %! pi#%aclare con abundante aua,elimine la ropa contaminada.




So%u&i67 )#Lu4o%

Sustancia Fo *elirosa.

Co7"!&"o &o7 %os o9oslave con abundante aua.T$!s i7:!%!&i67tomar aire fresco.Co7"!&"o &o7 %! pi#%aclare con abundante aua,elimine la ropa contaminada.




E"!7o%Sustancia altamente

inflamable.

Co7"!&"o &o7 %os o9oslave con abundante aua.

T$!s i7:!%!&i67tomar aire fresco.


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Co7"!&"o &o7 %! pi#%aclare con abundante aua,elimine la ropa contaminada.

T$!s i74#s"i67beba aua 'm%imo / vasos(. Siocurre cualquiera de los casos anteriores acuda al

mdico 'muestre la etiqueta(.

No"!*ara cualquier otra informacin consultar las 8i&:!s )# s#4u$i)!)de cada reactivoubicadas en el laboratorio y tambin pueden consultar la norma Co'#7i7 2;& 4

6( @ristal

violeta'@G( @lulas color violeta @lulas color violeta

/( Luol

'solucin

iodada '=((

Se forma el comple+o @G4=. Las clulas

contin:an teidas de color violeta.

Se forma el comple+o @G4=.

Las clulas contin:an teidas

de color violeta.

5( lco-ol

Se des-idratan las paredes celulares. Secontraen los poros. ;isminuye la

permeabilidad. El comple+o @G4= no sale de

las clulas que contin:an

teidas de color violeta.

Eliminacin por e%traccin derasas de las paredes

celulares. umenta la

porosidad. El comple+o @G4=

se separa de la clula.

H( Safranina

@lulas no decoloradas9 quedan teidas de

color violeta.

@lulas decoloradas9 se tien

de color rosado.


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;.2 PASOS A SE/UIR PARA REALIAR TINCIN /RAM

i4. 1 T&7i&! p!$! $#!%i?!$ u7 8$o"is

;.2.1 i9!$ u7 8$o"is

@on la ayuda de una asa previamente flameada tomar una muestra y colocarla en portaob+eto

bien limpio ' con alco-ol y flameado ( con el asa conteniendo la muestra proceder a realizar la

e%tensin en el portaob+eto mediante movimientos iratorios, dar vueltas sobre la parte media

de la lmina, de manera que al final obtenamos como producto una espiral .

Esperar que se seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mec-ero para fi+ar la muestra

teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo ' solo se pasa por la llama ( puesto que el

calor e%cesivo puede cambiar la morfoloa celular de las bacterias de la muestra. El calor

deseable es aquel que sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la

mano.

;.2.2 Ti7&i67

reue violeta cristal con un otero de manera que cubra toda la muestra de+e actuar por 6

minuto. Esta tincin viene dada para fi+arse a temperatura de /2 B@


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;.2.3 E79u!4u#

l transcurrir un minuto en+uaue la muestra con un c-orro de aua. *ara realizar el lavado,

se debe de tener en cuenta que el c-orro de aua no debe caer directamente sobre la muestra,

este debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra, el c-orro debe ser

delado y suave, el en+uaue se debe realizar poniendo la lmina en posicin inclinada -acia

aba+o.

;.2.* Mo$)i#7"#

!na vez en+uaado el portaob+eto, se aplica como mordiente Iodo o Luol durante un

minuto con un otero.

El mordiente cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorante y determine

su fi+acin a las bacterias.

;.2.- D#&o%o$!&i67

*asado el minuto de -aber actuado el mordiente se decolora con Etanol al A2 3, cetona

cetona4 lco-ol, se realiza iual con la lmina inclinada, se area con el decolorante en un

otero en cantidades suficientes -asta que ya no escurra mas lquido azul y sala

transparente

;.2.; L!'!)o y s#&!)o

Lavar con aua para quitar los restos del residuo del decolorante y esperar que seque la

lmina al aire libre o con la ayuda del mec-ero como en el primer paso.

;.2.< Ti7&i67 )# &o7"$!s"#


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!na vez que la lmina ya se sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a

utilizar un colorante de contraste como por e+emplo la safranina o Cucsina, de+ar actuar por

un minuto.

;.2. Nu#'o #79u!4u#

*asado el minuto correspondiente se procede, a en+uaar la lmina con aua como se

describi en el paso 5, se de+a secar. !na vez que la preparacin est totalmente seca, poner

una ota muy pequea de aceite de cedro y observar al microscopio con el ob+etivo de

inmersin 'ver ne%o a la prctica manual de uso del microscopio(

i4 .2. P$#p!$!&i67 )# u7 8$o"is

-./ /ESTIN DE DESECOS /ENERADOS EN LA PRCTICA;urante la realizacin de prctica se eneran los desec-os de las soluciones

preparadas, estos desec-os se cataloan como pelirosos y no pelirosos se:n el

;ecreto /


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opa, Equipos y ;ispositivos de *roteccin *ersonal.

Seleccin de acuerdo al >ieso Jcupacional.

P$#p!$!)o po$=n. ntonio Sei+as$ !niversidad @atlica ndrs #ello "uayana.


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ANEXOS

M!7u!% )#% i&$os&opio 6p"i&o p!$! uso )#% %!@o$!"o$io )# I74#7i#$>! S!7i"!$i! )# %!UCAB/u!y!7!F

E% i&$os&opio p"i&o

El microscopio normal u ptico est formado por dos lentes. El ob+eto que se quiere estudiar

se coloca en la platina. La luz procedente del ob+eto penetra en el microscopio por el ob+etivo,

que desempea la funcin de una lupa9 es decir, produce una imaen muy ampliada del

ob+eto. Esta imaen se modifica mediante otro sistema de lentes, el ocular. El aumento final

conseuido es iual al producto de los aumentos del ob+etivo por los del ocular. En el

microscopio ptico este aumento tiene un lmite, que se denomina Rpoder de resolucinR y

que es apro%imadamente de 6/00 aumentos.

R#&o#7)!&io7#s p!$! p$i7&ipi!7"#s ;ebes colocar tu microscopio en una mesa fi+a, de modo tal que puedas sentarte con

comodidad para ver el ocular sin estirarte o apoyarte.

?rata que la mesa sea lo suficientemente rande como para colocar sobre ella todo el material

que necesites para traba+ar. ;ebes colocar tu microscopio en una mesa fi+a.

El ob+eto que se desea e%aminar 'lquidos, plantas, insectos, clulas animales o veetales,

etc.( debe colocarse en un portaob+etos, que es una lamina de vidrio de 6 mm de espesor y a

continuacin se cubre con un cubreob+etos, un cuadrado de / cm de lado o un circulo con esa

medida dimetro. *ractica -asta que tenas la certeza de saber para que lado debes mover la

perilla de enfoque, para -acer subir o ba+ar las lentes. En alunos microscopios, al mover el

tornillo toda la platina sobe o ba+a, en vez de -acerlo el puente.

*ara comenzar, selecciona siempre la lente de menor aumento que te permite ver me+or el

ob+eto y encontrar fcilmente la parte que ms te interesa observar.

@oloca el portaob+eto sobre la platina de manera tal que la parte que quieres observar se

encuentre ba+o la lente. !tiliza los broc-es para fi+ar el portaob+eto en su sitio.


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Jbserva desde un costado la platina y mueve la perilla de enfoque para acercar la lente,

lueo mira a travs del microscopio y sube las lentes irando la perilla de enfoque -asta que el

ob+eto entre en foco y su imaen se vuelva ntida y clara.

T#7 &ui)!)oGGG Fo ba+es la lente mientras estas mirando por el microscopio, porque puedesolpear el portaob+eto y romperlo o romper la lente.

I/. 3 P!$"#s )#% i&$os&opio 6p"i&o

6 O&u%!$lente situada cerca del o+o del observador. mpla la imaen del ob+etivo./ O@9#"i'olente situada cerca de la preparacin. mpla la imaen de sta.5 Co7)#7s!)o$lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.H Di!8$!4!reula la cantidad de luz que entra en el condensador.2 o&odirie los rayos luminosos -acia el condensador.< L#7"# o&u%!$@apta y amplia la imaen formada en los ob+etivos.

Q Tu@oes una cmara oscura unida al brazo mediante una cremallera.

1 R#'6%'#$Es un sistema que coe los ob+etivos, y que rota para utilizar un ob+etivo u otro.

A To$7i%%os !&$o y i&$o"$i&o Son tornillos de enfoque, mueven la platina -aciaarriba y -acia aba+o. El macromtrico lo -ace de forma rpida y el micromtrico de forma

lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fi+a la platina a una determinada altura.

60 P%!"i7!Es una plataforma -orizontal con un orificio central, sobre el que se coloca lapreparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada

por deba+o. ;os pinzas sirven para retener el portaob+etos sobre la platina y un sistema de

cremallera uiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparacin de


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delante -acia atrs o de izquierda a derec-a y viceversa. En la parte posterior de uno de los

laterales se encuentra un nonius que permite fi+ar las coordenadas de cualquier campo ptico9

de esta forma se puede acudir a l cuando interesa.

M!7#9o )#% i&$os&opio 6p"i&o1.@olocar el ob+etivo de menor aumento en posicin de empleo y ba+ar la platinacompletamente. Si el microscopio se recoi correctamente en el uso anterior, ya debera estar

en esas condiciones.

2.@olocar la preparacin sobre la platina su+etndola con las pinzas metlicas.3.@omenzar la observacin con el ob+etivo de H% 'ya est en posicin( o colocar el de 60aumentos '60%( si la preparacin es de bacterias.

*. P!$! $#!%i?!$ #% #78oqu#$!. cercar al m%imo la lente del ob+etivo a la preparacin, empleando el tornillomacromtrico. Esto debe -acerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se

corre el rieso de incrustar el ob+etivo en la preparacin pudindose daar aluno de ellos o

ambos.

@.&irando, a-ora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el ob+etivo de la

preparacin con el macromtrico y, cuando se observe alo ntido la muestra, irar elmicromtrico -asta obtener un enfoque fino.

-. P!s!$ !% si4ui#7"# o@9#"i'o.La imaen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el

micromtrico para lorar el enfoque fino. Si al cambiar de ob+etivo se perdi por completo la

imaen, es preferible volver a enfocar con el ob+etivo anterior y repetir la operacin desde el

paso 5. El ob+etivo de H0% enfoca a muy poca distancia del ob+eto a observar, y por ello es

fcil que ocurran dos tipos de percances$ incrustarlo en la preparacin si se descuidan las

precauciones anteriores y manc-arlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin

que ya se enfoc con el ob+etivo de inmersin.No"!*or qu se utiliza aceite de inmersin cuando se emplea el ob+etivo de mayor aumentode un microscopio ptico '600%(N

R#spu#s"!a( Los ob+etivos de mayor aumento, tienen una distancia focal muy pequea y adems la

primera lente del ob+etivo es de pequeo dimetro.

b( Los rayos que desde la muestra se dirien al ob+etivo atraviesan el vidrio del cubreob+eto y

al pasar al aire se separan de la normal. lunos rayos incluso sufren refle%in total en la

interface vidrio4aire


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c( Solo llea al microscopio una pequea parte de la luz que parte de la muestra, con el

problema que conlleva para la visin.

d( l intercalar, entre el ob+etivo y el cubreob+eto una ota de aceite de cedro, de ndice de

refraccin casi iual al vidrio, los rayos emerentes ya no se apartan de la normal, sino que

contin:an su camino sin desviacin, consiuiendo as que una mayor cantidad de luz lleue al

ob+etivo, me+orando notablemente la visin.

RCsica "eneralR. Ooaqun @atal de lemany. Galencia 6A


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2.@uando no se est utilizando el microscopio, -ay que mantenerlo cubierto con su fundapara evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolonada, se debe

uardar en su ca+a dentro de un armario para proteerlo del polvo.

3.Funca -ay que tocar los lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavementecon un papel de filtro o, me+or, con un papel de ptica.

*.Fo de+ar el portaob+etos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio.-.;espus de utilizar el ob+etivo de inmersin, -ay que limpiar el aceite que queda en elob+etivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro 'menos recomendable(. En

cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite -a

lleado a secarse y pearse en el ob+etivo, -ay que limpiarlo con una mezcla de alco-ol4

acetona 'Q$5( o %ilol. Fo -ay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos

disolventes en e%ceso se pueden daar las lentes y su su+ecin.

;. Fo forzar nunca los tornillos iratorios del microscopio 'macromtrico, micromtrico,platina, revlver y condensador(.

! S!7i"!$i!UCAB/u!y!7!F

@abeza binocular tipo Seidentopf con inclinacin a H2T, rotatorio 5


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i4. *. M!7#9o )#% i&$os&opio

i4.-. B!&"#$i!s /$!posi"i'!s y /$!7#4!"i'!s i4.;. B!&"#$i!s

/$!posi"i'!s


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Práctica N°2. TINCIÓN GRAM Y MANEJO DE MICROSCOPIO (2)

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