1. INTRODUCCIÓN -...
43
1. INTRODUCCIÓN Las plantas silvestres representan un recurso invaluable para el desarrollo de cultivos resistentes a las enfermedades. La resistencia a enfermedades es altamente deseable, especialmente cuando se logra una protección durable y de amplio espectro contra enfermedades causadas por patógenos. Los métodos convencionales de mejoramiento han proveído históricamente de los medios, para transferir la resistencia entre especies silvestres y cultivadas que son inter-fértiles. Sin embargo, la ingeniería genética promete una aproximación complementaria para superar la infertilidad que existe comúnmente entre la mayoría de las especies vegetales. Las variantes de los patógenos proveen de una herramienta crítica para determinar los atributos fisiológicos y genéticos de la resistencia a enfermedades y finalmente el progreso en seleccionar un cultivar resistente. Las variantes de los patógenos serán útiles cada vez más para determinar la distribución geográfica de la resistencia a enfermedades en las especies silvestres, dotando de posibles pistas de cómo incorporar estos genes en un cultivo. Por ejemplo, la resistencia perdurable puede haber evolucionado en especies silvestres como una combinación de varios genes que están distribuidos en una mezcla natural de genotipos, variando en diferentes combinaciones de genes entre diferentes ecotipos. Esta investigación provee experiencia en la obtención de variantes de patógenos y su posible uso para investigaciones de genética molecular y fitomejoramiento. Se estudió el comportamiento de recombinantes derivados del cruzamiento de aislados de Hyaloperonospora parasitica (= Peronospora parasitica) en el laboratorio y aislados de Colletotrichum destructivum modificados por ingeniería genética.
-
Upload
trinhkhanh -
Category
Documents
-
view
214 -
download
0
Transcript of 1. INTRODUCCIÓN -...
1. INTRODUCCIÓN
Las plantas silvestres representan un recurso invaluable para el desarrollo de cultivos
resistentes a las enfermedades. La resistencia a enfermedades es altamente deseable,
especialmente cuando se logra una protección durable y de amplio espectro contra
enfermedades causadas por patógenos. Los métodos convencionales de mejoramiento han
proveído históricamente de los medios, para transferir la resistencia entre especies silvestres
y cultivadas que son inter-fértiles. Sin embargo, la ingeniería genética promete una
aproximación complementaria para superar la infertilidad que existe comúnmente entre la
mayoría de las especies vegetales.
Las variantes de los patógenos proveen de una herramienta crítica para determinar los
atributos fisiológicos y genéticos de la resistencia a enfermedades y finalmente el progreso
en seleccionar un cultivar resistente. Las variantes de los patógenos serán útiles cada vez
más para determinar la distribución geográfica de la resistencia a enfermedades en las
especies silvestres, dotando de posibles pistas de cómo incorporar estos genes en un
cultivo.
Por ejemplo, la resistencia perdurable puede haber evolucionado en especies silvestres
como una combinación de varios genes que están distribuidos en una mezcla natural de
genotipos, variando en diferentes combinaciones de genes entre diferentes ecotipos.
Esta investigación provee experiencia en la obtención de variantes de patógenos y su
posible uso para investigaciones de genética molecular y fitomejoramiento. Se estudió el
comportamiento de recombinantes derivados del cruzamiento de aislados de
Hyaloperonospora parasitica (= Peronospora parasitica) en el laboratorio y aislados de
Colletotrichum destructivum modificados por ingeniería genética.
2
La primera hipótesis de esta investigación es que es posible generar un híbrido de H.
parasitica entre los aislados Emoy2 y Hiks1. Para demostrar esta hipótesis se seleccionó
una serie de híbridos de los aislados de H. parasitica y se evaluaron usando diferenciales de
Arabidopsis thaliana y marcadores moleculares.
La segunda hipótesis es que existe un aislado de Colletotrichum destructivum transformado
por ingeniería genética, que permite entregar eficientemente a Arabidopsis thaliana el gen
de avirulencia ATR13 de Hyaloperonospora parasitica. Para probar esta hipótesis se
transformó el aislado de C. destructivum IMI34061 para que lleve en su genoma el gen
ATR13 y luego se infectaron plantas de A. thaliana con este aislado.
3
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Genes de resistencia y avirulencia:
Un amplio rango de patógenos, incluyendo virus, bacterias, hongos, nemátodos e insectos,
usan a las plantas como una fuente de alimento y protección. Las plantas han desarrollado
mecanismos para reconocer a los potenciales colonizadores y defenderse de ellos. El
mecanismo de defensa es frecuentemente activado por la interacción directa o indirecta por
un gen de resistencia (R) en la planta y un gen de avirulencia (Avr) en el patógeno (FLOR,
1942).
La evidencia genética obtenida a partir de un amplio rango de patosistemas vegetales
sugiere que cuando una combinación apropiada de genes R-Avr está presente, el resultado
es resistencia del hospedero, mientras que la ausencia o inactivación de cualquiera de los
genes del par R-Avr, resulta en susceptibilidad del hospedero al patógeno. Una explicación
común de la base molecular de esta interacción gen por gen, es un modelo de elicitor-
receptor. De acuerdo a este modelo, los genes Avr directa o indirectamente, producen un
elicitor que es reconocido por el correspondiente receptor del gen R. Esta interacción
molecular gatilla una cascada de señales que resulta en la activación de las defensas de la
planta y la limitación del crecimiento del patógeno (WARREN et al., 1998).
2.2. Arabidopsis thaliana:
Arabidopsis thaliana es una planta de la familia de las Brasicáceas (que incluye cultivos
como el repollo, coliflor, brócoli y raps) que ha sido ampliamente usada como un
organismo modelo en biología vegetal. No tiene importancia agronómica, pero presenta
importantes ventajas para la investigación en genética y biología molecular (TAIR, 2005) y
4
al mismo tiempo presenta genes que pueden ser potencialmente útiles para la mejora de
cultivos.
A. thaliana tiene una amplia distribución natural a través de Europa, Asia y Norte América
(MEINKE et al., 1998). Más de 750 entradas naturales de A. thaliana han sido colectadas
en el mundo y están disponibles en dos grandes centros de recolección y almacenamiento
de semillas: el ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center) en los Estados Unidos y el
NASC (National Arabidopsis Stock Centre) en Europa. Estas entradas son bastante
variables en términos de morfología y desarrollo como también en su fisiología (TAIR,
2005).
El ciclo de vida de la planta, incluyendo la germinación de las semillas, formación de la
roseta, emergencia del tallo central, floración y maduración de las primeras semillas, dura
entre seis y ocho semanas. Dicha duración corresponde a una entrada de uso común como
Columbia (Col-0), cuando es cultivada en condiciones de día largo y temperaturas cálidas
(18-25ºC) (MEYEROWITZ y PRUITT, 1985; MEINKE et al., 1998; KOORNEEF y
SOMERVILLE, 2002; TAIR, 2005). El fotoperíodo, temperatura y genotipo asociado, por
ejemplo, a un requerimiento de vernalización pueden extender el ciclo de vida a varios
meses (REDEI, 1975).
Típicamente, las flores se vuelven auto fértiles una vez que la yema abre; en este momento
pueden ser cruzadas aplicando polen en la superficie del estigma. Las flores están formadas
por un anillo exterior con cuatro sépalos verdes y uno interior con cuatro pétalos, seis
estambres que llevan el polen y un gineceo central, el cual origina la silicua (MEINKE et
al., 1998).
5
Las semillas maduras son de aproximadamente 0,5 mm de largo y están localizadas en las
silicua. Germinan alrededor de una semana después de ser sembradas; la exposición al frío
acelera la germinación. Las plántulas forman una roseta de 2 a 10 cm de diámetro
dependiendo de las condiciones de crecimiento. Las hojas están cubiertas con numerosos
tricomas unicelulares. Las plantas maduras alcanzan entre 15 y 20 cm de altura y
frecuentemente producen varios cientos de silicuas con más de 500 semillas en total
(MEINKE et al., 1998). MEYEROWITZ y PRUITT (1985) describieron más de 10.000
semillas por planta y REDEI (1975) notó que la producción de una sola planta puede
superar las 50.000 semillas.
Las plantas se pueden cultivar en placas Petri o en contenedores, ya sea en un invernadero o
bajo luz fluorescente en un laboratorio. La emergencia del tallo floral comienza
aproximadamente tres semanas después del transplante, y la inflorescencia resultante forma
una progresión linear de flores y silicuas por varias semanas antes del comienzo de la
senescencia. Las raíces tienen una estructura simple (MEINKE et al., 1998).
Desde un punto de vista científico, Arabidopsis presenta varias ventajas que la hicieron
convertirse en un organismo modelo para la biología molecular y celular de las plantas con
flores en la década de 1980 (MEYEROWITZ, 2001). Las características principales de
Arabidopsis son las siguientes:
- Alta producción de semillas (MEYEROWITZ, 2001).
- Fácil de cultivar en espacios confinados: cinco a 10 plantas pueden crecer en 1 cm2
(REDEI, 1975). Docenas pueden crecer en un pequeño contenedor y decenas de
miles pueden crecer en una habitación pequeña (MEYEROWITZ y PRUITT, 1985).
- Corto ciclo de vida (MEYEROWITZ, 2001).
- Fácil mutación y transformación (MEYEROWITZ, 2001).
6
- Tiene un pequeño genoma de 125 mb en total de las cuales 114,5 ya han sido
secuenciadas (THE ARABIDOPSIS GENOME INITIATIVE, 2000).
- Existen mapas extensivos de los cinco cromosomas (TAIR, 2005).
- Hay un gran número de líneas mutantes y recursos genómicos (TAIR, 2005).
2.3. Mildiú de Arabidopsis:
Hyaloperonospora parasitica es un oomicete de la familia Peronosporaceae. Es un biotrofo
obligado que no puede existir fuera de su íntima asociación con A. thaliana
(SLUSARENKO y SCHLAICH, 2003). De acuerdo a DANGL et al. (1992) es diploide,
homotálico y cenocítico en su estado vegetativo. Los aislados que infectan a A. thaliana
han probado ser no patogénicos en otras crucíferas (SLUSARENKO y SCHLAICH, 2003).
Las infecciones son aparentes al ojo desnudo y pueden ser vistas como una “alfombra” de
esporangióforos cubriendo ambas superficies de las hojas y pecíolos (SLUSARENKO y
SCHLAICH, 2003). Los síntomas en plantas adultas de A. thaliana son discretos, con
manchas verde claro en las hojas de la roseta que eventualmente se tornan cloróticas
(DANGL et al., 1992).
El ciclo de vida de H. parasitica comienza cuando las oosporas que han pasado el invierno
en restos de hojas sobre el suelo germinan en las raíces de A. thaliana y penetran
directamente, infectando plántulas del hospedero. Arabidopsis es típicamente una planta
anual de invierno, por lo que es más probable que la infección por oosporas ocurra al final
del otoño. La infección planta a planta ocurre vía esporas, liberadas desde los cotiledones u
hojas verdaderas de una planta (DANGL et al., 1992). Generalmente, las oosporas pueden
ser encontradas mas o menos una semana después de la infección con esporas provenientes
7
de las hojas verdaderas o cotiledones (SLUSARENKO y SCHLAICH, 2003). De a cuerdo
a DANGL et al. (1992) las oosporas son uninucleadas, esféricas y de paredes gruesas.
La enfermedad es típica en condiciones húmedas y frías, pero no hay datos empíricos bajo
condiciones de campo; sin embargo, una regla general para otros mildiús de brasicáceas es
que la enfermedad es más problemática en el campo con temperaturas entre 10 y 15ºC y
alta humedad. La esporulación ocurre principalmente en la noche y las esporas son
diseminadas durante la mañana cuando los esporangióforos se tuercen violentamente,
liberando las esporas en el aire (SLUSARENKO y SCHLAICH, 2003).
La infección ocurre después de que una espora germina, ya sea para producir un apresorio
directamente o alternativamente un corto tubo germinal, generalmente seis horas después
de hacer contacto con la hoja. Una hifa crece desde el lado del apresorio y luego penetra la
hoja en la juntura anticlinal de dos células epidermales; raramente, el apresorio se forma
sobre un estoma y la hifa crece directamente a través de él (KOCH y SLUSARENKO,
1990; SLUSARENKO y SCHLAICH, 2003). Luego, el patógeno crece, ramificándose a
través del tejido hospedero, insertando haustorios en las células (DANGL et al., 1992).
2.4. Patogenicidad de Colletotrichum sp. en Arabidopsis thaliana:
El género ascomicete Colletotrichum comprende un importante número de patógenos de
plantas. Estos patógenos causan antracnosis en un amplio rango de cultivos incluyendo
poáceas, fabáceas y frutales (BAILEY y JEGER, 1992).
Algunas especies pertenecientes al género Colletotrichum han sido usadas como modelo
para el estudio de las bases moleculares del proceso de infección, diferenciación de
estructuras e interacciones entre hongos y plantas (PERFECT et al., 1999), pero ninguno de
8
los hospederos usados en estos estudios ha sido especie modelo en sí. Sin embargo, más
recientemente O’CONNELL et al. (2004) describieron un nuevo patosistema entre
Colletotrichum y Arabidopsis que podría ser usado como un excelente modelo para la
investigación de interacciones entre plantas y hongos.
No han habido reportes previos de una especie del género Colletotrichum que cause
infecciones naturales en A. thaliana. Sin embargo, O’CONNELL et al. (2004) reportaron
que aislados de C. higginsianum aislados desde Brassica campestris tenían la habilidad de
infectar plántulas y plantas adultas de Arabidopsis bajo condiciones de laboratorio. Ellos
notaron que el proceso de infección fue muy similar a los reportados en frejol caupí, alfalfa
y tabaco para C. destructivum. Aunque los aislados usados fueron originalmente descritos
como C. higginsianum, mediante el análisis de la secuencia de nucleótidos de la región
ADN-ITS y características morfológicas y fisiológicas, se identificaron similitudes con
otras especies de Colletotrichum. Esto ha dejado el status taxonómico de este grupo de
aislados abierto al debate. NARUSAKA et al. (2004) describieron que la infección de
Arabidopsis por C. higginsianum mostraba síntomas similares a la infección en nabo.
De acuerdo a PERFECT y GREEN (2001) el proceso de infección de C. destructivum
comienza con las esporas que germinan para formar apresorios melanizados. En la fase
biotrófica las hifas de penetración se desarrollan desde los apresorios; las hifas infectan
primero una célula epidermal. Dentro de esta célula crecen vesículas de infección
multilobuladas y otras hifas. Después, en la etapa necrotrófica, las hifas secundarias se
propagan a células vecinas causando destrucción de la membrana plasmática y muerte
celular. O’CONNELL et al. (2004) reportaron que 72 horas después de la infección en
Arabidopsis, el hongo comienza a producir abundantes acérvulos en la superficie del tejido
muerto del hospedero, consistiendo de masas de conidias producidas desde un racimo de
conidióforos cortos.
9
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Selección de un híbrido de Hyaloperonospora parasitica:
Un esquema de este experimento se puede apreciar en la Figura 1.
3.1.1. Material vegetal
Se utilizaron plántulas del mutante de A. thaliana Ws-edsI. Ws-eds1 es una mutación de la
entrada Ws-0 obtenida por PARKER et al. (1996), que es recesiva para el locus EDS1
(EDS significa susceptibilidad a enfermedades aumentada) el que es necesario para el
correcto funcionamiento de los genes RPP (RPP significa resistencia a Hyaloperonospora
parasitica) RPP1/ RPP14, RPP10 y RPP12. Las plantas fueron cultivadas en una bandeja
con 40 contenedores de 2 x 2 cm, conteniendo una mezcla de sustrato F2s Levington con
arena y una capa delgada de una mezcla de sustrato en la superficie (compuesta de seis
partes de F2s Levington, una parte de arena y una parte de vermiculita), previamente
humedecida. 100 a 200 semillas fueron sembradas en cada contenedor. La bandeja fue
asperjada con agua, cubierta con papel de aluminio, colocada dentro de una bolsa plástica y
almacenada en un refrigerador a 4ºC en condiciones de oscuridad por dos días. Luego
fueron ubicadas en una cámara de crecimiento a 20ºC con un fotoperíodo de 10 horas y una
densidad de flujo de fotones de 100 a 200 µmoles m-2s-1 por siete días.
3.1.2. Inoculación
Para preparar la suspensión de esporas, se colectaron plántulas infectadas que presentaban
esporulación en tubos Eppendorf de 0,5 ml, luego se agregaron 100 a 200 µl de agua doble
destilada y el tubo fue golpeado suavemente con el dedo para liberar esporas que hayan
10
FIGURA 1. Producción, selección e inoculación en diferenciales de A. thaliana de
candidatos a híbridos de H. parasitica,
Selección de plántulas infectadas con
candidatos a híbridos
Siete días
Inoculación
Prueba de candidatos en diferenciales de A. thaliana
Congelación de muestras a -70ºC
Cuantificación del nivel de esporulación
Identificación de los candidatos
Mantención de
candidatos en Ws-eds1
Siembra de semillas de Arabidopsis Ws-eds1 junto con oosporas de aislados de H. parasitica Hiks1, Emoy2
y Maks9
Siete días
Inoculación
Producción de
candidatos a híbridos de H. parasitica
11
quedado atrapadas en los esporangióforos. La suspensión fue examinada bajo el
microscopio para comprobar la presencia de esporas viables (esporas redondas y
transparentes) y la concentración fue ajustada a aproximadamente 5 x 104 esporas/ml
usando un hematocitómetro. La suspensión de esporas fue inoculada usando una
micropipeta, ubicando una gota de aproximadamente 2 µl en cada cotiledón de plantas Ws-
eds1 de siete días de edad.
3.1.3. Manejo de las oosporas
Se utilizaron plantas infectadas con los aislados de H. parasitica: Hiks1, Emoy2 y Maks9
para preparar una suspensión de esporas, como está descrito en el punto 3.1.2 (con igual
volumen y concentración para cada aislado). Esta suspensión fue pulverizada sobre dos
bandejas con plantas Ws-eds1 de siete días de edad. Las plantas se llevaron a una cámara
de crecimiento como está indicado en el punto 3.1.1., pero con una temperatura de 18ºC por
dos semanas. Después de este período, las hojas de las plantas (conteniendo oosporas)
fueron picadas, colocadas en una bolsa de papel, secadas al aire y mantenidas en un frasco
hermético de plástico transparente.
3.1.4. Producción de candidatos a híbridos de H. parasitica
Una mezcla de hojas secas y molidas de A. thaliana Ws-eds1, conteniendo oosporas de los
aislados de H. parasitica Hiks1, Emoy2 y Maks9, colectadas en septiembre de 2004, fueron
esparcidas sobre el sustrato. Luego, semillas de Ws-eds1 fueron sembradas, como está
descrito en el punto 3.1.3., y las plantas fueron cultivadas en la misma manera descrita en el
punto 3.1.3., por una semana. La bandeja fue examinada con una lupa y las plántulas que
presentaron esporulación fueron colectadas en tubos Eppendorf de 0,5 ml usando pinzas
12
finas de metal, las que fueron limpiadas con etanol al 70% después de colectar cada
plántula.
3.1.5. Mantención de los candidatos a híbridos
Plántulas colectadas de la misma forma descrita en el punto 3.1.4. fueron usadas para
preparar una suspensión de esporas. La suspensión fue inoculada ubicando una gota de
aproximadamente 2 µl en cada cotiledón de plantas de Arabidopsis Ws-eds1 de siete días
de edad. Un contenedor de 2 x 2 cm fue usado para cada posible híbrido. Después de la
inoculación, cada contenedor fue ubicado en una caja hermética de plástico transparente, la
cual fue cubierta con papel aluminio, conservándola a 4ºC en un refrigerador y en oscuridad
por 2 días. Luego las plantas estuvieron por siete días bajo las mismas condiciones descritas
en el punto 3.1.3. El proceso fue repetido indefinidamente, manteniendo el inóculo vivo en
Ws-eds1. Además, se tomaron muestras de plántulas infectadas y se congelaron a -70ºC,
para tener un respaldo en caso de requerir repetir un experimento.
3.1.6. Confirmación de los híbridos
Plántulas de A. thaliana con reacciones diferenciales a H. parasitica fueron cultivadas en
una bandeja de 3 x 3 cm, subdividida en nueve contenedores de 1 x 1 cm llenos con una
mezcla de sustrato (cuya composición está descrita en el punto 3.1.1.). Cinco a 10 semillas
fueron sembradas en cada contenedor, distribuidas como sigue: tres contenedores con Ws-
eds1 (como un control positivo, ampliamente susceptible), un contenedor con Ty-1, uno
con Bur-1, uno con Not-1, uno con Sis-1 (reemplazada por Brm-1 después de los primeros
experimentos), uno con CN3796 y uno con CN3831. Estas entradas fueron proporcionadas
por el Prof. Dr. Eric Holub de la Universidad de Warwick, Warwick HRI, Inglaterra, las
letras representan la ubicación en que fueron colectadas (todas ellas son del Reino Unido) y
13
los números son para diferenciarlas de entradas colectadas en el mismo lugar; las entradas
CN3796 y CN3831 sólo tienen el código interno que les da el NASC. Los diferenciales
fueron dejados por siete días bajo las mismas condiciones descritas en el punto 3.1.1 Al
séptimo día fueron inoculados como está descrito en el punto 3.1.3. “Manejo de las
esporas”. Luego se dejaron otra semana, esta vez bajo las condiciones descritas en el punto
3.1.5. “Mantención de los candidatos a híbridos”. Al final de la semana, se registraron las
reacciones de los diferenciales al patógeno, contando el número de plantas infectadas por
contenedor y el número de esporangióforos por cotiledón, usando una lupa. El nivel de
esporulación fue cuantificado usando la siguiente escala:
- Baja esporulación: 1 a 10 esporangióforos por cotiledón
- Esporulación media: 11 a 19 esporangióforos por cotiledón
- Alta esporulación: más de 20 esporangióforos por cotiledón
Una plántula fue considerada susceptible si presentaba esporulación. Cuando no se observó
esporulación, la entrada se registró como resistente.
3.2. Colletotrichum destructivum: cultivo, transformación mediada por A. tumefaciens con
el plásmido pBht2-GFP e inoculación en Arabidopsis:
Un esquema de este experimento se puede apreciar en la Figura 2.
3.2.1. Cultivo del hongo
A través de esta investigación la especie usada es referida como C. destructivum. El aislado
silvestre IMI 34061 del hongo C. destructivum fue cultivado en placas Petri con agar papa
dextrosa (PDA) y 25 µg/ml de aeuromicina a 20ºC y en ausencia de luz. Fue subcultivado
regularmente después de que la placa se cubría con el hongo (normalmente 15 a 20 días).
14
FIGURA 2. Colletotrichum destructivum: cultivo, transformación mediada por A.
tumefaciens con el plásmido pBht2-GFP e inoculación en Arabidopsis.
Test de fluorescencia de
GFP
Observación bajo microscopio del
proceso de infección
Registro de las reacciones
Inoculación de transformantes y tipo silvestre en Arabidopsis (Col 5 y Ws-
eds1)
Cultivo de C. destructivum en placas petri con PDA.
Transformación de C. destructivum mediada por A.
tumefaciens con el plásmido pBht2-GFP
15
Para el aislamiento y mantención de los transformantes, se usó higromicina a una
concentración de 100 µg/ml.
3.2.2. Transformación de Colletotrichum destructivum mediada por Agrobacterium
tumefaciens
Este método ha sido usado antes, para expresar la proteína fluorescente verde (GFP) en
Colletotrichum acutatum por TALHINHAS (2005)* pero esta es la primera vez que es
descrito. El vector binario usado fue pBht2-GFP (en la Figura 3), una modificación de un
plásmido usado por MULLINS et al (2001) y construido sobre la base de pCAMBIA 1300
(Cambia, Canberra, Australia).
La línea de Agrobacterium tumefaciens AGL1 penn electroporada con el plásmido pBht2-
GFP cedida por el Dr. Surapappedy Srenivasaprasad de la Universidad de Warwick,
Warwick HRI, Inglaterra. La bacteria fue inoculada en una placa Petri con agar Luria-
ºBertani (LB), 30 µg/ml de kanamicina y 20 µg/ml de rifampicina e incubada por 48 horas
a 26ºC en ausencia de luz. Una colonia individual fue tomada desde esta placa e inoculada
en 5 ml de medio líquido LB con 30 µg/ml de kanamicina e incubada por una noche a 26ºC
y 150 rpm. Al día siguiente se tomaron 2 ml de este cultivo y se inoculó en 25 ml de medio
mínimo (MM), incubando bajo las mismas condiciones. De este cultivo se tomaron 3 ml,
que se usaron para medir la densidad óptica a 660 nm usando un espectrofotómetro Phillips
PU 8720 UV/VIS y medio de inducción (IM) como blanco. Se tomó un volumen apropiado
del cultivo, de tal forma que cuando fue diluido en 50 ml de IM, la densidad óptica a 660
nm fue igual a 0,15. Veinte ml de la solución diluida fueron centrifugados a 2500 rpm por
ocho minutos. Se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 50 ml de IM con
0,8 µg/ml de acetosiringona (AS) y 30 µg/ml de kanamicina. El cultivo fue transferido a un
* TALINHAS, P. Ing. Agr., Dr. 2005. Warwick HRI, Universidad de Warwick, Comunicación personal.
16
matraz estéril e incubado a 26ºC y 150 rpm por seis horas. Se preparó una suspensión
conidial de concentración 1 x 106/ml usando cultivos de C. destructivum de 15 días de
edad, añadiendo aproximadamente 5 ml de agua estéril a una placa. Luego, con un loop
plástico se frotó suavemente en la superficie del cultivo y la suspensión se colectó en tubos
Falcon de 50 ml. Se colocaron membranas de celofán en forma de disco del mismo tamaño
de la placa sobre placas Petri con agar IM y 2% de AS. Sobre la membrana de cada placa se
esparcieron 100 µl de suspensión conidial y 100 µl de cultivo resuspendido de
Agrobacterium tumefaciens, de tal manera que cubrieron el disco de celofán
completamente.
Las placas se incubaron a 22ºC por 48 horas en un lugar oscuro. Los discos de celofán
llevando las esporas en germinación se cortaron en trozos radiales de igual tamaño (ocho
trozos por disco) y se colocaron en placas de selección con PDA, 250 µg/ml de higromicina
y 400 µg/ml de cefotaxima. Se ubicaron cuatro trozos sobre cada placa de tal manera que
quedasen ordenados como una cruz de malta al mirar desde arriba. Estas placas se
incubaron a 20ºC en oscuridad. Luego de 15 a 20 días las colonias que crecieron en el
medio de selección fueron transferidas a tubos Eppendorf con 1 ml de medio líquido de
dextrosa de papa (PDB) más los mismos antibióticos a la misma concentración descrita
anteriormente, los tubos se mantuvieron bajo las mismas condiciones que las placas. Las
colonias que crecieron normalmente y expresaron GFP (luego de verificar la fluorescencia
como se explica en el punto 3.2.4.), fueron transferidas a placas con PDA y 100 µg/ml de
higromicina y subcultivados regularmente como es descrito en el punto 3.2.1. Dos
transformantes que mostraron el mejor nivel de fluorescencia, identificados como T25 y
T33 fueron seleccionados para ser inoculados en A. thaliana.
17
FIGURA 3. Plásmido pBHt2-GFP.
18
3.2.3. Inoculación de las plantas
3.2.3.1. Cultivo de las plantas para ser inoculadas
Las plántulas fueron cultivadas como se describe en el punto 3.1.1. Para la prueba de los
transformantes T25 y T33 se usaron las entradas Col-5 y Ws- eds1. Las plantas de cada
entrada se desarrollaron en cuatro contenedores de 2 x 2 cm.
3.2.3.2. Inoculación
La suspensión conidial se preparó como se describe en el punto 3.2.2., pero ajustando la
concentración a 1 x 105 conidias/ml. Para probar los transformantes T25 y T33, la solución
conidial se inoculó usando una pipeta de la misma manera descrita para H. parasitica en el
punto 3.1.2. Para cada entrada, un contenedor con plántulas de siete días de edad se inoculó
con el transformante de C. destructivum T25, uno con T33, uno con el aislado silvestre IMI
03461 (control positivo) y uno que no se inoculó (control negativo).
3.2.3.3. Microscopía y Fotografía
Los transformantes y un control IMI 03461 se examinaron usando un microscopio de
fluorescencia Leitz Dialux 20 y fueron fotografiados usando una cámara Panasonic
WVE550. Las muestras se prepararon tomando una gota de cultivo conteniendo hifas y
esporas desde un tubo Eppendorf, luego de agitarlo en un vórtex para separar la masa de
hifas. Un cotiledón se montó en un portaobjetos con una gota de agua estéril, se observó y
fotografió de la misma forma que los transformantes. Se tomaron fotos de las estructuras
del hongo por si sólo e infectando a Arabidopsis con luz blanca y con luz ultravioleta, para
confirmar la expresión de GFP.
19
3.3. Monitoreo de 82 entradas de A. thaliana con C. destructivum:
Un esquema de este experimento se puede apreciar en la Figura 4.
3.3.1. Inoculación de las plantas
3.3.1.1. Cultivo de las plantas para ser inoculadas
Las plántulas fueron cultivadas como se describe en el punto 3.1.1. Una bandeja con 100
contenedores de 1x1 cm se usó para cultivar 99 entradas de A. thaliana del Reino Unido.
En cada contenedor se ubicaron dos a tres semillas de cada entrada. En el Cuadro 1 se listan
los nombres de las entradas.
3.3.1.2.Inoculación
La suspensión conidial se preparó como se describe en el punto 3.2.3.2. usando esporas del
aislado silvestre de C. destructivum IMI 03461. El inóculo se pulverizó sobre las plantas en
una primera etapa; las plántulas que sobrevivieron se re-inocularon usando el método de la
pipeta descrito en el punto 3.1.1, siete y nueve días después de la primera inoculación.
3.3.2. Registro de las reacciones
De las 99 entradas de A. thaliana del Reino Unido que se sembraron, sólo 82 germinaron,
las que fueron monitoreadas. Las reacciones de las entradas al aislado silvestre de C.
destructivum IMI 03461 se registraron de la siguiente forma: plantas asintomáticas se
registraron como “verdes” (v), plantas cloróticas como (c), plantas necróticas como (n) y
plantas muertas como (m).
20
FIGURA 4. Monitoreo de 82 entradas de A. thaliana con C.
destructivum.
Inoculación en 82 entradas de Arabidopsis del Reino
Unido
Registro de las reacciones
Cultivo de C. destructivum en placas petri con PDA.
21
CUADRO 1. 82 entradas del Reino Unido de A. thaliana monitoreadas.
UK 3 Amb UK 39 Haw 1 UK 73 Sna UK 26 Cul 1 UK 66 Sco 1 UK 4 Asp UK 40 Hil 1 UK 75 Son UK 27 Duc 1 UK 67 Sgt 1 UK 5 Ban 2 UK 41 Lgt UK 76 Si 2 UK 28 Dun UK 87 Bag 2 UK 6 Bea UK 42 Lnv UK 77 Su UK 29 Edi 1 UK 88 Lee UK 7 Bek UK 43 Kil 1 UK 78 Tea 1 UK 30 Edi 2 UK 89 Bet Uk 8 Bid 1 UK 44 Ksk 1 UK 79 Ty 1 UK 31 Ema UK 90 Bak UK 9 Big 1 UK 45 Ksk 2 UK 80 Urt UK 33 Fab 1 UK 91 Roy UK 11 Brm UK 47 Lan 1 UK 81 Wen UK 34 Far 1 UK 92 Che UK 12 Bur UK 48 Lqz UK 82 Wig UK 54 Nov UK 93 Rut UK 13 Cal 2 UK 49 Leg UK 83 Wim UK 55 Not UK 94 Nas 1 UK 14 Cam 1 UK 50 Lha UK 84 Wis UK 56 Hun UK 99 Jau UK 15 Chi 1 UK 51 Lve 1 UK 19 Cnt 1 UK 57 Pdw UK 100 Por UK 16 Chr UK 68 Sev UK 21 Cnt3 UK 58 Pee UK 105 Whi 2 UK 17 Chs UK 69 Sis UK 22 Coc 1 UK 61 Ply 1 UK 133 Ard 1 UK 35 Fav 1 UK 70 Sit UK 23 Cra 1 UK 62 Poo UK 37 Frd 1 UK 71 Sta UK 24 Crl 1 UK 63 Rip UK 38 God 1 UK 72 Sma 1 UK 25 Crl 2 UK 65 Rot
UK = Reino Unido, el primer número es de referencia interna, las siglas representan la locación donde se colectó la entrada y el segundo número sirve para diferenciar dos entradas colectadas en el mismo lugar.
3.4. Proceso de clonación del gen de Hyaloperonospora parasitica ATR13 en el plásmido
quimérico pPgpd/GFP010:
3.4.1. Extracción de ADN
El plásmido pPgpd/GFP010 con un vector binario conteniendo un marcador de ampicilina,
el gen GFP y un sitio de clonación múltiple, fue proporcionado por la Dra. Adriana Soares
de Warwick HRI, Universidad de Warwick, Inglaterra. El plásmido contiene un promotor y
un terminador del hongo Aspergillus nidulans y fue construido sobre la base del plásmido
pGFP010 (SOARES, 2004). La Figura 5 presenta un esquema del plásmido
pPgpd/GFP010. El plásmido se extrajo con el kit QUIAGEN Quiaprep Spin miniprep
22
usando una micro centrífuga y siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad de
ADN obtenido se chequeó usando un Nanodrop y por observación directa en un gel de
agarosa al 1%. El ADN genómico del aislado de H. parasitica Maks 9 y el ADN BAC del
aislado del mismo hongo Emoy 2, fue proporcionado por la Dra. Rebecca Allen de
Warwick HRI, Universidad de Warwick, Inglaterra.
3.4.2. Digestión del plásmido
El plásmido pPgpd/GFP010 se digirió usando las enzimas de restricción Nco I y Not I (por
separado y las dos juntas). El volumen de las digestiones fue de 20 µl y se incubaron en
oscuridad a 37ºC por la noche. Los resultados se chequearon separando los productos de la
digestión en un gel de agarosa al 1% junto con un marcador tipo VI de Invitrogen, para
chequear el tamaño de los fragmentos, y tomando fotos de él con una cámara ultravioleta
UVP Bio Doc- IT™ System.
3.4.3. PCR
Se diseñaron partidores para la clonación del gen ATR13 en el plásmido pPgpd/GFP010.
Los partidores fueron sintetizados por Sigma. El volumen de las reacciones fue de 20 µl, se
usó la mezcla lista Red Taq con MgCl2 de Sigma, que contiene todo lo necesario para
realizar un PCR, excepto el agua. Se preparó un control negativo con agua en vez de ADN
para cada reacción. Se usó un termociclador Phoenix (Helena Biosciences). El programa de
PCR que se usó para todos los partidores fue el siguiente:
- 94 a 95ºC por dos minutos (un ciclo)
- 94ºC por 45 segundos, 65ºC por 45 segundos y 72ºC por 45 segundos (30 ciclos)
- 72ºC por 10 minutos (un ciclo)
23
FIGURA 5. Plásmido pPgpd/GFP010.
24
El resultado de las reacciones de PCR se chequeó de la misma manera que las digestiones,
como está descrito en el punto 3.4.2., pero usando un marcador tipo II de Invitrogen.
25
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Selección de un híbrido de H. parasitica:
Las reacciones esperadas de Arabidopsis a la infección con los aislados Emoy2, Maks9 y
sus híbridos putativos, se muestran en el Cuadro 2. En dicho cuadro, resistente implica baja
o nula esporulación y susceptible esporulación media a alta.
CUADRO 2. Reacciones esperadas de los aislados según HOLUB (2005) *.
Entradas de Arabidopsis thaliana Aislados de Hyaloperonospora
parasitica Wseds1 Bur-1 Ty-1 Not 1 Sis-1 CN3796 CN3831 Hiks1 S S S S S R R Emoy2 S S S R R S S Maks9 S R R S S S S
Emoy2xMaks9 S R R R R S S Emoy2xHiks1 S S S R R R R Maks9xHiks1 S R R S S R R
R = resistente, S = susceptible.
Como se puede ver en el Cuadro 2, la entrada Ws-eds1 es susceptible a todos los aislados y
sus híbridos. Las otras entradas tienen reacciones mezcladas, que vistas en conjunto
muestran un fenotipo que permite la identificación de un aislado dado, por ejemplo, un
fenotipo RRSSSS (siguiendo el orden que se muestra en la tabla y excluyendo a Ws-eds1)
indica que es más probable que el aislado sea Maks9. En el Cuadro 3 se puede ver que dos
entradas con la misma reacción esperada, no siempre coincidieron en los experimentos
realizados. Por ejemplo, en el caso de la muestra 2, sólo las entradas CN3796 y CN3831
muestran la misma respuesta. Los candidatos a híbridos se identificaron comparando los
* HOLUB, E Biólogo, Prof. Dr. 2005. Warwick HRI, Universidad de Warwick, Comunicación personal.
26
fenotipos obtenidos con los fenotipos esperados mostrados en el Cuadro 2. Si una entrada
mostraba baja esporulación y/o un bajo número de plántulas infectadas (como la muestra
16), el aislado se probaba de nuevo (los aislados probados más de una vez se muestran en el
Cuadro 4), lo mismo se hizo en el caso de fenotipos SSSSSS o RRRRRR.
CUADRO 3. Variación de las respuestas de las entradas.
ID Muestra Ws –eds1 Ty-1 Bur-1 Not-1 Sis-1 CN3796 CN3831 Fenotipo 2 S S 1/5 B R S 3/5 A R R R SRSRRR 3 S S 2/4 A R S 1/8 A R R R SRSRRR 4 S S 2/4 A R R S1/3 B R R SRRSRR 8 S R R R R R R RRRRRR 9 S S 2/5 B R R R R R SRRRRR
10 S R R R S 1/4 A R R RRRSRR 11 S R R R R R R RRRRRR 13 S R R S 1/4A R S 1/6 A S 2/ 8 B RRSRSS 14 R R R R R R R RRRRRR 16 S R S 1/6 B R S 5/5 B R R RSRSRR 17 S S 2/6 A R R S 2/4 B R R SRRSRR 19 S S 3/6 B R R R R R SRRRRR 20 S S 3/6 A S 2/5 B S1/7 A S 2/5 B R R SSSSRR
S = susceptible, R = resistente, números fraccionarios = número de plantas infectadas/número de plantas inoculadas, A = alta esporulación, B = baja esporulación.
Se identificaron varios posibles híbridos producto del cruce de los aislados, que fueron
probados varias veces, como se puede ver en el Cuadro 4. Sin embargo, los aislados se
autofecundaron en una mayor frecuencia que la que se cruzaron; 34 del total de 39
candidatos probados en los diferenciales presentaron un fenotipo que indicaría
homocigosis, 24 de ellos Hiks9, seis Emoy2 y tres Maks9. Se detectaron dos híbridos de
Emoy2xMaks9, dos de Emoy2xHiks1 y uno de Maks9xHiks1. Algunos aislados mostraron
inconsistencia entre pruebas, siendo identificados como un aislado primero y luego como
uno diferente (un ejemplo es la muestra 8). Estos casos fueron probablemente producto de
mezclas de esporas (no debido al método de inoculación, sino al de producción de híbridos)
o a la no germinación de ellas por razones ajenas a la resistencia.
27
CUADRO 4. Resultados de los cruces y pruebas de los aislados de H. parasitica.
Número de registro interno
1era prueba 2da prueba 3era prueba 4taprueba Aislado más probable
2 Hiks1 Hiks1 3 Hiks1 Hiks1 4 Hiks1 Hiks 1 Hiks 1 Hiks1 8 ? Maks9xHiks1 Emoy2xHiks1 Maks9xHiks1 Maks9xHiks1 9 Emoy2xHiks1 Hiks1 Hiks1 Hiks1 13 Maks9 Maks9 16 Hiks1 Hiks1 Hiks1 Hiks1 17 Hiks1 Hiks1 Hiks1 Hiks1 19 Emoy2xHiks1 Emoy2xHiks1 Maks9xHiks1 Hiks1 Emoy2xHiks1 20 Hiks1 Hiks1 21 Hiks1 Hiks1 23 Hiks1 Hiks1 24 Hiks1 Hiks1 25 Hiks1 Hiks1 26 Hiks1 Hiks1 27 Emoy2 Emoy2 28 Hiks1 Hiks1 29 Maks9 Maks9 30 Hiks1 Hiks1 31 Hiks1 Hiks1 32 Hiks1 Hiks1 33 Hiks1 Hiks1 35 Hiks1 Hiks1 38 Hiks1 Hiks1 39 Maks9 Maks9 39 Hiks1 Hiks1 1b Emoy2 Emoy2 2b Hiks1 Hiks1 4b Emoy2 Emoy2 Emoy2 5b Hiks1 Hiks1 6b Emoy2 Emoy2 Emoy2 7b Emoy2 Emoy2 9b Hiks1 Hiks1
11b ?(rrr) Emoy2xHiks1 Emoy2xHiks1 13b Emoy2xMaks9 Emoy2xMaks9 Emoy2xMaks9 14b ?(sss) Emoy2xMaks9 Emoy2xMaks9 15b Emoy2 Emoy2
28
Para disminuir las posibilidades de mezcla, al producir híbridos, se podría inocular sólo una
mezcla de tejido seco con esporas de dos aislados sobre una entrada susceptible al híbrido
resultante, con el inconveniente que se alargaría mucho el tiempo de experimentación.
El objetivo de esta parte del proyecto era encontrar un aislado híbrido entre Emoy2 y
Hiks1. Hiks1 posee las avirulencias ATR7 y ATR27 (MC DOWELL et a.l, 2000; TOR et
al., 2004). ATR (Arabidopsis thaliana recognized) significa reconocido por A. thaliana,
según HOLUB, BEYNON y CRUTE (1994). Al autofecundar este híbrido se podría
permitir la segregación de los genes ATR7 y ATR27 presentes en Hiks1 en aislados
separados. Se identificaron dos aislados candidatos a ser un híbrido de los aislados
Emoy2xHiks1 usando diferenciales de A. thaliana. Una prueba fenotípica no es suficiente
para confirmar la naturaleza híbrida de un candidato. Como trabajo futuro, se debiera
obtener un cultivo del H. parasitica a partir de una sola espora, para descartar la posibilidad
de que sea una mezcla, y luego se podrían usar marcadores CAPS para probar la identidad
del híbrido de manera molecular. GUNN, BYRNE y HOLUB (2002) usaron esta técnica
para identificar la progenie del cruce de dos aislados homotálicos de H. parasitica.
4.2. Colletotrichum destructivum: cultivo, transformación mediada por A. tumefaciens con
el plásmido pBht2-GFP e inoculación en Arabidopsis:
Para demostrar la expresión de un gen/proteína heterólogo en C. destructivum, el aislado
silvestre IMI 34061 del hongo se transformó usando un plásmido conteniendo el gen GFP,
descrito por primera vez como un marcador de expresión de genes por CHALFIE et al.
(1992) y un marcador de higromicina, llamado pBht2-GFP. Se obtuvo una tasa de
transformación de 0,00017 %. Los 34 transformantes obtenidos fueron capaces de crecer en
un medio selectivo de PDA con 100 µg/ml de higromicina. Las colonias formadas
29
presentaron un color anaranjado más brillante y profundo que las colonias del aislado
silvestre y su micelio era mucho más difícil de romper para obtener muestras.
Basado en el nivel de expresión de GFP, los transformantes T25 y T33 se seleccionaron
para ser inoculados en las entradas de A. thaliana Ws-eds1 y Col-5. Ambas entradas
mostraron susceptibilidad al ser inoculadas con el aislado silvestre IMI 34061, presentando
clorosis al tercer día después de la inoculación; al cuarto día se presentó necrosis y una
semana después de la inoculación las plantas murieron. Las plantas inoculadas con los
transformantes se comportaron de la misma manera, pero debido a su fluorescencia, su
desarrollo fue visible bajo un microscopio de fluorescencia.
La Figura 6 muestra al transformante T33 bajo luz blanca (A), y luz UV (B); la
fluorescencia verde en la segunda imagen es producto de la proteína expresada por el gen
GFP insertado. Las imágenes C (luz blanca) y D (luz UV) muestra la primera etapa de la
infección de un cotiledón de la entrada Ws-eds1 por el transformante T33 (se pueden ver
las esporas fluorescentes y los apresorios como manchas negras). Las imágenes E y F
muestran imágenes bajo luz blanca y UV del avance del micelio del transformante T33 en
el tejido de Col-5 al tercer día después de la inoculación. La imagen G muestra un cotiledón
de la entrada Ws-eds1 cuatro días después e la infección, completamente necrótico en el
lado derecho; la luz UV (H) revela que el área está completamente colonizada por el
transformante T33.
Este experimento demuestra que es posible infectar A. thaliana con transformantes GFP de
C. destructivum, obtenidos usando el plásmido pBht2-GFP. O’CONNELL et al (2004)
fueron capaces de fotografiar infecciones del mismo tipo de transformantes en Arabidopsis,
pero ellos usaron el vector binario pBin-GFP-hph.
30
FIGURA 6. Transformante de C. destructivum T33 en cultivo (A y B) e infectando a A.
thaliana (C a H), bajo luz blanca (izq.) y UV (der.).
A B
C D
E F
G H
31
4.3. Monitoreo de 82 entradas de A. thaliana con C. destructivum:
De las 99 entradas originalmente sembradas para ser inoculadas con el aislado IMI 34061,
17 nunca germinaron, probablemente debido a un problema de calidad de las semillas.
Nueve entradas sobrevivieron tres inoculaciones sucesivas, y el resto de ellas fueron
susceptibles al hongo. Las entradas de Arabidopsis sobrevivientes y sus desempeños en la
prueba con C. destructivum se pueden ver en el Cuadro 6.
Varias entradas presentaron una germinación desuniforme probablemente por diferencias
en los requerimientos de frío de las entradas. Esto se podría evitar en futuros ensayos
organizando las entradas en grupos con un período de frío conocido y similar. Las entradas
mostradas en el Cuadro 5 podrían ser usadas para estudiar su mecanismo de resistencia y
ver si sus reacciones varían con la temperatura, parámetro que hace variar reacciones de
Arabidopsis a C. destructivum (O’CONNELL et al., 2004). Todas ellas podrían ser
monitoreadas con un sistema basado en Colletotrichum como el propuesto en este taller,
para identificar candidatos a genes de avirulencia. Además podrían ser usados como
controles positivos en experimentos de patología involucrando el aislado IMI 34061.
4.4. Proceso de clonación del gen de Hyaloperonospora parasitica ATR13 en el plásmido
quimérico inserto en E.coli pPgpd/GFP010:
El objetivo de esta parte del proyecto era producir un transformante de Colletotrichum
conteniendo el gen ATR13. Como el vector pBht2-GFP probó ser exitoso en transformar el
hongo (punto 4.2.), se eligió para clonar el gen en su estructura. La idea era digerir el
plásmido de tal manera de cortar el trozo conteniendo el gen GFP e insertar ahí el gen
32
ATR13, pero según TALINHAS (2005)*, las enzimas que podrían realizar el corte
necesario, cortan en más de dos lugares la doble hebra de ADN.
CUADRO 5. Entradas de Arabidopsis sobrevivientes a inoculaciones sucesivas con C. destructivum.
Entradas de A. thaliana
Segunda Inoculación
Día 7
Tercera Inoculación
Día 9 Día 12
UK 5 Ban-2 2 v 1m 2 v 2 v UK 23 Cra-1 1c 1n 1m 1 c 1 c UK 34 Far-1 1c 1v 1 c 1 v 1 c 1 v UK 41 Lgt-1 2 v 2 v 2 v UK 43 Kil-1 3 m 1 v 1 v 1 v UK 67 Sgt-1 3 c 3 c 3 c UK 73 Sna-1 1 c 3 c 3 c UK 76 Si-2 1 c 2 m 1 c 1 c
UK 80 Unt-1 1 c 1 n 1 m 1 c 1 c v = verde; c = clorótica; n = necrótica; m = muerta, los números representan la cantidad de plántulas, los días son los transcurridos después de la primera inoculación.
Por esto se eligió el plásmido pPgpd/GFP010 para clonar ATR13 primero, usando las
enzimas de restricción Nco I y Not I. Luego, el plásmido pPgpd/GFP010 se digeriría con
las enzimas Sac 1 y Xba 1, obteniendo así el casette completo con promotor, terminador y
el gen ATR13 entre ellos. Este cassette se podría insertar en pBht2-GFP usando las mismas
enzimas Xba I y Sac I. En esta investigación sólo se alcanzó a realizar una parte de la
primera etapa: se digirió exitosamente el plásmido pPgpd/GFP010 con las enzimas Nco I y
Not I, y se diseñaron estrategias de clonación y partidores para clonar ATR13 en su
estructura como se puede ver en el Cuadro 6.
* TALINHAS, P. Ing. Agr., Dr. 2005. Warwick HRI, Universidad de Warwick, Comunicación personal.
33
CUADRO 6. Partidores, secuencias y estrategias de clonación
Nombre y combinación de
partidores Secuencia Estrategia de clonación
ATR13 Maks9 F 5'atgcgccttgttcacgcggtactgctacct 3'
ATR13 Maks9 R 5' ctactgtctgtcaagggcagcccgaatttc 3'
Clonación de extremo romo
ATR13 Maks9 F1 5' acgtcatgccatggttatgcgccttgttcacgcggtactgctacct 3'
ATR13 Maks9 R1 5' gctacagtgcggccgcctactgtctgtcaagggcagcccgaagtttc 3'
Para clonación direccional con Nco I y Not I (que producirá dos Aa adicionales en el extremo N).
ATR13 Maks9 F2 5' acgtcatgccatggtttagtgaatgcgccttgttcacgcggtactgctacct 3'
ATR13 Maks9 R1 5' gctacagtgcggccgcctactgtctgtcaagggcagcccgaagtttc 3'
Para clonación direccional con Nco I y Not I (que mantendría la secuencia peptídica original debido a dos codones de detención después del sitio de NcoI).
ATR13 Maks9 F1 5' acgtcatgccatggttatgcgccttgttcacgcggtactgctacct 3'
ATR13 Maks9 fusR 5' gctacagtccatggcctgtctgtcaagggcagcccgaagtttc 3'
Para clonación no direccional con Nco I (fusionándose con el gen GFP y el resto como la segunda combinación).
ATR13 Maks9 F2 5' acgtcatgccatggtttagtgaatgcgccttgttcacgcggtactgctacct 3'
ATR13 Maks9 fusR 5' gctacagtccatggcctgtctgtcaagggcagcccgaagtttc 3'
Para clonación no direccional con Nco I (fusionándose con el gen GFP y el resto como la tercera combinación).
ATR13 Emoy2 R 5' cgctgtcatgtggtaggtacacaactactg 3'
ATR13 Emoy2 Rl 5' gctacagtgcggccgccgctgtcatgtggtaggtacacaactactg 3'
Sólo para probar con ADN BAC de Emoy2.
Dos de estos pares de partidores se probaron usando un gen ATR13 BAC (cromosoma
bacterial artificial) de Emoy2. Según ALLEN et al. (2004) el alelo de ATR13 de Emoy2
tiene pequeñas diferencias en secuencia interna con el alelo de Maks9. El ADN de Emoy2
se usó porque permitiría determinar cuales partidores de los diseñados funcionaban bien y
cuales no, sin sacrificar el ADN genómico de Maks9. Maks9 contiene el alelo del gen
ATR13 que reconoce al gen RPP13, este gen está presente en la entrada transgénica Col-
34
5::RPP13-Nd, que se usaría en el experimento final de infección de Arabidopsis con el
transformante de Colletotrichum.
Los pasos a realizar en el futuro serían los siguientes: probar todos los partidores en el
ADN de Emoy2, y de los partidores que funcionasen, elegir el par más adecuado de
acuerdo a las estrategias de clonación presentadas en el Cuadro 6.
Luego éste par de partidores debiera ser usado en el ADN de Maks9, para luego clonar el
gen ATR13 en el plásmido pPgpd/GFP010 y luego en el pBht2-GFP. Los productos finales
de PCR para la clonación debieran ser amplificados con una polimerasa de alta fidelidad
como Pfu, para prevenir cualquier tipo de errores de secuencia. Este plásmido debiera
electroporarse en Agrobacterium tumefaciens y siguiendo el mismo protocolo descrito en la
sección 3.2.2., transformar Colletotrichum destructivum. Luego, este hongo transformante
se inocularía en Arabidopsis (entrada Col-5::RPP13-Nd) para ver si es capaz de entregar el
gen ATR13 de tal manera que esta entrada no presente infección (fenotipo opuesto al
normal).
35
5. CONCLUSIONES
Es posible generar potenciales híbridos entre los aislados de H. parasitica Emoy2 y Hiks1,
pero que necesitan ser confirmados usando marcadores moleculares.
No fue posible producir un aislado transformante de C. destructivum que lleve en su
genoma el gen de H. parasitica ATR13. Se probó un método exitoso de transformación de
C. destructivum y la clonación del gen ATR13 en un plásmido para ser electroporado en A.
tumefaciens y luego transformar C. destructivum, es decir se avanzó en sus primeras etapas.
36
6. RESUMEN Esta investigación se focalizó en el estudio de variantes de patógenos como posibles sondeadores para la detección de genes de resistencia a enfermedades de las plantas. Se utilizó los aislados de Hyaloperonospora parasitica (= Peronospora parasitica) Emoy2 y Hiks1. El aislado Hiks1 contiene los genes de reconocimiento de Arabidopsis thaliana (A. thaliana recognized, ATR) 7 y ATR27. Dichos genes permiten el reconocimiento de los genes de resistencia a Peronospora parasitica (Resistance to P. parasitica, RPP) 7 y RPP27 en A. thaliana. Un híbrido entre ambos aislados del hongo permitiría separar los genes en líneas puras, a través del método de retrocruzas. Mediante co-cultivo se obtuvo una serie de potenciales híbridos entre los aislados Emoy2, Hiks1 y Maks9. Los híbridos putativos fueron evaluados mediante un diferencial con 7 entradas de Arabidopsis thaliana. Los cotiledones fueron inoculados luego de crecer 7 días a 20ºC con un fotoperíodo de 10 horas y una densidad de flujo de fotones de 100 a 200 µmoles m-2s-1. La susceptibilidad de las entradas a la infección se cuantificó mediante el número de esporangióforos presentes en los cotiledones. Mediante este método se identificaron dos híbridos como Emoy2 x Hiks1, dos de Emoy2 x Maks9 y uno de Maks9 x Hiks1. La transformación de un aislado del hongo Colletotrichum destructivum es importante para el desarrollo de técnicas que permitan el monitoreo combinado de varias entradas de A. thaliana, con el fin de detectar genes de resistencia a enfermedades. Se utilizó el aislado IMI34061 del hongo, usando como vector a Agrobacterium tumefaciens con el plásmido pBht2 que contiene el gen la proteína fluorescente verde (GFP, green fluorescent protein). El gen GFP proviene la medusa Aequorea victoria y permite su fluorescencia bajo condiciones de luz azul. La transformación se llevó a cabo mediante co-cultivo de la bacteria y el hongo. Se obtuvo 34 transformantes, los cuales mostraron fluorescencia al ser expuestos a luz ultravioleta, lo que indica actividad del gen GFP. Se seleccionó dos de colonias de hongos transformantes en base a la intensidad de su fluorescencia. Con ellas se inoculó las entradas Ws-eds1 y Col 5 de A. thalina, produciéndose una infección de la planta. Con ello se demostró que el hongo no perdió su capacidad patogénica al ser transformado. La clonación de un gen de avirulencia de H. parasitica en el genoma de C. destructivum, permitiría detectar las reacciones a dicho gen en un conjunto de entradas de A. thaliana al mismo tiempo. El plásmido pPgpd-GFP/010, proveería de la base para insertar un gen de avirulencia en el plásmido pBht2-GFP. El plásmido pPgpd/GFP010 se digirió exitosamente con las enzimas Nco I y Not I, y se diseñaron estrategias de clonación y partidores para clonar el gen de H. parasitica ATR13 (ATR13 reconoce al gen de H. parasitica RPP13) en la estructura del plásmido.
37
Para poder monitorear entradas de A. thaliana usando C. destructivum, es necesario conocer las reacciones de la planta a este patógeno. Se monitoreó la infección con el aislado IMI34061 del hongo C. destructivum en 82 entradas de A. thaliana del Reino Unido, presentando 9 de ellas algún grado de resistencia al patógeno.
38
7. ABSTRACT This study focused on the variants of pathogens used as possible probes for detection of disease resistance genes within plants. The Hyaloperonospora parasitica (= Peronospora parasitica) isolates Maks9, Emoy2 and Hiks1 were used. Hiks1 contains the Arabidopsis thaliana recognized genes 7 and ATR27. Such genes allow the recognition of the resistance to P. parasitica genes 7 and RPP27 in A. thaliana. A hybrid between both isolates would permit the separation of the genes into pure lines, through the backcrossing method. Several putative hybrids among the isolates Emoy2, HIks1 and Maks9 were obtained through co-cultivation. The putative hybrids were screened using an A. thaliana differential with 7 accessions. The cotyledons were inoculated after 7 days growth at 20ºC, with a photoperiod of 10 hours, and a photon flux density of 100 to 200 µmols m-2s-1. The susceptibility of these accessions to infection was quantified by the number of sporangiophores present on the cotyledons. Two Emoy2 x Hiks1, two Emoy2 x Maks9 and one Maks9 x Hiks1 hybrids were identified using this method. The transformation of an isolate of the fungus Colletotrichum destructivum is important for the development of techniques that would allow the combined screening of several A. thaliana accessions, with the objective of detecting disease resistance genes. The IMI34061 isolate of the fungus was used in this study, using Agrobacterium tumefaciens with the plasmid pBht2, which contains the green fluorescent protein (GFP), as a vector. The GFP gene comes from the jellyfish Aequorea victoria and allows it to glow under blue light conditions. The transformation was made by co-cultivation of the bacteria and the fungus. 34 transformants were obtained, all of which showed fluorescence under UV light, indicating GFP gene activity. Two colonies were selected based on their fluorescence intensity. These two colonies were inoculated on the A. thaliana accessions Ws-eds1 and Col 5, and were able to successfully infect the plants, thus demonstrating that the fungus did not lose its ability to infect plants after being transformed. The cloning of an H. parasitica avirulence gene in the genome of C. destructivum, would allow the screening of the reactions to such genes in a group of A. thaliana accessions at the same time. The pPgpd-GFP/010 plasmid would provide the base for the insertion of an avirulence gene in the pBht2-GFP plasmid. The pPgpd/GFP010 plasmid was successfully digested with the Nco I and Not I enzymes. Primers and cloning strategies were then designed to clone the H. parasitica gene ATR13 (ATR13 recognizes the A. thaliana gene RPP13) for insertion in the plasmid structure.
39
To screen A. thaliana accessions using C. destructivum, it is necessary to know the reactions of the plant to this pathogen. In a screening of 82 UK accessions of A. thaliana for infection by the IMI34061 isolate of C. destructivum, nine plants were found that demonstrated some degree of resistance to this pathogen.
40
8. LITERATURA CITADA
ALLEN, R.L.; BITTNER-EDDY P.D.; GRENVILLE-BRIGGS L.J.; MEITZ, J.C.; REHMANY, A.P.; ROSE, L.E. and BEYNON, J.L. 2004. Host–parasite coevolutionary conflict between Arabidopsis and downy mildew. Science 306: 1957-1960.
BAILEY, J.A. and JEGGER M.J. 1992. Colletotrichum: Biology, Pathology and Control. Wallingford, CAB International. 388 p.
CHALFIE, M.; TU, Y.; EUSKIRCHEN, G.; WARD, W.W. and PRASHER, D.C. 1992. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263: 802-805.
DANGL, J.L.; HOLUB, E.B.; DEBENER, T.; LEHNACKERS, H.; RITTER, C. and CRUTE, I. R. 1992. Genetic definitions of loci involved in Arabidopsis-pathogen interactions. In: Koncz, C., Chua, N.H. y Schell, J eds. Methods in Arabidopsis research. London, World Scientific. pp 393-418.
FLOR, H. H. 1942. Inheritence of pathogenicity in a cross between physiologic races 22
and 24 of Melampsora lini. Phytopatology 32: 5.
GUNN, N.D.; BYRNE, J. and HOLUB E.B. 2002. Outcrossing of two homothallic isolates of Peronospora parasitica and segregation of avirulence matching six resistant lociin Arabidopsis thaliana. In: Phillips, S., Gisi, U. y Lebeda A. eds. Advances in downy mildew research. Dordretch, Springer. pp 185-188.
HOLUB, E.B.; BEYNON, J.L. and CRUTE, I.R. 1994. Phenotypic and genotypic characterization of interactions between isolates of Peronospora parasitica and accessions of Arabidopsis thaliana. Molecular Plant-Microbe Interactions 7(2) 223-239.
KOCH, E. and SLUSARENKO, A. 1990. Arabidopsis is susceptible to infection by a downy mildew fungus. The Plant Cell 2: 437-445.
41
KOORNEEF, M. and SOMERVILLE, C. 2002. A fortunate choice: the history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics 3: 883-889.
MC DOWELL, J.M.; CUZICK, A.; CAN, C.; BEYNON, J.; DANGL, J.L. and HOLUB, E.B. 2000. Downy mildew (Peronospora parasitica) resistance genes in Arabidopsis vary in functional requirements for NDR1, EDS1, NPR1 and salicylic acid accumulation. The Plant Journal 22 (6) 523-529.
MEINKE, D.W.; CHERRY, J.M.; DEAN, C.; ROUNSLEY, S.D. and KOORNNEEF, M. 1998. Arabidopsis thaliana: a model plant for genome analysis. Science 228: 662-682.
MEYEROWITZ, E.M. 2001. Prehistory and history of Arabidopsis research. Plant Physiology 125: 15-19.
MEYEROWITZ, E.M. and PRUITT, R.E. 1985. Arabidopsis thaliana and plant molecular genetics. Science 229: 1214-1218.
MULLINS, E. D.; CHEN, X.; ROMAINE, P.; RAINA, R.; GEISER, D. M.; and KANG, S. 2001. Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer. Phytopathology 91:173-180.
NARUSAKA, Y.; NARUSAKA, M.; PARK, P.; KUBO, Y.; HIRAYAMA, T.; SEKI, M.; SHIRAISI, T.; ISHIDA, J.; NAKASHIMA, M.; ENJU, A.; SAKURAI, T.; SATOU, M.; KOBAYASHI, M. and SHINOZAKI, K. 2004. RCH1, a locus in Arabidopsis that confers resistance to the hemibiotrophic fungal pathogen Colletotrichum higginsianum. Molecular Plant-Microbe Interactions 17(7): 749-762.
O’CONNELL, R.; HERBERT, C.; SREENIVASAPRASAD, S.; KHATIB, M.; ESQUERRÉ-TUGAYÉ, M.T. and DUMAS, B. 2004. A novel Arabidopsis-Colletotrichum pathosystem for the molecular dissection of plant-fungal interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions 17(3): 272-282.
42
PARKER, J.E.; HOLUB, E.B.; FROST, L.N.; FALK, A.; GUNN, N.D. and DANIELS, N.J. 1996. Characterization of eds1, a mutation in Arabidopsis suppressing resistance to Peronospora parasitica specified by several different RPP genes. The Plant Cell 8: 2033-2046.
PERFECT, S.E and GREEN, J.R. 2001. Infection structures of biotrophic and hemibiotrophic fungal plant pathogens. Molecular Plant Pathology 2(2): 101-108.
PERFECT, S.E.; HUGHES, H.B.; O’CONNELL, R.J. and GREEN, J.R. 1999. Colletotrichum: A model genus for studies on pathology and fungal-plant interactions. Fungal Genetics and Biology 27: 186-198.
REDEI. 1975. Arabidopsis as a genetic tool. Annual Review of Genetics 9: 111-127.
SLUSARENKO, A.J. and SCHLAICH, N.L. 2003. Downy mildew of Arabidopsis thaliana caused by Hyaloperonospora parasitica (formerly Peronospora parasitica). Molecular Plant Pathology 4(3): 159-170.
SOARES, A.X. 2004. Verticillium dahliae: Analysis of colonisation of strawberry cultivars (fragaria x ananassa) and development of a transformation tool for genetic manipulation. Tesis Doctoral. Warwick, Imperial College London and Warwick HRI. 271p.
TAIR. 22/06/05. The Arabidopsis Information Resource, (on line). http:// www.arabidopsis.org /info/aboutarabidopsis.jsp.
THE ARABIDOPSIS GENOME INITIATIVE. 2000. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408(6814): 796-815.
TÖR, M.; BROWN, D.; COOPER, A.; WOODS-TÖR, A.; SJÖLANDER, K.; JONES, J.D.G. and HOLUB, E.B. 2004. Arabidopsis downy mildew resistance gene RPP27 encodes a receptor-like protein similar to CLAVATA2 and tomato Cf-91. Plant Physiology 135: 1-13.
43
WARREN, R.F.; HENK, A.; MOWERY, P.; HOLUB, E. and INNES, R.W. 1998. A mutation within the Leucine-Rich Repeat domain of the Arabidopsis disease resistance gene RPS5 partially suppresses multiple bacterial and downy mildew resistance genes. The Plant Cell 10: 1439–1452.
