5.3.3 Unión de los factores recombinantes humanos

80 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial

5.3.3 Unión de los factores recombinantes humanos

De acuerdo con el análisis de los sensogramas obtenidos en los ensayos de unión para

cada factor recombinante, se evidenció una correlación directa entre la respuesta

obtenida en Unidades de Resonancia y la concentración de cada uno de los factores,

como se puede apreciar en la Tabla 5.9. Los ensayos para cada concentración (20, 100,

250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL) fueron realizados por triplicado, mostrando

reproducibilidad y conservando la tendencia característica de las gráficas de unión. La

solución buffer vehículo se escogió de acuerdo con la naturaleza química de cada factor.

Tabla 5. 9. Unión de los Factores recombinantes evaluados en diferentes concentraciones, en Unidades de Resonancia

CONCENTRACION (ng/mL)

FACTOR

EGF IL-4 Ang-2 TNF- α TGF-ß1 VEGF 2500 18,433 15,333 574,200 981,650 0,000 1034,600 1500 10,013 10,400 322,400 221,633 939,750 492,667 500 13,100 6,300 102,167 80,633 335,900 371,000 250 8,967 6,467 96,950 43,867 335,900 0,000 100 7,067 4,567 54,167 32,033 114,250 100,433 20 6,200 2,833 15,600 5,100 0,000 22,033

Figura 5.16 5.17 5.18

5.19 5.20 5.21

Capítulo 5 81

Los datos de UR de los ensayos de unión de los diferentes analitos, llevados a cabo con

concentraciones diferentes de los mismos se muestran en las Figuras 5.17 a 5.22.

Figura 5. 17 Ensayo de unión del factor recombiante humano EGF. Se muestran los valores de unión del EGF en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL), en unidades de resonancia, encontrados en función del tiempo.


Figura 5. 18 Ensayo de unión del factor recombiante humano IL-4. Se muestran los valores de unión de IL-4 en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500,1500 y 2500 ng/mL.), en unidades de resonancia (UR), encontrados en función del tiempo.

Capítulo 5 83

Figura 5. 19 Ensayo de unión del factor recombiante humano Ang-2. Se muestran los valores de unión de Ang-2 en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), en unidades de resonancia (UR), encontrados en función del tiempo.


Figura 5. 20 Ensayo de unión del factor recombiante humano TNF-α. Se muestran los valores de TNF-α unión de en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), en unidades de resonancia (UR), encontrados en función del tiempo.

Capítulo 5 85

Figura 5. 21 Ensayo de unión del factor recombiante humano TGF-ß1. Se muestran los valores de unión de TGF-ß1 en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), en unidades de resonancia, encontrados en función del tiempo.


Figura 5. 22 Ensayo de unión del factor recombinante humano VEGF. Se muestran los valores de unión de VEGF en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), en unidades de resonancia, encontrados en función del tiempo.

5.3.4 Curvas de calibración patrón de los factores recombinantes Una vez inmovilizados los diferente anticuerpos anti-analito, se realizaron los ensayos de

unión específica de cada uno de los factores evaluados. La inyección de cada uno de

ellos se efectuó por triplicado con mínimo seis puntos de dilución, en concentraciones de

20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL. Para la elaboración de las curvas de calibración

de los patrones estándar, se hicieron regresiones lineales de los datos utilizando el

programa Origin 8. Los valores correspondientes a cada factor fueron graficados y las

líneas rectas trazadas entre los puntos fueron empleadas para establecer las

concentraciones de los analitos presentes en los medios de cultivo del TCAA a los 3 y 7

días ( Figuras 5.22-5.27 ). Para cada una de las curvas se presenta la ecuación de la

recta, la interpolación en Y, el valor de R2 y el error estándar.

Capítulo 5 87

Figura 5. 23 Curva de calibración factor recombiante humano EGF. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), R2: 0.7885.


Figura 5. 24 Curva de calibración factor recombiante humano IL-4. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.). R2: 0.867.

Capítulo 5 89

Figura 5. 25 Curva de calibración factor recombiante humano Ang-2. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.). R2: 0.871.


Figura 5. 26 Curva de calibración factor recombiante humanoTNF- α. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.). R2: 0.860.

Capítulo 5 91

Figura 5. 27 Curva de calibración factor recombiante humano TGF-ß 1. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.). R2: 0.767.


Figura 5. 28 Curva de calibración factor recombiante humano VEGF. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), R2: 0.930.

5.3.5 Cuantificación de los factores en medios de cultivo Las muestras de los medios de cultivo a los días 3 y 7, tanto para TCAA elaborados en

soportes de colágeno con estructuras unidireccionales y multidireccionales, previamente

centrifugadas para eliminar residuos solidos del soporte, fueron inyectadas con diferentes

factores de dilución (1:3) para el tercer día y (1:27) para el séptimo día. El medio de

dilución fue agua destilada.

Capítulo 5 93

Figura 5. 29 Cuantificación del factor recombinante humano (EGF). La figura presenta las concentraciones (µg/mL) de EGF en los medios de TCAA a los 3 y 7 días de cultivo.

Figura 5. 30 Cuantificación de IL-4. La figura presenta las concentraciones (µg/mL) de IL-4 en los medios de TCAA a los 3 y 7 días de cultivo.

0 100 200 300 400 500 600 700

Día 3 Dia 7

µg/m

L

Tiempo de cultivo

Cuantijicación de EGF

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Día 3 Día 7

µ/mL

Tiempo de cultivo

Cuantijicación de IL-‐4


Figura 5. 31 Cuantificación factor recombinante humano Ang-2. La figura presenta las concentraciones (µg/mL) de Ang-2 en los medios de TCAA a los 3 y 7 días de cultivo.

Figura 5. 32 Cuantificación factor recombinante humano TNF- α. La figura

presenta las concentraciones (µg/mL) de TNF- α en los medios de TCAA a los 3

y 7 días de cultivo.

0

5

10

15

20

25

30

Día 3 Día 7

µg/m

L

Tiempo de cultivo

Cuantijicación de Ang-‐2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Día 3 Día 7

µg/m

L

Tiempo de cultivo

Cuantijicación de TNF-‐α

Capítulo 5 95

Figura 5. 33 Cuantificación factor recombinante humano TGF-ß 1. La figura muestra las concentraciones (µg/mL) de TGF-ß 1 en los medios de TCAA a los 3 y 7 días de cultivo.

Figura 5.34. Cuantificación factor recombinante humano VEGF. La figura muestra las concentraciones (µg/mL) deVEGF en los medios de TCAA a los 3 y 7 días de cultivo.

0 0,5 1

1,5 2

2,5 3

3,5 4

Día 3 Día 7

µg/m

L

Tiempo de cultivo

Cuantijicación de TGF-‐β1

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

1,2 1,4 1,6

Día 3 Día 7

µg/m

L

Tiempo de cultivo

Cuantijicación de VEGF

Capítulo 5 97

6. Discusión

Ante la pérdida de la mucosa de revestimiento de la cavidad oral por diferentes motivos:

patologías (enfermedad periodontal, neoplasias, traumatismos), malformaciones

congénitas (labio fisurado o paladar hendido) o procedimientos quirúrgicos

reconstructivos, se han propuesto terapias de medicina regenerativa, como por ejemplo,

el injerto de sustitutos de mucosa oral elaborados mediante ingeniería tisular. Esta

aproximación, busca minimizar las secuelas de los tratamientos convencionales (tales

como el uso de injertos autólogos de mucosa o piel) que pueden conllevar a procesos de

cicatrización por segunda intensión del área donante, contracción de la herida y

formación de queloides o apéndices pilosos que afectan la función y la estética del área

intervenida (Szpaderska A. 2003; Izumi 2004; Fontanilla 2006; Moharamzadeh K 2007).

En estudios previos del grupo de trabajo en Ingeniería de tejidos se evaluó en un modelo

lagomorfo de herida de espesor parcial de mucosa oral, el desempeño de tejido

conectivo artificial autólogo de mucosa oral (TCAA) y soportes de colágeno I acelulares

(SC) como injerto. Los resultados perfilan a estos productos como posibles sustitutos

para uso terapéutico en heridas de mucosa oral de espesor parcial y total (Espinosa L

2010). En cortes histológicos que se realizaron de muestras de TCAA tomadas a los siete

días de incubación, tiempo en que se injerta, se evidenció la presencia de matriz

extracelular eosinófila y nuevas fibras de colágeno sintetizadas por los fibroblastos que

contiene, indicando que el soporte de colágeno tipo I empleado permite la adhesión,

crecimiento y proliferación celular. Adicionalmente, se evidenció que durante el tiempo de

incubación el soporte es remodelado y reemplazado por tejido artificial metabólicamente

activo, mediante procesos modulados por factores solubles secretados por las células

presentes.

El objetivo de este trabajo fue detectar y cuantificar factores de crecimiento y citoquinas

que intervienen en el proceso de cicatrización, que son secretados por el TCAA en el

medio de cultivo, empleando un sistema de detección basado en microarreglos de

anticuerpos y un sistema de cuantificación basado en un biosensor de tipo óptico. Los

resultados obtenidos confirman los datos reportados en estudios previos de secreción de

factores en TCAA a los siete días (Espinosa L 2010) y muestran la presencia de factores de


crecimiento, quimoquinas, citoquinas, y factores remodeladores de la matriz extracelular

en el medio de cultivo de TCAA a las 4 horas y 3 días. Los factores cuantificados (EGF,

IL-4, Ang-2, TNF-α, TGF-β 1, VEGF), fueron escogidos teniendo en cuenta resultados

previos (Espinosa L 2010) y los resultados obtenidos en el presente trabajo con los

microarreglos de anticuerpos. El conjunto de datos obtenidos muestran que los

fibroblastos en el soporte de colágeno secretan glicosaminoglicanos y expresan

proteínas involucradas en el remodelamiento de matriz extracelular, angiogenesis,

inflamación, quimiotaxis y crecimiento celular.

Se han publicado estudios acerca de la expresión de factores en sustitutos de piel

usados como injerto en heridas de mucosa oral, Dermagraft® (Raguse 2005), elaborado con

fibroblastos dérmicos sembrados sobre soportes, o constituidos por dermis cadavérica

(AlloDerm®) y queratinocitos de mucosa oral (Xu 2009; Sorokin 2010). Los resultados de la

evaluaciones de los factores secretados por sustitutos de piel empleados en mucosa,

son diferentes a los reportados por nuestro grupo en trabajos previos (Espinosa, Fontanilla

2010) y en este trabajo. Lo anterior, sugiere que el resultado de injertar tejido artificial

puede en parte variar debido a que los perfiles de factores secretados por cada uno de

estos tejidos son diferentes. En los casos antes mencionados estas diferencias puede

deberse al hecho de que los fibroblastos aislados de mucosa oral que hacen parte de

TCAA, son diferentes genotípica y fenotípicamente a los fibroblastos provenientes de

dermis cutánea y a los queratinocitos (Stephens 2001; Chen 2010).

Es importante identificar los factores de crecimiento y citoquinas presentes en el medio

de cultivo del TCAA al día 7, momento de ser injertado, puesto que como hemos

demostrado este sustituto se comporta como un sistema tridimensinal bioactivo que

aporta en el sitio de la herida sustancias que promueven y modulan la cicatrización. De

las 43 proteínas evaluadas, 42 se expresaron en las monocapas de fibroblastos y

solamente 26 en el TCAA. Principalmente, se detectaron citoquinas, quimoquinas,

factores angiogénicos y factores remodeladores de matriz extracelular sugiriendo que la

naturaleza química y la tridimensionalidad proporcionada por el soporte de colágeno

estimulan a los fibroblastos para recambiar matriz extracelular y promover la

angiogénesis. Estos resultados corroboran estudios que muestran que la matriz

extracelular influye en la expresión de genes y que ésta expresión es diferente a la de las

células cultivadas en superficies bidimensionales. El estudio en mención también señala

Capítulo 5 99

que las propiedades del sustrato utilizado para promover la adhesión celular, influencian

la expresión de integrinas y la biosíntesis de proteínas (Pampaloni 2007). La angiogenina

fue el único factor que no se detectó, probablemente por la inhibición que ejercen en su

secreción la angiostatina y endostatina, factores angiostáticos presentes en los medios

(Distler 2007).

El proceso de cicatrización de las heridas en la mucosa oral cumple las mismas fases

que en la piel (hemostasia e inflamación, proliferación y remodelación de la matriz); sin

embargo las lesiones orales sanan más rápido, con menos formación de tejido cicatrizal

fibroso, menor contracción y raramente forman queloides, semejante a la regeneración

de las heridas en los tejidos fetales, incluyendo heridas en mucosa de paladar duro

(Szpaderska A. 2003; Warburton G 2005; Wong JW 2009). Entre las causas que pueden influenciar

una mejor curación de la mucosa, se encuentra la menor presencia de infiltrado

inflamatorio y los niveles más bajos de citoquina pro-inflamatorias como IL-1, TNF-α y

quimoquinas como el KC (Schrementi 2006; Chen 2010). Se han reportado estudios in vitro e

in vivo que indican que la secreción de IL-6 y IL-8 por fibroblastos de heridas de adulto y

feto, se encuentra disminuida o no es detectada en heridas fetales con mínima o nula

formación de cicatriz. Los resultados aquí presentados, muestran que el TCAA no está

secretando IL-6 y IL-8, citoquinas pro-inflamatorias y coinciden con lo encontrado por los

reportes anteriormente mencionados. Estos hallazgos se corroboraron con los

experimentos de cuantificación usando la tecnología del biosensor, en los cuales en las

muestras del séptimo día de incubación se detectaron niveles muy bajos de TNF-α (0.2

µg/mL). En este trabajo se detectaron niveles muy bajos de TGF-ß1 potente inductor de la

diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos (Dugina V. 2001), y no se encontró

secreción de PDGF-BB, en el medio de cultivo de TCAA a los 3 y 7 días de cultivo.

Trabajos de otros investigadores proponen que el TGF-ß1 y el PDGF, presentes en la

cicatrización de tejidos adultos, están encargados de regular el balance entre las

metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y las metaloproteinasas de matriz inhibitorias de

tejido (TIMPs), durante la remodelación de la matriz extracelular (Khateb T 1997; Shannon DB

2006).

Entre los factores de crecimiento y receptores detectados en el medio de cultivo del


TCAA al séptimo día, en porcentajes significativamente mayores que en los cultivos en

monocapa, sobresalen algunos involucrados en procesos de angiogénesis

(Angiopoyetina 1 y 2, MCP-3), regulando este proceso positivamente; otros (Endostatina,

angiostatina y angiopoyetina 2), actúan como factores angiostáticos. La presencia de los

receptores VEGF-R2 y VEGF-R3, es importante porque la unión del VEGF al primer

receptor media la angiogénesis y su unión al VEGF-R3 media la linfangiogénesis (Wong

JW 2009). Por lo anterior se podría sugerir que adicionalmente al efecto angiogénico, el

TCAA cuando es injertado estimula la formación de capilares linfáticos probablemente

para promover no solamente la neovascularización del tejido cicatrizal sino también

modular la respuesta inflamatoria. Estudios previos, encontraron que la respuesta

inflamatoria y la angiogénesis inician después de la primera semana pos-injerto y que

alrededor de la octava semana el proceso inflamatorio se resuelve, e igualmente, que la

angiogénesis fue máxima a las cuatro semanas y luego declinó (Jansen 2008).

Los perfiles de secreción de factores y citoquinas en los medios de cultivo del TCAA,

varían dependiendo del tiempo, posiblemente por la actividad metabólica de las células,

según la actividad que desarrollen en la formación y remodelación del tejido artificial. A

las cuatro horas de incubación se detectaron factores que promueven el reclutamiento de

células inflamatorias como PMN neutrófilos, macrofágos y monocitos (uPAR, MCP-4,

ENA, GRO-IFN-γ, TNF-α, RANTES), diferenciación de queratinocitos (EGF, IGF-1,

PDGF-BB, PIGF), angiogénesis (VEGF-R2, I-309, I-TAC,ENA-78, angiostatina, TGF-ß1)

y síntesis de proteínas de la matriz extracelular; en este momento los fibroblastos

sembrados comienzan a adherirse a la matriz de colágeno tipo I (Rumalla 2001; Werner 2003;

Enoch S 2008; Kornacker M. 2008).

La cuantificación en tiempo real de los factores, fue posible gracias a la tecnología de los

biosensores, novedosa en nuestro país. Aunque los coeficientes de correlación sugieren

variabilidad, el error estándar calculado con el programa Origin 8 indicó que el nivel de

confianza de las cuantificaciones era aceptable. En consecuencia, en este trabajo se

estandarizó una metodología de cuantificación con un biosensor óptico tipo SPR, de

factores proteicos presentes en el medio de cultivo de TCAA que intervienen en el cierre

de heridas mucosa. La cantidad de ligandos (anticuerpos anti-factores) inmovilizada

sobre la superficie del chip CM5, estuvo entre las 7000 y 14500 unidades de resonancia,

comparable con lo reportado en otros estudios (Wong M. S 1999; Pflegerl K 2001).

Capítulo 5 101

En los ensayos de regeneración de la superficie de los chips realizados en este estudio,

no se logró la regeneración con la solución recomendada por el fabricante (10 mM

glicina-HCl, pH 2,5), razón por la cual fue necesario realizar el test de regeneración

propuesto por Andersson y colaboradores en 1999, probando diferentes soluciones

escogidas dependiendo de la naturaleza química de los ligandos. La estabilidad del

sistema establecido se demuestra con la prueba de rendimiento de superficie en la que la

línea de base se mantiene constante entre cada ciclo.

En nuestros ensayos encontramos y cuantificamos factores que no se detectaron con el

sistema de microarreglos (método cualitativo), como el TGF ß1 en el TCAA a los 7 días

de incubación, en concentración de 0 a 3 µg/mL. Por otro lado se corroboró la presencia

de factores angiogénicos como el VEGF y Angiopoyetina 2, en todas las muestras

evaluadas al séptimo día en rangos de 0.3 a 0.5µg/mL y 14 a 18 µg/mL, respectivamente,

mientras que al tercer día no hubo una concentración de factores muy alta. El

establecimiento de una metodología para la cuantificación de factores proteicos solubles

en medios de cultivo, realizada en este trabajo, permitirá desarrollar futuros ensayos en

trabajos del grupo y de otros grupos que se quieran beneficiar de la metodología

estandarizada.

7. Conclusiones y recomendaciones

7.2. Conclusiones

• El tejido conjuntivo artificial autólogo ( TCAA ) expresa factores de crecimiento y

citoquinas involucradas en el proceso de cicatrización de heridas mucosas,

posiblemente regulando por acción paracrina y autocrina las fases de inflamación,

angiogénesis, reepitelización y remodelación de la matriz extracelular.

• El perfil de los factores secretados en el medio de cultivo del TCAA depende del

tiempo de incubación.

• El TCAA actúa en el momento de ser injertado ( 7 días de incubación) como un

tejido activo que aporta señales bioquímicas.

• Mediante la tecnología de los biosensores se pueden cuantificar en tiempo real los

factores proteicos solubles secretados por los fibroblastos que hacen parte del

TCAA.


7.2. Recomendaciones

• Evaluar la cinética de secreción de citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias de

las heridas injertadas y del TCAA antes de ser injertado.

• Determinar in situ, el perfil de factores autocrinos y paracrinos que se producen en

heridas injertadas con TCAA y con SC.

• Evaluar si parámetros, como la composición y las características microestructurales

de los soportes, influyen en los perfiles de secreción y en el tipo de cicatrización de la

herida.

• Identificar y cuantificar mediante el uso del Biosensor SPR el perfil de secreción de

factores y citoquinas en TCAA elaborado en soportes de colágeno con diferente

microestructura.

A. Anexo A: Reactivos utilizados

Reactivos Elaboración de soportes de Colágeno Tipo I (SC) y Tejido Conectivo Artificial Autólogo (TCAA).

NaOH 1 M Merck

ácido acético 0,1M Suero Fetal Bovino (SFB) Sigma Chemical Co piruvato de sodio 1% Life Technologies) soluciones de colágeno (2mg/mL), medio DMEM Gibco, Invitrogen

Detección de los factores de crecimiento y citoquinas en los sobrenadantes de los cultivos de TCAA.

estreptavidina-peroxidasa de rábano (HRP). RayBiotech,

biotina. Buffer de detección RayBiotech, ácido bicinconínico Sigma Chemical Co

Albúmina de suero bovino, 0,5 mg/mL Sigma Chemical Co

Cuantificación de los factores de crecimiento y citoquinas

Mouse monoclonal anti-human VEGF ab Invitrogen

Mouse monoclonal anti-humanEGF ab Invitrogen Mouse monoclonal anti-human Interleukin-4 (IL-4) Invitrogen

Rabbit polyclonal anti-human Angioietin 2 ab Invitrogen

Mouse monoclonal anti-humanTNF-α ab Invitrogen

Mouse monoclonal anti-humanTGF-β1 ab Invitrogen

Recombinant human Vascular Endothelial Cell Growth Factor (VEGF).

Gibco, Invitrogen

Recombinant human Epidermal Growth Factor (EGF).Liofilizado

Gibco, Invitrogen

Recombinant human Interleukin-4 (IL-4).Liofilizado

Gibco, Invitrogen

Recombinant Human Angiopoietin-2 (Ag-2). Liofilizado

Gibco, Invitrogen


Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α). Liofilizado

Gibco, Invitrogen

Recombinant Human Transforming Growth Factor-β1(TGF-β1). Liofilizado

Gibco, Invitrogen

Triton X-100 Merck Acido Sulfurico Buffer HBS-EP BIACORE EDC Etanolamina NHS

HEPES

Equipos

Agitadores magnético Velp Scientifica homogenizador Ultraturrax T-25 basic S1, IKA WORKS,

INC liofilizaron Heto* PowerDry PL6000 Freeze Dryer,

Thermo Scientific Brand Products, Rochester, NY, USA

Cabina de lujo laminar Thermo scientific

Incubadora Incub Safe

Microscopio Zeiss Balanza analítica Sartoriuos

Agitador CAT VM4

digitalizador de imágenes U

Genius (Syngene Laboratories, Frederick, MD, USA

Potenciómetro Sartorious

Biosensor Optico SPR 100 BIACORE

Centrífuga Beckman GP

Micropipetas

Bibliografía

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5.3.3 Unión de los factores recombinantes humanos

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