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ÍNDICE DE MATERIAS

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1. INTRODUCCIÓN 1 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4 2.1. Cultivo in vitro 4 2.2. Micropropagación 5 2.2.1. Ventajas de la micropropagación 5 2.2.2. Desventajas de la micropropagación 6 2.3. Aclimatación 6 2.3.1. Antecedentes generales 6 2.3.2. Causas de la pérdida de plantas durante la aclimatación 8 2.3.3. Técnicas para disminuir el porcentaje de pérdida durante la

aclimatación 12 3. MATERIALES Y MÉTODOS 18 3.1. Material vegetal 18 3.2. Ensayo 1. Reducción de la humedad relativa, con el uso de

polipropileno y su efecto sobre la aclimatación 20 3.3. Ensayo 2. Uso de CCC o cycocel y su efecto sobre la

aclimatación 33 4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 35 4.1. Ensayo 1. Reducción de la humedad relativa, con el uso de

polipropileno y su efecto sobre la aclimatación 35 4.2. Ensayo 2. Uso de CCC o cycocel y su efecto sobre la aclimatación 48 5. CONCLUSIONES 57 6. RESUMEN 58 7. LITERATURA CITADA 59

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1. INTRODUCCIÓN

Dentro de los métodos de propagación vegetativa, el cultivo in vitro es una

alternativa factible que permite lograr la propagación clonal masiva a partir de

escaso material madre y, en algunos casos, la eliminación de enfermedades

(RUBILAR, 2000).

El término cultivo in vitro se aplica a todo cultivo bajo cristal, en medio aséptico,

dentro del cual se incluyen diversas técnicas cuyos métodos y fines son muy

diferentes (BOUTHERIN y BRON, 1994).

La micropropagación es la técnicas in vitro más extendida actualmente, cuyo fin

esencial es producir, en gran cantidad, plantas jóvenes idénticas al pie madre, no

teniendo influencia sobre la calidad sanitaria (BOUTHERIN y BRON, 1994).

La micropropagación se compone de 4 etapas secuenciales: establecimiento,

proliferación o multiplicación, enraizamiento y aclimatación (BOUTHERIN y BRON,

1994). En la etapa de aclimatación es donde se producen las mayores pérdidas.

El ambiente in vitro es conocido por inducir modificaciones morfológicas, anatómicas

y fisiológicas a las plantas micropropagadas (GRIBAUDO, NOVELLO y

RESTAGNO, 2001). Es por esto que la aclimatación de la plantas desarrolladas in

vitro, a las condiciones ex vitro, es un paso crítico para muchas especies y requiere

tiempo e instalaciones caras, las que restringen el uso comercial de la

micropropagación (FILA et al., 1998).

Una de las causas de pérdida de plantas micropropagadas es que son

generalmente susceptibles a la rápida deshidratación cuando se exponen a una

humedad relativa reducida. Además, esta transición in vitro a ex vitro es una fase

crítica, ya que las plantas deben pasar de heterotróficas a completamente

autotróficas, a través de la fotosíntesis (THOMAS, 1998).

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Estas dificultades durante la aclimatación se deben a que el transplante es realizado

desde un ambiente in vitro, en el que las plantas se mantienen en una atmósfera

con muy poco intercambio gaseoso, una humedad relativa cercana al 100% y una

fuente exógena de carbohidratos metabolizables, a un ambiente ex vitro donde

estas condiciones no están controladas (GROUT y PRICE, 1987).

Todas las deficiencias o disfunciones provocadas por o durante la incubación in vitro

es necesario corregirlas de forma gradual, e, incluso, comenzar la adaptación en

condiciones in vitro, con el objetivo de mejorar la calidad de la planta, los niveles de

producción y los costos del proceso de micropropagación (LÓPEZ, 2002).

El uso de la disminución de la humedad relativa al interior del tubo de cultivo

(GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO, 2001; SHORT y ROBERTS, 1987 Y SMITH

et al., 1992), la adición de retardantes del crecimiento al medio de cultivo

(GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO, 2001; SMITH, 1991 y RITCHIE, SHORT y

DAVEY, 1991) y el incremento de la ventilación en el tubo de cultivo (ZOBAYED,

ARMSTRONG y ARMSTRONG, 2001; SANTAMARÍA et al., 2000 y MURPHY et al.,

1998), durante la etapa de enraizamiento, ha mejorado la aclimatación de las

plantas (disminuyendo la mortalidad y sus costos) e incluso, en algunos casos, no

ha sido necesaria.

Este estudio se fundamenta en el hecho que si se pudiese lograr disminuir el estrés

de la planta al momento del transplante, con el uso de sellos que permitan una

mayor ventilación en el tubo de cultivo y con ello una disminución de la humedad

relativa o con la aplicación de un retardante del crecimiento en la fase de

enraizamiento, se podría lograr aumentar el porcentaje de plantas aclimatadas y

con ello hacer más comercial el uso de la propagación in vitro.

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Objetivo general:

Evaluar el efecto de la preaclimatación de las plantas micropropagadas de violeta

africana (Saintpaulia ionantha Wendl.), en su respuesta a la aclimatación.

Objetivos específicos:

- Evaluar el efecto del uso de sellos de polipropileno que permiten una mayor

ventilación, en la reducción de la humedad relativa.

- Evaluar el efecto de la reducción de la humedad relativa, en la etapa de

enraizamiento, sobre la aclimatación de violeta africana propagada in vitro.

- Evaluar el uso de CCC o cycocel, un retardante del crecimiento, en el medio de

enraizamiento y su efecto sobre la aclimatación de violeta africana propagada in

vitro.

- Analizar la presencia de estomas en las hojas de plantas de violeta africana

propagadas in vitro, con el uso de impresiones epidermales.

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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1. Cultivo in vitro: Actualmente se acepta que el término cultivo de tejidos vegetales in vitro comprende

a una célula individual, un tejido, o un órgano creciendo en condiciones de asepsia

(GRAVINA, MAJOR y PIESTUN, 1995).

El cultivo in vitro es posible gracias a una propiedad de las células vegetales

llamada totipotencia celular, que significa que toda célula vegetal viva con núcleo, es

capaz, cual fuere su “especialización” del momento, de reproducir fielmente la planta

completa de la cual proviene. Cada célula posee entonces la totalidad del patrimonio

genético de la planta (BOUTHERIN y BRON, 1994).

La técnica general consiste en tomar un fragmento de tejido vegetal, colocarlo en un

medio nutritivo y provocar (gracias a un equilibrio adecuado de los elementos del

medio), directamente o tras manipulación, el desarrollo de una plántula. El conjunto

de estas operaciones se desarrolla en condiciones estériles y se seguirá por una

aclimatación en medio tradicional (BOUTHERIN y BRON, 1994).

Las distintas técnicas utilizadas se aplican a la resolución de problemas productivos

en cultivos de interés comercial y en la elucidación de procesos fisiológicos y

bioquímicos en vegetales. En líneas generales, las aplicaciones del cultivo in vitro,

pueden concentrarse en tres grandes grupos: mejoramiento genético, producción de

plantas libres de virus y propagación vegetativa, esto es, micropropagación (GRAVINA, MAJOR y PIESTUN, 1995).

BOUTHERIN y BRON (1994) mencionan que en el cultivo in vitro se desarrollan

cuatro técnicas que son el cultivo de meristemos, la micropropagación, los cultivos

de protoplastos, y el cultivo de anteras, de granos de polen y de óvulos. Esto debido

a que el modo de proceder y los fines que se pretenden son muy diferentes.

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2.2. Micropropagación: La micropropagación consiste en producir plantas a partir de porciones muy

pequeñas de ellas, de tejidos o células cultivadas en un tubo de ensayo o en otro

recipiente en que se puedan controlar estrictamente las condiciones de ambiente y

la nutrición (HARTMANN y KESTER, 1995).

El fin esencial de la micropropagación es el de reproducir una gran cantidad de

plantas idénticas al pie madre. Esta técnica permite la eliminación de bacterias y

hongos, ya que, al ser detectada su presencia en el medio de cultivo, se eliminan los

tubos contaminados. La micropropagación no ofrece ninguna garantía contra los

virus (BOUTHERIN y BRON, 1994).

Para evitar el transmitir estas enfermedades, es indispensable tener como punto de

partida un material vegetal sano. Estos pies-madres sanos se obtienen, si es

necesario, a partir del cultivo in vitro o después del indexage (BOUTHERIN y BRON,

1994).

La micropropagación se compone de 4 etapas secuenciales: establecimiento,

proliferación o multiplicación, enraizamiento y aclimatación (BOUTHERIN y BRON,

1994).

2.2.1. Ventajas de la micropropagación.

Las principales ventajas de la micropropagación residen en la posibilidad de utilizar

una o pocas plantas madres y con ello mantener el genotipo vía clonación, obtener

un gran número de plantas en un espacio restringido y en un tiempo limitado,

regular los programas de producción viverística de una forma desvinculada de la

periodicidad de los ciclos de cultivo y obtener plantas exentas de virus si se trabaja

con ciertas precauciones, es decir, reduciendo los explantes a una mínima porción

de los ápices gemarios (BALDINI, 1992).

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2.2.2. Desventajas de la micropropagación.

Las instalaciones necesarias son costosas y en muchas especies su empleo

comercial no se justifica, el personal que realiza las operaciones debe tener

adiestramiento específico, en algunos cultivares y con ciertos sistemas de cultivo se

pueden originar clases específicas de modificaciones genéticas y epigenéticas que

pueden alterar las plantas producidas, hay un cierto número de vegetales que

permanecen rebeldes a esta técnica y en algunas especies arbóreas frutales se han

observado fenómenos de juvenilidad (BOUTHERIN y BRON, 1994).

Pero la mayor dificultad es la fase de aclimatación, ya que es aquí donde existen las

mayores pérdidas, limitando así la incorporación comercial de la micropropagación

(LEWANDOWSKI, 1991).

2.3. Aclimatación: 2.3.1. Antecedentes generales.

Es la fase final del proceso, durante la cual las plántulas se preparan gradualmente

para el cambio de condiciones ambientales rigurosamente controladas y uniformes

del cultivo in vitro, a las extremadamente variables del cultivo en el campo

(BALDINI, 1992). Al principio de esta etapa, la plántula puede estar enraizada o no

(HARTMANN y KESTER, 1995).

La calidad final de las plantas in vitro depende en parte de su aclimatación. Tras

esta delicada fase (dos a tres semanas), las plantas se habituarán,

progresivamente, al ambiente del invernadero (BOUTHERIN y BRON, 1994).

Según BOUTHERIN y BRON (1994), las dificultades del transplante desde un

ambiente in vitro, se deben a que bajo estas condiciones, las plantas se mantienen

en una atmósfera saturada donde los movimientos de aire son nulos, la luz es

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artificial y la temperatura es relativamente alta y regular. HARTMANN y KESTER

(1995) señalan que otra dificultad es la fuente exógena de carbohidratos

metabolizables presentes en el medio de cultivo.

Pero la composición gaseosa dentro de los recipientes de cultivo puede variar

inmensamente, dependiendo del tipo de recipiente, del tapado del mismo y del

material vegetal. Por otra parte, la atmósfera, saturada en humedad, favorece el

fenómeno de la vitrificación (GRAVINA, MAJOR y PIESTUN, 1995).

La vitrificación es un desorden fisiológico y morfológico de las plantas propagadas in

vitro, caracterizado por el desarrollo de tejidos translúcidos, hiperhidratados y

suculentos. Este fenómeno se presenta principalmente en las hojas, las que pueden

presentar un anormal color verde claro como consecuencia de una insuficiencia de

clorofila, afectando los procesos de fotosíntesis e intercambio gaseoso. La

responsabilidad de estos fenómenos puede atribuirse a un exceso de humedad

relativa, un medio de cultivo inadecuado especialmente en cultivos en medio líquido,

un exceso de factores nutricionales, altos niveles de reguladores de crecimiento y

baja intensidad lumínica (WELDT, 1996).

Otra dificultad es que las condiciones de cultivo convencionales en el sistema in

vitro son subóptimas para el desarrollo fotosintético. Generalmente presenta una

baja intensidad de luz, una concentración de CO2 en el interior de los tubos de

cultivo menor a 100 ppm, durante el fotoperíodo (FUJIWARA, KOZAI y WATANABE,

1990; KOZAI, 1990; NEIL, ISRAEL y RICHARD, 1987), en cambio, la concentración

de CO2 en la atmósfera es de 350 ppm (PUC, 2003).

De todo lo anterior, se deduce que la plántula es extremadamente sensible y frágil a

todas las agresiones climáticas, incluso a las mínimas, que están presentes en un

invernadero tradicional. Por lo tanto, será necesario, en un primer momento situar

estas plántulas en condiciones similares a las que ellas conocen (BOUTHERIN y

BRON, 1994).

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Las bajas tasas de sobrevivencia y de crecimiento de las plantas cultivadas in vitro

durante la transferencia, es un punto conflictivo. Este problema puede ser superado,

considerando todo el proceso productivo, comenzando por mejorar las condiciones

de desarrollo de las plantas antes de removerlas del cultivo in vitro (WARDLE;

DOBBS y SHORT, 1983).

Además, las tasas de crecimiento de las plantas que logran sobrevivir después de la

transferencia, son generalmente pobres, retardando el período de aclimatación y

obteniendo plantas menos competentes para su posterior desarrollo a condiciones

de campo (LAKSO et al., 1986).

2.3.2. Causas de la pérdida de plantas durante la aclimatación.

Las plantas deben adaptarse, de una nutrición heterótrofa (en donde la fuente de

carbono es agregada al medio de cultivo), a una nutrición autótrofa. Tienen que

desarrollar raíces, brotes funcionales y aumentar su resistencia a la desecación y al

ataque de organismos patógenos (HARTMANN y KESTER, 1995).

Según KOZAI (1990a), durante el período de aclimatación, cerca de un 20 – 50 %

de las plantas se pierden, debido, principalmente, a tres grandes causas.

La primera causa descrita por KOZAI (1990a) es que existe una baja tasa

fotosintética y un incompleto desarrollo autotrófico de las plantas in vitro, lo que

influye en el cambio de nutrición provocado al momento de la transferencia.

Las hojas formadas in vitro son frecuentemente delgadas, blandas y

fotosintéticamente poco activas, presentando pocas y pequeñas células de

parénquima en empalizada, con baja eficiencia en el uso de la luz y con grandes

espacios en el mesófilo (PIERIK, 1987).

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Además, según lo mencionado por HARTMANN y KESTER (1995), aunque las

hojas pueden estar verdes, en realidad no son capaces de efectuar fotosíntesis, lo

que implica que la plántula debe iniciar nuevas hojas después de que ha sido

removida del ambiente del medio de cultivo.

Existen algunos informes que indican que las plantas in vitro tienen habilidad

fotosintética y que se desarrollan autotróficamente, pero que su actividad

fotosintética es restringida, principalmente por la baja concentración de CO2 en el

interior de los tubos durante el fotoperíodo (FUJIWARA, KOZAI y WATANABE,

1990).

Estos autores indican que, debido a la baja concentración de CO2, estas plantas son

forzadas a crecer hetero o mixo – tróficamente, con la absorción de azúcar desde el

cultivo como principal fuente de carbono.

Este drástico cambio de mixo o hetero – trófico a autotrófico, como modo de

nutrición, es una de las etapas más críticas de la micropropagación, ya que podría

causar en las plantas serios daños fisiológicos. Por esto, es natural que en muchos

casos la tasa de crecimiento y sobrevivencia de las plantas sea muy baja (KOZAI,

1990b y DESJARDINS, GOSSELIN y YELLE, 1987).

GROUT y ASTON (1978) demostraron que este cambio en el tipo de nutrición es

relativamente lento, ya que, siete días después del transplante, aún no había una

toma neta de CO2 .

La segunda causa descrita por KOZAI (1990a) es que las plantas in vitro poseen

una alta tasa transpiratoria, que provoca una gran pérdida de agua, debido a una

delgada capa cuticular y un anormal funcionamiento estomático.

Las plantas in vitro son muy susceptibles a la excesiva desecación inmediatamente

después de removidas desde el cultivo. Este estrés hídrico es la principal causa del

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problema del transplante (SUTTER y LANGHANS, 1979; BRAINERD et al., 1981 y

SUTTER, 1988).

Generalmente, una planta que ha crecido bajo condiciones in vitro, presenta la

cutícula poco desarrollada, debido a la alta humedad relativa presente en el tubo de

cultivo utilizado (90-100%), lo que provoca una excesiva pérdida de agua

postransplante. Además, los estomas no operan adecuadamente, siendo la causa

de la mayor pérdida de agua durante las primeras horas de aclimatación; a su vez,

existe una pobre conexión vascular, lo que reduce la conducción de agua

(GRAVINA, MAJOR y PIESTUN, 1995).

Algunos investigadores señalan que los estomas de plantas propagadas in vitro,

tienen un mal funcionamiento, que no se cierran cuando las plantas son removidas

desde el cultivo y que producen problemas en el control de la transpiración

(WARDLE, DOBBS y SHORT, 1983; BRAINERD y FUCHIGAMI, 1982 y

FUCHIGAMI, CHENG y SOELDER, 1981).

Sin embargo, BRAINERD y FUCHIGAMI (1981) y SUTTER y LANGHANS (1979)

han sugerido que existe una respuesta lenta de los estomas a los cambios de

humedad relativa. Además, LEWANDOWSKI (1991) menciona que el porcentaje de

pérdida de agua disminuye con la edad de las plántulas, ya que poseen hojas mejor

diferenciadas y aclimatadas.

BRAINERD y FUCHIGAMI (1981) determinaron que el rango de pérdida de agua de

hojas extraídas de manzanos asépticamente cultivados fue inversamente

proporcional al porcentaje de cierre estomático.

Finalmente, la tercera causa descrita por KOZAI (1990a) es que existe una

reducción en el ascenso de agua a través, de las raíces y sistema vascular.

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Las raíces formadas in vitro son poco funcionales, presentando epidermis no

suberizada y pocos pelos radicales, los que generalmente mueren postransplante y

deben ser regenerados. Esto trae como consecuencia que el ya mencionado pasaje

de una nutrición heterótrofa a una autótrofa, se vea dificultado o enlentecido, con el

consecuente riesgo de pérdida de plantas (GRAVINA, MAJOR y PIESTUN, 1995).

Además, BOUTHERIN y BRON (1994) mencionan que las raíces desarrolladas in

vitro son extremadamente frágiles y que, al ser colocadas en el sustrato, mueren.

Por lo tanto, es necesario esperar la formación y el crecimiento de nuevas raíces

para que la planta se alimente.

Investigaciones realizadas por GROUT y ASTON (1977) en coliflor, señalan que

existe una formación anormal del xilema en la zona del callo, en plantas cultivadas

in vitro. Debido a esto, las raíces que crecen bajo estas condiciones tienen un pobre

desarrollo vascular.

Tal situación no es problema en el cultivo, cuando las plantas están rodeadas por

alta humedad y solución nutritiva, pero sí tienen bastantes limitantes en el transporte

de agua después del transplante. Es así como algunos autores proponen remover

completamente el sistema radicular inicial y aplicar un compuesto enraizante para

formar uno nuevo (CLARE y COLLIN, 1974).

Por el contrario, APTER, DAVIES y McWILLIAMS (1993b) observaron que las raíces

desarrolladas in vitro no eran reemplazadas, sino que sobrevivían al transplante y a

la aclimatación. Además, según NORTON y NORTON (1981), no hay diferencias

significativas respecto al número de raíces, entre la plantas enraizados in vitro y las

enraizadas ex vitro.

APTER, McWILLIAMS y DAVIES (1993a) describen que no existían diferencias

manifiestas en la densidad de los pelos radicales y que las conexiones xilemáticas

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entre la raíz y el tallo estaban igualmente desarrolladas en condiciones in vitro y ex

vitro.

Se puede observar claramente que las condiciones ambientales del cultivo

influencian profundamente las características anatómicas y fisiológicas de las

plantas in vitro, y éstas pueden ser las principales razones de la baja sobrevivencia

y baja tasa de crecimiento de las plantas en el período de aclimatación (MORALES,

1992).

2.3.2. Técnicas para disminuir el porcentaje de pérdida durante la aclimatación.

En resumen, la aclimatación está influenciada directamente por las siguientes

condiciones ambientales: luz, temperatura, flujo de aire y el gradiente de vapor de

presión entre la hoja y el aire (SUTTER, 1988).

Durante el período inicial del transplante son esenciales varias condiciones

ambientales. Una de ellas es el mantenimiento elevado de humedad relativa (del

50% al 100%), durante 2 a 3 semanas para proteger la planta de la desecación y

permitir que inicie nuevas raíces y brotes. El segundo requerimiento es que el

sustrato utilizado debe ser sano, bien drenante, que permita que las raíces se

desarrollen con rapidez. Un tercer requerimiento es la protección contra diversos

organismos patógenos hasta que haya algo de resistencia; y el último requerimiento

es el control del crecimiento durante el transplante para superar o evitar el letargo y

la falta de crecimiento resultante (HARTMANN y KESTER, 1995).

KOZAI y HAYASHI (1987) señalan que se puede disminuir el rango de muerte de

las plántulas y aumentar el crecimiento con un control óptimo del medio ambiente,

por ejemplo, con una alta humedad relativa (HR), bajo nivel de luz y temperatura

constante en el estado temprano, ya que estas condiciones podrían bajar el estrés

hídrico de las plantas.

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BOUTHERIN y BRON (1994) describen dos técnicas que mantienen una alta

humedad relativa durante la aclimatación. Estas técnicas son el fog-system o niebla

artificial, el cual es empleado principalmente en especies leñosas, y la puesta en

estufa con láminas de plástico, se utiliza en especies cuya aclimatación no es

demasiado delicada.

THOMAS y SCHIEFELBEIN (2001) mencionan que se puede disminuir el porcentaje

de pérdida de plantas y, con ello, facilitar el proceso de aclimatación, al cubrir los

contenedores, en los cuales se encuentran las plántulas, con una cúpula

transparente, la cual se debe alzar ligeramente después de una a dos semanas y

retirar por completo a la tercera semana. Aunque en este ensayo se observó daño

de deshidratación en algunas de las hojas desarrolladas in vitro, esta técnica ayudó

a resistir la transición a condiciones ex vitro.

En un estudio realizado por THOMAS (1998), se utilizó la técnica del sachet

(RAVINDRA y THOMAS, 1995), que consiste en una bolsa de polipropileno

transparente con sustrato a dos tercios de su capacidad y cerrada en su superficie

después de realizar el transplante. Con ésta se obtuvo el máximo establecimiento,

sin daño o con el mínimo daño en las hojas formadas in vitro, cuando las plantas se

incubaron por tres semanas en el sachet cerrado, seguido por una semana de

incubación con el sachet abierto.

GROUT y PRICE (1987) señalan que junto con mejorar las técnicas de aclimatación

posteriores a la etapa de transplante, se deben manipular los individuos en la etapa

in vitro con el fin de que estén mejor preparados para asumir rápidamente un

crecimiento independiente. Esto se refiere a que se aumente la capacidad

fotosintética in vitro para asegurar un balance positivo en la fijación del carbón, y

que el follaje que se desarrolle permita un rápido aumento de la fijación de éste para

responder al estrés y demandas de las condiciones ex vitro.

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DONNEY y VIDAVER (1984a) realizaron un estudio, en el que describen que el

suplementar con luz y enriquecer con CO2, es importante en la adaptación

morfológica de las hojas a las nuevas condiciones ambientales. Además, KOZAI y

HAYASHI (1987) señalan que el período de aclimatación se puede disminuir al

enriquecer con CO2 el ambiente in vitro, ya que esto promueve el crecimiento de las

plantas.

La concentración de CO2 al interior del tubo puede ser incrementada con el

aumento de la tasa de ventilación y/o con el incremento de la concentración de CO2

en el aire de entrada (KUBOTA y KOZAI, 1990).

KOZAI y WATANABE (1990) mencionan que el uso de tapas plásticas transparentes

y permeables permite que la concentración de CO2 en los tubos, durante el

fotoperíodo, sea llevada a niveles más altos que en los tubos cerrados

herméticamente; además, que la humedad relativa de los tubos sea llevada a

niveles más bajos, dependiendo de la diferencia en la presión de vapor de agua

dentro y fuera del tubo; y, por último, que la intensidad lumínica sea llevada a

niveles más altos que en tubos con papel aluminio.

La intensidad de la luz puede tener un pronunciado efecto en el desarrollo de la hoja

y puede modificar sus características, como su grosor, diferenciación del mesófilo,

desarrollo vascular, división celular y desarrollo estomático (KOZAI, OKI y

FUJIWARA, 1990).

En un estudio realizado por LÓPEZ (2002), se favoreció la lignificación, el desarrollo

cuticular y estomático e incluso se realizó el trasplante directo al campo, cuando las

plantas in vitro fueron sometidas a una elevada intensidad lumínica, un fotoperíodo

más corto y una temperatura inferior a la normal, durante un par de semanas.

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MURPHY et al. (1998) señalan que, al mejorar la ventilación al interior del tubo de

cultivo, se obtiene una mayor tasa de sobrevivencia, ya que hay un aumento en la

resistencia de la hoja a la deshidratación, debido a una mejor regulación estomática.

SANTAMARÍA et al. (2000) mencionan que la tasa de crecimiento de la planta no

fue afectada por el grado de ventilación de los tubos de cultivo, aunque el área foliar

fue mayor en plantas provenientes de tubos que poseían una menor tasa de

intercambio gaseoso. Por otro lado, el mejor funcionamiento estomático, el

crecimiento y el aumento de la sobrevivencia de las plantas provenientes de los

tubos ventilados, parece ser resultado de un mayor flujo de aire y no por una mejora

del ambiente gaseoso. Además, se observó que la humedad relativa al interior de

los tubos de cultivo, no fue afectada por su nivel de ventilación.

ZOBAYED, ARMSTRONG y ARMSTRONG (2001) observaron que el tamaño y la

densidad estomática estaban inversamente relacionados con el grado de

ventilación, y que las plantas de tubos con un sistema de ventilación tienen tasas de

sobrevivencia más altas que las plantas de frascos sin ventilación. Además, estos

autores mencionan que todos los efectos adversos, provocados bajo las condiciones

in vitro, pueden prevenirse o ser reducidos por la introducción de ventilación al

interior de los tubos de cultivo.

MARIN y GELLA (1988) señalan que las plantas micropropagadas necesitan de un

estímulo externo que les permita cambiar su régimen heterotrófico hacia uno

autotrófico. Este estímulo puede ser la baja humedad relativa.

FUJIWARA, KOZAI y WATANABE (1990) concluyeron que una menor humedad

relativa en el tubo de cultivo puede reducir la tasa de pérdida de agua de las hojas y,

por lo tanto, producir plantas con una alta tolerancia al estrés hídrico.

Se obtuvo una menor tasa de pérdida de agua en las hojas de plantas in vitro,

cuando estaban previamente cultivadas con una reducida humedad relativa. La

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reducción de la humedad relativa aumentó el contenido de clorofila en las hojas y el

número y espesor de las raíces (GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO, 2001).

SMITH (1991) reportó que, al disminuir la humedad relativa al interior de los tubos

de cultivo, se observó una reducción en la longitud del tallo, una mejor fisiología de

los estomas y un aumento del área de la hoja, del contenido de clorofila por hoja, del

diámetro de la raíz, de la cera epicuticular y del espesor de la cutícula.

Un óptimo crecimiento y endurecimiento in vitro ocurre cuando las plantas son

cultivadas a 80% de humedad relativa. Incluso las plantas pudieron ser directamente

transferidas al sustrato sin la protección de una alta humedad (SHORT y ROBERTS,

1987). Estos autores señalan que disminuir la humedad relativa al interior del tubo

de cultivo, estimula una mayor producción de cera epicuticular, previene la

vitrificación, pero disminuye el crecimiento de las plantas in vitro.

El uso de inhibidores de crecimiento, como el paclobutrazol, en el medio de cultivo

durante la etapa de enraizamiento, también ha dado buenos resultados sobre la

aclimatación.

El paclobutrazol es un regulador de crecimiento vegetal que pertenece al grupo de

los triazoles. Su mayor efecto bioquímico es la abstención de la producción de

giberelinas mediante la inhibición de la oxidación de kaureno a ácido kaurenoico,

correspondiente a la etapa dos en la vía de la síntesis del ácido giberélico (AZCON-

BIETO y TALÓN, 2000).

En un estudio realizado por GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO (2001), no se

observaron diferencias (fisiológicas, morfológicas y anatómicas) entre las plantas

enraizadas en un medio con paclobutrazol y las que enraizaron en un medio sin él.

Además, este compuesto no tuvo efecto sobre la aclimatación de las plantas.

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En cambio, SMITH (1991) utilizó paclobutrazol en el medio de cultivo, obteniendo

como resultado una reducción en la vitrificación, un mejor funcionamiento

estomático, un aumento en el espesor de las raíces y en el contenido de clorofila por

hoja.

El uso de paclobutrazol y la reducción de la humedad relativa, en crisantemo, rosa y

vid, otorgó como resultado que las plantas desarrolladas en estas condiciones in

vitro, se aclimataron mucho más rápido e incluso no necesitaron aclimatación

(SMITH, 1991).

RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991) mencionan que una disminución de la humedad

relativa, en el ambiente in vitro, o paclobutrazol en el medio de cultivo, estimuló el

desarrollo de hojas con un incremento en su producción de cera epicuticular, un

mejor funcionamiento estomático y una reducción en su deshidratación, por lo tanto,

incrementó el porcentaje de sobrevivencia de las plantas al ser transferidas a

condiciones ex vitro. Además, señalan que el uso de paclobutrazol provocó una

disminución de la altura de la planta y que la reducción de la humedad relativa

incrementó el número de hojas, la superficie foliar y la materia seca de las plantas.

Además, se determinó que la humedad relativa óptima al interior del tubo de cultivo,

para el desarrollo de las plantas in vitro, fue del 81%.

GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO (2001) facilitan el proceso de aclimatación al

utilizar paclobutrazol y reducción de la humedad relativa durante la etapa de

enraizamiento, esto se debe a que modificaron rasgos morfológicos y fisiológicos de

las plantas in vitro.

SMITH et al. (1992) señalan que se pueden obtener resultados mucho más

favorables al combinar el uso de paclobutrazol, en el medio de enraizamiento, con la

reducción de la humedad relativa, al interior del tubo de cultivo, e incluso, no es

necesario efectuar el proceso de aclimatación.

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3. MATERIALES Y MÉTODOS Los ensayos se realizaron en el Laboratorio de Propagación “Profesor Gregorio

Rosenberg”, en la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de

Valparaíso, calle San Francisco s/n, la Palma, Provincia de Quillota, V Región,

Chile, entre marzo del 2002 y agosto del 2003.

3.1. Material vegetal: El material utilizado para cada ensayo se extrajo de una planta de violeta africana

(Saintpaulia ionantha Wendl.) variedad Heidrun, que tenía un tamaño de 7*13 cm y

que en ese momento se encontraba en floración, ésta se ubicó en el invernadero del

laboratorio en un contenedor de 500 cc. Estas plantas se obtuvieron en el vivero

Sakura, ubicado en la zona de La Cruz.

Los explantes de violeta se obtuvieron a través del método descrito por KYTE

(1987) y todos los ensayos se realizaron en la etapa de enraizamiento.

Los medios de enraizamiento se prepararon mediante soluciones madres según lo

descrito por la técnica de PIERIK (1987), para las cuales se utilizó agua bidestilada

al igual que para las diluciones, con el fin de formar los medios de cultivo.

La formulación mineral de los medios de enraizamiento utilizada fue la descrita por

MURASHIGE y SHOOG (1962) y los medios se prepararon según lo descrito por

PIERIK (1990).

El pH de los medios de cultivo se ajustó a 5.5, utilizando alícuotas de Ácido

clorhídrico 0.1 N o Hidróxido de Potasio 0.1 N.

Se emplearon tubos de vidrio de 2 * 8 cm, en los que se vertieron 15 ml de medio y

se cubrieron, posteriormente, con un trozo de papel aluminio de 25 cm2.

19

La esterilización se realizó en un autoclave de control manual a 121 ºC y a 1,1 bar

de presión, por 15 minutos.

El repique del material vegetal se realizó en una cámara de flujo laminar con aire

filtrado a 0.2 micras, disponiendo un explante (conjunto de microhojas) por tubo.

Una vez realizado el repique, los tubos se almacenaron en una cámara de

crecimiento a 25 ± 2 ºC, con tubos de luz fluorescente (luz blanca fría), con una

intensidad lumínica de 1600 lux y un fotoperíodo de 16 horas.

Las mediciones de longitud se realizaron con un pie de metro digital, marca

Mitutoyo, por fuera y adosado al tubo. La altura de la planta fue considerada desde

la superficie del medio hasta la lámina foliar con mayor altura (mm), el ancho de la

planta se midió desde los bordes externos de las láminas foliares más externas

(mm).

Se obtuvo el porcentaje de enraizamiento de las plantas, en cada tratamiento (que

serán descritos en cada ensayo), al momento de ser retirada de las condiciones in

vitro. Se consideró como planta enraizada aquella con, al menos, una raíz de 3 mm,

la que se midió desde la superficie del medio hacia abajo.

La presencia de estomas, su estado y la densidad estomática se midieron por medio

de impresiones epidermales en el haz y envés de la hoja, en 2 plantas por

tratamiento y 3 hojas por planta. Estas impresiones se obtuvieron al aplicar una

pincelada de pegafix madera marca Henkel en el haz y en el envés de la hoja. Una

vez que la impresión estuvo seca se retiró cuidadosamente y posteriormente, se

observó en un microscopio eléctrico marca Nikon, con un lente 10/0,25.

El grado de vitrificación se evaluó con una escala descrita por MESA (2001), en

donde se asignó una calificación a cada estado del explante:

1 : Explante sin vitrificación

20

2 : Explante con 50% de vitrificación

3 : Vitrificación total del explante

El color del explante se evaluó con una tabla Munsell (MUNSELL, 1998), asignando

un número a cada color del explante:

1 : 7.5 GY 4 / 4 (color verde oscuro)

2 : 5 GY 3 / 4 (color verde característico de la especie)

3 : 5 GY 5 / 8 (color verde claro)

4 : 2.5 GY 8 / 12 (color amarillo- verde)

3.2. Ensayo 1. Reducción de la humedad relativa, con el uso de polipropileno y su efecto sobre la aclimatación:

En este ensayo, se evaluó el uso de cinco cubiertas utilizadas para el cierre de los

tubos de cultivo, donde cada una de ellas se identificó como uno de los tratamientos

realizados.

Para la reducción de la humedad relativa, se utilizaron cuatro cubiertas de

polipropileno, que se diferenciaban entre sí por su porosidad y, como consecuencia,

por su grado de ventilación al interior del tubo de cultivo.

Los tratamientos fueron los siguientes:

T0: cubierta de papel aluminio (Control)

T1: cubierta A de polipropileno

T2: cubierta B de polipropileno

T3: cubierta C de polipropileno

T4: cubierta D de polipropileno

Para cada tratamiento, se realizaron 30 repeticiones.

21

Estas cubiertas de polipropileno se obtuvieron de las mascarillas empleadas en los

pabellones quirúrgicos (FIGURA 1), que se componen por tres telas de polipropileno

que no tienen una porosidad comercial y, por lo tanto, para poder identificarlas se

pesó un trozo de 7 cm2, de cada una de ellas, en una balanza electrónica marca

Precisa y se la clasificó con un número. La tela 1 fue la menos porosa y pesó 160

mg, la tela 2 poseía una porosidad intermedia y su peso fue de 110 mg y finalmente

la tela 3 se identificó como la más porosa y pesó 70 mg.

Entre sí, estas cubiertas, se diferencian por la combinación de las telas y para poder

identificarlas se les asignó una letra. De lo anterior, se obtiene que la cubierta A se

compone por la combinación de la tela 2 y 3, la cubierta B por la combinación de la

tela 1 y 2, la cubierta C por la combinación de la tela 1 y 3 y, finalmente, la cubierta

D por la combinación de todas las telas (FIGURA 2).

Su esterilización se realizó, en una estufa con calor seco a 105 ºC, por un período

de dos días, justo antes de ser ocupadas.

Como explante, se utilizó un conjunto de microhojas, el cual presentaba una altura

mínima de 15 mm, un ancho de 18 mm y un mínimo de seis microhojas, de las

cuales, cuatro debían tener una lámina de un tamaño superior a ocho milímetros.

El medio de enraizamiento con el que se trabajó, corresponde a un MS

(MURASHIGE y SKOOG, 1962), con macroelementos y microelementos,

suplementados con 0,1 mg/l de tiamina, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de

piridoxina, 0,2 mg/l de bencil amino purina (BAP), 0,3 mg/l de ácido indol butírico

(AIB), 100 mg/l de inositol, 300 mg/l de carbón activo, 25 g/l de sacarosa y como

gelificante se utilizó 7,5 g/l de agar algas marinas.

Las plántulas que serían utilizadas, se llevaron a la cámara de flujo, donde se

depositó un explante, en el medio de enraizamiento, por cada tubo de cultivo.

22

FIGURA 1. Mascarilla utilizada en los pabellones

quirúrgicos y las tres telas que la componen.

23

FIGURA 2. Cubiertas de polipropileno utilizadas para tapar los

tubos de cultivo.

Cubierta A

Tela 2

Tela 3

Tela 1

Tela 3

Cubierta B

Cubierta C Cubierta D

Tela 1

Tela 1

Tela 3

Tela 2

Tela 2

24

Luego se colocó la cubierta sobre la superficie del tubo de cultivo y se selló con

vitafilm sólo por la parte lateral, para mantenerla firmemente adherida, teniendo la

precaución de no cubrir la superficie (FIGURA 3).

Posteriormente, los tubos se almacenaron en la cámara de crecimiento por un

período de 20 días (FIGURA 4). Durante este tiempo, en cuatro ocasiones, es decir,

cada cinco días, a las plántulas se les realizó la medición de las siguientes

variables: altura (mm), ancho (mm), color, vitrificación, número total de hojas (n),

número de hojas con una lámina superior a 8 mm (n) y altura del medio de cultivo

(mm).

Al transcurrir estos 20 días, las plantas se retiraron de la condición in vitro para ser

llevadas a la condición ex vitro, en el invernadero. Al momento de transplantar al

sustrato, se midió el porcentaje de enraizamiento (%), la densidad estomática

(número de estomas/ mm2) y todas las variables mencionadas anteriormente.

Se evaluó la altura del medio de cultivo, ya que, al existir una mayor ventilación al

interior del tubo, se provocó una rápida deshidratación del medio. Por lo tanto, es

importante conocer su agotamiento, para evitar que los explantes queden sin él,

antes de ser retirados de las condiciones in vitro.

Previamente al transplante, las plántulas se retiraron del medio de cultivo y sus

raíces se lavaron con abundante agua, con el objetivo de retirar todo el agar

adherido a ellas, y ,con ello, evitar la proliferación de hongos y de otros patógenos.

Para el transplante a sustrato se utilizó como contenedor, un vaso de plumavit de

230 cc de capacidad, los cuales previamente se lavaron con abundante agua y

luego se asperjaron con una solución funguicida de Benlate – Captan. Además, para

favorecer el drenaje del exceso de agua, los vasos se perforaron en la base con 4

orificios (de un diámetro de 6,35 mm). Luego de esto, los recipientes se llenaron a

dos tercios de su capacidad, con una mezcla de turba y perlita (1:1).

25

FIGURA 3. Procedimiento realizado para preaclimatar plántulas de violeta africana, utilizando cubiertas de polipropileno.

A

B

26

FIGURA 4. Fotografía de los tubos de crecimiento con las cinco cubiertas utilizadas, en la cámara de crecimiento.

27

Las plántulas se transplantaron a los contenedores, teniendo la precaución de no

dañar las raíces desarrolladas in vitro. Luego, se realizó un riego hasta que drenó

agua por los orificios ubicados en la base del contenedor.

Finalmente, para mantener una alta humedad relativa, los contenedores de todos

los tratamientos se cubrieron con bolsas de polietileno transparentes (10 * 15 cm), que se sellaron en la base con cinta de embalaje (FIGURA 5). Posteriormente, se

llevaron a invernadero frío por una semana y luego se trasladaron al sombreadero

(FIGURA 6).

Al quinto día después del transplante, se realizó un corte de aproximadamente tres

centímetros en una de las puntas de cada bolsa, a los 10 días en la otra punta; a los

15 días, se abrió el borde superior y, a los 20 días, se retiró completamente la bolsa

(FIGURA 7). Este procedimiento corresponde a la etapa de aclimatación, donde las

plantas se adaptaron gradualmente a la humedad ambiental existente.

Al completar el período de aclimatación, es decir, a los 20 días, se midió el

porcentaje de sobrevivencia (%), la altura (mm), el ancho (mm), el número total de

hojas (n), el número de hojas con lámina superior a ocho milímetros y el color.

El riego se realizó por los orificios ubicados en la base del contenedor, al colocarlo

en el interior de un balde con agua. Se revisó periódicamente la humedad del

sustrato y éste se regó cada vez que se necesitó.

El ensayo se condujo como un diseño completamente al azar (DCA), en el que la

unidad experimental fueron las plántulas de violeta africana y se realizaron 30

repeticiones por tratamiento. Para determinar el efecto de los tratamientos, se

realizó un análisis de varianza y, en caso de existir efecto de algún tratamiento, se

aplicó un test de separación de medias de Tukey o un test no paramétrico de

Kruskal – Wallis, dependiendo de la variable analizada, para poder identificar cuál o

cuáles fueron los tratamientos efectivos.

28

FIGURA 5. Fotografía que muestra el uso de una bolsa de polietileno transparente para mantener una alta humedad relativa alrededor de la planta.

29

FIGURA 6. Fotografía de las plantas in vitro de violeta

africana aclimatándose en el invernadero.

30

Día 1 Día 5 Día 10

Día 15 Día 20

FIGURA 7. Aclimatación de las plantas in vitro de violeta

africana (Saintpaulia ionantha Wendl.), con el uso de una bolsa de polietileno transparente.

31

Las variables cuantitativas como largo, ancho, número de hojas, número de hojas

con una lámina superior a ocho centímetros, altura del medio de cultivo, densidad

estomática, porcentaje de enraizamiento, porcentaje de sobrevivencia y vitrificación

se contrastaron con el test de separación de medias de Tukey con un 95% de

confianza.

En cambio, el color corresponde a una variable cualitativa, y se contrastó con el test

no paramétrico de Kruskal – Wallis con un 95% de confianza.

Se midió la humedad relativa al interior de los tubos de cultivo, de cada uno de los

cinco tratamientos, utilizando un sensor de temperatura y humedad marca ERTCO.

Estas mediciones se realizaron por un período de cuatro días, con cada una de las

cubiertas.

Esta medición no pudo ser realizada en los tubos de cultivo de 2 * 8 cm, utilizados

para el enraizamiento de las plántulas, debido a que el tamaño del sensor era

mucho mayor que la apertura del tubo, por lo tanto, se utilizaron tubos de cultivo de

un diámetro mayor (4.5 * 11 cm), esta característica aumenta los riesgos de

contaminación, por esta razón en su interior no se colocaron explantes.

El sensor se ubicó colgando a la mitad del tubo, de manera de no tocar ni el medio

de cultivo ni las paredes de vidrio. Se sostuvo con un armazón de fierro, el cual se

fijó al tubo con un elástico. Luego, se tapó la superficie con una de las cubiertas y,

finalmente, se selló por la parte lateral con vitafilm (FIGURA 8).

Posteriormente, estos tubos de cultivo se almacenaron en la cámara de crecimiento

utilizada para este ensayo.

32

FIGURA 8. Instalación del sensor de humedad relativa y temperatura.

33

3.3. Ensayo 2. Uso de CCC o cycocel y su efecto sobre la aclimatación: Los explantes de violeta africana que se utilizaron para este ensayo contaban con

las mismas características de los del Ensayo 1.

Se utilizó cycocel (CCC) que cuenta con características similares al paclobutrazol,

ya que también es un inhibidor de la síntesis de las giberelinas (SALISBURY y

ROSS, 1994).

Como medio de enraizamiento, se utilizó un MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962),

con macroelementos y microelementos, suplementados con 0,1 mg/l de tiamina, 0,5

mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina, 0,2 mg/l de bencil amino purina

(BAP), 0,3 mg/l de ácido indol butírico (BAP), 100 mg/l de inositol, 300 mg/l de

carbón activo, 25 g/l de sacarosa y, como gelificante, se utilizó 7,5 g/l de agar algas.

A los tubos del tratamiento correspondiente se les adicionó un miligramo por litro de

CCC.

Los tratamientos fueron los siguientes:

T0: medio de enraizamiento + 0 mg/l de cycocel(Control)

T1: medio de enraizamiento + 1mg/l de cycocel

Para cada tratamiento, se realizaron 30 repeticiones.

Luego de que se colocó un explante por tubo, la superficie de éstos se cubrió con

papel aluminio y se sellaron con vitafilm, solo por los laterales, de manera de dejarla

muy firmemente adherida al tubo.

Finalmente, los tubos con los explantes en su interior se llevaron a la cámara de

crecimiento, en donde se midieron las mismas variables descritas en el Ensayo 1, a

34

excepción de la altura del agar ya que con esta cubierta no se corrían riesgos de

deshidratación.

El traslado de las plántulas de violeta africana (Saintpaulia ionantha Wendl.), desde

las condiciones in vitro a las condiciones ex vitro y su posterior aclimatación, se

realizó de la misma forma descrita en el Ensayo 1.

El ensayo se condujo como un diseño completamente al azar (DCA), donde la

unidad experimental fueron las plántulas de violeta africana y se realizaron 30

repeticiones por tratamiento. Para determinar el efecto de los tratamientos se realizó

un análisis de varianza y, de existir diferencia estadísticamente significativa entre los

tratamientos, se aplicó un test de separación de medias para poder identificar cuál o

cuáles fueron los tratamientos efectivos. Las variables cuantitativas se contrastaron

con el test de separación de medias de Tukey y el color con un test no paramétrico

de Kruskal – Wallis.

35

4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

4.1. Ensayo 1. Reducción de la humedad relativa, con el uso de polipropileno y su efecto sobre la aclimatación:

El análisis de varianza efectuado a los 5 días de enraizamiento in vitro, permitió

determinar, con un error del 5%, que no existió efecto de las cubiertas sobre las

variables medidas. Es decir, con todos los tratamientos, el resultado, en cada una

de las variables, fue el mismo.

Estos resultados pueden deberse al corto período transcurrido entre el

establecimiento de los explantes y el momento de la medición, lo que pudo haber

impedido una respuesta de las plántulas.

El análisis de varianza, realizado en las cuatro fechas evaluadas, permitió

determinar (P=0.05) que no existió efecto de las cubiertas sobre la altura de las

plántulas de violeta africana. Es decir, con todos los tratamientos, se obtuvo el

mismo resultado, en la altura. Esto podría ser debido a que estas plantas presentan

un crecimiento en roseta con tallos muy cortos (LARSON, 1988), por lo tanto, la

variable ancho expresa mejor su crecimiento.

El test de Tukey (P=0.05), realizado a los 10, 15 y 20 días de enraizamiento in vitro,

indicó que existen diferencias significativas respecto al ancho de las plántulas de

violeta africana, como efecto de las cubiertas de los tubos de cultivo (CUADRO 1).

A los 10 días de enraizamiento in vitro, se observó en las plántulas del tratamiento

control, es decir, con cubiertas de papel aluminio, el valor más alto de esta variable

y, en las provenientes de los tubos con la cubierta de polipropileno C, el valor más

bajo. Por otra parte, los tratamientos con las cubiertas A, B y D exhibieron una

igualdad estadística entre sí y con tratamiento con la cubierta C y el tratamiento

control (papel aluminio).

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CUADRO 1. Efecto de las cubiertas, utilizadas para tapar los tubos de cultivo, sobre el ancho (mm) de las plantas in vitro de violeta africana a los 10, 15 y 20 días de enraizamiento in vitro

Tratamiento Día 10 Día 15 Día 20

T0 Control 24,21 a* 25,27 a* 26,91 a* T1 Cubierta A 23,29 ab 24,57 ab 25,99 ab T2 Cubierta B 23,47 ab 24,38 ab 23,35 b T3 Cubierta C 22,59 b 23,95 b 25,01 b T4 Cubierta D 23,56 ab 24,52 ab 25,30 b

* Promedios con letras iguales, en la misma columna, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test de Tukey (P=0.05). Los resultados obtenidos a los 15 días de enraizamiento in vitro, siguieron la misma

tendencia estadística que en la medición anterior, aunque se observó un aumento

del valor promedio en cada tratamiento.

Al igual que en las dos mediciones anteriores, se observó que las plántulas del

tratamiento control presentaron el valor más alto en esta variable, es decir,

obtuvieron un mayor desarrollo in vitro, que las provenientes de los tratamientos con

cubiertas de polipropileno.

Estos resultados concuerdan con lo señalado por ZOBAYED, ARMSTRONG y

ARMSTRONG (2001), quienes observaron que el tamaño de las plantas in vitro

estaba inversamente relacionado con el grado de ventilación del tubo de cultivo.

Además, SHORT y ROBERTS (1987) señalaron que al disminuir la humedad

relativa al interior del tubo de cultivo, se reduce el crecimiento de las plántulas.

Contrario a esto, CASTRO (1993) señala que obtuvo un mayor crecimiento en los

explantes de frutilla provenientes de tubos cubiertos con papel aluminio; asimismo,

DE PROFT et al. (1985) citados por CASTRO (1993) señalan que un sellado

hermético provoca un crecimiento detrimental en los cultivos, a diferencia de un

sellado que permita el intercambio gaseoso.

37

En cambio, SANTAMARÍA et al. (2000) mencionan que la tasa de crecimiento de la

planta no fue afectada por el grado de ventilación de los tubos de cultivo, lo cual no

coincide con los resultados descritos anteriormente, ya que, en este ensayo, se

observó influencia de la ventilación en el volumen de las plántulas.


para las variables número total de hojas y número de hojas con una lámina superior

a ocho milímetros, determinó que existen diferencias significativas entre las

cubiertas utilizadas para tapar los tubos de cultivo (CUADRO 2).

CUADRO 2. Efecto de las cubiertas, utilizadas para tapar los tubos de cultivo, sobre el número total de hojas (NTH) y el número de hojas con una lámina superior a ocho milímetros (NHL) en las plantas in vitro de violeta africana, a los 10, 15 y 20 días de enraizamiento in vitro

Día 10 Día 15 Día 20 Tratamiento NTH NHL NTH NHL NTH NHL

T0 Control 9,46 a* 4,66 a* 10,70 a* 5,10 a* 12,06 a* 5,63 a* T1 Cubierta A 8,40 ab 3,50 abc 8,70 b 2,38 b 8,80 b 4,00 b T2 Cubierta B 8,73 ab 3,73 ab 8,93 b 3,43 b 9,40 b 4,03 b T3 Cubierta C 8,16 b 2,33 c 8,46 b 3,16 b 8,76 b 3,76 b T4 Cubierta D 8,20 b 3,06 bc 8,66 b 3,16 b 9,00 b 3,70 b * Promedios con letras iguales, en la misma columna, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test de Tukey (P=0.05).

En la medición realizada a los 10 días de enraizamiento in vitro, se observó el mayor

número total de hojas en las plántulas provenientes del tratamiento con papel

aluminio (tratamiento control) y el valor más bajo, en el tratamiento con la cubierta C

y D. Además, los tratamientos con las cubiertas A y B son estadísticamente iguales

entre sí e iguales a los tratamientos con las cubiertas C, D y al tratamiento control

con papel aluminio.

El mayor número de hojas con una lámina superior a ocho milímetros, a los 10 días

de enraizamiento in vitro, se observó en los tratamientos con las cubiertas A , B y

38

con papel aluminio (control); en cambio, el valor más bajo se observó en los

tratamientos con las cubiertas A, C y D.

En las dos últimas mediciones, es decir, a los 15 y 20 días de enraizamiento in vitro,

el tratamiento control (cubierta de papel aluminio) continuó presentando los valores

más altos en estas variables. En cambio, los valores más bajos se registraron en los

tratamientos con las cubiertas de polipropileno, que entre sí, no presentaron

diferencia estadísticamente significativa.

Estos resultados coinciden con lo señalado por SANTAMARÍA et al. (2000) quienes

observaron una mayor área foliar en las plantas de Delphinium, provenientes de

tubos con una menor tasa de intercambio gaseoso.

Sin embargo, SMITH (1991) reportó que al disminuir la humedad relativa al interior

del tubo de cultivo, se observó una reducción en la longitud del tallo y un aumento

en el área de la hoja en crisantemo, rosa y vid. Lo que coincide con lo señalado por

TAKAZAWA, KOZAI y WATANABE (1990), quienes observaron un mayor peso

seco, peso fresco y área foliar en los ambientes enriquecidos con CO2, es decir, en

los tubos que poseen una mayor ventilación.

Según el test de Tukey (P=0.05), realizado para la vitrificación, a los 10, 15 y 20 días

de enraizamiento in vitro, existen diferencias significativas entre las cubiertas

utilizadas para tapar los tubos de cultivo (CUADRO 3).

En el Cuadro 3, se puede observar que, en estas tres fechas evaluadas, se mantuvo

la misma tendencia estadística y que, además, los promedios no sufrieron variación.

Sólo en el tratamiento control, con papel aluminio, se observó la presencia de

plantas con vitrificación, en cambio, en los tratamientos con cubierta de polipropileno

la presencia de este fenómeno fue nula. Lo que coincide con los resultados

39

obtenidos por SHORT y ROBERST (1987), quienes señalan que al disminuir la

humedad relativa al interior del tubo de cultivo se previene la vitrificación.

CUADRO 3. Efecto de las cubiertas de los tubos de cultivo, sobre la vitrificación de las plantas in vitro de violeta africana, a los 10, 15 y 20 días de enraizamiento in vitro


To Control 1,33 a* 1,33 a* 1,33 a* T1 Cubierta A 1,00 b 1,00 b 1,00 b T2 Cubierta B 1,00 b 1,00 b 1,00 b T3 Cubierta C 1,00 b 1,00 b 1,00 b T4 Cubierta D 1,00 b 1,00 b 1,00 b

* Promedios con letras iguales, en la misma columna, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test de Tukey (P=0.05).

Asimismo, RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991) mencionan que una disminución de

la humedad relativa en el ambiente in vitro disminuye la incidencia de la vitrificación

en las plántulas.

Se observó, a lo largo de todo el período de enraizamiento in vitro, que las plántulas

del tratamiento control presentaron los valores más altos en todas las variables

medidas. Esto se traduce en que, a pesar de presentar un 50% de vitrificación en

alguna de sus plantas, lograron el mayor desarrollo in vitro.

La variable color, a los 5 y 10 días de enraizamiento in vitro, no mostró diferencias

significativas, según el test no paramétrico de Kruskall – Wallis (P=0.05). En ambas

ocasiones, la mayoría de las plántulas, en los cinco tratamientos, presentaron el

color verde característico de la especie (5 GY 3/4, según tabla MUNSELL, 1988).

En cambio, cuando se realizó este test, a los 15 y 20 días de enraizamiento in vitro,

se determinó que existían diferencias significativas entre las cubiertas de los tubos

de cultivo, respecto a esta variable (CUADRO 4).

40

En estas dos mediciones se observó la misma tendencia estadística, a pesar de que

el valor promedio aumentó en el tiempo.

CUADRO 4. Efecto de las cubiertas de los tubos de cultivo, sobre el color de las plántulas de violeta africana, a los 15 y 20 días de enraizamiento in vitro

Tratamiento Día 15 Día 20

To Control 2,67 a* 3,03 a* T1 Cubierta A 2,17 b 2,13 b T2 Cubierta B 2,07 b 2,07 b T3 Cubierta C 2,07 b 2,07 b T4 Cubierta D 2,17 b 2,23 b

* Promedios con letras iguales, en la misma columna, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test no paramétrico de Kruskall – Wallis (P=0.05).

Los mejores resultados se obtuvieron en los tratamientos con las cubiertas de

polipropileno, ya que éstos presentaron la mayor cantidad de plántulas de violeta

africana con el color verde característico de la especie (5 GY 3/4, según tabla

MUNSELL, 1988). En cambio en el tratamiento control, con papel aluminio, se

observó que la mayor cantidad de plantas presentaron un color verde claro (5 GY

5/8, según la tabla de MUNSELL, 1988) y amarillo verdoso (2.5 GY 8/12, según la

tabla de MUNSELL, 1988). Este menor contenido de clorofila en los tubos con papel

aluminio podría deberse a que las habituales condiciones in vitro son desfavorables

para su producción (MORALES, 1992).

Además, estos resultados concuerdan con lo señalado por GRIBAUDO, NOVELO y

RESTAGNO (2001), quienes observaron un aumento en la cantidad de clorofila al

disminuir la humedad relativa al interior del tubo de cultivo, lo que se reflejó, en un

predominio del color verde intenso. Este fenómeno podría reforzar la proporción de

fotosíntesis de las plantas, disminuyendo las pérdidas en el transplante.

En los Cuadros 2, 3 y 4, se puede observar al retirar las plántulas de la condición in

vitro, que las provenientes de los tratamientos con cubiertas de polipropileno (T1,

41

T2, T3 y T4) no presentaron diferencia estadística entre sí, aunque existió diferencia

con las procedentes del tratamiento control, respecto a las variables número total

de hojas, número de hojas con una lámina superior a ocho milímetros, vitrificación y

color. Sin embargo, respecto a la variable ancho observada en el Cuadro 1, las

plántulas provenientes del tratamiento con la cubierta A de polipropileno son

estadísticamente iguales a las del tratamiento con cubierta de papel aluminio

(control) y a los otros tres tratamientos con cubiertas de polipropileno (T2, T3 y T4).

El test de Tukey (P=0.05), realizado para la altura del medio de cultivo, en las cuatro

fechas evaluadas, determinó que existen diferencias significativas entre las

cubiertas utilizadas en los tubos de cultivo (CUADRO 5).

La altura inicial del medio de enraizamiento, al verter los 15 ml en los tubos, fue de

23,44 mm.

CUADRO 5. Efecto de las cubiertas de los tubos de cultivo sobre la altura (mm) del

medio de enraizamiento, en las cuatro fechas evaluadas. La altura inicial del medio, con 15 ml, fue de 23,44 mm

Tratamiento Día 5 Día 10 Día 15 Día 20

T0 Control 23,04 a* 22,46 a* 22,07 a* 21,81 a* T1 Cubierta A 19,16 b 16,27 b 14,31 b 13,00 b T2 Cubierta B 19,47 ab 17,15 b 15,84 b 14,44 b T3 Cubierta C 18,36 b 15,70 b 14,16 b 12,58 b T4 Cubierta D 19,36 b 16,54 b 14,74 b 13,25 b


En el Cuadro 4, se puede observar que el mayor agotamiento ocurrió en los

tratamientos con cubiertas de polipropileno y que, en los tubos con cubierta de papel

aluminio, su agotamiento fue casi nulo.

Similares resultados obtuvieron MURPHY et al. (1998), quienes observaron que la

pérdida de peso del medio se debía a una ganancia de peso de la planta y a la

evapotranspiración, pero, en tubos con mayor ventilación, la ganancia de peso era

42

reducida y la pérdida de peso del medio era casi cinco veces mayor que en los

tubos con papel aluminio.

Al aplicar un test de comparación de medias (P=0.05), se determinó que existen

diferencias significativas entre los tratamientos, respecto al porcentaje de

enraizamiento y al porcentaje de sobrevivencia (CUADRO 6).

CUADRO 6. Efecto de las cubiertas de los tubos de cultivo, sobre el porcentaje de enraizamiento y de sobrevivencia de las plántulas de violeta africana, al momento de ser retiradas de las condiciones in vitro

Tratamiento Enraizamiento (%) Sobrevivencia (%)

T0 Control 86,66 b* 100,0 a* T1 Cubierta A 100,00 a 100,0 a T2 Cubierta B 83,33 b 100,0 a T3 Cubierta C 85,19 b 90,0 b T4 Cubierta D 79,31 b 96,7 ab

* Promedios con letras iguales, en la misma columna, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test de Comparación de Proporciones (P=0.05).

Las plantas desarrolladas en los tubos tapados con la cubierta A, presentaron el

mayor porcentaje de enraizamiento, incluso se pudo deducir que los 30 explantes

con que se inició el tratamiento se encontraron enraizados al momento de ser

retirados de las condiciones in vitro, para ser llevadas a las condiciones ex vitro, en

el invernadero. En cambio, el menor porcentaje de enraizamiento se observó en los

tratamientos restantes (T0, T2, T3 y T4), que no presentaron diferencia estadística

entre ellos.

GRIBAUDO, NOVELO y RESTAGNO (2001) señalan que el disminuir la humedad

relativa al interior del tubo de cultivo aumenta el número de raíces y su espesor, lo

que reemplazaría la pérdida de agua por las hojas.

El menor porcentaje de sobrevivencia se observó en los tratamientos con las

cubiertas de polipropileno C y D. La pérdida de plantas fue debida exclusivamente, a

la contaminación de los explantes y del medio de cultivo por hongos y bacterias. Lo

43

que podría ser causa del mayor intercambio gaseoso de las cubiertas y del trabajo

poco preciso del operador (PIERIK, 1990).

WARDLE, DOBBS y SHORT (1983) señalan que, en las plantas de crisantemo

cultivadas en tubos con una menor humedad relativa, se observó un alto porcentaje

de mortalidad y aquellas que sobrevivían eran más pequeñas y con pocas raíces.

Con respecto a las impresiones epidermales, realizadas al retirar las plantas de la

condición in vitro, se pudo observar que las plántulas de violeta africana,

independientemente del tipo de cubierta, presentaron estomas en el haz y envés de

la hoja, los cuales se encontraron abiertos y sin una forma u orden aparente.

Además, en todas las plantas, se observó la misma densidad estomática (3

estomas/mm2) (FIGURA 9).

Lo que no concuerda con lo señalado por SHORT y ROBERTS (1987), quienes

observaron que las hojas de crisantemo desarrolladas con una menor humedad

relativa, al interior del tubo de cultivo, poseían estomas que podían inducir la

apertura y el cierre. Sin embargo, no se lograba el cierre estomático en plantas

cultivadas con un 100% de humedad relativa.

Además, ZOBAYED, ARMSTRONG y ARMSTRONG (2001) observaron que el

tamaño y la densidad estomática estaban inversamente relacionados con el grado

de ventilación.

El test de Tukey (P=0.05), realizado al finalizar el período de aclimatación, para las

variables número total de hojas, número de hojas con una lámina superior a ocho

milímetros, indicó que existen diferencias significativas entre las cubiertas utilizadas

para sellar los tubos de cultivo, sobre la aclimatación (CUADRO 7).

44

FIGURA 9. Impresiones estomáticas de las hojas de las plántulas de violeta africana. A) T0: cubierta papel aluminio (control). B) T1: cubierta A de polipropileno (Tela 2 y 3). C) T2: cubierta B de polipropileno (Tela 1 y 2). D). T3: cubierta C (Tela 1y 3). E) T4: cubierta D (Tela 1, 2 y 3).

A

C

E

B

D

45

En cambio, el análisis estadístico realizado al finalizar el período de aclimatación,

para la variable ancho, determinó que no existen diferencias estadísticas entre las

cubiertas utilizadas.

CUADRO 7. Efecto de las cubiertas de los tubos de cultivo, sobre la aclimatación de las plantas de violeta africana, considerando las variables ancho, número de hojas (NTH), número total de hojas con una lámina superior a ocho milímetros(NHL) y porcentaje de sobrevivencia

Tratamiento Ancho (mm) NTH NHL Sobrevivencia (%)

T0 Control 34,34 a* 12,70 ab* 7,33 ab* 50,0 b** T1 Cubierta A 35,45 a 12,83 ab 5,83 b 100,0 a T2 Cubierta B 37,14 a 9,96 b 6,30 b 96,7 a T3 Cubierta C 36,00 a 14,03 a 8,23 a 100,0 a T4 Cubierta D 36,32 a 11,00 b 5,96 b 96,6 a

* Promedios con letras iguales, en la misma columna, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test de Tukey (P=0.05). ** Promedios con letras iguales, en las columnas, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test de Comparación de Proporciones (P=0.05).

El menor porcentaje de sobrevivencia de las plantas de violeta africana, al finalizar

el período de aclimatación, se registró en el tratamiento con papel aluminio. En

cambio, el mayor porcentaje se observó en los tratamientos con las cubiertas de

polipropileno A, B, C y D, que no presentaron diferencia significativa entre sí.

Lo señalado por RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991) coincide con los resultados

obtenidos en este ensayo, ya que observaron una menor deshidratación de las

plantas propagadas in vitro, al disminuir la humedad relativa al interior del tubo de

cultivo, lo que incrementó el porcentaje de sobrevivencia al ser transferidas a

condiciones in vivo.

Además, ZOBAYED, ARMSTRONG y ARMSTRONG (2001) observaron que las

plantas de tubos con un sistema de ventilación, tienen tasas de sobrevivencia más

altas que las plantas de frascos sin ventilación, al ser llevadas a las condiciones ex

vitro.

46

El mayor número total de hojas al finalizar el período de aclimatación, se observó en

las plantas provenientes del tratamiento con la cubierta C y el menor valor se

presentó en los tratamientos con la cubierta A y D. Los tratamientos con cubierta de

papel aluminio y con la cubierta A exhibieron una igualdad estadística entre sí y con

los tratamientos con las cubiertas B, C y D.

En la variable número de hojas con una lámina superior a ocho milímetros, el valor

más alto se presentó en las plantas provenientes del tratamiento con la cubierta C y

el valor más bajo, en las provenientes de los tratamientos con las cubiertas A, B y D.

Sin embargo, el tratamiento control presentó valores estadísticamente semejantes a

los tratamientos con las cubiertas de polipropileno A, B, C y D.

Con respecto al color, al finalizar el período de aclimatación, no se registraron

diferencias significativas según el test no paramétrico de Kruskall – Wallis (P=0.05).

La mayoría de las plantas presentó el color verde característico de la especie (5 GY

3/4 según la tabla MUNSELL, 1988).

Existió una evolución del color de las plantas de violeta africana, desde la etapa de

enraizamiento a la etapa de aclimatación, siendo mucho más notorio en las plantas

provenientes de los tubos con cubiertas de papel aluminio. Este menor contenido de

clorofila durante el desarrollo in vitro se debe a que las condiciones son

desfavorables para su producción (MORALES, 1992).

En cuanto a la humedad relativa al interior del tubo de cultivo, medida por 4 días con

el sensor de humedad y temperatura marca ERTCO, el test de Tukey (P=0.05)

determinó que existen diferencias significativas entre las cubiertas de polipropileno

utilizadas para tapar los tubos de cultivo (CUADRO 8).

En las tres ocasiones en que se intentó medir la humedad relativa al interior de los

tubos cubiertos con papel aluminio, no se registraron datos, lo que puede ser debido

47

a que este sensor tiene como rango máximo de medición un 97% de humedad

relativa y, en estos tubos, la literatura indica que ésta es cercana al 100%.

CUADRO 8. Efecto de las cubiertas de polipropileno, sobre la humedad relativa al

interior de los tubos de cultivo

Tratamiento Humedad relativa (%) T1 Cubierta A 92,92 b* T2 Cubierta B 90,22 bc T3 Cubierta C 87,52 c T4 Cubierta D 95,46 a


Se puede observar que la mayor humedad relativa se registró en los tubos con la

cubierta D y la menor se obtuvo con el uso de la cubierta C y cubierta B. Pero,

además, la cubierta B presentó un valor intermedio, junto con la cubierta A.

Según estos valores, se puede señalar que la ventilación de los tubos de cultivo

afectó su humedad relativa, provocando su disminución. Estos resultados son

completamente opuestos a los obtenidos por SANTAMARÍA et al. (2000), quienes

no observaron efecto de la ventilación de los tubos de cultivo sobre la humedad

relativa.

La humedad relativa del tubo de cultivo podría disminuirse aún más, ya que, como

se observó en un estudio realizado por SHORT y ROBERTS (1987), se obtuvo un

óptimo crecimiento y endurecimiento in vitro cuando las plantas se cultivaron con un

80% de humedad relativa, es decir, el crecimiento promedio de estas plantas fue

similar al de las plantas desarrolladas con 100% de humedad relativa. Además,

estas plantas, cultivadas con un 80% de humedad relativa, pudieron ser

directamente transplantadas al sustrato, sin ser protegidas con una alta humedad

relativa. Similares resultados obtuvieron RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991) con una

humedad relativa del 81%.

48

En los Cuadros 6 y 7 se puede observar que, aunque en el tratamiento con la

cubierta de papel aluminio (control) se obtuvo un 100% de sobrevivencia, al finalizar

el período in vitro, no fue relevante, ya que su porcentaje de sobrevivencia al

finalizar el período de aclimatación no solo fue el menor (50%), sino que, además,

fue muy bajo en comparación con los tratamientos con cubierta de polipropileno. En

cambio, en el tratamiento con la cubierta A de polipropileno se finalizó el período de

aclimatación con las 30 plantas con las que se inició el ensayo de preaclimatación,

lo que no ocurrió en ningún otro tratamiento. Este resultado podría deberse a que

esta cubierta es la más porosa, a causa de su composición (tela 2 y 3), por lo tanto,

permite el mayor intercambio gaseoso y además, como se observa en el Cuadro 8,

junto con la cubierta B, registró la menor humedad relativa al interior del tubo de

cultivo.

4.2. Ensayo 2. Uso de CCC o cycocel y su efecto sobre la aclimatación: En este ensayo, al igual que en el Ensayo 1, las plántulas de violeta africana se

almacenaron durante 20 días en la cámara de crecimiento, además, se realizó el

mismo número de mediciones con igual cantidad de días entre ellas y se midieron

las mismas variables, a excepción de la altura del medio de cultivo, ya que no

existían riesgos de una excesiva evapotranspiración.

El análisis de varianza, realizado a los 5 y 10 días de enraizamiento in vitro, permitió

determinar, con un error del 5%, que no existió efecto de los tratamientos sobre la

altura de las plántulas de violeta africana.

Sin embrago, al aplicar el test de Tukey (P=0.05) a los 15 y 20 días de

enraizamiento in vitro, se comprobó que existen diferencias significativas entre los

tratamientos respecto a esta variable (CUADRO 9).

En estas dos mediciones, la mayor altura de las plántulas de violeta africana se

observó en las provenientes del tratamiento con 1mg/l de CCC en el medio de

49

enraizamiento y, por consiguiente, la menor se presentó en el tratamiento sin CCC.

Aunque el valor promedio de esta variable, en cada tratamiento, se incrementó en la

segunda medición.

CUADRO 9. Efecto del uso de CCC en el medio de enraizamiento, sobre la altura

(mm) de las plántulas de violeta africana, a los de 15 y 20 días de enraizamiento in vitro

Tratamiento Día 15 Día 20

T0 0 mg/l CCC (Control) 12,85 b* 13,92 b* T1 1mg/l CCC 13,80 a 15,89 a

* Promedios con letras iguales, en la misma columna, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test de Tukey (P=0.05). Lo que no concuerda con lo señalado por RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991),

quienes observaron una disminución en la altura de las plantas in vitro, al utilizar

paclobutrazol.


indicó que existen diferencias significativas en cuanto al ancho de las plántulas de

violeta africana, como efecto del uso o no de CCC en el medio de enraizamiento

(CUADRO 10).

CUADRO 10. Efecto del uso de CCC en el medio de enraizamiento, sobre el ancho (mm) de las plantas in vitro de violeta africana, en las cuatro fechas evaluadas


T0 0 mg/l CCC (Control) 20,60 b* 23,41 a* 24,82 b* 25,94 b* T1 1 mg/l CCC 21,86 a 24,03 a 25,65 a 27,14 a


Por el contrario, el análisis estadístico realizado a esta variable, determinó que no

existen diferencias significativas entre los tratamientos, a los 10 días de

enraizamiento in vitro.

50

Se observa en el Cuadro 10 que, a los 5, 15 y 20 días de enraizamiento in vitro, el

tratamiento con CCC en el medio de cultivo, mostró el valor más alto en la variable

ancho, es decir, las plantas de este tratamiento desarrollaron el mayor volumen in

vitro.

Lo que no coincide con lo registrado por GRIBAUDO, NOVELO y RESTAGNO

(2001), quienes señalan que el uso de paclobutrazol en el medio de enraizamiento

no fue significativo en el desarrollo de las plántulas.

El análisis de varianza, realizado a los 5 días de enraizamiento in vitro, permitió

determinar, con un error del 5%, que no existió efecto de los tratamientos sobre el

número total de hojas y sobre el número de hojas con una lámina superior a ocho

milímetros de las plántulas de violeta africana.

Según el test de Tukey (P=0.05), realizado a los 10, 15 y 20 días de enraizamiento

in vitro, se demostró que existen diferencias significativas entre aplicar o no CCC al

medio de enraizamiento, en relación con la variable número de hojas con una

lámina mayor a ocho milímetros (CUADRO 11).

CUADRO 11. Efecto del uso de CCC en el medio de enraizamiento, sobre el número total de hojas (NTH) y el número de hojas con una lámina superior a ocho milímetros (NHL) de las plántulas de violeta africana, a los 10, 15 y 20 días de enraizamiento in vitro

Día 10 Día 15 Día 20

Tratamiento NTH NHL NTH NHL NTH NHL T0 0 mg/l CCC 9,03 b* 2,93 b* 10,06 a* 4,33 b* 11,10 a* 5,13 b*T1 1 mg/l CCC 9,96 a 4,56 a 10,66 a 5,76 a 11,53 a 7,43 a


En cambio, al realizar este análisis estadístico en la variable número total de hojas,

sólo se manifestaron diferencias significativas entre los tratamientos, en la medición

realizada a los 10 días de enraizamiento in vitro.

51

Las plántulas provenientes de un medio de enraizamiento con CCC desarrollaron el

mayor número total de hojas, en estas tres mediciones.

Asimismo, el mayor número de hojas con una lámina superior a ocho milímetros

también se observó, en estas tres mediciones, en las plántulas provenientes del

tratamiento con CCC en el medio de enraizamiento, por ende, el menor número se

observó en el tratamiento sin CCC. Los valores promedios de esta variable, para

cada tratamiento, se incrementaron a través del tiempo.

Esto concuerda con lo señalado por RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991), quienes

observaron un mayor número de hojas, con una mayor área foliar al utilizar

paclobutrazol en la etapa de enraizamiento.

El test de Tukey (P=0.05), realizado en las cuatro fechas evaluadas para la

vitrificación de la plántula, indicó que existen diferencias significativas entre utilizar o

no CCC en el medio de enraizamiento (CUADRO 12).

CUADRO 12. Efecto del uso de CCC en el medio de enraizamiento sobre vitrificación de las plantas in vitro de violeta africana, en las cuatro fechas evaluadas


T0 0 mg/l CCC (Control) 1,33 a* 1,33 a* 1,33 a* 1,33 a* T1 1 mg/l CCC 1,00 b 1,00 b 1,00 b 1,00 b


A lo largo de los 20 días, es decir, en las cuatro mediciones, se observó la misma

tendencia estadística y numérica en los valores promedio de la vitrificación de las

plántulas de violeta africana.

Exclusivamente en el tratamiento control, sin CCC, se observaron plantas con un

50% de vitrificación, en cambio, en los tratamientos con CCC (1mg/l) fue nula la

presencia de este fenómeno. Lo que coincide con los resultados obtenidos por

52

SMITH (1991), quien señala que, al utilizar paclobutrazol en el medio de cultivo, se

redujo la vitrificación en las plántulas.

Respecto del color de las plántulas, el análisis estadístico realizado a los 5 días de

enraizamiento in vitro, determinó, con un error del 5%, que no existió efecto al

utilizar o no CCC en el medio de enraizamiento sobre esta variable. El color

predominante en ambas ocasiones, en todos los tratamientos, fue el verde

característico de la especie (5 GY 3/4, según la tabla MUNSELL, 1988).

Por el contrario, el test no paramétrico de Kruskall – Wallis (P=0.05), realizado a los

10, 15 y 20 días, determinó que existen diferencias significativas al adicionar o no

CCC al medio de enraizamiento, respecto a esta variable (CUADRO 13).

CUADRO 13. Efecto del uso del de CCC en el medio de enraizamiento, sobre el color de las plantas in vitro de violeta africana, a los 10, 15 y 20 días de enraizamiento in vitro


T0 0 mg/l CCC (control) 2,67 a* 2,73 a* 2,83 a* T1 1 mg/ l CCC 2,13 b 2,13 b 2,13 b

* Promedios con letras iguales, en la misma columna, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test no paramétrico de Kruskall – Wallis (P=0.05).

A lo largo de estas tres mediciones, se observó la misma tendencia estadística, en

la que se obtuvieron los mejores resultados en el tratamiento con CCC en el medio

de enraizamiento (1 mg/l), ya que presenta la mayor cantidad de plántulas con el

color característico de la especie (5 GY 3/4, según la tabla MUNSELL, 1988).

Sólo en este tratamiento, con CCC en el medio de enraizamiento, se obtuvo una

pequeña fracción de plántulas de violeta africana con un color verde más oscuro

(7.5 GY 4/4, según la tabla MUNSELL, 1988) que el común en esta especie.

En cambio, en el tratamiento control, sin CCC en el medio de enraizamiento, se

observó una gran cantidad de plántulas de violeta africana con los colores verde

53

claro (5 GY 5/8, según la tabla de MUNSELL, 1988), y amarillo verdoso (2.5 GY

8/12, según la tabla de MUNSELL, 1988).

Estos resultados coinciden con lo señalado por SMITH (1991), quien observó que el

uso de paclobutrazol en el medio de enraizamiento incrementó el contenido de

clorofila en las hojas.

El test de Tukey (P=0.05), realizado al momento de retirar las plántulas de violeta

africana de las condiciones in vitro, determinó que existen diferencias significativas

entre los tratamientos, respecto al porcentaje de enraizamiento y al porcentaje de

sobrevivencia (CUADRO 14).

CUADRO 14. Efecto del uso de CCC en el medio de cultivo, sobre el porcentaje de enraizamiento y de sobrevivencia de las plántulas de violeta africana, al momento de ser retiradas de las condiciones in vitro

Tratamiento Enraizamiento (%) Sobrevivencia (%)

T0 0 mg/l CCC (Control) 90 b* 90 b* T1 1mg/l CCC 100 a 100 a

* Promedios con letras iguales, en la misma columna, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test de Comparación de Proporciones (P=0.05). En el tratamiento con CCC en el medio, se obtuvo un 100% de sobrevivencia de las

plántulas de violeta africana, que corresponde al mayor valor entre los tratamientos

realizados. Lo que significa que se finalizó el período de enraizamiento, con los 30

explantes con que se dio inicio al enraizamiento.

La pérdida de plantas, en el ensayo sin CCC fue causada exclusivamente por la

contaminación del medio y de los explantes, con hongos y bacterias, lo que podría

ser causa del trabajo poco preciso del operador (PIERIK, 1990).

El mayor porcentaje de enraizamiento también se obtuvo en el tratamiento con

CCC, donde todas las plántulas de este ensayo lucieron la presencia de raíces, es

decir, las 30 plántulas iniciales.

54

Similares resultados obtuvo SMITH (1991), quien utilizó paclobutrazol en el medio

de cultivo y obtuvo como resultado un aumento en el espesor de las raíces.

Al observar las impresiones epidermales realizadas al retirar las plantas de la

condición in vitro, se pudo determinar, al igual que en el ensayo anterior, que todas

las plantas in vitro de violeta africana, independientemente de la utilización de CCC

en el medio de enraizamiento, tuvieron la misma densidad estomática (3

estomas/mm2) (FIGURA 10). Estos estomas se presentaron en el haz y envés de la

hoja, abiertos y sin una forma u orden aparente.

Lo que es contrario a lo señalado por SMITH (1991), quien observó un mejor

funcionamiento estomático al utilizar paclobutrazol durante el período de

enraizamiento, al igual que RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991), quienes también

observaron un mejor funcionamiento estomático al utilizar este compuesto.

Según el test de Tukey (P=0.05), realizado al finalizar el período de aclimatación, se

demostró que existen diferencias significativas entre los tratamientos, respecto a la

altura, número total de hojas, número de hojas mayores a ocho milímetros y

porcentaje de sobrevivencia de las plantas de violeta africana (CUADRO 15).

CUADRO 15. Efecto del uso de CCC sobre la aclimatación de las plantas de violeta africana, respecto a la altura, ancho, número total de hojas (NTH), número de hojas con una lámina superior a ocho milímetros (NHL) y porcentaje de sobrevivencia

Tratamiento Altura (mm) Ancho

(mm) NTH NHL Sobrevivencia (%)

T0 Control 35,7 b* 33,74 a* 11,46 b* 8,36 b* 83,3 b** T1 1mg/l CCC 39,9 a 36,20 a 13,16 a 10,56 a 100 a

* Promedios con letras iguales, en la misma columna, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test de Tukey (P=0.05). ** Promedios con letras iguales, en las columnas, indican que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, según el test de Comparación de Proporciones (P=0.05).

55

FIGURA 10. Impresiones estomáticas de las hojas de las plántulas de violeta africana, de cada tratamiento. A) T0: 0 mg/l de cycocel (control). B) T1: 1mg/l de cycocel

A B

56

Por el contrario, el ancho de las plantas no presentó deferencia significativa entre

los dos tratamientos realizados.

Las plantas de violeta africana, provenientes del tratamiento con CCC en el medio

de enraizamiento, registraron un 100% de sobrevivencia, por lo que se deduce que

el período de aclimatación finalizó con las 30 plantas con las cuales se comenzó el

período de enraizamiento.

Estos resultados coinciden con lo indicado por RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991),

quienes observaron que el uso de paclobutrazol en el medio de cultivo incrementó el

porcentaje de sobrevivencia de las plantas al ser aclimatadas. Al igual que SMITH et

al. (1992), quienes señalan que el uso de paclobutrazol incrementa el porcentaje de

sobrevivencia en las plantas, durante el periodo de aclimatación.

En este tratamiento, se registró el mayor número total de hojas y el mayor número

de hojas con una lámina superior a ocho milímetros en las plantas de violeta

africana, sin embargo, su altura fue la menor.

El test no paramétrico de Kruskall – Wallis (P=0.05), realizado para la variable color

al finalizar el período de aclimatación, no mostró diferencias significativas. La mayor

cantidad de plantas, en ambos tratamientos, presentó el verde característico de la

especie (5 GY 3/4, según la tabla de MUNSELL, 1988).

Las plantas que, al momento de ser retiradas de las condiciones in vitro,

presentaron colores verde claro (5 GY 5/8, según la tabla de MUNSELL, 1988) o

amarillo verdoso (2.5 GY 8/12, según la tabla de MUNSELL, 1988), al finalizar su

período de aclimatación exhibieron el color verde característico de la especie (5 GY

3/4, según la tabla de MUNSELL, 1988), lo que concuerda con lo señalado por

DONNELY y VIDAVER (1984), quienes observaron un aumento en la cantidad de

clorofila en las plantas al ser transferidas, desde condiciones in vitro, a las

condiciones externas.

57

5. CONCLUSIONES

El proceso de preaclimatación influyó sobre la respuesta de las plantas de violeta

africana, propagadas in vitro, a la aclimatación.

Con las cubiertas de polipropileno, se consiguió disminuir la humedad relativa al

interior de los tubos de cultivo, teniendo en consideración que, según la literatura, el

papel aluminio mantiene una humedad relativa al interior del tubo de cultivo cercana

al 100%.

Al preaclimatar, utilizando cubiertas de polipropileno, se logró una mejor

aclimatación de las plantas in vitro de violeta africana que al utilizar cubiertas de

papel aluminio, ya que se disminuyó la mortalidad y, en todos los tratamientos, se

obtuvieron plantas terminadas de gran desarrollo.

Al preaclimatar, utilizando cycocel (CCC) en el medio de enraizamiento, se

consiguió desarrollar plantas con una mayor resistencia para afrontar el proceso de

la aclimatación, lográndose un 100% de sobrevivencia.

Las plantas in vitro de violeta africana, independientemente del tipo de cubierta y del

uso de CCC, presentaron la misma densidad estomática en haz y envés de la hoja,

además, todos los estomas observados se encontraban abiertos y sin presentar una

forma u orden aparente.

58

6. RESUMEN En el Laboratorio de Propagación “Profesor Gregorio Rosenberg”, en la Facultad de Agronomía de la Universidad Católica de Valparaíso, ubicada en la calle San Francisco s/n, la Palma, Provincia de Quillota, V Región, se evaluó el efecto del uso de la preaclimatación de las plantas in vitro de violeta africana (Saintpaulia ionantha Wendl.), en su respuesta a su posterior aclimatación. Estos ensayos de preaclimatación se realizaron en la etapa III de la micropropagación, correspondiente al enraizamiento in vitro de las plantas. Como explante, se utilizó un conjunto de micro hojas y se trabajó como medio de enraizamiento con un MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), con macroelementos y microelementos, suplementados con 0,1 mg/l de tiamina, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina, 0,2 mg/l de bencil amino purina (BAP), 0,3 mg/l de ácido indol butírico (AIB), 100 mg/l de inositol, 300 mg/l de carbón activo, 25 g/l de sacarosa y como gelificante se utilizó 7,5 g/l de agar algas marinas. En el Ensayo 1, los tubos que se preaclimataron se taparon con una de las cuatro cubiertas de polipropileno y, luego, se sellaron por la parte lateral con vitafilm; en cambio, los tubos no preaclimatados solo se taparon con aluminio y se sellaron con vitafilm. Con las cubiertas de polipropileno, se pudo disminuir la humedad relativa al interior de los tubos de cultivo. Con dos de las cubiertas de polipropileno, se tuvieron problemas de contaminación causadas por hongos y bacterias. Sin embargo, con estas cubiertas, se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia al finalizar el período de aclimatación y su tamaño, área foliar y color no tuvieron diferencia con las plantas provenientes del tratamiento con cubierta de papel aluminio (control). En el Ensayo 2, se preaclimataron las plántulas, adicionando 1 mg/l de cycocel (CCC) al medio de enraizamiento. En dicho tratamiento, se registraron los valores más altos de sobrevivencia, tanto al finalizar el período in vitro como en la aclimatación.

59

7. LITERATURA CITADA

APTER, R.; McWILLIAMS, E. and DAVIES, F. 1993a. In vitro and ex vitro adventitious root formation in Asian jasmine (Trachelospermum asiaticum) I. Comparative morphology. J.Amer.Soc.Hort.Sci. 118 (6): 906-909.

APTER, R.; McWILLIAMS, E. and DAVIES, F. 1993b. In vitro and ex vitro

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BOUTHERIN, D. y BRON, G. 1994. Multiplicación de plantas hortícolas. Primera

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