PRACTICA 1:PRACTICA 1:

Método de cuenta total estándar Método de cuenta total estándar de microorganismos mesófilos de microorganismos mesófilos

aerobios en alimentos y método aerobios en alimentos y método del numero mas probable para del numero mas probable para el análisis de coliformes fecales el análisis de coliformes fecales

en alimentos.en alimentos.

Mauricio Sánchez LecuonaMauricio Sánchez LecuonaZamora Núñez FranciscoZamora Núñez Francisco

Omar FloresOmar FloresSandra MejiaSandra Mejia

PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO

1. Pesar 10 g de alimento (en condiciones 1. Pesar 10 g de alimento (en condiciones asépticas), añadir 90 ml de solución asépticas), añadir 90 ml de solución salina y licuar por un minuto salina y licuar por un minuto ( alimentos sólidos)( alimentos sólidos)

2. Pesar 10 g de alimento (en condiciones 2. Pesar 10 g de alimento (en condiciones asépticas), añadir 90 ml de solución asépticas), añadir 90 ml de solución salina y licuar por un minuto salina y licuar por un minuto ( alimentos semi-sólidos o líquidos)( alimentos semi-sólidos o líquidos)

3. Seguir haciendo diluciones colocando 1 3. Seguir haciendo diluciones colocando 1 ml de la solución anterior con 9 ml de ml de la solución anterior con 9 ml de solución salina sucesivamente (10solución salina sucesivamente (10-2-2, 10-3, , 10-3, etc.)etc.)

4. Inocular 0.1 ml de cada dilución sobre 4. Inocular 0.1 ml de cada dilución sobre placas de Agar cuenta estándar e placas de Agar cuenta estándar e incubar.incubar.

5. Posteriormente, inoclurar una serie de 5. Posteriormente, inoclurar una serie de tres tubos con 10 ml de caldo lauril y 1 tres tubos con 10 ml de caldo lauril y 1 ml de solución correspondiente a las tres ml de solución correspondiente a las tres primeras diluciones hechas primeras diluciones hechas anteriormente. Dejar incubar y observar anteriormente. Dejar incubar y observar resultados.resultados.

6. De los tubos anteriores, observar 6. De los tubos anteriores, observar los que dan positivos en la prueba los que dan positivos en la prueba de caldo Lauril y pasar de dos a de caldo Lauril y pasar de dos a tres asadas de cultivos con 10 ml tres asadas de cultivos con 10 ml de Caldo EC. Dejar incubar.de Caldo EC. Dejar incubar.

7. Sembrar dos placas de medio EMB 7. Sembrar dos placas de medio EMB y RVB apartir de los tubos positivos y RVB apartir de los tubos positivos con medio EC.con medio EC.

8. Seleccionar colonias de las placas 8. Seleccionar colonias de las placas de medio EMB y RBV y sembrarlas de medio EMB y RBV y sembrarlas en Agar SIM, Agar Citrato de en Agar SIM, Agar Citrato de Simmons y Caldo RM-VP Simmons y Caldo RM-VP

9. Realizar la prueba de Indol con el 9. Realizar la prueba de Indol con el reactivo de Kovac para el Agar Sim reactivo de Kovac para el Agar Sim y la de Vogues-Proskauer para el y la de Vogues-Proskauer para el Caldo RM-VP. Observar los Caldo RM-VP. Observar los resultados.resultados.

Agar cuenta estándarAgar cuenta estándar(Agar triptona-extracto de (Agar triptona-extracto de

levadura)levadura)

Este medio de cultivo es el de uso Este medio de cultivo es el de uso mas generalizado. mas generalizado.

Se utiliza principalmente para el Se utiliza principalmente para el aislamiento e identificación y cuenta aislamiento e identificación y cuenta de coliformesde coliformes

CALDO LAURIL CALDO LAURIL SULFATOSULFATO

Medio selectivo recomendado Medio selectivo recomendado para la detección y recuento de para la detección y recuento de coniformes en aguas, aguas coniformes en aguas, aguas residuales y alimentos. residuales y alimentos.

Considerar como positivos Considerar como positivos aquellos tubos que presentan gas.aquellos tubos que presentan gas.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

  Triptosa 20.0

Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta la disolución total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentación. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C.

Lactosa 5.0

Cloruro de sodio 5.0

  Lauril sulfato de sodio

0.1

  Fosfato dipotásico 2.75

  Fosfato monopotásico

2.75

pH final: 6.8 ± 0.2

CALDO LAURIL CALDO LAURIL SULFATOSULFATO

Caldo ECCaldo EC Medio de cultivo para coliformes y E.coli en Medio de cultivo para coliformes y E.coli en

aguas, alimentos y otros materiales.aguas, alimentos y otros materiales. La lactosa es la fuente de energía para los La lactosa es la fuente de energía para los

microorganismos, especialmente coliformes y microorganismos, especialmente coliformes y E.coli con producción de gas. Las sales biliares E.coli con producción de gas. Las sales biliares inhiben el crecimiento de Gram.-positivos. La inhiben el crecimiento de Gram.-positivos. La peptona de caseína proporciona los nutrientes peptona de caseína proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo de las bacterias y el necesarios para el desarrollo de las bacterias y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico. cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico.

Se consideran resultados positivos el Se consideran resultados positivos el crecimiento bacteriano y producción de crecimiento bacteriano y producción de gas. gas.

AGAR EMBAGAR EMB ( (EOSINA AZUL DE METILENOEOSINA AZUL DE METILENO))

Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enteró bacterias.crecimiento de enteró bacterias.

La combinación utilizada de eosina y azul de metileno, La combinación utilizada de eosina y azul de metileno, inhibe el desarrollo de microorganismos Gram. inhibe el desarrollo de microorganismos Gram. positivos y de bacterias Gram. negativas y también, positivos y de bacterias Gram. negativas y también, permite diferenciar bacterias fermentadoras y no permite diferenciar bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa. fermentadoras de lactosa.

Los microorganismos fermentadores de lactosa, Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de color azulado-negro, con brillo originan colonias de color azulado-negro, con brillo metálico. Las colonias producidas por metálico. Las colonias producidas por microorganismos no fermentadores de lactosa son microorganismos no fermentadores de lactosa son incoloras.incoloras.

Fórmula (en gramos por Fórmula (en gramos por litro)litro)

Peptona10.0Peptona10.0 Lactosa10.0Lactosa10.0 Fosfato Fosfato

dipotásico2.0dipotásico2.0 Agar15.0Agar15.0 Eosina0.4Eosina0.4 Azul de Azul de

metileno0.065metileno0.065

EMB (+)

AGAR ROJO NEUTRO-AGAR ROJO NEUTRO-CRISTAL VIOLETA-BILIS CRISTAL VIOLETA-BILIS

RVBRVB Agar selectivo propuesto por DAVIS Agar selectivo propuesto por DAVIS

(1951) para la detección y la (1951) para la detección y la enumeración de las bacterias del enumeración de las bacterias del coliform incluyendo E. coli en agua, coliform incluyendo E. coli en agua, leche, helado, carne y otros leche, helado, carne y otros comestibles.comestibles.

Medio de color púrpura-rojizoMedio de color púrpura-rojizo

AGAR RVBAGAR RVBFórmula (en gramos por

litro)Instrucciones

Extracto de levadura 3.0Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45°C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.

  Peptona 7.0

Sales biliares 1.5

Lactosa 10.0

Cloruro de sodio 5.0

  Agar 15.0

  Rojo neutro 0.03

Cristal violeta 0.002

pH final: 7.4 ± 0.2

RESULTADOSRESULTADOS

Microorganismos

Colonias

Enterobacterias fermentadoras de

lactosa

Rojas, de 1 a 2 mm de diámetro, con halo de

precipitación rojizo

Enterobacterias no fermentadoras de

lactosaIncoloras

Enterococcus spp.Rosadas como punta de

alfiler (puntiformes)

AGAR SULFURO INDOL AGAR SULFURO INDOL MOVILIDAD SIMMOVILIDAD SIM

Es un medio semisólido destinado a Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. mismo tubo.

Es útil para diferenciar miembros de Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.la familia Enterobacteriaceae.

Es de color ámbar.Es de color ámbar.

AGAR SULFURO INDOL AGAR SULFURO INDOL MOVILIDADMOVILIDAD

Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones

Tripteína 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.

Peptona 6.1

Sulfato de hierro y amonio

0.2

Tiosulfato de sodio 0.2

Agar 3.5

pH final: 7.3 ± 0.2

RESULTADOSRESULTADOS Cepas móviles:Cepas móviles: producen turbidez del producen turbidez del

medio, que se extiende mas allá de la línea medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra. de siembra.

Cepas inmóviles:Cepas inmóviles: el crecimiento se el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra. observa solamente en la línea de siembra.

Cepas SH2 positivas:Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. medio.

Cepas SH2 negativas:Cepas SH2 negativas: el medio el medio permanece sin cambio de color.permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas:Cepas indol positivas: desarrollo desarrollo de color rojo luego de agregar el de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich. reactivo de Kovac´s o de Erlich.

Cepas indol negativas:Cepas indol negativas: sin cambio sin cambio de color. de color.

AGAR CITRATO DE AGAR CITRATO DE SIMMONS SIMMONS

Contiene citrato de sodio y fosfato de amonio Contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamenterespectivamente

Azul de bromotimol como indicador de pH. Azul de bromotimol como indicador de pH.

Sólo las bacterias capaces de metabolizar el Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color de verde a azul.por un cambio de color de verde a azul.

Fórmula (en gramos por Fórmula (en gramos por litro)litro)

Citrato de sodio 2.0Citrato de sodio 2.0

Cloruro de sodio 5.0Cloruro de sodio 5.0

Fosfato di potásico 1.0Fosfato di potásico 1.0

Fosfato monoamónico Fosfato monoamónico 1.01.0

Sulfato de magnesio Sulfato de magnesio 0.20.2

Azul de bromotimol Azul de bromotimol l0.08l0.08

Agar 15.0Agar 15.0

CALDO RM-VPCALDO RM-VP Medio utilizado para la realización Medio utilizado para la realización

del ensayo de Rojo de Metilo y Voges del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer. Proskauer.

Es particularmente útil para la Es particularmente útil para la clasificación de enteró bacterias.clasificación de enteró bacterias.

CALDO RM-VPCALDO RM-VP

Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones

Pluripeptona 7.0 Suspender 17 g del polvo por litro de agua destilada. Calentar suavemente agitando hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

Glucosa 5.0

Fosfato dipotásico 5.0

pH final: 6.9 ± 0.2

REVELADO DE PRUEBAS REVELADO DE PRUEBAS BIOQUIMICASBIOQUIMICAS

Prueba del rojo de metiloPrueba del rojo de metilo::Añadir unas gotas de una solución de rojo de Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio. metilo al 0.04%, observar el color del medio.

Prueba del Voges ProskauerPrueba del Voges Proskauer::

Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.el color de la superficie del medio.

RESULTADOSRESULTADOS

Prueba del rojo de metilo:Prueba del rojo de metilo: Positivo: color rojo.Positivo: color rojo.Negativo: color amarillo Negativo: color amarillo

Prueba de Voges Proskauer: Prueba de Voges Proskauer: Positivo: desarrollo de un color rojo Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una en pocos minutos después de una completa agitación del tubo.completa agitación del tubo.Negativo: ausencia de color rojo. Negativo: ausencia de color rojo.