PRACTICA NÚMERO 1: CULTIVOS FÚNGICOS

OBJETIVOS:

Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:

Conocer qué es un medio de cultivo, utilidad, clasificación y ejemplos.

Observar y diferenciar el crecimiento de levaduras y mohos en medios de

cultivo en placa y en tubo.

Conocer la técnica de microcultivo, utilidad, procedimiento.

Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente:

aire agua y tierra.

MEDIO DE CULTIVO

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el

laboratorio. Al conjunto de estas soluciones líquidas o sólidas que contienen los nutrientes

necesarios para el crecimiento de los microorganismos se les conoce como medio de

cultivo.

El medio de cultivo es aquella solución que cuenta con los nutrientes

necesarios para recuperar, multiplicar, aislar e identificar los microorganismos

(bajo condiciones favorables de temperatura y pH, exento de todo microorganismo

contaminante), así como efectuar pruebas de susceptibilidad.

http://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_cultivo.

Los medios de cultivo pueden clasificarse:

Según su consistencia:

a. Líquidos

b. Sólidos

Los medios líquidos son infusiones preparadas bien sea colocando carne picada

en agua o disolviendo en esta un extracto de carne comercializado, no llevan ninguna

solución solidificante. Contienen proteínas, factores esenciales de crecimiento y

oligoelementos. A estos medios se les pueden añadir otros nutrientes como peptonas y

glucosa así como cloruro de sodio y un tampón de pH.

Los medios sólidos están constituidos por un medió líquido mas una solución

gelificante, como el agar en polvo que se disuelve por ebullición, que los solidifica.

Pueden ser trasvasados en tubos o placas de Petri. Estas últimas son recipientes de

vidrio o plástico transparente con una tapa y ofrecen una gran superficie para la siembra.

Según su aporte nutritivo:

a. Básicos

b. Complejos

Los medios básicos contienen las sustancias mínimas para el crecimiento de

hongos metabólicamente no exigente. Pueden contener agar o no dependiendo si se

quieren solidos o líquidos, respectivamente; peptonas, glucosa. Deben poseer un pH y

una osmolaridad adecuada para la multiplicación de los hongos. Estos medios también

pueden ser utilizados como base en la preparación de otros medios como los

enriquecidos, selectivos, entre otros.

Los medios enriquecidos pueden contener suero, sangre o factores esenciales

específicos como vitaminas o cofactores para el crecimiento de hongos exigentes en

requerimientos nutritivos y que no crecen bien en los medios básicos.

Según su finalidad:

a. Medios de aislamiento: Utilizados para el aislamiento de levaduras ppor la

técnica de agotamiento, han de ser sólidos. Ejemplo, Agar Sabouraud, Agar Lactrimel

b. Medios selectivos: Son aquellos que permiten la recuperación de un hongo en

específico e inhiben el crecimiento de otro. Ejemplo, Sabouraud con clicoheximida (inhibe

hongos contaminantes como Aspergillus, etc).

c. Medios selectivos diferenciales: son aquellos medios utilizados para recuperar

o aislar un hongo en específico, por ello, para diferenciar las distintas colonias, se les

añade sustancias que confieren un color diferente a las colonias según la distinta

actividad metabólica. Para este propósito se utilizan azúcares como el manitol, la lactosa,

sorbitol y otros, junto a un indicador de pH como rojo neutro, azul de bromotimol, etc.

Ejemplo. CHROMagar Candida utilizado en la identificación de Candida albicans, Candida

krusei y Candida tropicalis.

Los medios de cultivo utilizados en micología contienen nutrientes suficientes para

asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc).

El pH ligeramente ácido tiende a facilitar el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo

tiempo el desarrollo de otros microorganismos.

A los medios de cultivo se les puede añadir antibióticos antibacterianos para inhibir

el crecimiento de las bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras. Los más

usados son el Cloranfenicol y la Gentamicina. Se añade también actidiona (Cicloheximida)

que inhibe el desarrollo de hongos saprofitos ambientales. Los medios cuya composición

contengan actidione no debe ser utilizados para el aislamiento de Cryptococcus

neoformans, ya que inhiben su crecimiento.

Entre los medios más empleados en la Micología se encuentran:

Medio Sabouraud dextrosa (SAB):

Contiene un 2% de glucosa y es ligeramente ácido (pH=6.9), se considera el

medio estándar para recuperar y mantener una amplia variedad de hongos que pueden

aislarse en el laboratorio de micología clínica. Es el medio estándar para observar la

morfología típica de los hongos, pero no es el medio ideal de crecimiento o para estudiar

la esporulación. Permite el crecimiento de actinomicetos aerobios.

Se utiliza indistintamente en tubo o en placa.

Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina:

Es el medio Sabouraud clásico con la incorporación de los antibióticos

Gentamicina y Cloranfenicol, que permiten el crecimiento de casi todos los hongos

filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a una gran mayoría de bacterias.

Se utiliza en tubo o en placa.

Agar Lactrimel de Borelli:

Se emplea para favorecer la producción de pigmentos y la esporulación de

la mayoría de dermatofitos. Contiene harina de trigo, leche descremada en polvo,

agar, miel y antibiótico.

Los medios de cultivo pueden ser preparados en placa o en tubo. Los medios en

placa tienen la ventaja de ofrecer mayor superficie para el aislamiento pero, para soportar

la deshidratación durante el largo período de incubación a que van a ser sometidos (un

mes o más), has de contener una gruesa capa de medio (25 a 40 ml). Son más peligrosos

a la hora de su manipulación y fáciles de contaminar. Mientras que los medios en tubo

tienen una superficie de trabajo mucho más pequeña, pero ofrecen máxima seguridad en

su manipulación y buena resistencia a la deshidratación y a la contaminación.

A la hora de elegir un medio de cultivo adecuado se debe tener en cuenta el tipo

de muestra y los microorganismos fúngicos que requieren ser aislados. Si la muestra

procede de zonas presuntamente contaminadas, es fundamental incluir, junto a los

medios normales, medios que contengan sustancias inhibitorias de bacterias y hongos

saprofitos (cloranfenicol, gentamicina, cicloheximida).

Tanto la muestra como las placas y tubos que se van a sembrar deben

manipularse por medidas de seguridad y para evitar contaminaciones ambientales,

los cultivos con crecimiento micelial (temperatura ambiente) de Histoplasma

capsulatum, Paraccoccidioides brasiliensis y Coccidioides posadasii (C. immitis)

deben ser manipulados en campana de flujo laminar. Han de rotularse

adecuadamente, con el número de la muestra y la fecha en que se realiza la

siembra. Las placas se precintan con cinta de Parafilm, en la que se realizan un

par de aberturas, y los tubos se dejan con el tapón de rosca a medio cerrar (para

mantener la aerobiosis).

http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html

Para realizar un cultivo fúngico, generalmente los especímenes se colocan

sobre la superficie del medio de cultivo y se conservan a temperatura ambiente

(26 a 27 ºC); en caso de micosis sistémicas, es mejor a 30-37 ºC. Las levaduras

se siembran con técnica de agotamiento en placa. Los pelos y escamas se

disponen en fragmentos en diferentes puntos de la superficie del medio. En

líquidos, heces y pus se deben sembrar aproximadamente 0,5 a 1,0 ml por tubo.

Las levaduras se desarrollan en 24 a 48 horas, los contaminantes en dos a cuatro

días y la mayoría de los hongos patógenos requiere una a dos semanas. (arenas)

La identificación de los hongos se basa en el examen macroscópico de la colonia y

en sus características microscópicas. Semejanzas macroscópicas como la forma de la

colonia, el color de la superficie, la textura y la producción de pigmentos son muy útiles

para la identificación (cuadro 1). En los medios de cultivo las levaduras forman colonias

húmedas, cremosas, opacas o pastosas, y los hongos filamentosos producen colonias

algodonosas, lanosas o pulverulentas.

En general, la morfología microscópica de los hongos es estable y presenta pocas

variaciones. La identificación definitiva se basa en la forma característica, método de

producción y ordenamiento de las esporas, siendo también importante conocer el tamaño

y la disposición de las hifas en el caso de los hongos filamentosos, en los levaduriformes

se observa la presencia de blastoconidias, seudohifas, clamidosporas. Cuadro 2

CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS HONGO FILAMENTOSO HONGO LEVADURIFORME

COLOR

ColoniaReverso

Pigmento del medioTAMAÑO DE LA COLONIA

DiámetroAPARIENCIA Aterciopelada,

algodonosa,pulverulenta

Cremosa

Cuadro 1. Descripción macroscópicas de los hongos

CARACTERISTICAS MICROSCÓPICAS HONGO FILAMENTOSO

HONGO LEVADURIFOR

ME

MICELIO

HIALINO

SEPTADOASEPTADO

DEMATIACEO

SEPTADOASEPTADO

GRUESO

DELGADOPRODUCCIÓN,

TAMAÑOY DISPOSICIÓN DE LAS CONIDIAS

DEPENDIENDO DE LA ESPECIE

Cuadro 2. Descripción microscópica de los hongos

La preparación del material para la observación microscópica puede realizarse en

fresco, con cinta de celofán adhesiva o mediante cultivo en lámina o microcultivo.

PREPARACIÓN EN FRESCO

Este procedimiento es el que utilizan la mayoría de los laboratorios, ya que las

muestras se preparan con facilidad y rapidez y además permite identificar muchas de las

especies de hongos más habituales. El mayor inconveniente de la observación en fresco

es que se puede alterar el ordenamiento característico de las esporas al presionar con el

cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es válido en los casos en que es

necesario conocer la disposición de las esporas.

Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuación:

1. Seleccionar una colonia aislada.

2. Calentar el asa en aguja (al rojo vivo) para esterilizar, dejar enfriar.

3. Extraer un fragmento de la colonia que contenga además un poco de agar en la

parte inferior.

4. Depositar el fragmento extraído sobre un portaobjetos en el cual, previamente, se

ha depositado una gota de azul de lactofenol.

5. Cubrir con un portaobjeto y presionar suavemente para dispersar la colonia y el

agar; de esta forma, la muestra está disponible para su observación al microscopio.

PREPARACIÓN CON CINTA DE CELOFÁN ADHESIVA

Es un método rápido para observar microscópicamente los mohos sin alterar el

arreglo de sus conidias.

Una de las desventajas es que si la cinta transparente no se presiona con

suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra no es adecuada, ya que al

no quedar bien adherida la cinta, las esporas o las hifas no se pueden identificar.

En los casos en que mediante este método no se observen esporas deberá

realizarse la preparación en fresco.

El procedimiento se lleva a cabo como sigue :

1. Colocar una gota de azul de lactofenol sobre una lámina portaobjeto.

2. Cortar un pedazo de cinta adhesiva transparente (2 a 3 cm) y fijarlo a un

asa en aguja.

3. Colocar la cinta sobre la superficie de la colonia de moho, haciendo presión.

4. Colocar la cinta sobre la lámina, cubrir con una laminilla.

5. Observar al microscopio.

MÉTODO DE MICROCULTIVO (Método de Riddel):

También llamado cultivo en lámina. Este cultivo se realiza una vez

recuperado el hongo del espécimen clínico. Es útil para la identificación de

especies de hongos filamentosos (exclusivamente).

La técnica de microcultivo se realiza de la siguiente manera:

1. Introducir en una placa de Petri un papel absorbente, una varilla de vidrio en

forma de U y una lámina portaobjeto. Esterilizar con calor seco.

2. Tomar una placa de petri con agar Sabouraud o Lactrimel y bajo

condiciones de esterilidad cortar con un bisturí cuadros de 1 cm de lado y

colocar uno de ellos sobre la lámina portaobjeto previamente esterilizada en

el paso 1.

3. Inocular en el centro de los cuatro lados del agar con el hongo en estudio y

colocar encima una laminilla o lámina cubreobjeto (Figura 2).

4. Humedecer el papel absorbente con aproximadamente 5 ml de agua

destilada estéril, para evitar desecación.

5. Incubar a temperatura ambiente. La colonia crecerá por debajo de la

superficie del cubreobjeto. Se examina el montaje periódicamente a simple

vista para determinar si la colonia ha crecido o se haya contaminado, se

deja por un lapso mínimo de 15 días.

6. Cuando es evidente el crecimiento, se retira cuidadosamente el cubreobjeto

con pinzas estériles y se coloca en un portaobjeto que contiene una gota de

azul de lactofenol. Si se desea un montaje permanente, se limpia la

superficie del portaobjeto e inmediatamente adyacente al borde del

cubreobjeto se aplica esmalte para uñas color claro.

7. Observar las dos láminas preparadas al microscopio óptico.

HONGOS CONTAMINANTES

Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayoría saprófitos, hallándose

libres en la naturaleza, especialmente en la materia orgánica en descomposición. Las

condiciones necesarias para que un hongo crezca en una superficie son: existencia de

esporas, base nutriente, humedad y temperatura entre 4 y 38 oC.

El crecimiento de hongos en sistemas de aire acondicionado y edificios puede

producir en sus habitantes determinadas patologías entre las que cabe destacar asma y

alveolitis alérgicas. La contaminación ambiental por hongos en el medio ambiente y en

interior de edificios, es debida básicamente a hongos filamentosos y levaduras.

Procedimiento para el aislamiento de hongos contaminantes

Aire:

Materiales: Placa de Petri con medio de cultivo Sabouraud o Lactrimel.

Las placas serán expuestas en diferentes ambientes (cerrados y externos)

mediante 2 procedimientos:

a. Captura por sedimentación:

1. Rotular una placa de petri con el nro del equipo de trabajo, fecha y lugar.

2. Destapar la placa y dejarla abierta por 10 minutos.

3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la próxima

actividad práctica.

b. Captura por choque sobre la superficie de agar:

1. Rotular una placa de petri con el nro del equipo de trabajo, fecha y lugar

2. Destapar la placa y agitarla 10 veces.

3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la próxima

actividad práctica.

Agua:

Materiales: Un tubo con tapa de baquelita, esteril; 1 placa de Petri con Agar

Sabouraud o Lactrimel, pipeta Pasteur, hisopo estéril o asa de siembra.

1. Recolectar aproximadamente 10 ml de agua (Poceta, Filtros, entre otros.

Según le indique el profesor), con la ayuda de la pipeta Pasteur y colocarlos

dentro del tubo con tapa de baquelita estéril.

2. Rotular el tubo con el nro del equipo de trabajo, fecha y lugar.

3. Sembrar la muestra en una placa de Petri con medio Sabouraud o lactrimel

según le indique el profesor.

4. Rotular la placa con el nro del equipo de trabajo, fecha y lugar. Sellar la

placa con papel parafilm o tirro alrededor de la misma.

5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la próxima actividad práctica.

Tierra:

Materiales: 1 placa de Petri vacia y esteril, 1 placa de Petri con medio de

cultivo Sabouraud o lactrimel, 1 baja lengua esteril, 1 tubo con tapa de

baquelita que contenga 1 ml de solución salina fisiológica (esteril).

1. Recolectar la tierra con baja lengua esteril y colocarla en la placa de Petri

esteril, vacia.

2. Llevar al laboratorio. Agregar una porción de tierra con la ayuda de un baja

lengua esteril dentro del tubo que contiene 1 ml de solución salina

fisiológica (SSF), mezclar para homogeneizar.

3. Agregar esta mezcla (Tierra+SSF) en la superficie de la placa de Petri con

agar Sabouraud o lactrimel.

4. Rotular la placa con el nro del equipo de trabajo, fecha y lugar. Sellar la

placa con papel parafilm o tirro alrededor de la misma.

5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la próxima actividad

práctica.

Luego de la incubación por una semana a temperatura ambiente,

realizar el estudio macroscópico de las colonias aisladas (a simple vista),

anotando: color presencia de pigmento, textura, bordes de la colonia.

Realizar también el estudio microscópico a través del reconocimiento de las

especies por medio de la morfología de las esporas.

ACTIVIDAD PRÁCTICA:

1. Describa las características macroscópicas de un hongo filamentoso y de un

hongo levaduriforme en medio de cultivo preparado en tubo y en placa de

Petri.

2. Describa las características microscópicas mediante la observación de

láminas realizadas con la técnica de microcultivo proporcionadas por el

profesor y dibuje las estructuras observadas.

3. Realizar microcultivo de un hongo filamentoso (demostrativa).

4. Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente: aire,

agua y tierra.