PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE...

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO

FACULTAD DE AGRONOMIA

AREA DE HORTALIZAS Y FLORES

TALLER DE LICENCIATURA

PROPAGACIÓN in vitro DE ALGUNAS ESPECIES DE Leucocoryne

CLAUDIA FUENTEVILLA SAA

QUILLOTA CHILE 2004

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN 2

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4

2.1. Antecedentes generales del género Leucocoryne 4

2.1.1. Ubicación taxonómica y distribución geográfica 4

2.1.2. Descripción botánica del género Leucocoryne 5

2.2. Antecedentes sobre propagación de Leucocoryne 6

2.2.1. Propagación sexual 6

2.2.2. Propagación asexual 7

2.3. Antecedentes sobre propagación in vitro 8

2.3.1. Definición 8

2.3.2. Ventajas y desventajas de la micropropagación 10

2.3.3. Factores que inciden en la micropropagación 11

2.3.3.1. Instalaciones 11

2.3.3.2. Selección del explante 11

2.3.3.3. Desinfección 12

2.3.3.4. Medios de cultivo 12

2.3.3.5. Condiciones ambientales de incubación 14

2.3.4. Etapas de la micropropagación 15

2.3.4.1. Establecimiento 15

2.3.4.2. Multiplicación 15

2.3.4.3. Enraizamiento 16

2.3.4.4. Aclimatación 16

2.4. Antecedentes sobre propagación asexual por técnicas in vitro en Leucocoryne 17

3. MATERIALES Y MÉTODOS 21

3.1. Ensayo 1. Efecto de tres medios de cultivo y uso de mitad de bulbo obtenido

por corte longitudinal como explante, sobre el comportamiento y formación de 22

bulbillos en las etapas de establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo

in vitro.

3.1.1. Preparación de medios 23

3.1.2. Preparación material vegetal 23

3.1.3. Protocolo desinfección 24

3.1.4. Protocolo de siembra 25

3.2. Ensayo 2. Efecto de dos tipos de cortes en bulbos y dos cultivares, sobre el

comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de establecimiento del

cultivo in vitro.





3.3. Ensayo 3. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la

hoja, sobre el comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de

establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo in vitro.






hoja, utilizando material ex vitro, sobre el nivel de contaminación en el

establecimiento de los explantes.





3.5. Ensayo 5. Germinación in vitro: Caracterización de la curva de germinación y

bulbificación in vitro, de Leucocoryne purpurea.



27

30

32

36



4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 39

4.1. Ensayo 1. Efecto de tres medios de cultivo y uso de mitad de bulbo obtenido

por corte longitudinal como explante, sobre el comportamiento y formación de

bulbillos en las etapas de establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo

in vitro.

4.1.1. Análisis de la variable contaminación 39

4.1.2. Análisis de la variable rendimiento y diámetro de bulbillos obtenidos 40


comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de establecimiento,

multiplicación y engorde del cultivo in vitro.



hoja, sobre el comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de

establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo in vitro.


4.3.2. Análisis de la variable rendimiento y diámetro de bulbillos obtenidos 49


hoja, utilizando material ex vitro, sobre el nivel de contaminación en el

establecimiento de los explantes.



bulbificación in vitro, de Leucocoryne purpurea.

5. CONCLUSIONES 59

6. RESUMEN 60

7. ABSTRACT 61

39

53

44

47

51

8. LITERATURA CITADA 62

ANEXOS

1. INTRODUCCIÓN

La diversidad climática y la aislación geográfica de Chile da lugar a una aislación botánica

maravillosa con una enorme diversidad genética (BRIDGEN, OLATE y SCHIAPPACASSE,

2002).

Dicha característica climática, da como resultado un gran endemismo en importante parte de

las familias de geófitas de nuestro país, y sus respectivos géneros. En el caso del “Huilli”, el

género en cuestión no es la excepción y según un estudio realizado por CONAF en el año

1989, la mayoría de los géneros descritos ya se encontraban en estado vulnerable. Con el

paso del tiempo y la acción antrópica, muchas de estas especies podrían ya encontrarse en

estado de peligro, debido a la alta tasa de extracción de bulbos y corte de flores para llegar a

mercados floristas informales.

La incansable búsqueda de nuevos productos que ofrecer en el mercado de la floricultura, en

paralelo a la necesidad de proteger las especies nativas de nuestro país, que dicho sea de

paso, cada vez se encuentran más cerca de desaparecer, ha sido el fundamento para la

realización de un proyecto de mejora genética y protección, que se ha iniciado con

Leucocoryne y es en este contexto que se enmarca esta investigación.

El Proyecto FONDO SAG 6 - 5 - 400: “Defensa del patrimonio genético de Leucocoryne a

través del mejoramiento genético y su introducción como cultivo para flor de corte.”, como

programa de mejora genética, se sostiene en tres pilares: diversidad (natural o generada por

cruzamientos), desarrollo de ejemplares con características deseables para un fin específico

(que en este caso puede ser flor de corte, o bien para maceta) y la capacidad de multiplicar

dichos ejemplares de tal modo de llegar a constituir un cultivar.

Persiguiendo este último fin, la técnica de cultivo in vitro, se convierte en una herramienta

eficaz para llevar a cabo la posibilidad de introducir especies del género Leucocoryne en el

mercado, ya que se trata de una planta de fácil manejo, desde el punto de vista agronómico, y

podría competir con otras bulbosas, considerando que Chile presenta condiciones

fitosanitarias óptimas para trabajar con este tipo de especies.

La hipótesis sobre la cual se basa esta investigación es que utilizando técnicas de propagación

in vitro, específicamente la micropropagación, es posible obtener un alto número de bulbos

florales, es decir, con capacidad de florecer el mismo año de plantación, de una variedad o

tipo específica, en un corto período de tiempo.

Así mismo, los objetivos que persigue esta investigación son los siguientes:

Objetivo general:

Determinar un protocolo para la propagación in vitro de Leucocoryne spp.

Objetivos específicos:

Evaluar respuesta de crecimiento de Leucocoryne en distintos medios de cultivo.

Evaluar el efecto del tipo de explante sobre el comportamiento y formación de bulbos in

vitro.

2. REVISION BIBLIOGRÁFICA

2.1. Antecedentes generales del género Leucocoryne:

2.1.1. Ubicación taxonómica y distribución geográfica

Gloria del sol o “Huilli”, en lengua nativa, es el nombre común con que se conocen las

plantas geófitas del género Leucocoryne. El primero en ubicarlo en una familia fue

J.G.Baker, quien lo hizo en la familia Liliaceae (ZOELLNER, 1972), pero la taxonomía

actual lo ubica en la familia Alliaceae (MANSUR et al. , 2002).

MANSUR et al. (2002), señala que el género Leucocoryne es endémico de Chile. Su

distribución más septentrional son los cordones montañosos que acompañan a la costa, a una

altura de 400-800 m, zona que se extiende desde Iquique hasta el valle de Copiapó. Desde la

desembocadura del río Copiapó, se observa un ensanchamiento del área ocupada por

Leucocoryne. Desde el río Elqui hasta el río Maipo prospera en la cordillera de la costa, en el

valle central y en la cordillera de Los Andes en donde aparecen numerosas especies. Desde el

río Maipo hacia el sur se nota una disminución de Leucocoryne existiendo solamente una

especie en el río Bío-Bío (HOFFMAN, 1998; ZOELLNER, 1972).

En la distribución de Leucocoryne, existen factores climáticos comunes: son zonas donde las

lluvias caen esporádicamente y sólo en los meses de invierno. Aparece una vegetación

efímera en la que predominan los geófitos y terófitos, pequeñas plantas que cubren los

campos con sus flores en los meses primaverales, para desaparecer rápidamente cuando se

acercan los meses estivales y los campos se convierten en semidesiertos (ZOELLNER,

1972).

2.1.2. Descripción botánica del gÉnero Leucocoryne

Según SCHIAPPACASSE, YAÑES Y PEÑAILILLO (1999), las especies geófitas son

plantas de estructuras vegetativas subterráneas especializadas en el almacenamiento de

carbohidratos, agua y minerales. Estas estructuras les permiten sobrevivir en estado de receso

cuando las condiciones son desfavorables, tales como sequía y temperaturas extremas.

Cuando las condiciones son favorables, rápidamente reanudan el crecimiento y completan su

ciclo. Estas plantas se pueden clasificar en cinco categorías: bulbos, cormos, tubérculos,

rizomas y raíces tuberosas. Las cuatro primeras categorías involucran, tanto modificaciones

del tallo como de las hojas y el último es principalmente una metamorfosis de la raíz

(HARTMANN, 1990).

El órgano geófito de Leucocoryne es un bulbo esférico o algo ovalado, de 1.5 a 2.5 cm de

diámetro, el que está cubierto exteriormente por membranas secas de color castaño y en su

interior se encuentran hasta veinte túnicas carnosas. En la base del bulbo existe un disco del

cual nacen muchas raíces fasciculadas. En su ápice se yergue el cuello, una estructura

cilíndrica, formada por la base de las hojas que generalmente está rodeada de hojas secas,

remanentes de años anteriores. De dicho ápice nace un escapo floral único que puede tener

una altura de 30 – 80 cm, es hueco y glabro, y en su ápice existen dos espatas. La

inflorescencia es una umbela pausiflora o multiflora. Las flores poseen pedicelos filiformes

glabros (MANSUR et al., 2002).

El perigonio consta de un tubo basal de 8 – 12 mm de color verdoso. Este tubo termina en 6

tépalos estrellados de 1.4 – 2.0 cm de largo, su coloración varía del blanco al celeste. En el

ápice del tubo floral surgen tres estructuras carnosas cilíndricas que alcanzan hasta 6 mm de

largo, que corresponden a los estaminodios. El androceo consta de 3 estambres, sin

filamentos y cuyas anteras están adheridas al tubo floral, constan de 2 tecas y poseen

dehiscencia longitudinal. El polen es monadal, heteropolar, bilateral, monocolpado. El

gineceo posee un ovario súpero hipogineo cilíndrico, con un estigma corto, capitado, ubicado

por debajo de los estambres. El fruto es una cápsula tricarpelar dehiscente. Cada carpelo

posee muchas semillas lenticulares insertadas en el eje (MANSUR et al., 2002).

2.2. Antecedentes sobre propagación de Leucocoryne:

2.2.1. Propagación sexual

Como indica MANSUR et al (2002), la polinización del estigma se efectúa con facilidad. El

polen acumulado sobre el estigma cae y fecunda la flor, por lo que cualquier insecto que la

visite, puede actuar de vector de manera sencilla. Rara vez puede tener autopolinización ya

que es autoincompatible y preferentemente su polinización es cruzada, lo que da pie a una

alta diversidad de especies en el genero en estudio. Pero este tipo de reproducción presentaría

un problema, en condiciones naturales, es que los frutos maduran en octubre – noviembre y

las semillas caen a un suelo endurecido, expuestas a ser comidas o destruidas.

Por otra parte, SCHIAPPACASSE, YAÑES Y PEÑAILILLO (1999), señalan la existencia

de diversas ventajas y desventajas de la propagación por semillas. Entre ellas (aunque no

aplicables a todas) se encuentran:

- Permite realizar mejoramiento genético.

- Existen menos posibilidades de transmisión de enfermedades a través de semillas que a

través de estructuras vegetativas.

- Las semillas se comercializan fácilmente: su tamaño es pequeño, pueden pasar barreras

aduaneras mejor y sufren menos los cambios de hemisferio que las estructuras

vegetativas.

- En algunos casos, las plantas resultantes de semillas pueden no tener la deseada similitud

con los progenitores.

- El periodo de juvenilidad puede durar mucho tiempo; en el caso del tulipán suelen

transcurrir cuatro a cinco temporadas desde una siembra hasta que las plantas produzcan

flores.

- En algunos casos, el periodo de viabilidad de las semillas es corto.

- Algunas semillas tienen complejos mecanismos que impiden su germinación por

prolongados periodos de tiempo y germinan sólo si se les proporcionan condiciones

muy especiales.

Los mismos autores indican que los mecanismos que aseguran la germinación de las semillas

en condiciones favorables para el desarrollo de las plántulas, e impiden su germinación bajo

condiciones “normales” son diversos. Tales semillas están en letargo o “dormancia”. La

dormancia puede deberse a diferentes causas, según las cuales se denomina ecodormancia,

paradormancia o endodormancia.

2.2.2. Propagación asexual

La reproducción vegetativa se produce por la formación de nuevos bulbillos que se originan

en el disco basal del bulbo madre, como pequeñas estructuras, que en su ciclo vital, poco a

poco se transformaran en nuevos bulbos (MANSUR et al., 2002).

Según MANSUR et al. (2002), el ciclo de vida natural de todas las especies de este género,

toma al menos tres años desde semilla a bulbo floral, pudiendo variar levemente según la

especie. Este ciclo comienza cuando las semillas germinan superficialmente con temperaturas

entre 10 – 15°C. Al cabo de aproximadamente 45 días, empieza a formar un bulbillo que

crece y se desarrolla, y que al cabo de 90 días postgerminación, llega a tener un diámetro

aproximado de 4 a 6 mm y 60 mg de peso. Luego, en noviembre, entra en receso. En la

segunda temporada de crecimiento el bulbo brota sin necesidad de agua, desarrolla un par de

hojas y engorda. Al cabo de 100 – 120 días, la planta senesce, sin alcanzar aún un tamaño

floral. En la tercera temporada de crecimiento, aproximadamente 90 – 100 días después de

emergencia, y con un bulbo de 0.3 gramos de peso, la planta produce uno o dos escapos

florales, teniendo cada uno de cinco a ocho flores y 25 a 40 semillas por flor. Esto coincide

con investigaciones realizadas por OHKAWA (1999), donde los bulbos con un peso superior

a 0.3 gramos florecen en un 100 %, y todas las varas florales tienen calidad para que puedan

utilizarse como flor de corte. Este autor indica que no todos los bulbos con un peso entre 0.1

y 0.2 gramos florecen y para que alcancen un tamaño comercial deben cultivarse por un año,

al cabo del cual alcanzarán un peso mayor a un gramo.

Además, durante el desarrollo del proyecto “Defensa del patrimonio genético de Leucocoryne

a través del mejoramiento genético y su introducción como cultivo para flor de corte.”, que se

lleva a cabo en la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de

Valparaíso, se ha observado que algunos individuos de Leucocoryne, poseen la capacidad de

generar bulbillos en la porción aérea de la planta, es decir, se originan en la parte superior del

escapo floral, en la base de la zona de inserción de los pedúnculos florales (Figura 1).

Así mismo, SCHIAPPACASSE, YAÑES Y PEÑAILILLO (1999) se refieren a distintas

técnicas artificiales, que aceleran la propagación vegetativa propia en especies geófitas. Entre

ellas se encuentran el corte en cruz o “scoring”, vaciado o “scooping” y “coring”. Los tres

métodos se aplican a bulbos tunicados, de preferencia en receso.

El primero consiste en hacer cortes profundos a lo largo del diámetro de la cara basal del

bulbo, en el plato basal. Los cortes tienen que ser lo suficientemente profundos para dañar el

punto de crecimiento. El segundo, “scooping”, consiste en remover completamente el plato

basal y la base de las escamas. Se puede realizar con un cuchillo o con una cuchara de borde

cortante. Finalmente, la técnica conocida como “coring”, consiste en la remoción de un

cilindro de tejido que incluye el punto de crecimiento, introduciendo un sacabocado o

utensilio desde la zona del plato basal verticalmente hacia el interior del bulbo.

2.3. Antecedentes sobre propagación in vitro:

2.3.1. Definición

El término de cultivo in vitro se aplica a todo cultivo bajo vidrio (tubo, bocal, etc.) en medio

aséptico, e incluye diversas técnicas cuyos métodos y fines son muy diferentes

(BOUTHERIN y BRON, 1994). Por otra parte, PIERIK (1990), señala que el cultivo sobre

un medio nutritivo en condiciones estériles, optimizando las condiciones ambientales y

nutricionales de células, protoplastos, embriones, semillas, explantes (trozos de tejidos u

órganos extraídos de la planta madre) o plantas, es lo que se conoce como cultivo in vitro.

La micropropagación consiste en producir plantas a partir de porciones muy pequeñas de

ellas. La capacidad de ciertos tejidos vegetales, como el callo y las suspensiones de células,

FIGURA 1. Bulbillos aéreos (bulbilos) generados en individuos de Leucocoryne sp. Quillota

octubre del 2002.

así como aquella de varios órganos de plantas tales como tallos, flores, raíces y embriones, de

crecer de manera más o menos indefinida, se ha utilizado durante muchas décadas en los

laboratorios científicos como un instrumento de investigación por genetistas, botánicos y

fitopatólogos (HARTMANN y KESTER, 1995).

Es importante destacar que el cultivo in vitro es posible gracias a una propiedad de las células

vegetales llamada totipotencia celular. Con esto se quiere decir que una célula no embrionaria

tiene el potencial de diferenciarse en una célula embrionaria y después desarrollarse en una

planta nueva completa si el ambiente es favorable, ya que todos los genes para la producción

de la planta completa existen en esas células diferenciadas (SALISBURY y ROSS, 1994).

2.3.2. Ventajas y desventajas de la micropropagación

Según KITTO (1997) y MROGINSKI (1991), entre las ventajas más importantes de este

método de propagación cuando se compara con los convencionales están:

Altos coeficientes de multiplicación que permiten manipular volúmenes elevados de

plantas en cortos períodos de tiempo.

Rápida introducción de nuevas variedades o clones.

Reducción del tiempo de multiplicación.

Producción independiente de las condiciones ambientales.

Incremento en los rendimientos debido al rejuvenecimiento y saneamiento.

Uniformidad en las plantaciones producidas.

Mejor facilidad para la comercialización.

Además, dentro de las ventajas de este método, señaladas por BOUTHERIN y BRON (1994),

se encuentran:

Salvamento de especies en vía de desaparición.

Permite la programación de cultivos a lo largo del año.

Creación de bancos de germoplasma, que podrán conservar especies o cultivares que

ofrezcan un interés agronómico, hortícola, industrial, ecológico, etc.

Garantía de homogeneidad.

Buena calidad sanitaria.

Dentro de las desventajas de este proceso HARTMANN Y KESTER (1995), indican que:

Las instalaciones necesarias son costosas y en muchas especies de plantas las

consideraciones económicas es posible que no justifiquen su empleo comercial.

Para efectuar las operaciones se necesita adiestramiento específico.

Los errores de identidad, introducción de organismos patógenos desconocidos o la

aparición de mutantes desapercibidos, pueden multiplicarse a escala considerable, en un

tiempo muy corto.

Con respecto a las modificaciones genéticas, la técnica mas generalizada y la más segura para

evitar la variabilidad y lograr la reconstitución de clones homogéneos, es el cultivo de

meristemas o ápices de tallo de forma directa. Cuando se generan plantas a partir de callo, se

facilita la aparición de variantes, sobre todo si se utilizan mezclas complejas de reguladores

de crecimiento (MARGARA, 1988). El callo corresponde a una masa de células no

especializadas, típicamente poliploides, dispuestas laxamente (SALISBURY y ROSS, 1994).

2.3.3. Factores que inciden en la micropropagación

2.3.3.1. Instalaciones

Se debe disponer de instalaciones especiales de tipo laboratorio para preparar los cultivos,

producir y mantener condiciones estériles y proporcionar las condiciones de crecimiento

adecuadas (HARTMANN y KESTER, 1995)

2.3.3.2. Selección del explante

Prácticamente se puede utilizar cualquier porción o parte de la planta. Para iniciar los trabajos

de cultivo in vitro, en primera instancia, dicha selección está dada por el objetivo perseguido

y la especie vegetal que se trate. Generalmente, se emplean plantas sanas y vigorosas, y

dentro de éstas, las zonas que se encuentran en activa división, como los meristemos. Las

plantas jóvenes son las que aportan los explantes más reactivos, ya que la totipotencialidad

disminuye con la edad. El tamaño del explante es otro aspecto que se debe tener en cuenta,

pues la dificultad para iniciar un cultivo aumenta con su disminución (MROGINSKI, 1991).

Esto coincide con lo planteado por PIERIK (1990) quien indica que en términos generales,

explantes jóvenes no leñosos, en estado vegetativo y de mayor tamaño, tienen mayor

capacidad de regeneración y adaptación in vitro.

El tamaño de un explante puede variar desde 1 a 5 mm de la punta meristemática misma, a un

trozo de tallo de varios centímetros de largo. También se pueden utilizar para obtener

explantes trozos de hojas que tengan nervaduras, escamas de bulbos, escapos florales y

cotiledones (HARTMANN y KESTER, 1995).

2.3.3.3. Desinfección

Diversos compuestos químicos se utilizan para desinfectar superficialmente los explantes. Se

emplean con mayor frecuencia el etanol (70% v/v) y el hipoclorito de sodio (1-3%) y con

menor frecuencia se utiliza el hipoclorito de calcio (6-12 %) y el bicloruro de mercurio (0.1 –

1.25 %), aunque con este compuesto por lo general se obtienen mejores resultados, es

altamente tóxico y no se remueve con facilidad del explante. Conjuntamente con los

desinfectantes se pueden añadir gotas de Tween 20, para reducir la tensión superficial y

eliminar las burbujas que se forman en la superficie y cavidades del explante (JIMENEZ,

1998 y MARGARA, 1988). No obstante, las concentraciones del agente esterilizante y la

duración se deben escoger en función de minimizar los daños para los explantes. Se debe

tener en cuenta la especie vegetal y tipo de explante, ya que no existe un procedimiento único

(ROCA, 1991; MROGINSKI, 1991 y MARGARA, 1988). Luego se escurre la solución y el

material se enjuaga 2 o 3 veces con agua destilada estéril (HARTMANN y KESTER, 1995).

2.3.3.4. Medios de cultivo

Los explantes cultivados in vitro no se comportan completamente autotróficos, entonces el

medio de cultivo debe aportar el agua, los macro y micro nutrientes, azúcares y,

eventualmente, vitaminas y reguladores de crecimiento. La constitución del medio de cultivo

depende de la planta (genotipo), de las interacciones de éste con el ambiente (factores

físicos), del tamaño del explante y del objetivo o etapa de la micropropagación (PIERIK,

1990).

La efectividad del medio depende tanto de los ingredientes básicos, como del pH del medio y

del agente solidificante (MARGARA, 1988).

Para el cultivo in vitro, no existe un medio universal, sin embargo el medio MS basal

propuesto por Murashige y Skoog (1962), con algunas modificaciones en sus ingredientes ha

sido el más frecuentemente utilizado en la mayoría de las especies propagadas in vitro.

También se han empleado, pero con menor frecuencia, los medios Wh propuesto por White

(1943), B5 propuesto por Gamborg et al. (1968), BDS propuesto por Dunstan y Short (1977)

(IZQUIERDO y QUIONES, 2001).

Por otro lado, los reguladores de crecimiento son compuestos orgánicos que se sintetizan en

alguna parte de la planta y se traslocan a otra parte, en donde concentraciones muy bajas

causan una respuesta fisiológica (SALISBURY y ROSS, 1994). Un balance apropiado entre

auxinas y citoquininas es necesario para la formación de plantas a partir de meristemos,

ápices o yemas. Este balance está determinado por las concentraciones endógenas de auxinas

y citoquininas presentes en el explante, las cuales dependen de la especie y del tipo de

explante. Se considera que si la relación auxina/citoquinina en el medio de cultivo es

favorable a la segunda se incentiva la formación de brotes y lo contrario promueve el

enraizamiento y la callogénesis (JIMENEZ, 1998 y DIXON, 1994).

Las auxinas sintéticas comprenden al ácido naftalenacético (ANA), usado de 0.1 a 10 mg*l-1;

al ácido indolbutírico (IBA), usado a razón de 0.1 a 10 mg*l-1; a los ácidos 4-

clorofenoxiacético (CPA) y 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), usados ambos en proporción de

0.05 a 0.5 mg*l-1 y el ácido indolacético (AIA), empleado en cantidades de 1 a 50 mg*l-1. Las

citoquininas incluyen a la N6-benciladenina (BA), la kinetina, la N6-isopentenil-adenina (2iP)

y la zeatina, y se utiliza en un rango de 0.01 a 10 mg*l-1 (HARTMANN y KESTER, 1995).

Sobre la base de experiencias recientes, aparecen los jasmonatos, especialmente al ácido

jasmónico (AJ) y el jasmonato de metilo (MeJA), como promotor de defensa de las plantas a

ataques de insectos y resistencia de enfermedades. Los jasmonatos han sido encontrados a

través de plantas, con las concentraciones más altas posibles en tejidos jóvenes en activo

crecimiento. El jasmonato de metilo es el principal componente del aceite esencial de

Jasminium y otras especies. Altas concentraciones de ácido jasmónico han sido aisladas

desde líquidos filtrados de cultivos de hongos.

Los jasmonatos fueron inicialmente reconocidos por su habilidad como promotores de la

senescencia de segmentos de hojas de cebada, pero un papel en la resistencia a enfermedades

fue sugerido cuando la biosíntesis de fitoalexinas en cultivo de células, fue ligado al

contenido de ácido jasmónico. Ahora es sabido que el ácido jasmónico se acumula en plantas

heridas, y que además activa algunos genes codificadores de proteínas con propiedades

fungicidas.

Por su efecto en la expresión genética, los jasmonatos moderan un número importante de

otros procesos fisiológicos, entre los que se incluyen la germinación de semillas y polen,

almacenamiento de proteínas de reserva y desarrollo radicular. En la mayoría de esos efectos

los jasmonatos aparecen en un trabajo conjunto con el etileno. Este amplio espectro de acción

de los jasmonatos ha conducido a algunos investigadores a sugerir que los jasmonatos pueden

ser elevados al nivel de fitohormonas (HOPKINS, 1999).

2.3.3.5. Condiciones ambientales de incubación

Este requisito se debe cumplir rigurosamente para el éxito en el establecimiento de los

cultivos in vitro. Para ello es conveniente que los explantes se incuben en ambientes

controlados de luz (1000 – 5000 lux) y temperatura (20 – 28 °C), así como de humedad

relativa (70 – 80 %) acordes con los objetivos del trabajo. Estos efectos influyen

prácticamente en todos los procesos: absorción de agua, evaporación, fotosíntesis,

respiración, crecimiento, floración, cuajado del fruto, entre otros (ROCA, 1991 y PIERIK,

1990). No obstante se debe tener en cuenta que cada cultivo tiene sus propias especificidades


2.3.4. Etapas de la micropropagación

Muchos autores coinciden en la existencia de 4 fases o etapas en la micropropagación. Sin

embargo, IZQUIERDO y QUIONES (2001), hacen referencia a una etapa previa a estas

cuatro etapas. La llaman Fase 0 o Preparativa, y sería indispensable en el desarrollo de un

esquema de micropropagación, ya que es la fase en que se selecciona la planta donadora de

los explantes y se determinan todas las condiciones para el posterior establecimiento de los

mismos.

2.3.4.1. Establecimiento

La función de esta etapa es establecer al explante en el medio de cultivo e inducir el

desarrollo de brotes múltiples para multiplicación posterior, lo cual puede implicar: (a)

estimular la formación de brotes axilares, (b) la iniciación de brotes adventicios en brotes,

hojas, escamas de bulbos, escapos florales, cotiledones y material similar, o (c) la iniciación

de formación de callo en superficies cortadas (HARTMANN y KESTER, 1995).

2.3.4.2. Multiplicación

En esta etapa, cada explante se desarrolla y forma un grupo de brotes que salen de una masa

basal común expandida de tejido tipo callo. Luego, esta estructura se divide en propágulos

separados, que se transplantan a un medio de cultivo fresco. El tipo de medio que se use

depende de la especie, cultivar y tipo de cultivo. De ordinario es esencialmente el mismo que

se usó en la etapa de establecimiento, pero a menudo se aumenta la concentración de

citoquinina (HARTMANN y KESTER, 1995).

2.3.4.3. Enraizamiento

Los propágulos de algunas variedades necesitan una etapa de cultivo adicional, pues aún

cuando la sobrevivencia no sea un problema, es necesaria esta etapa para el enraizamiento

individual de los brotes, el incremento de su resistencia al estrés de humedad y enfermedades,

para el establecimiento de las reservas de alimentos necesarios en el período de transición y

para el desarrollo de la capacidad autotrófica, debido a que la apariencia verde de las plantas

no es suficiente para poder realizar la fotosíntesis, ya que aunque los pigmentos

fotosintetizadores estén presentes, las enzimas están en ocasiones ausentes o inactivas


2.3.4.4. Aclimatación

Las plantas enraizadas, o sin enraizar, se sacan del recipiente de cultivo, se lava por completo

el agar, para remover una fuente potencial de contaminación y se transplantan a una mezcla

de suelo estándar, pasteurizada, en macetas pequeñas en una forma más o menos

convencional. Inicialmente se debe proteger las plantas colocándolas bajo sombreadero, con

alta humedad relativa o bajo niebla. Pueden necesitarse varios días para que se formen nuevas

raíces (HARTMANN y KESTER, 1995).

BOUTHERIN y BRON (1994) señalan que las raíces nacidas in vitro son extremadamente

frágiles y colocadas en contacto con un sustrato, mueren. Es necesario esperar la formación y

el crecimiento de nuevas raíces para que la planta se nutra. Durante esta fase, las jóvenes

plántulas se van a comportar como estaquillas. Será necesario entonces, asegurar los mismos

cuidados: higrometría elevada, temperatura cercana a los 20°C, sombreado eventual,

vigilancia muy cuidadosa de las enfermedades.

Sin embargo, las raíces formadas in vitro probaron ser plenamente capaces de expandirse y

crecer durante la aclimatación. Esta conclusión se opone a la hipótesis de que las raíces in

vitro no son capaces de sobrevivir bajo condiciones ex vitro (PIERIK, 1990).

SAFFIE (2002) se refiere a un experimento realizado con jazmín asiático, donde las raíces

formadas in vitro son viables y totalmente capaces de continuar el crecimiento después de ser

transferidas desde un medio in vitro a un invernadero convencional, a pesar de la reducida

absorción de fósforo.

2.4. Antecedentes sobre propagación asexual por técnicas in vitro en Leucocoryne:

En el caso de Leucocoryne, existen escasos antecedentes de experiencias previas a esta

investigación en cuanto a la micropropagación u otra técnica in vitro. No obstante, en otras

especies pertenecientes a la familia Alliaceae, como es el ajo (Allium sativum) y cebolla

(Allium cepa), o bien en tulipán (Tulipa spp.), también poseedor de bulbo tunicado, hay

antecedentes de este tipo de propagación.

BHOJWANI (1980), evaluó el comportamiento in vitro del clon de ajo francés “ Rose de

Kakylis” previamente saneado a virus. Desinfecta los dientes, aísla los ápices caulinares y los

inocula en el medio basal B5 suplementado con 0.5 mg*l-1 de 2-iP y 1 mg*l-1 de ANA,

obteniendo 5.8 brotes por explante como promedio en un mes, mientras que con 0.5 mg*l-1 de

6-BAP sólo obtuvo 2 a 4 brotes, y en medio basal MS con las mismas concentraciones de

ANA y 2-iP obtuvo solamente 2.6 brotes / explante. Al transferir las plántulas al medio B5

con 0.2 mg*l-1 de ANA como suplemento hormonal logró el 100 % de enraizamiento.

Posteriormente WALKEY et al. (1987) obtiene plantas de Allium sativum libres de virus por

cultivo de meristemos. Los explantes entre 0.5 – 0.8 mm crecieron mejor en el medio B5 que

en el MS cuando el mismo se enriqueció con AIA (2.5 mg*l-1) y 6-BAP (4-8 mg*l-1) o KIN

(4-8 mg*l-1), siendo superior la combinación AIA y KIN, que formó entre 4 – 5 brotes por

explante.

Uno de los primeros informes relacionados con la microbulbificación sincronizada in vitro en

ajos de sanidad controlada fue realizado por RACCA (1989) citado por IZQUIERDO y

QUIONES (2001). Este autor utiliza como medio basal MS a la mitad suplementado con 0.3

ppm de ANA y 3 ppm de 2-ip, pero las pérdidas fueron superiores al 70 % cuando se

transfirieron las plántulas propagadas in vitro directamente a macetas. Este inconveniente lo

solucionó transfiriendo las vitroplantas después de la fase de multiplicación a un medio MS

diluido a la mitad sin suplemento de auxinas ni citoquininas, un volumen de medio de cultivo

de 25 cm3/explante, días largos (16 horas luz) y cálidos (22°C). A los 90 días obtuvo un 62 %

de bulbificación con 60 g*l-1 de sacarosa. Estos microbulbillos alcanzan una sobrevivencia

superior al 85 % en campo, siempre y cuando su tamaño sea superior a 3 mm de diámetro.

SUN YOO, PIKE y COBB (1990), trabajan con escamas sacadas de bulbos dormantes. En

este ensayo se compara el uso de distintos reguladores de crecimiento: ácido indolacético,

ácido giberélico, ácido abscísico y kinetina, sobre el crecimiento de brotes y hojas en los

explantes. Se indica que la mejor respuesta se observó con el uso de kinetina, incorporado al

medio, que correspondía al medio basal propuesto por MURASHIGE y SKOOG (1962), 7

g*l-1 de agar y 10 uM de kinetina.

CAPOTE (1993), establece una metodología para la micropropagación in vitro de genotipos

cubanos de cebolla en la que utiliza yemas. Estas yemas, luego de ser desinfectadas, fueron

inoculadas en un medio MS reducido a la mitad, que se suplementó con 0.5 mg*l-1 de ANA y

4 mg*l-1 de 6-BAP. La inducción de brotes fue de 12.8 brotes por explante. Los brotes

enraizaron en el medio basal antes expuesto, enriquecido con 0.5 mg*l-1 de ANA.

Además, es importante señalar, el estudio acerca de la influencia del ácido jasmónico (AJ), en

la formación de brotes y bulbos en cultivo in vitro de Allium sativum, donde el medio fue

suplementado con éste como regulador de crecimiento, junto a N6-isopentenil-adenina (2iP)

y se obtuvo 18 brotes/explante y un 55.8 % de bulbificación in vitro (RAVNIKAR et al,

1993).

Finalmente en ajo, IZQUIERDO (2000), estudió algunos clones en cada fase para la

micropropagación del cultivo y obtuvo como resultado que los explantes se establecen mejor

y en menor tiempo en un medio MS basal suplementado con 0.1 mg*l-1 de ANA y 0.1 mg*l-1

de KIN: se obtienen entre 4.9 y 7.3 brotes por explante. El mayor porcentaje de bulbificación

in vitro se induce en el medio basal antes citado cuando se le adicionan 75 g*l-1 de sacarosa.

Por otra parte, en tulipán, se realizó una experiencia de cultivo in vitro, donde el material

utilizado como explante, correspondió al tallo floral, que fue cortado en rebanadas, y puestas

tanto en medio sólido como en medio líquido. El problema que aquí se presenta, es que

muchos de los brotes originados no tienen un punto de crecimiento. El porcentaje de brotes

sin punto de crecimiento puede llegar a ser de mas de un 95 %. Sin embargo, por medio del

uso de ácido jasmónico (AJ), el número de brotes con un punto de crecimiento puede ser

incrementado considerablemente, desde un 5 a 10 % hasta más de un 40 % e incluso

pudiendo alcanzar un 90 % (LANGENS, 2001).

En otras especies como orquídeas, específicamente en Diuris longifolia R. Br., se ha

investigado la micropropagación a partir de inflorescencias. En este caso se utilizan las

yemas de varas florecidas, y las plántulas resultantes tienen las mismas características

genéticas que su progenitor. Los explantes son desinfectados durante 5 a 10 minutos en

hipoclorito de sodio al 1 % con adición de 0.05 % de Tween 80, y lavados tres veces por 5 a

10 minutos en agua destilada esteril. Luego son puestos en el medio Vacin y Went (1949)

modificado, con adición de N6-benciladenina (BA). Los protocormos se forman a los 49 días

después de haber ubicado los explantes en dicho medio (COLLINS y DIXON, 1992).

CUADRO 1. Resumen experiencias de micropropagación en ajo, cebolla, tulipán y orquídea.

AUTOR ESPECIE MEDIO

ESTABLECIMIENTO

OBSERVACIONES

SUN YOO,

PIKE and

COBB (1990)

Cebolla MS + 30 g*l-1sucrosa + 7

g*l-1 agar + 10 um*l-1

Kinetina

Respuesta superior en relación con

otros reguladores de crecimiento

utilizados (IAA, GA, ABA).

CAPOTE

(1993)

Cebolla MS/2 + 0.5 mg*l-1 ANA

+ 4 mg*l-1 6 BAP

Medio enraizamiento: MS + 0.5

mg*l-1 ANA.

B5 + 0.5 mg*l-1 2-iP + 1

mg*l-1 ANA

5.8 brotes / explante (1 mes)

B5 + 0.5 mg*l-1 6 BAP 2 – 4 brotes / explante (1 mes)

BHOJWANI

(1980)

Ajo

MS + 0.5 mg*l-1 2-iP + 1

mg*l-1 ANA

2.6 brotes / explante (1 mes)

WALKEY et

al. (1987)

Ajo B5 + 2.5 mg*l-1 AIA + 4

– 8 mg*l-1 Kinetina

4 – 5 brotes / explante

RACCA*

(1989)

Ajo MS/2 + 0.3 ppm ANA +

3 ppm 2-iP

Con medio de engorde MS/2 + 60

g*l-1 sacarosa se obtiene 62% de

bulbificación en 90 días.

RAVNICAR

et al. (1993)

Ajo MS + AJ + 2-ip 18 brotes / explante y 55.8 % de

bulbificación in vitro.

LANGENS

(2001)

Tulipán Medio enriquecido con

AJ.

Se observó un aumento de hasta un

90 % en la obtención de brotes con

punto de crecimiento.

COLLINS y

DIXON

(1992)

Orquídea Medio Vacin y Went

(1949) modificado + BA

Se obtienen protocormos a los 49

días del establecimiento.

IZQUIERDO

(2000)

Ajo MS + 0.1 mg*l-1 ANA +

0.1 mg*l-1 Kin

4.9 – 7.3 brotes / explante

* : Citado por IZQUIERDO y QUIONES, 2003.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación correspondiente a la propagación in vitro de Leucocoryne sp., se llevó a

cabo en el Laboratorio de Propagación “Profesor Gregorio Rosenberg” de la Facultad de

Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, ubicada en la calle San

Francisco s/n, La Palma, Quillota, durante el periodo comprendido entre marzo del 2003 y

marzo del 2004.

La investigación constó de cinco ensayos. Como material vegetal se utilizó bulbos de

Leucocoryne spp. cv. Caravelle y Sirius, la porción basal, media y apical de hojas y semillas.

Los medios fueron elegidos respecto de la literatura estudiada, eligiendo como medio basal el

MS, y variando las concentraciones de reguladores de crecimiento, entre las mínimas y las

máximas utilizadas por diversos autores.

Para la preparación de medios se adoptó algunas técnicas descritas por PIERIK (1990) y se

realizó siempre con al menos 4 días de anticipación al momento de ser utilizados.

Se preparó el medio MS (Anexo 1), extrayendo cada componente de una solución madre y

complementando con distintos reguladores de crecimiento. Los elementos líquidos se

traspasaron de la solución madre con la ayuda de pipetas a un frasco. Los elementos sólidos

fueron pesados en una balanza electrónica. La solución de dicho frasco, se depositó en una

probeta, y se aforó con agua bidestilada hasta obtener el volumen deseado, traspasándose

luego a una olla o vaso precipitado, el cuál fue puesto en el agitador (Heidolph MR 3001 K),

con el fin de homogenizar la solución, donde se le adicionó el azúcar y se reguló el pH en 5.7

con alícuotas de KOH (1 N) y HCl (1 N).

A continuación, la solución de medio, se calentó en un anafre eléctrico. Al alcanzar los 60°C,

se le adicionó agar de algas marinas y se revolvió hasta disolver, retirando el recipiente de la

fuente de calor al alcanzar los 92 °C (Temperatura de ebullición). Inmediatamente, el medio

fue distribuido en tubos o en frascos, tapándolos, con papel metálico en el caso de los tubos,

o bien, con tapas en el segundo caso. Finalmente los tubos, o frascos, fueron introducidos al

autoclave, donde se mantuvieron por 15 minutos a partir del momento en que se alcanzó 121

°C y 1.5 bar.

La preparación de la cámara de flujo laminar, previo a siembras o repiques, se realizó con una

limpieza del mesón con etanol al 96 %. Los instrumentos como pinzas, portabisturí, papel

absorbente, algodón y papel de aluminio, fueron esterilizados en una estufa de calor seco.

Una vez puestos todos estos instrumentos en el mesón, junto al mechero (metanol) y el

alcohol, se mantuvo la sala con luz ultravioleta (UV) por al menos 15 minutos.

3.1. Ensayo 1. Efecto de tres medios de cultivo y uso de mitad de bulbo obtenido por corte

longitudinal como explante, sobre el comportamiento y formación de bulbillos en las

etapas de establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo in vitro:

Este ensayo se inició el 24 de junio del 2003.

Los tratamientos (T) correspondieron a los tres medios de cultivo a utilizar y se evaluó la

contaminación traducida en sobrevivencia, el número de bulbillos generados por explante y el

diámetro final de éstos. La formación o no de tejido calloso se evaluó sólo de manera

descriptiva.

CUADRO 2. Definición de los tratamientos en ensayo 1.

N° DE

TRATAMIENTO

TRATAMIENTO

T 1 Medio 1 (M1)

T 2 Medio 2 (M2)

T 3 Medio 3 (M3)

El experimento se condujo por un Diseño Completamente al Azar (DCA) con un 5 % de

significancia, donde los resultados de contaminación traducidos en sobrevivencia, medida en

porcentaje en cada tratamiento, se analizó mediante test de comparación de medias Student

Newman Keuls, ya que dicho test, permite la comparación entre distintos tratamientos.

En este caso, inicialmente la unidad experimental fue un grupo de diez tubos, y se realizaron

cuatro repeticiones por tratamiento. Esto, en el caso de la variable contaminación, ya que

posteriormente, se determinó que cada explante fuese una unidad experimental, debido a los

altos niveles de contaminación obtenidos.

3.1.1. Preparación de medios

La preparación de los tres medios se realizó cuatro días antes de la siembra, como se

describió anteriormente. En este ensayo se mantuvo constante la concentración de ANA y se

adicionó en distintas concentraciones KIN, como se muestra en el Cuadro 3. Los tres medios

se prepararon con 30 g*l-1de sacarosa y 7 g*l-1 agar.

CUADRO 3. Composición de medios de cultivo de establecimiento ensayo1.

MEDIO

NUTRITIVO

CONSTITUCIÓN

Medio 1 (M1) MS (Anexo 1) + 0.1 mg/L de ANA + 4 mg/L de KIN

Medio 2 (M2) MS (Anexo 1) + 0.1 mg/L de ANA + 2 mg/L de KIN

Medio 3 (M3) MS (Anexo 1) + 0.1 mg/L de ANA + 0.1 mg/L de KIN

3.1.2. Preparación material vegetal

El material utilizado, correspondió a bulbos de Leucocoryne cv. Caravelle, traídos desde

Holanda en enero del año 2002, iniciándose su almacenaje en cámara a 20°C en octubre del

mismo año, vale decir, estos bulbos, se mantuvieron en cámara por ocho meses para luego ser

utilizados en este ensayo.

Al momento de la siembra in vitro, se podían observar lesiones de color café claro hendidas

en la catáfila carnosa más externa, lo que en ajo es evidencia de ataque fungoso,

característico de Penicillium spp.según lo descrito por APABLAZA (2000).

3.1.3. Protocolo desinfección

Como la búsqueda de un protocolo de desinfección no era el objetivo de esta investigación,

ésta se basó en trabajos exitosos realizados en ajo (Allium sativum), por el investigador,

RACCA (1989), modificándolo en algunos aspectos según la respuesta obtenida en un pre-

ensayo.

1. Los bulbos fueron limpiados, sacándoles la catáfila externa seca y lavados en agua

corriente. En este proceso, para asegurar una limpieza óptima, los bulbos fueron

cepillados y se les adicionó algunas gotas de Tween 20.

2. Una vez lavados, se les extrajo las catáfilas carnosas más externas, teniendo el cuidado de

no desprender el disco basal.

3. Posteriormente, los bulbos enteros, fueron depositados en un matraz de 250 ml y

sumergidos durante 15 minutos en una solución de Captan: Benomilo de 1.8 g*l-1 de cada

uno de estos fungicidas, adicionadas dos gotas de Tween 20, surfactante que ayudó a un

mejor contacto entre el fungicida y el explante.

4. Luego, fueron sumergidos durante 30 segundos en etanol al 70 %.

5. Por último fueron sumergidos por 15 minutos en cloruro de sodio al 1 %, preparado con

agua destilada, para finalmente, lavarlos tres veces con agua destilada estéril, al interior

de la cámara de flujo laminar.

3.1.4. Protocolo de siembra

Los bulbos extraídos desde el matraz, fueron cortados longitudinalmente, con bisturí

(Número 11) sobre una placa y luego puestos sobre papel absorbente, para retirar

cualquier exceso de agua.

Luego cada explante (mitad de bulbo), fue introducido en un tubo que contenía 7 cc de

medio, con una pinza, depositándolo sobre el agar con la zona de corte hacia abajo, y

presionando levemente. Durante este paso, se tuvo la precaución de que la boca del tubo

mirara siempre hacia el fondo de la cámara, de manera que recibiera solo aire purificado,

con el fin de aminorar la posibilidad de contaminación.

Posteriormente, cada tubo fue identificado con el medio que contenía, y el número de

repetición correspondiente, para luego ser llevados a cámara de crecimiento, con una

temperatura promedio de 23 °C y un periodo de luz de 16 horas, con una intensidad

lumínica de 2000 lux.

Luego, y con una periodicidad entre 25 y 30 días, se realizó un subcultivo a medio fresco. En

el caso en que el tamaño del bulbillo era menor a 2 mm de diámetro se repicó al mismo

medio en el que el explante se había establecido. Al contrario, si el bulbillo era mayor a 2

mm de diámetro se repicó a medio de engorde.

El medio de engorde utilizado corresponde al de bulbificación de Lilium, siendo el medio

basal el MS, adicionado con 60 g*l-1 de sacarosa (Anexo 2) y 6.5 g*l-1 de agar, distribuido en

frascos de 6 cm de diámetro por 10 cm de alto (30 cc/frasco).

Con los datos obtenidos en cada frasco, se elaboró una planilla donde se evaluó en primera

instancia, contaminación. Posteriormente, se evaluó el número de bulbos obtenidos por

explante y el diámetro de éstos. Para ello, se utilizó una lupa y un pie de metro digital. La

formación de callo sólo se abordó de manera descriptiva.

FIGURA 2. Explante de Leucocoryne sp. cv. Caravelle sembrado en ensayo 1, Quillota 2003.


comportamiento en la etapa de establecimiento de cultivo in vitro:

Este ensayo se inició el 31 de octubre del 2003.

Los factores a evaluar fueron el tipo de corte (rebanada v/s scoring) y dos cultivares

(Caravelle y Sirius), obteniéndose 4 tratamientos (Cuadro 4). Debido al alto porcentaje de

contaminación obtenido en este ensayo, sólo se evaluó la contaminación traducida en

sobrevivencia.

CUADRO 4. Definición tratamientos ensayo 2.

N° DE

TRATAMIENTO

TRATAMIENTO

T 1 Leucocoryne spp. cv. Caravelle y corte rebanada. (Car.+Reb.)

T 2 Leucocoryne spp. cv. Caravelle y “scoring”. (Car.+Scor.)

T 3 Leucocoryne spp. cv. Sirius y corte rebanada. (Sir.+Reb.)

T 4 Leucocoryne spp. cv. Sirius y “scoring”. (Sir.+Scor.)

El medio utilizado fue un medio basal MS enriquecido con Acido Jasmónico y Kinetina, y

fue llamado Medio 4.


significancia, con arreglo factorial de 2 x 2, donde los resultados de contaminación traducidos

en sobrevivencia, medida en porcentaje en cada tratamiento, se analizó mediante test de

comparación de medias Student Newman Keuls, ya que dicho test, permite la comparación

entre distintos tratamientos.

En este caso, un grupo de cinco explantes fue una unidad experimental.


La preparación de medios se realizó de igual forma que en el ensayo 1, variando la

composición de los reguladores de crecimiento, que en este caso fue Kinetina y Acido

Jasmónico (AJ), y la concentración de agar que fue de 6.5 g*l-1.

CUADRO 5. Composición de medios de cultivo de establecimiento ensayo2.

MEDIO

NUTRITIVO

CONSTITUCIÓN

Medio 4 (M4) MS (Anexo 1) + 0.01 mg*l-1 de AJ + 4 mg*l-1 de KIN

El medio fue distribuido en frascos medianos de 5 cm de diámetro por 9 cm de alto,

depositando 30 cc en cada uno.


El material utilizado, correspondió al mismo del ensayo 1, además de Leucocoryne cv. Sirius,

cuyos bulbos se mantuvieron bajo las mismas condiciones de almacenaje que los del

mencionado ensayo.

Al momento de la siembra in vitro, se podían observar abundantes lesiones de color café en

la catáfila carnosa más externa, lo que en ajo es evidencia de ataque fungoso, característico

de Penicillium spp.según lo descrito por APABLAZA (2000), además de un severo ataque de

chanchito blanco (Pseudococcus sp.).


En este ensayo se utilizó el mismo protocolo de desinfección utilizado en los bulbos del

ensayo 1, teniendo como precaución mantener separados los dos cultivares, durante todo el

proceso. Para ello se les puso en matraces de 250 ml, identificados con el nombre del cultivar

y el lavado en cámara de flujo, se realizó con agua adicionada con antioxidantes (Ácido

ascórbico y Ácido cítrico, en concentración de 200 g*l-1 cada uno).


1. De cada matraz se tomó cinco bulbos, los que fueron cortados en rebanadas desde el

disco basal hacia arriba, obteniéndose 25 explantes. Los veinte restantes, del mismo

cultivar, se sembraron enteros previa realización de un corte en cruz (“scoring”) en el

disco basal (20 explantes). Estos cortes fueron realizados con bisturí (Número 11) sobre

una placa y luego puestos sobre papel absorbente, para retirar cualquier exceso de agua.

2. Luego cada explante, fue introducido en un frasco que contenía 30 cc de medio, con una

pinza, depositándolo sobre el agar y presionando levemente. Durante este paso, se tuvo la

precaución de que la boca del tubo mirara siempre hacia el fondo de la cámara, de

manera que recibiera solo aire purificado, con el fin de aminorar la posibilidad de

contaminación.

3. Posteriormente, cada tubo fue identificado con el cultivar, el tipo de corte que contenía, y

el número de repetición correspondiente, para luego ser llevados a cámara de

crecimiento, con una temperatura promedio de 23 °C y un periodo de luz de 16 horas,

con una intensidad lumínica de 2000 lux.

Con una periodicidad entre 25 y 30 días, se realizó un transplante a medio fresco.

Con los datos obtenidos en cada frasco, se elaboró una planilla donde se evaluó

contaminación.

3.3. Ensayo 3. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la hoja, sobre

el comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de establecimiento,

multiplicación y engorde del cultivo in vitro:

Este ensayo se inició el 1 de septiembre del 2003.

Los factores analizados correspondieron a los tres medios de cultivo utilizados en el ensayo 1

(M1, M2 y M3) y las tres zonas de la hoja de donde se extrajo explantes, las que fueron: zona

apical, zona media y zona basal, obteniéndose 9 tratamientos. Se evaluó la contaminación

traducida en sobrevivencia, el número de bulbillos generados por explante y el diámetro final

de éstos. La formación o no de tejido calloso, al igual que en los ensayos 1 y 2, se evaluó de

manera descriptiva.


N° DE

TRATAMIENTO

TRATAMIENTO

T1 M1 a

T2 M1 m

T3 M1 b

T4 M2 a

T5 M2 m

T6 M2 b

T7 M3 a

T8 M3 m

T9 M3 b

Donde : a : Explante tomado de la zona apical de la hoja.

m : Explante tomado de la zona media de la hoja.

b : Explante tomado de la zona basal de la hoja.


significancia, con arreglo factorial de 3 x 3, donde la contaminación traducida en

sobrevivencia, medida en porcentaje en cada tratamiento, se analizó mediante test de


entre distintos tratamientos. La unidad experimental fue un explante


Se realizó de la forma descrita en el ensayo 1, utilizándose en este caso tubos, con 7 cc de

medio, y una concentración de agar de 6.8 g*l-1.


El material utilizado, correspondió a 3 hojas de Leucocoryne sp. cv. Caravelle. Los explantes

fueron tomados de los brotes generados por individuos del ensayo 1, al momento del primer

repique. Las hojas, de 8 cm de longitud aproximadamente, fueron cortadas y sembradas de

inmediato, para evitar su deshidratación.

3.3.3. Protocolo de desinfección

En este ensayo no se realizó desinfección del material, ya que provenía de material sano que

se manipuló al interior de la cámara de flujo laminar.


1. Cada hoja fue extraída desde el explante a repicar del ensayo 1 y fueron cortados tres

trozos de la porción apical, tres de la porción media y tres de la porción basal, con bisturí

(Número 11).

2. Luego cada explante (trozo de hoja), de longitud de 2 mm aproximadamente, fue

introducido en un tubo que contenía 7 cc de medio, con una pinza, depositándolo sobre el

agar de manera horizontal y presionando levemente. Durante este paso, se tuvo la

precaución de que la boca del tubo mirara siempre hacia el fondo de la cámara, de

manera que recibiera solo aire purificado, con el fin de aminorar la posibilidad de

contaminación.

3. Posteriormente, cada tubo fue identificado con el medio que contenía, y el número de

repetición correspondiente, para luego ser llevados a cámara de crecimiento, con una

temperatura promedio de 23 °C y un periodo de luz de 16 horas, con una intensidad

lumínica de 2000 lux.

Finalmente, y con una periodicidad entre 25 y 30 días, se realizó un repique. En el caso en

que el tamaño del bulbillo era menor a 2 mm de diámetro se repicó al mismo medio en el que

el explante se había establecido. Al contrario, si el bulbillo era mayor a 2 mm de diámetro se

repicó a medio de engorde.

Con los datos obtenidos en cada frasco, se elaboró una planilla donde se evaluó en primera

instancia, contaminación. Posteriormente, se evaluó, la formación de bulbillos (número de

bulbillos obtenidos por explante) y el diámetro de éstos. Para esto, se utilizó una lupa y un pie

de metro digital. La formación de callo, al igual que en los ensayos anteriores, sólo se

describió.

3.4. Ensayo 4. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la hoja,

utilizando material ex vitro, sobre el nivel de contaminación en el establecimiento de los

explantes:

Este ensayo se inició el 12 de diciembre del 2003.

Los factores correspondieron a los cuatro medios de cultivo a utilizar y las tres zonas de la

hoja de donde se extrajo explantes, las que fueron: zona apical, zona media y zona basal,

obteniéndose 12 tratamientos. Se evaluó la contaminación traducida en sobrevivencia, la

formación o no de tejido calloso, el número de bulbillos generados por explante y el peso

final de éstos.


N° DE

TRATAMIENTO

TRATAMIENTO

T1 M1 A

T2 M1 M

T3 M1 B

T4 M2 A

T5 M2 M

T6 M2 B

T7 M3 A

T8 M3 M

T9 M3 B

T10 M4 A

T11 M4 M

T12 M4 B

Donde : A : Explante tomado de la zona apical de la hoja.

M : Explante tomado de la zona media de la hoja.

B : Explante tomado de la zona basal de la hoja.

Los medios fueron los tres utilizados en el ensayo 1 (medio 1, 2 y 3) y el utilizado en el

ensayo 2 (Medio 4).


significancia, con arreglo factorial de 3 x 4, donde los resultados de contaminación traducidos

en sobrevivencia, medida en porcentaje en cada tratamiento, se analizó mediante test de


entre distintos tratamientos. La unidad experimental fue un explante


Se realizó de la forma descrita en los ensayos 1 y 2, utilizándose en este caso tubos, con 7 cc

de medio, y una concentración de agar de 6.8 g*l-1.


El material utilizado, correspondió a 5 hojas de Leucocoryne purpúrea, de aproximadamente

dos meses de edad, cuyas semillas fueron sembradas el 22 de septiembre del 2003, en

sustrato esterilizado y mantenidos bajo sombreadero en la Facultad de Agronomía, localidad

de La Palma.

Las hojas, de 8 cm de longitud aproximadamente, fueron colectadas el mismo día de la

siembra in vitro, pasando no más de cuatro horas desde su recolección hasta su siembra.


1. Las hojas fueron lavadas, en abundante agua corriente.

2. Una vez lavadas, se les puso en un matraz de 250 ml y fueron sumergidas durante 5

minutos en cloruro de sodio al 1 % adicionado con dos gotas de Tween 20 y con

constante agitación.

3. Finalmente, las hojas fueron lavadas tres veces con agua estéril más antioxidantes, al

interior de la cámara de flujo laminar.

FIGURA 3. Hojas de Leucocoryne purpurea utilizadas como material vegetal en ensayo 4, Quillota 2003.


1. Cada hoja fue extraída desde el matraz, y puesta en placa Petri que contenía una lámina

de 1 a 2 mm aproximadamente de agua bidestilada estéril con antioxidantes. Una vez

sumergida la hoja en dicha lámina de agua, fueron cortados cuatro trozos de la porción

apical, cuatro de la porción media y cuatro de la porción basal, con bisturí (Número 11).

Cada explante tenía una longitud de 2 mm, para posteriormente ser puestos sobre papel

absorbente, para retirar el exceso de agua.

2. Luego cada explante (trozo de hoja), fue introducido en un tubo que contenía 7 cc de

medio, con una pinza, depositándolo sobre el agar de manera horizontal, y presionando

levemente. Durante este paso, se tuvo la precaución de que la boca del tubo mirara

siempre hacia el fondo de la cámara, de manera que recibiera solo aire purificado, con el

fin de aminorar la posibilidad de contaminación.

3. Posteriormente, cada tubo fue identificado con el medio que contenía, y el número de

repetición correspondiente, para luego ser llevados a cámara, con una temperatura

promedio de 23 °C y un periodo de luz de 16 horas, con una intensidad lumínica de 2000

lux.

Posteriormente, y con una periodicidad entre 25 y 30 días, se realizó un repique a medio

fresco.

Con los datos obtenidos en cada frasco, se elaboró una planilla donde se evaluó

contaminación.


bulbificación in vitro, de Leucocoryne purpurea:

Este ensayo se inició el día 12 de diciembre del 2003.


El medio nutritivo usado para la germinación de las semillas, fue el medio basal MS diluido a

la mitad, sin adición de vitaminas, ni de sacarosa. Además se utilizó el medio de

bulbificación utilizado en los ensayos anteriores.


El material utilizado en este ensayo, correspondió a 130 semillas de Leucocoryne purpurea,

cosechadas en noviembre del año 2002, y almacenadas a temperatura ambiente, hasta la

ejecución de este ensayo, de las cuales 115 fueron sembradas en un medio llamado de

germinación y las 15 restantes fueron sembradas directamente en medio enriquecido con

sacarosa (bulbificación).


Las semillas fueron introducidas a un matraz, donde se les adicionó unas gotas de Tween 20,

y se les sumergió durante 10 minutos en hipoclorito de sodio al 1 %, para luego, ser lavadas

tres veces con agua destilada estéril, al interior de la cámara de flujo laminar.


Cada semilla fue introducida en un tubo de 2.5 cm de diámetro por 6 cm de altura, que

contenía aproximadamente 7 cc de medio, con todas las medidas que aseguraran una mínima

posibilidad de contaminación.

Posteriormente, y una vez sellados los tubos, fueron llevados a cámara en condiciones de

oscuridad, con temperatura de 10° C. Una vez emitida la radícula, y teniendo esta una

longitud de aproximadamente 2 a 3 mm, fueron trasladados a una cámara de crecimiento, con

una temperatura de 23 °C y con 16 horas de luz, con una intensidad de 2000 lux.

Una vez alcanzado un porcentaje de germinación cercano al 90 %, las plántulas, con un

crecimiento aproximado de 5 cm fueron repicadas a un medio de bulbificación (medio de

engorde utilizado en los ensayos 1, 2 y 3).

El porcentaje de germinación, se midió diariamente y el de bulbificación cada una semana.

4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

4.1. Ensayo 1. Efecto de tres medios de cultivo y uso de mitad de bulbo obtenido por corte

longitudinal como explante, sobre el comportamiento y formación de bulbillos en las

etapas de establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo in vitro:

4.1.1 Análisis de la variable contaminación

La gran limitante en el establecimiento in vitro de los explantes en este ensayo, resultó ser la

contaminación fungosa. Esta, fue de fácil determinación, ya que el signo que se presentó,

concordó con lo expuesto por APABLAZA (2000), para el genero Penicillium descrito para

ajo (Allium sativum), ya que en primer lugar se observó micelio de color blanco, que

posteriormente esporuló, mostrando un moho de color verde azulado.

Del análisis de varianza de los porcentajes de contaminación con hongos, se desprende que

no existe efecto de los tratamientos sobre dicha variable. A continuación, en el Cuadro 8 se

presentan los resultados de este análisis.

CUADRO 8. Porcentaje de explantes de Leucocoryne sp. cv. Caravelle, contaminados con

hongo, por tratamiento. Quillota 2003.

Porcentaje de explantes con contaminación fungosa

Tratamiento

Número de

Explantes

sembrados

Día 15

Día 30

Día 45

Día 60

M1 40 55 62.5 62.5 62.5

M2 40 55 60 60 62.5

M3 40 35 37.5 40 42.5

Se realizó cuatro evaluaciones en el tiempo, debido a que se observó que la contaminación

seguía expresándose durante un periodo prolongado. El hecho de que al día 60 siguieran

apareciendo explantes contaminados, podría indicar que el inóculo tuvo su origen en el

explante y no en un error de manipulación.

Cabe señalar, que gran parte del material utilizado, tal como se describió en el capítulo

anterior, presentaba lesiones color café hendidas en la catáfila carnosa más externa, que en

ajo evidencia ataque de Penicillium sp. (APABLAZA, 2000) y en un número importante de

explantes, el crecimiento del micelio tenía en dichas lesiones su punto de partida. En otros

casos, la contaminación partía del disco basal o bien en el agar, alrededor del explante. Esto

contrasta con lo presentado por BRIONES (2003), quien en un trabajo con Leucocoryne

coquimbensis y L. purpurea obtuvo entre un 13 y un 20 % de contaminación por bacterias,

siendo en su caso el ataque fungoso despreciable.

En este ensayo, no se detectó visualmente otro tipo de hongo que contaminara los explantes,

y el ataque bacteriano fue bajo y se presentó con posterioridad a la sexta semana (datos no

presentados).

4.1.1 Análisis de la variable rendimiento y diámetro de bulbillos obtenidos

Esta variable fue medida al final del ensayo.

Para ello, se utilizó los explantes que permanecieron sanos, y considerando que el nivel de

contaminación fue alto, se decidió que cada explante representara una repetición.

En el cuadro siguiente se muestra el rendimiento promedio obtenido en cada uno de los

tratamientos.

CUADRO 9. Efecto de tres medios de cultivo sobre el rendimiento y el diámetro de los

bulbos obtenidos de Leucocoryne sp. cv. Caravelle, Quillota 2003.

Tratamiento

Número de

Explantes

Rendimiento

(N° de bulbillos /

explante)

Diámetro bulbillos

(mm)

M1 8 8.38 6.15

M2 8 17 7.94

M3 8 7 7.89

El análisis de varianza de la variable número de bulbillos obtenidos por explante, arrojó que

no habría efecto de los tratamientos, es decir, los explantes respondieron favorablemente en

los tres medios de cultivo utilizados. Esto es importante de destacar, ya que cabe recordar que

la elección de los medios se realizó sobre la base de trabajos realizados en ajo (Allium

sativum). De lo que se podría inferir, que los medios de cultivo utilizados para dicha especie,

son convenientes para el establecimiento y propagación de Leucocoryne sp.

Así mismo, el análisis estadístico de la variable diámetro de los bulbillos obtenidos, tampoco

arroja diferencias entre los distintos medios, fluctuando entre 6 y 7 mm de diámetro, lo que al

ser relacionado con el peso, los sitúa en un rango apto para florecer en la temporada siguiente

según MANSUR et al. (2002) y OHKAWA (1999), quienes indican que un bulbo con peso

superior a 0.3 gr puede ser catalogado como bulbo floral.

Respecto de la formación de bulbillos, como se puede apreciar en la Figura 4, ésta se

desarrolló de manera muy diversa en los distintos explantes, no mostrando un patrón

uniforme de brotación. En algunos casos los bulbillos se generaron en el disco basal, en otros

en la parte apical del bulbo partido longitudinalmente (explante) así como en otras porciones

del explante. O bien, el bulbillo se formó a partir del engrosamiento de una catáfila interna.

FIGURA 4. Las fotos a, b, c, d, e y f muestran las distintas formas de generación de bulbillos

de Leucocoryne sp. cv. Caravelle, en la etapa de multiplicación del medio 1 (b),

medio 2 (d) y medio 3(a, c, d, f), en el ensayo 1. Quillota 2003.

a b c d e

a b

c d

e f

FIGURA 5. Aspecto de bulbillos, provenientes de explantes de Leucocoryne sp. cv. Caravelle

sembrados en el medio 2, engordando en medio MS suplementado con 60 g*l-1

de sacarosa, en el ensayo 1. Quillota 2003.

FIGURA 6. Aspecto de tejido calloso generado en explantes de Leucocoryne sp. cv.

Caravelle establecidos en medio 3, en el ensayo 1. En la foto c, puede apreciarse

los pelos radiculares que se generaron a partir del callo. Quillota 2003.

a

b

c

En cuanto a la formación de tejido calloso, variable que solo fue abordada de manera

descriptiva, se observó su formación en distintas proporciones dependiendo del medio de

cultivo en el cual se desarrolló el explante. En el medio en que menos se observó fue en el

medio 1 y por el contrario, la mayor cantidad de tejido de callo se observó en el medio 3

(Figura 6). Esto concuerda con lo señalado con DIXON (1994) y JIMENEZ (1998), que ven

favorecida la callogénesis con una relación auxina/citoquinina mas favorable a la primera, ya

que el medio 3 constó de medio MS, suplementado con 0.1 mg*l-1 de ANA y 0.1 mg*l-1 de

KIN, en contraste con el medio 1 que fue suplementado con 0.1 mg*l-1 de ANA y 4 mg*l-1 de

KIN, inclinando notablemente la relación a favor de la citoquinina.


comportamiento en la etapa de establecimiento de cultivo in vitro:

4.2.1. Análisis de la variable contaminación

De igual forma que en el ensayo 1, el principal problema en el establecimiento de los

explantes, fue la contaminación por hongos. A continuación en el Cuadro 10, se detallan los

resultados obtenidos.

CUADRO 10. Porcentaje de explantes de Leucocoryne sp. cv. Caravelle contaminados con

hongo, por tratamiento. Quillota 2003.


Tratamiento

Número de

Explantes

sembrados

Día 20

Día 40

Día 60

Caravelle+ Reb. 25 48 76 96

Caravelle + Scor. 25 48 76 96

Sirius + Reb. 25 40 72 92

Sirius + Scor. 25 48 76 100

FIGURA 7. Signo de la contaminación fungosa provocada por Penicillium sp. en explantes a

partir de bulbos de Leucocoryne sp. cv. Sirius(corte en rebanada), en ensayo 2.

Quillota 2003.

El análisis de varianza de los porcentajes de contaminación, indicó que no existe efecto de los

tratamientos sobre la variable en estudio. El signo, fácilmente visible, al igual que el ensayo

anterior, correspondió a un moho verde azulado, previo crecimiento de micelio blanquecino

(Figura 7).

Es importante destacar, que el estado sanitario de los bulbos utilizados en este ensayo, se

encontraba lejano al óptimo, ya que se observó deshidratación en los bulbos, lesiones café

hendidas en las catáfilas más externas (síntoma de Penicillium sp. en ajo) y ataque severo de

chanchito blanco, al momento de la siembra de explantes, debido a que correspondían a

descarte de bulbos plantados en dicha temporada (2003).

Aún cuando el ataque fungoso fue severo, pasado un periodo prolongado de tiempo (60 días),

siguieron apareciendo explantes contaminados, lo que podría indicar que el inóculo es

endógeno al explante, y la contaminación, en gran parte, no se debería a una manipulación

inadecuada.

Esto, evidenciaría la importancia de lo señalado por MROGINSKI (1991), PIERIK (1990) y

HARTMANN y KESTER (1995), respecto de la sanidad del material a propagar, de manera

de asegurar un buen establecimiento de los explantes.

4.3. Ensayo 3. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la hoja, sobre

el comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de establecimiento,

multiplicación y engorde del cultivo in vitro:

4.3.1 Análisis de la variable contaminación

En este ensayo, se pudo observar un bajo porcentaje de contaminación. A continuación, en el

Cuadro 11, se presentan los datos relacionados con esta variable.

CUADRO 11. Porcentaje de contaminación fungosa en explantes provenientes de hoja de

individuos de Leucocoryne sp. cv. Caravelle en etapa de multiplicación in

vitro. Quillota 2003.


Tratamiento

Número de

Explantes

sembrados

Día 30

Día 60

Día 90

Día 120

M1 a 3 0 0 0 33.33

M1 m 3 0 0 0 0

M1 b 3 0 0 0 0

M2 a 3 0 0 0 0

M2 m 3 0 33.33 33.33 66.67

M2 b 3 0 0 0 0

M3 a 3 0 0 0 0

M3 m 3 0 0 33.33 33.33

M3 b 3 0 0 33.33 33.33

El análisis de varianza estadístico, indicó que no existiría diferencia significativa entre los

tratamientos, respecto de la variable contaminación.

En este ensayo, a diferencia de los anteriores, los niveles de contaminación son bastante más

bajos y se presentan con posterioridad, a los cincuenta días después de la siembra de los

explantes. Esto puede deberse principalmente a dos aspectos. El primero de ellos es que el

material utilizado provenía de individuos que se mantuvieron sanos durante su etapa de

establecimiento in vitro, en el ensayo 1, y la manipulación de los explantes se realizó siempre

al interior de la cámara de flujo laminar, por lo que la posibilidad de contaminación externa

se minimizó de manera importante. El segundo aspecto, es que como indica ALISTER

(1998), en el caso del cultivo in vitro de Lilium, la mejor respuesta respecto de la

contaminación se obtiene con explantes provenientes de la zona aérea de la planta, ya que

cuando estos provienen de órganos subterráneos, dicho porcentaje aumenta notablemente,

debido al contacto de estos con el suelo y los microorganismos allí existentes.

4.3.1. Análisis de la variable rendimiento y diámetro de bulbillos obtenidos

A partir del análisis de varianza de estas variables, se determinó que existieron diferencias

significativas entre los tratamientos para éstas, como se muestra en el Cuadro 12.

CUADRO 12. Efecto de tres medios de cultivo y distinta zona de origen del explante dentro

de la hoja de Leucocoryne sp. cv. Caravelle, sobre el rendimiento y el

diámetro de los bulbos obtenidos in vitro. Quillota 2003.

Tratamiento

Número de

Explantes

Rendimiento

(N° de bulbillos /

explante)

Diámetro bulbillos

(mm)

M1 a 3 0 b 0 b

M1 m 3 0 b 0 b

M1 b 3 2 a 2.9 a

M2 a 3 0 b 0 b

M2 m 3 0 b 0 b

M2 b 3 0 b 0 b

M3 a 3 0 b 0 b

M3 m 3 0 b 0 b

M3 b 3 0 b 0 b

Letras iguales en las columnas indican que no existe diferencia estadística significativa entre

los tratamientos según el test de Student Newman Keuls, con un 5 % de significancia.

La formación de los bulbillos se observó aproximadamente un mes después de la siembra de

los explantes, por lo que se podría decir que, en general, y bajo las condiciones en las que se

desarrolló este ensayo, ese sería el tiempo suficiente para que ocurra la organogénesis (Figura

8).

FIGURA 8. Aspecto de formación y engorde de bulbillos a partir de explante de hoja de

Leucocoryne sp. cv. Caravelle en ensayo 3, Quillota 2003.

a) Explante con formación de bulbillos, 44 días después de la siembra. b)

Ampliación de a. c) Explante a los 30 días posteriores a la siembra. d) Explante

en etapa de multiplicación. e) Aspecto de un bulbo en medio MS suplementado

con 60 mg*l-1 de sacarosa.

a b

c d

c d

e

Al analizar las variables, se puede advertir que sólo en uno de los tratamientos efectuados, se

obtuvo respuesta, correspondiendo a la utilización del medio 1 y uso de la porción basal de la

hoja. Un aspecto destacable de esta situación, es que con este medio no se observó una

presencia notable de tejido calloso. Se pudo observar la generación de los bulbillos

directamente del trozo de hoja y no de este tipo de tejidos, lo que según MARGARA (1998),

sería una ventaja, ya que cuando se generan plantas a partir de callo, se facilita la aparición de

variantes, sobre todo si se utilizan mezclas complejas de reguladores de crecimiento.

Por otra parte, el diámetro promedio obtenido es de 2.9 mm, esto en 6 meses de cultivo in

vitro.

Respecto a la formación de tejido calloso, ésta fue baja y se pudo observar sólo en explantes

provenientes de la zona basal de la hoja. Esta respuesta, en conjunto con el análisis anterior

hacen pensar en una posible diferencia histológica dentro de la misma hoja, que promueve

distintas respuestas dependiendo de la zona de donde se extrae el explante.

3.6. Ensayo 4. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la hoja,

utilizando material ex vitro, sobre el nivel de contaminación en el establecimiento de los

explantes:

4.4.1. Análisis de la variable contaminación

En este ensayo, el análisis de varianza no arrojó diferencias entre los tratamientos, en el caso

de contaminación provocada por hongos. No así en el caso de contaminación provocada por

bacterias, donde sí se mostraron diferencias significativas.

CUADRO 13. Efecto de cuatro medios de cultivo y distinta zona de origen del explante

dentro de la hoja de Leucocoryne purpurea, sobre la contaminación con

hongos. Quillota 2003.

Porcentaje de explantes con contaminación

Provocada por hongos Provocada por bacterias

Tratamiento

Número de

Explantes

sembrados Día 20 Día 40 Día 60 Día 20 Día 40 Día 60

M1 A 4 25 25 25 0 b 25 b 25 b

M1 M 4 0 0 0 0 b 0 c 0 c

M1 B 4 25 25 25 0 b 25 b 25 b

M2 A 4 0 0 0 0 b 25 b 25 b

M2 M 4 25 25 50 0 b 0 c 0 c

M2 B 4 25 25 25 0 b 25 b 25 b

M3 A 4 25 25 50 0 b 25 b 25 b

M3 M 4 0 0 0 0 b 0 c 0 c

M3 B 4 50 50 50 0 b 0 c 0 c

M4 A 4 25 25 25 0 b 25 b 25 b

M4 M 4 25 25 25 0 b 0 c 0 c

M4 B 4 25 25 25 25 a 50 a 75 a

Letras iguales en las columnas indican que no existe diferencia estadística significativa entre

los tratamientos según el test de Student Newman Keuls, con un 5 % de significancia.

En este caso, la contaminación fungosa se presentó desde las primeras semanas después de la

siembra de explantes, manteniéndose relativamente constante, por lo que se podría atribuir a

que el protocolo de desinfección no fue él mas adecuado. Sin embargo, estos niveles de

contaminación son menores a los detectados en el caso de uso de explante proveniente de

bulbo, lo que sin duda corrobora lo concluido por ALISTER (1998) respecto al efecto del

origen del explante sobre la variable contaminación.

En cuanto a la contaminación producida por bacterias, del análisis se desprende que el mayor

porcentaje de contaminación bacteriana, se produce en el tratamiento 12. Esto podría

explicarse por el origen del explante, ya que al ser de la zona basal de la planta, estuvo en

contacto directo con el suelo y sus microorganismos. Esta situación se repite, con menor

incidencia, en los tratamientos donde el explante provenía de la misma zona. En el caso de

los tratamientos donde los explantes provenían de la zona media de la hoja, no hubo

contaminación bacteriana, lo que en concordancia con lo anterior, se debería a que esta

porción se encuentra más distante del suelo, sin tener un contacto directo con él durante el

cultivo ex vitro. Sin embargo, los resultados de los tratamientos 1, 4, 7 y 10 se contradicen

con lo anterior, ya que dichos explantes fueron tomados de la zona apical de la hoja, es decir,

la zona más distante del suelo, y se mantuvo una contaminación bacteriana de un 25 %,

donde bajo lo anteriormente expuesto, no se esperaría detectar contaminación.


bulbificación in vitro, de Leucocoryne purpurea:

El porcentaje de germinación fue medido diariamente. Al observar la Figura 9 es posible

apreciar la tendencia en la germinación de Leucocoryne purpurea en el tiempo, en

condiciones de oscuridad y a una temperatura de 10 °C, sembradas en medio de germinación.

En el caso de las semillas sembradas en medio de germinación y mantenidas a una

temperatura de 23 °C, no hubo germinación.

Así mismo, en las semillas sembradas directamente en medio de bulbificación (MS

suplementado con 60 g*l-1 de sacarosa), tampoco se produjo germinación, pero si hubo

imbibición, con un aumento en las dimensiones de las semillas considerable respecto de las

sembradas en medio de geminación. Al realizar un corte transversal a la semilla bajo la lupa,

se pudo notar que el proceso germinativo se encontraba gatillado, ya que se observaba

fácilmente la radícula bien formada (Figura 10 foto f). Esto podría deberse a que la alta

concentración de azúcar actúo de manera tal que lo que se efectuó fue un acondicionamiento

FIGURA 9. Curva de germinación in vitro de Leucocoryne purpurea a 10 °C de temperatura

y condición de oscuridad. Quillota 2003.

0 0 2

6

20

42

50

66

74 76 76 76

82 82

86

90 91

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Día

Porc

enta

je

FIGURA 10. Apectos Leucocoryne purpurea en ensayo 5. Quillota 2003.

a) Material vegetal utilizado en el ensayo. b) Plántula, 6 días post-germinación.

c) Estado de plántula al momento de repique a medio de engorde. d) Plántula

con dos semanas en medio de engorde. e) Comparación entre semilla sembrada

en medio de bulbificación(flecha roja) y semilla sembrada en medio de

germinación (flecha azul). f) Semilla sembrada en medio de bulbificación no

germinada, vista a la lupa.

a

a

a

b

c

d

e f

osmótico, técnica utilizada en la producción de semillas con el fin de gatillar el proceso

germinativo, de manera de uniformar la germinación en condiciones de campo.

Plántulas normales, según BESNIER (1989), son aquellas que tienen un sistema radicular

bien desarrollado, un eje caulinar con hipocotilo o epicotilo bien desarrollado y una yema

terminal, además de dos cotiledones (en el caso de las dicotiledóneas). Por el contrario, el

mismo autor se refiere a plántulas anormales como aquellas que no parecen dar origen a

plantas normales por falta de estructuras esenciales o porque están dañadas, plántulas

deformes o desequilibradas, o con desarrollo débil. En este ensayo el 100 % de las semillas

germinadas dieron origen a plántulas normales.

En el caso de la bulbificación, el cambio a un medio MS suplementado con sacarosa tuvo un

efecto positivo, ya que desde la primera semana se detectó un ensanchamiento en la base del

cuello de las plántulas, en un 34.1 % de los individuos, aumentando de manera gradual hasta

obtener, en cinco semanas, un 62.6 % de las plantas germinadas bulbificadas, tendencia que

puede observarse en la Figura 11.

Finalmente, el diámetro ecuatorial del bulbo, promedio, alcanzado en esas cinco semanas fue

de 2.73 mm (Figura 12). Esto concuerda con los resultados obtenidos por BRIONES (2003),

quien obtuvo un diámetro ecuatorial del bulbo de 2.4 mm en seis semanas, pero con una

mayor concentración de sacarosa (90 – 120 g*l-1 sacarosa). De este último resultado se

desprende que, si bien es cierto el tamaño obtenido no corresponde a un bulbo floral, sí es

posible disminuir de manera importante el tiempo transcurrido desde germinación hasta

bulbificación y posterior receso, durante el primer ciclo de vida de esta especie, ya que

MANSUR et al. (2002) señala que en condiciones naturales este primer ciclo tiene una

duración de alrededor de 100 días.

FIGURA 11. Curva de bulbificación in vitro, Leucocoryne purpurea. Quillota 2003.

34.1

47.3

58.2 61

.5

62.6

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4 5

Semana

Porc

enta

je

FIGURA 12. Curva de crecimiento promedio de bulbos engordados a partir de semilla de

Leucocoryne purpurea, en condiciones in vitro. Quillota 2003.

1.25

1.73 1.

9

2.2

2.73

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

1 2 3 4 5

Semana

Diá

met

ro e

cuat

oria

l (m

m)

5. CONCLUSIONES

Es posible la obtención de una metodología de propagación in vitro para Leucocoryne spp.

utilizando la técnica de micropropagación, en las etapas de establecimiento, proliferación y

engorde.

Los tres medios de cultivo utilizados (M1, M2 y M3 constituidos por medio MS

suplementado con distintas concentraciones de ANA y KIN) resultaron favorables para el

establecimiento y multiplicación de los explantes, cuando estos fueron trozos de bulbos

(mitad de bulbo). Por el contrario, cuando los explantes provenían de las distintas porciones

de la hoja (apical, media y basal), sólo se observó una respuesta favorable con el medio 1(MS

suplementado con 0.1 mg*l-1 de ANA y 4 mg*l-1 de KIN).

El origen del explante, determinó fuertemente el nivel de contaminación en la etapa de

establecimiento, siendo éste mayor en explantes provenientes de bulbo. En explantes

provenientes de la parte aérea de la planta (hoja), el nivel de contaminación fue menor.

Respecto del rendimiento obtenido (número de bulbillos por explante) la tasa fue mayor en

explantes provenientes de bulbo. Así también, explantes provenientes de la zona basal de la

hoja, tendrían un mayor potencial para generar bulbillos, en relación con explantes

provenientes de otras porciones de hoja.

La germinación y posterior bulbificación, in vitro, logran acortar de manera importante el

primer ciclo de la planta de Leucocoryne sp., respecto del ciclo natural de individuos de este

género.

6. RESUMEN El género Leucocoryne, endémico de Chile, posee características muy particulares que le aportan un potencial y una proyección importante en el mercado, como flor de corte y / o aplicaciones en paisajismo, y el cultivo in vitro representa una alternativa para la propagación masiva del material vegetal. Es por eso que en el Laboratorio de Propagación de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso se realizó una investigación con el fin de determinar un protocolo de propagación in vitro de Leucocoryne spp. Se logró establecer un protocolo de propagación in vitro, donde se utilizó como material vegetal bulbos de Leucocoryne sp. cultivar Caravelle y Sirius, y hojas de Leucocoryne purpurea, desde donde se extrajo los explantes. En el caso de bulbo, el explante correspondió a la mitad de éste, obtenido mediante un corte longitudinal. Por otro lado, de hoja se extrajo tres tipos de explantes, los que se determinaron, según su ubicación en la hoja, en zona apical, zona media y zona basal. En cuanto a la contaminación esta resultó ser menor en explantes provenientes de hoja, ya que en el uso de trozo de bulbo, la contaminación fungosa fue una limitante importante en el establecimiento de los explantes. Respecto del rendimiento obtenido (Bulbos obtenidos por explante), fue mayor en el caso de trozo de bulbo como explante. Cabe destacar, que cuando se utilizó trozo de hoja como explante, en los únicos que se obtuvo respuesta fue en aquellos provenientes de la zona basal de ésta. Se probó el efecto de distintos medios de cultivo, constituidos por medio MS suplementado con ANA y KIN en distintas concentraciones, y en el caso de explantes provenientes de bulbo, los tres medios utilizados fueron favorables para el establecimiento y proliferación in vitro. En el caso de explantes provenientes de hoja, el único medio donde se observó respuesta fue en el medio 1 (MS suplementado con 0.1 mg*l-1 de ANA y 4 mg*l-1 de KIN). Para la tercera etapa in vitro, llamada de engorde (o bulbificación) se utilizó un medio MS adicionado con 60 g*l-1 de sacarosa. Los calibres obtenidos en el caso de los bulbos provenientes de explantes extraídos de bulbos, los sitúa en calibres de bulbo de tamaño floral. No así los obtenidos de explantes aéreos. Finalmente, se caracterizó la germinación y bulbificación in vitro, de Leucocoryne purpurea, donde se obtuvo un 91 % de germinación, un 100 % de plántulas normales, un 62.6 % de bulbificación y un diámetro ecuatorial del bulbo final de 2.79 mm, promedio. Los dos últimos parámetros, obtenidos en cinco semanas de cultivo en medio de engorde (medio MS adicionado con 60 gr / l de sacarosa), lo que indica que puede acortarse de manera importante el primer ciclo de vida de esta especie, respecto con el ciclo natural desarrollado bajo las condiciones climáticas normales que afectan el territorio donde este género puede encontrarse.

7. ABSTRACT The Chilean endemic genus Leucocoryne has distinctive features that make it interesting for use as a cut flower and as a garden plant, with a great market potential. In vitro techniques could allow mass propagation of select genotypes. In order to develop a protocol for in vitro propagation of this genus, a series of experiments were carried out in the Plant Propagation Laboratory at the Faculty of Agricultural Sciences of the Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. A laboratory protocol for in vitro propagation was developed, obtaining explants from bulb tissue of the Leucocoryne sp. ‘Caravelle’ and ‘Sirius’, as well as leaf tissue from Leucocoryne purpurea. Bulb explants were prepared by lengthwise sectioning of the structure, obtaining two halves. Leaf explants were prepared from the apical, intermediate and basal regions of the leaf. Explant establishment was curtailed by contamination. Fewer losses were oserved when using leaf explants, while bulb explants were severely infected by fungi. With regards to propagation efficiency, defined as the number of bulb obtained from each explant, it was greater when using bulb tissue. Only basal leaf explants were succesful. Several culture media were tested, using an MS salt solution supplemented with NAA and kinetin in several concentrations. Bulb explants showed good results in all of the three culture media tested, used for both for the establishment and in vitro proliferation stages. Leaf explants showed a positive response only when using Medium 1 (MS supplemented with 0.1 mg*l-1 NAA and 4 mg*l-1 kinetin). The third in vitro stege, named enlarging (or bulbing) was done with MS medium suppemented with 60 g*l-1 sucrose. When using bulb explants, the bulbs obtained a size adequate for flowering, while the bulbs derived from leaf explants were smoller. In another experiment, in vitro seed germination was studied in Leucocoryne purpurea. Up to 91% germination was observed, with 100% of normal plants. After five weeks of culture in a bulb-inducing medium (60 g*l-1 sucrose), 62.6% bulbing was observed, with an average bulb equatorial diameter of 2.79 mm. These results suggest that the first growing cycle in this species could be substantially shortened, as compared to its normal cycle in the natural enviroment in which this genus is found.

8. LITERATURA CITADA

ALISTER, P. 1998. Producción de plantas de Lilium libres de virus. Taller de Licenciatura. Ing. Agr. Quillota, Universidad Católica de Valparaíso. Facultad de Agronomía. 44p.

APABLAZA, G. 2000. Patología de Cultivos Epidemiología y Control Holístico. Santiago,

Universidad Católica de Chile. 347p. BHOJWANI, M. W. 1980. In vitro propagation of garlic by shoot proliferation. Scientia

Horticulturae. 13:47-52 BESNIER, F. 1989. Semillas Biología y Tecnología. Madrid, Mundiprensa. 637p. BRIDGEN, M., OLATE, E. y SCHIAPPACASSE, F. 2002. Flowering geophytes from

Chile. Acta Horticulturae. 570:75-79 BRIONES, C., 2003. Parte I: Métodos de esterilización y efectos ambientales sobre el

crecimiento de bulbos de Leucocoryne sp. en cultivo in vitro Parte II: Propagación in vitro y ex vitro de un olivo de Getsemaní. Proyecto de titulo. Ing. Agr. Santiago, Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Agronomía y Ciencias Forestales. 28p.

BOUTHERIN, D. y BRON, G. 1994. Multiplicación de plantas hortícolas. Zaragoza,

Acribia. 225p. CAPOTE, A. 1993. Estudio del comportamiento in vitro de cultivares cubanos de cebolla

(Allium cepa L.). Tesis. Doctor en Ciencias Biológicas. Resumen. La Habana, Universidad de La Habana. Facultad de Biología. 35p.

COLLINS, M. y DIXON, K.W. 1992. Micropropagation of an Australian terrestrial orchid

Diuris longifolia R. Br. Australian Journal of Experimental Agriculture. Vol(32): 131-135.

CORPORACIÓN NACIONAL FORESTAL. 1989. Libro rojo de la flora terrestre de Chile. Santiago. CONAF. 157p.

DIXON, R.A. 1994. Plant cell culture. A practical approach. New York. IRL Press Oxford

University. 230p. HARTMANN, H. y KESTER, D. 1995. Propagación de plantas. México D.F. Compañía

editorial Continental. 760p. HERNANDEZ, R., PRADO, O., GIL, V., PEREZ, J., RUÍZ, M., FONT, C. 1994.

Producción de ajo (Allium sativum L.) libre de virus mediante cultivo de meristemos. Centro Agrícola 21(1): 76-84

HOFFMAN, A. 1995. Flora silvestre de Chile zona central. Santiago. Fundación Claudio

Gay. 254p. HOPKINS, W. 1999. Introduction to Plant Physiology Second Edition. New York. John

Wiley & Sons, Inc. 495p. IZQUIERDO, H. 2000. Propagación in vitro de genotipos cubanos de ajo (Allium sativum

L.). Tesis Master en Biología Vegetal. La Habana, Universidad de La Habana. 92p.

IZQUIERDO O., H. y QUIONES O., Y. Marzo 2003. Obtención de semilla de ajo, (on

line). www.utm.mx/temas-docs/nfnotas15R2.pdf JIMENEZ, E. 1998. Cultivo de ápices y meristemos. In: Perez, J. (Ed). Propagación y

mejora genética de plantas por biotecnología. Santa Clara, IBP. pp.45-56 KITTO, S.L. 1997. Comercial micropropagation. HortScience 32 (6): 1-3 LANGENS, M. 2001. Progress in tissue culture techniques for propagation of tulips.

Flower Tech. 4 (8): 22-24.

MANSUR, L., ZOELLNER, O., RIEDEMANN, P., VERDUGO, G., HARRISON, C. 2002. Leucocoryne, un género nativo chileno y su uso como planta de jardín. Valparaíso, Oficina de Transferencia Tecnológica Universidad Católica de Valparaíso. 49p.

MARGARA, J. 1988. Multiplicación vegetativa y cultivo in vitro. Los meristemos y la

organogénesis. Madrid, Mundi-prensa. 232p. MARRERO, D. y AGRAMONTE, D. 1994. Obtención de plantas de ajo (Allium sativum

L.) a partir del cultivo de callos. Cultivos Tropicales 15 (3): 97 MROGINSKI, L. 1991. Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales in vitro. In: Roca,

W. y Mroginski, L. (Eds). Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y aplicaciones. Cali, Centro Internacional de Agricultura Tropical. pp.10-12

OHKAWA, K. 1999. Propagación y control de la floración de Zephyra y Leucocoryne.

FIA. Los geófitos nativos y su importancia en la floricultura. Talca, 12 noviembre

1999. 27-40.

PIERIK, R. 1990. Cultivo in vitro de plantas superiores. Madrid, Mundiprensa. 326p. RAVNIKAR, M., ZEL, J., PLAPER, I. Y SPACAPAN, A. 1993. Jasmonic acid stimulates

shoots and bulb formation of garlic in vitro. Journal of Plant Growth Regulation. 12: 73-77.

ROCA, W. 1991. Establecimiento de un cultivo de tejidos vegetales. In: Roca, W. y

Mroginski, L. (Eds). Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y

aplicaciones. Cali, Centro Internacional de Agricultura Tropical. pp.2-17.

SAFFIE, D. 2002. Aclimatación de plantas de vid (Vitis vinifera) propagadas in vitro. Taller

de Licenciatura. Quillota, Universidad Católica de Valparaíso. 47p. SALISBURY, F. y ROSS, C. 1994. Fisiología vegetal. México D.F., Iberoamérica. 759p.

SCHIAPPACASSE, F., YAÑES, P. y PEÑAILILLO, P. 1999 Propagación de geófitos

nativos. FIA. Los geófitos nativos y su importancia en la floricultura. Talca. 12

noviembre 1999. 11-26.

SUN YOO, K., PIKE, L. and GREG C., B. 1990. Promotion of in vitro leaf growth of inner

scales excised from dormant onion bulbs. HortScience. 25(2): 228-229.

WALKEY, D., WEBB, M.J., BOLLAND, C. and MILLER, A. 1987. Production of virus-

free garlic (Allium sativum L.) by meristem-tip cultura. Journal of Horticultural

Science 62 (2): 211-220.

ZOELLNER, O. 1972. El género Leucocoryne. Anales del Museo de Historia Natural. 5:9-

83.

ANEXOS

ANEXO 1. Composición medio nutritivo MURASHIGE y SKOOG, 1962 Código solución

madre Constitución Concentración

solución madre (g/l)

Volumen para preparación de

1 l de medio (ml/l)

Concentración final del medio

(mg/l)

Macroelementos

I NH4NO3 330 5 1650 II KNO3 190 10 1900 III KH2PO4 34 5 170 IV MgSO47H2O 74 5 370 V CaCl22H2O 88 5 440

Microelementos VI KI 0.166 5 0.83

H3PO3 1.24 5 6.2 ZnSO44H2O 2.12 8.6 MnSO44H2O 3.38 22.3

VII CuSO45H2O 0.01 2.5 0.025 VIII Na2MoO42H2O 0.05 5 0.25 IX CoCl26H2O 0.01 2.5 0.025

X Na2EDTA 7.46 5 37.3 FeSO47H2O 5.56 27.8

Vitaminas XI Tiamina HCl 0.02 0.5 0.1 XII Piridoxina 0.1 2.5 0.5 XIII Ác. Nicotínico 0.1 2.5 0.5

Sacarosa: 30 g*l-1 de medio

ANEXO 2. Composición medio nutritivo MURASHIGE y SKOOG (1962), modificado para

bulbificación.

Código solución

madre Constitución Concentración

solución madre (g/l)

Volumen para preparación de

1 l de medio (ml/l)

Concentración final del medio

(mg/l)

Macroelementos

I NH4NO3 330 5 1650 II KNO3 190 10 1900 III KH2PO4 34 5 170 IV MgSO47H2O 74 5 370 V CaCl22H2O 88 5 440

Microelementos VI KI 0.166 5 0.83

H3PO3 1.24 5 6.2 ZnSO44H2O 2.12 8.6 MnSO44H2O 3.38 22.3

VII CuSO45H2O 0.01 2.5 0.025 VIII Na2MoO42H2O 0.05 5 0.25 IX CoCl26H2O 0.01 2.5 0.025

X Na2EDTA 7.46 5 37.3 FeSO47H2O 5.56 27.8

Vitaminas XI Tiamina HCl 0.02 0.5 0.1 XII Piridoxina 0.1 0.5 XIII Ác. Nicotínico 0.1 0.5

Sacarosa: 60 g*l-1 de medio

ANEXO 3. Rendimiento obtenido en ensayo 1, a partir de explantes de bulbos de Leucocoryne sp. cv. Caravelle. Quillota 2003.

Repetición Número de bulbillos / explante

Medio 1 Medio 2 Medio 3 1 16 27 21 2 2 60 13 3 5 12 1 4 7 7 12 5 15 9 3 6 18 18 1 7 3 2 2 8 1 1 3

ANEXO 4. Diámetro ecuatorial de bulbos obtenidos en ensayo 1, a partir de explantes de bulbos de Leucocoryne sp. cv. Caravelle. Quillota 2003.

Repetición Diámetro ecuatorial de bulbo (mm)

Medio 1 Medio 2 Medio 3 1 5.33 6.45 5.07 2 7.86 5.99 5.83 3 4.60 5.12 14.38 4 5.94 7.33 6.08 5 6.18 6.71 6.27 6 5.95 5.56 14.27 7 3.10 10.18 5.32 8 10.21 16.19 5.93

ANEXO 5. Rendimiento ensayo 3, a partir de explantes de hojas de Leucocoryne sp. cv. Caravelle. Quillota 2003.

Tratamiento Número de bulbillos / explante

Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3 1 0 0 0 2 0 0 0 3 4 2 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 7 0 0 0 8 0 0 0 9 0 0 0

ANEXO 6. Diámetro ecuatorial de bulbos obtenidos en ensayo 3, a partir de explantes de hoja de Leucocoryne sp. cv. Caravelle. Quillota 2003.

Tratamiento Diámetro ecuatorial de bulbo (mm)

Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3 1 0 0 0 2 0 0 0 3 5.16 3.55 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 7 0 0 0 8 0 0 0 9 0 0 0

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