Prac. 1 Determinacion de La Actividad de Ureasa

Determinación de la Actividad de Ureasa Bioquímica

PRÁCTICA DE LABORATORIO N°1

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA

I. INTRODUCCIÓN.

Las enzimas son biocatalizadores específicos de naturaleza proteica que actúan

acelerando las reacciones químicas experimentando cambios físicos durante ellas, pero

recuperando su estado original cuando dichas reacciones han culminado. De manera

general, una reacción química catalizada por una enzima se representa de la siguiente

manera:

La ureasa, aislada y cristalizada en 1926 por el bioquímico estadounidense J.B.

Summer, se puede aislar de vegetales, mohos y bacterias, no encontrándose presente

en las células de mamíferos. Esta enzima actúa sobre enlaces carbono-nitrógeno ( C-N)

diferente de los enlaces peptídicos y cataliza la siguiente reacción: UREA + H2O

CO2 + 2NH3, pudiendo ser inhibida por iones plata, mercurio, y otros metales pesados.

Se señala que un reductor suave como el sulfito produce su inactivación reversible.

Una unidad de ureasa se define como aquella que libera un micromol de amoníaco a

partir de urea, por minuto, bajo condiciones de ensayo específicas de pH y

temperatura ( Ph 7.2 y 37 °C).

El objeto de la presente experiencia es demostrar la actividad enzimática,

determinando para ello la actividad de ureasa.

II. MATERIALES.

1. Material Biológico: Enzima Ureasa.

2. Material y Equipo de Laboratorio:

Gradillas para tubos.

Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. (07).

Pipetas de 1 ml. (0.2; una al 1/100), 2ml, 5ml y 10 ml.

Baño María a 37 °C.

Goteros o pipetas descartables de plástico.

Pizeta con agua destilada.

Espectrofotómetro o Fotocolorímetro.

Ingeniería Agroindustrial Página 1

SUSTRATO + ENZIMA COMPLEJO ENZIMA - SUSTRATO ENZIMA + PRODCUTO


3. Reactivos:

Buffer Tris-HCL 0.05 M, pH 7.2

Solución de urea 0.075 M en buffer Tris- HCl 0.05 M, pH 7.2

Solución de ureasa 0.05 %

Solución de HgCl2 1%

Solución de rojo de metilo 0.04%

III. PROCEDIMIENTO.

A. SISTEMA DE INCUBACIÓN:

COMPONENTES(ml) Y PROCESO TUBO 1 TUBO2

Buffer Tris - HCl 0.05 M pH 7.2 0.5 0.5

Urea 0,075M bufferada 3.0 3.0

Mezclar y pre-incubar a 37ºC por 5 minutos

Ureasa 0.05% ----- 0.5

Incubar a 37ºC por 15 minutos

Mezclar suavemente e incubar a 37°C por 15 minutos

HgCl2 1 %, mezclar 2 gotas 2 gotas

Ureasa 0.05 % 0.5 -----

Mezclar, preparar y seguir con los siguientes sistemas

B. VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA POR EL MÉTODO DE LOS

PRODUCTOS FORMADOS:

1. CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTO FORMADO. REACCIÓN DE

NEUTRALIZACIÓN:

Se pasa 2ml. De contenido del tubo 1(Control o Blanco) a otro tubo marcado

(1B), se añade una gota del indicador rojo de metilo al 0.04 % y se titula con HCl

0.05N (usar pipeta de 1 ml. Graduada al 1/100). El punto final es la aparición de

un color rosa pálido. Se anota el volumen del ácido gastado, el cual se restará



del valor de titulación a obtener en el tubo 2. Este tubo blanco represente el

ácido necesario para neutralizar los componentes del medio inicial.

Luego se pasa 2ml del contenido del tubo 2 (Problema) a otro tubo marcado

(2B) y se procede a titular como en el paso anterior. Como se produce una base

en esta reacción, el tubo experimental problema (tubo 2) necesita ácido para

lograr la neutralización.

CÁLCULOS:

Se calculan los resultados en términos de velocidad de reacción o actividad

enzimática expresados como micromoles de úrea desdoblados por minuto a

37°C (unidades de ureasa).

Expresar la actividad de ureasa en términos de unidades enzimáticas (unidades

de ureasa), considerando, además de la temperatura y el tiempo, la cantidad

(en peso) de ureasa empleada y el Ph.

2. CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTO FORMADO. MÉTODO COLORIMÉTRICO

( ESPECTROFOTOMÉTRICO), REACCIÓN DE NESSLER:

COMPONENTES (mL) BLANCO 1 2

Tubo 1 del sistema de incubación ----- 0.1 -------

Tubo 2 del sistema de incubación ------ ------ 0.1

Agua destilada 4.5 4.4 4.4

Reactivo de Nessler 0.5 0.5 0.5

Dejar en repodo durante 10 minutos y leer en fotocolorímetro con filtro verde,

o en espectrofotómetro a 540 nm.


Velocidad=(Vol. HCl gastado(problema) – Vol. HCl(blanco) (Molaridad de HCl)(1000)(4)

(15 minutos) (2) (2)


CÁLCULOS:

a) CORRECCIÓN DE LECTURAS:

Restar lectura del tubo blanco de reactivos de las lecturas de los tubos 1

(control o blanco) y 2 (problema). Luego, restar la lectura del tubo 1 de la

lectura del tubo 2.

b) VELOCIDAD DE REACCIÓN O ACTIVIDAD DE UREASA:

Se determina en términos de mg de NH3 producido por mL, mediante la

siguiente fórmula:

Factor de calibración: 0.06 y 37 mg NH3/mL para fotocolorímetro Klett-

Summerson, y espectrofotómetro Spectronic-20, respectivamente.

Determinar las Unidades de Ureasa en términos de micromoles de NH3

producidos pro minuto, a 37°C y a pH 7.2, considerando la cantidad (en

peso) de ureasa utilizada.

IV.- CUESTIONARIO:

1.- EXPLICAR EL DISEÑO EXPERIMENTAL. ¿CUAL ES EL PROPÓSITO DE CADA TUBO? ¿CUÁL ES EL

TUBO CONTROL? ¿ES NECESARIO MÁS DE UN TUBO CONTROL?

EXPLICAR EL DISEÑO EXPERIMENTAL.

El propósito de esta práctica es demostrar la actividad enzimática determinando la actividad de la

ureasa. Sabemos que las enzimas son biocatalizadoras específicos de naturaleza proteica que

actúan acelerando las reacciones, uno de los factores que afectan es el tiempo de incubación en

los dos tubos y que se expreso en términos de velocidad.

Una vez obtenidos los tubos 1 y 2 por sistema de incubación procedemos a la valoración de la

actividad de la ureasa por el método de productos formados. Primero lo haremos por reacción


Velocidad = (Lectura del tubo2) (Factor de calibración) =… mg NH3/mL


de neutralización donde tomamos 1 mL de cada tubo para colocarlos en los tubos 1(B) y 2(B)

donde luego añadimos 1 gota de rojo de metilo al 0.04% y lo titulamos con HCL

0.05Nobservando como punto final un rosa pálido que indicara por finalizada la titulación. En el

tubo (B) observamos que necesito mas acido para lograr neutralizarse. Con los datos obtenidos

en esta experiencia se precedió a calcular los resultados en términos de velocidad de reacción o

actividad enzimática expresados como micro moles de urea desdoblados por minuto a 37ºC

(unidades de ureasa) con un pH optimo de 7.2

Segundo por reacción de Nessler donde haremos tres tubos: Blanco, 1 y 2 de acuerdo a los

componentes indicados, dejaremos en reposo por 10 minutos y lo leeremos en fotocolorímetro

con filtro verde, o un espectrofotómetro a 540 nm. Lo cual nos permitió hacer cálculos en

corrección de lecturas y hallar la velocidad de reacción o actividad de ureasa

¿CUAL ES EL PROPÓSITO DE CADA TUBO?

En el primer tubo se demostró que cuando existe un inhibidor enzimático en el sistema, la

reacción no se da, quedando la enzima inactiva.

En el segundo tubo se demostró que a condiciones especificas, se forma amoniaco debido a

la actividad de la enzima.

¿CUÁL ES EL TUBO CONTROL?

El tubo control viene a ser el tubo 1 en el cual no hubo ninguna reacción

enzimática, el cual nos sirve para la comparación del tubo 2

¿ES NECESARIO MÁS DE UN TUBO CONTROL?

En este caso si hubiera sido necesario un tubo donde hubiera tenido todos los

reactivos excepto la ureasa, para así verificar si verdaderamente el inhibidor

enzimático inactiva al 100% a la enzima.

2.- OBSERVE LAS REACCIONES EN LOS TUBOS DE TITULACIÓN Y ANOTAR SUS OBSERVACIONES.

Luego de haber realizado el sistema de incubación de los tubos 1 y 2, agregamos en los tubos 1(B) y

2(B) 2mL de éstos para agregarles rojo de metilo al 0.04 % se observó que en ambos la solución tornó

amarillenta. Después se procedió a titular con HCl hasta que dio en ambos una coloración rosa pálido

que es el punto final.



Las observaciones en el tubo 1(B) fueron que con solo 0.15 mL se tornó color rosa pálido lo que se

indicó como tubo control, en el tubo 2(B) para que se torne rosa pálido en la titulación de HCl requirió

0.56 mL lo que se indicó como un tubo problema que requiere de más acido para poder

neutralizarse.

3.- CALCULE LAS UNIDADES DE LA UREASA A PARTIR SUS RESULTADOS.

Velocidad = (Vol. HCl gastado (problema) – Vol. HCl gastado (blanco)) (molaridad HCl) (100) (4)

(15 minutos) (2) (2ml.)

Velocidad = X u moles de úrea desdobladas/minuto, a 37°C, pH 7.2

Unidad de ureasa: Cantidad de ureasa necesaria para desdoblar 1 u mol de

úrea/minuto, a 37°C, pH 7.2

Si:

X u moles úrea desdobladas 0.5 ml. de ureasa

Y u moles úrea desdobladas 100 ml. de ureasa

Si:

Y u moles úrea son desdobladas 0.05 g. ureasa

Z u moles úrea son desdobladas 100 g. ureasa

Por tanto: Si 1 unidad de ureasa 1 u mol úrea

X unidad ureasa Z u moles úrea

Cantidad de ureasa a partir de nuestros resultados :

Vol. Hcl gastado TUBO 1 = 0.15 m l

Vol. Hcl gastado TUBO 2 = 0.56 m l

Velocidad = (0.56 – 0.15) (0.05) (1000) (4)

(15 minutos) (2) (2)

Velocidad = 1.36 u moles de úrea desdobladas/minuto.

Y = (1.36 u moles de úrea) (100 ml)

(0.5)


Y = (X u moles úrea) (100 ml.) 0.5 mlY = … u moles de úrea.

Z = (Y moles úrea) 100 g (0.05 g)Z = … u moles úrea


Y = 272 u moles de úrea.

Z = (272 u moles úrea) (100 g.)

(0.05 g.)

Z = 544000 u moles úrea.

X = (1 unidad de ureasa) (544 u moles úrea)

(1 u mol úrea)

X = 544000 unidades de ureasa.

4.- ¿CUÁL ES LA FUNCIÓN DEL HGCL2 EN ESTE ENSAYO?

La función del Hg CL2 en experimentación del sistema de incubación es detenerla actividad

enzimática de la ureasa. El HgCl2 cumplió la función de inhibir o neutralizar el proceso de

la reacción.

5. DISEÑAR TABLA CON SUS RESULTADOS:

VELOCIDAD 1,36 moles de urea desdoblada/min

Y 272 unidades molesde úrea

Z 544000 unidades moles de urea

X 544000 unidades de ureasa

6. ¿A QUÉ DATOS EXPERIMENTALES PUEDE REMITIRSE PARA AFIRMAR QUE LAS

ENZIMAS SON DE NATURALEZA PROTEICA? SEGÚN ELLO, ¿QUÉ PRECAUCIONES SE

DEBEN TOMAR PARA MANIPULAR LAS ENZIMAS?

Como el objetivo de nuestra practica es demostrar la actividad enzimática determinando para

ello la actividad de la ureasa, por conocimiento sabemos que las enzimas son biocatalizadores

específicos de naturaleza proteica que actúan acelerando las reacciones químicas en este caso

uno de los factores que afectan esta actividad enzimática es el tiempo de incubación en los

tubos 1 y 2 ( con los componentes indicados en cada uno de ellos) que nos permitió expresar

esta actividad en términos de velocidad; es decir, la cantidad de producto formado por unidad

de tiempo que generalmente se determina en micromoles de producto formado por minuto,

teniendo en cuenta un pH optimo de 7.2 y un temperatura de37ºC.Una vez obtenidos los



tubos 1 y 2 por sistema de incubación procedemos a la valoración de la actividad de la ureasa

por el método de productos formados. Primero lo haremos por reacción de neutralización

donde tomamos 1 mL de cada tubo para colocarlos en los tubos 1(B) y 2(B) donde luego

añadimos 1 gota de rojo de metilo al 0.04% y lo titulamos con HCL 0.05N observando como

punto final un rosa pálido que indicara por finalizada la titulación. En el tubo (B) observamos

que necesito mas acido para lograr neutralizarse.

Con los datos obtenidos en esta experiencia se precedió a calcular los resultados en términos

de velocidad de reacción o actividad enzimática expresados como micromoles de urea

desdoblados por minuto a 37ºC (unidades de ureasa) con un pH optimo de 7.2.Segundo por

reacción de Nessler donde haremos tres tubos: Blanco, 1 y 2 de acuerdo a los componentes

indicados, dejaremos en reposo por 10 minutos y lo leeremos en el fotocolorímetro con filtro

verde, o un espectrofotómetro a 540 nm. Lo cual nos permitió hacer cálculos en corrección de

lecturas y hallar la velocidad de reacción o actividad de ureasa.

El éxito del trabajo con enzimas depende del cuidado con que se eviten las

condiciones en las cuales son inestables:

Deben evitarse altas temperaturas y acidez o alcalinidad extremas. Durante el

aislamiento y la purificación conviene, en general, trabajar entre 0 y 4 oC y

evitar pH mayor que 9 o menor que 5.

Debe evitarse la formación de espuma, ya que la misma es indicador de

desnaturalización proteica.

Los solventes orgánicos inactivan muchas enzimas a temperatura ambiente; de

modo que los fraccionamientos con los mismos deben llevarse a cabo a baja

temperatura y ésta no debe elevarse hasta que el solvente se haya eliminado o

diluido a concentraciones inocuas.

Deben tomarse también varias precauciones en lo que se refiere a las

condiciones de la reacción:

Elegir pH y temperatura en las zonas de mayor estabilidad de la enzima

Llevar a cabo la reacción a temperatura constante.

Elegir un buffer adecuado para evitar cambios de pH

Evitar la introducción de trazas de otras enzimas (por ejemplo saliva).



Elegir una cantidad de enzima adecuada para obtener variaciones apropiadas

de la magnitud a medir.

7) EXPLIQUE EL FUNDAMENTO DE LA VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA MEDIANTE EL

MÉTODO DELOS PRODUCTOS FORMADOS UTILIZANDO LA REACCIÓN DE NEUTRALIZACIÓN.

A partir del experimento realizado se puede concluir que la ureasa aceleró la reacción

ya que cuando se aplicó el amortiguador a ambos tubos; el tubo 2, el cual contenía la

enzima tenía como producto: AMONIACO y dióxido.

Esto se vio evidenciado en el proceso de titulación, cuando el tubo 2 requirió un

mayor gasto para neutralizar la base formada (amoniaco).

9) ¿CÓMO SE DENOMINA LAS SUSTANCIAS SOBRE LAS CUALES ACTÚAN LAS ENZIMAS? EXPLIQUE

LOSMECANISMOS.

Las sustancias sobre las cuales actúan las enzimas se denomina SUSTRATO, pero

debemos tener en cuenta que estas no alteran el equilibrio de la reacción, solamente

aumentan la velocidad con que estas se producen, actuando como catalizadores.

Generalmente, las enzimas se nombran añadiendo la terminación "asa" a la raíz del

nombre de la sustancia sobre la que actúan.

Mecanismos de control de la actividad enzimática:

La temperatura : Si se suministra a una reacción enzimática energía en forma de

calor, al ser captada por las moléculas es transformada en energía cinética. Ello

favorece la movilidad de estas moléculas y por tanto el número de encuentros

se incrementa. Si la temperatura es excesiva, la enzima, cuya estructura es

proteínica, se desnaturaliza perdiendo totalmente sus propiedades, de forma

que la actividad enzimática

PH : Todas las enzimas tienen dos valores límite de pH entre los cuales son

efectivas. Traspasados estos valores, la enzima se desnaturaliza y deja de

actuar. Entre estos dos valores extremos se sitúa un pH en el cual la enzima

alcanza una efectividad máxima: Es el llamado pH óptimo. Este es

independiente del punto isoeléctrico de la molécula enzimática, es decir,

cuando ésta no tiene carga global, ya que hay tantos radicales ácidos como

básicos. El pH óptimo está condicionado por el tipo de enzima y de sustrato,



debido a que el pH influye en el grado de ionización de los radicales del

sustrato.

Concentración del sustrato : En toda reacción enzimática, si se incrementa la

concentración del sustrato se produce un aumento de la velocidad de

formación del producto, tiende a restablecer el equilibrio químico entre la

concentración del sustrato y la del producto. En este proceso la enzima no

varía.

Activadores: Algunos iones favorecen la unión de la enzima con el sustrato; por

ejemplo, la enzima fosforilasa, que regula la formación de ATPa partir de ADP y

un grupo fosfato (H3PO4) y que se suele representar como Pi (Fosfato

orgánico), se ve activada por la presencia de iones magnesio Mg+ 2.

Inhibidores: Hay inhibición cuando disminuye la actividad y la eficacia de una

enzima. Las sustancias distintas del sustrato que tienen este efecto se

denominan inhibidores

La inhibición irreversible o envenenamiento de la enzima tiene lugar cuando el

inhibidor se fija permanentemente al centro activo inutilizándolo al alterar su

estructura. La inhibición reversible tiene lugar cuando no se inutiliza el centro activo,

sino que solo se impide su normal funcionamiento.

V.-CONCLUSIONES:

El tubo 1 (B) se indicó como un tubo control ya que sólo contiene una cantidad de sustancia

que luego se procedió a cuantificar y se tomó de referencia al medir la muestra real.

El tubo 2(B) se indicó como tubo problema porque se formó una base, por lo cual éste

requirió de más ácido, lo cual se usó para la cuantificación de la velocidad de reacción.

VI.- ANEXOS.




Tubo Control

Prac. 1 Determinacion de La Actividad de Ureasa

Documents

Transcript of Prac. 1 Determinacion de La Actividad de Ureasa