Permisibilidad de cultivos celulares secundarios de alpaca ...

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA

E. A. P. DE MEDICINA VETERINARIA

Permisibilidad de cultivos celulares secundarios de

alpaca y llama a multiplicación viral de herpesvirus

bovino, virus de la diarrea viral bovina, virus

parainfluenza 3 bovina y virus respiratorio sincitial

bovino

TESIS

para optar el título de Médico Veterinario

AUTOR

Manuel Rodolfo Sánchez Salazar

Lima – Perú

2006

A mis padres, Manuel y Flor; a mis hermanos Renato y Vanessa. Por que sin ellos simplemente no seria nada. A mis abuelos, tíos y primos. Por su cariño y constante aliento. A mi abuelo Manuel Sánchez Quispe, por sus constantes consejos. A quienes contribuyeron directamente en la realización de esta tesis, a los doctores Hermelinda Rivera, Alberto Manchego, Nieves Sandoval, Rosa Perales, Mariluz Arainga. Al Sr. Ricardo Ibáñez y Sra. Guadalupe Mamani. A mis amigos Rocío Ramírez, Roberto Prieto, Katherine Portilla, Mercy Ramírez, Susana Cachata, Juan Carlos Huamàn, Rubén Villacaqui. Muchas gracias por su valioso apoyo. A mis amigos Gonzalo Vallenas, Otto Zea, Eduardo Sal y Rosas, Eben Salinas, Joana Ramos, Walter Paredes, Karina Vidal, Rubén Mallaopoma, Nino Arias; Quienes me brindaron su amistad, la cual valoraré por toda la vida. �

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TABLA DE CONTENIDO

Resumen

Abstract

Lista de cuadros

Lista de figuras

I. Introducción …………………………………………………..….……………1

II. Revision bibliografica. ………………………………………….…..……………3

A. La técnica de cultivo de tejidos………………………………………......3

B. Agentes virales causantes de cuadros respiratorios

y reproductivos…………………………………………………………….6

1.-Virus de la Diarea Viral Bovina……………………………….6

2.-Virus Herpes Bovino tipo 1……………………………………9

3.-Virus Respiratorio Sincitial Bovino…………………………14

4.-Virus Parainfluenza 3………………………………………..17

III. Materiales y métodos………………………………………….……..…………..20

A.- Establecimiento de cultivos celulares secundarios

de alpaca y llama………………………………………………………..20

1.-Obtención de fetos de Alpacas y Llamas………………….20

2.-Establecimiento de cultivo Primario……………….………20

3.-Establecimiento de cultivos secundarios………………….22

B.- Ensayos de permisibilidad de cultivos celulares………………...……23

C.-Observación y evaluación de las monocapas inoculadas…………...24

1.-Determinación de Cambios Citopatogénicos………………24

2.-Detección de antígenos virales………………………………25

IV. RESULTADOS …………………………………………..……………………...26

V. DISCUSIÔN ………………………………………………………………….34

VI.CONCLUSIONES…………………………….………………………………......41

VII. LITERATURA CITADA……………………………………………………….…42

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LISTA DE CUADROS �

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Cuadro 1. Cepas virales y tipo celular utilizados………………………………27

Cuadro 2.Caracterización de ECP en cultivos celulares………………………28

Cuadro 3. Tiempo transcurrido a la presentación de ECP según tipo

celular………………………………………………………………………………..29

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LISTA DE FIGURAS.

Figura 1. Obtención de órganos de feto de alpaca para la realización de los

explantes primarios…………………………………………………………………..21

Figura 2.- Células infectadas con Virus Parainfluenza Bovina 3……………….30

Figura 3. Células infectadas con Herpevirus Bovino tipo 1……………………..31

Figura 4. Células infectadas con Virus respiratorio Sincitial Bovino…………...32

Figura 5. Células infectadas con Virus de la Diarrea Viral Bovina……………..33

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RESUMEN.

El objetivo del presente estudio fue determinar la permisibilidad de los cultivos

celulares secundarios de alpaca y llama a la infección por distintos agentes

virales de conocida seroprevalencia en este tipo de ganado. Se establecieron

dos líneas celulares de cornete nasal y piel de alpaca y llama infectándose con

Virus de la diarrea viral bovina (VDVB), Virus Herpes Bovino tipo 1 (VHB-1),

Virus respiratorio Sincitial Bovino (VRSB) y Virus Parainfluenza bovino tipo

3(VPI-3). Se determinó y caracterizó la presentación de efectos citopatogénicos

(ECP) por medio de microscopia óptica de las monocapas teñidas con

Hematoxilina-Eosina (HE). Se confirmó la presencia de antígenos virales por

medio de la prueba de Inmunofluorescencia Directa (IF). Los cultivos celulares

secundarios de piel y cornete nasal de llama y alpaca fueron permisibles a la

infección de los distintos virus, presentando los ECP característicos de cada

uno de ellos. Esto demuestra que las células de alpaca y llama cultivadas in

vitro presentan receptores homólogos a los presentes en células bovinas y

determina que este tipo de cultivos es un modelo apropiado para ensayos de

infección viral.

Palabras claves: alpacas, llamas, líneas celulares, permisibilidad, Virus de la

diarrea viral bovina (VDVB), Virus Herpes Bovino tipo 1 (VHB-1), Virus

respiratorio Sincitial Bovino (VRSB) y Virus Parainfluenza bovino tipo 3(VPI-3),

Efectos citopatogénicos (ECP).

SUMMARY.

In order to determine the permisibility of alpaca and llama cell cultures to

infection by various viral agents of known seroprevalence, nasal turbinate and

skin cell lines of alpaca and llama were established and infected with Bovine

Viral Diarrhoea Virus (BVDV), Bovine Herpes Virus type 1 (BHV-1), Bovine

respiratory Sincitial Virus (BRSV) and Bovine Parainfluenza Virus type 3 (BPIV-

3). Presentation of citopathogenic effect (CPE) was determined and

characterized by optical microscopy of Hematoxilin-Eosine stained monolayers.

The presence of viral antigen was confirmed by Direct Immunofluorescence.

Every cell line was permisible to infection with the four viral strains, showing the

characteristic CPE. These results prove that alpaca and llama cells cultured in

vitro show homologue receptors to those found in bovine cells and determine

that these type of cultured cells repesent an appropriate model for viral

infection assays.

Keywords: alpaca, llama, cell lines, permisibility, Bovine Viral Diarrhoea Virus

(BVDV), Bovine Herpes Virus type 1 (BHV-1), Bovine respiratory Sincitial Virus

(BRSV) and Bovine Parainfluenza Virus type 3 (BPIV-3), Citopathogenic effect

(CPE).

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I. INTRODUCCION

Los lamoides, donde se incluyen Guanacos (Lama guanicoe), Llamas

(Lama glama), Alpacas (Lama pacos) y Vicuñas (Vicugna vicugna) son especies

indígenas de Sud América. La domesticación de las Llamas y Alpacas debe haber

ocurrido hace 5500 ó 6000 años (Wheeler, 2003).

En muchas zonas altoandinas, la crianza de Camélidos Sud Americanos

(CSA) es una actividad muy importante en la economía de los pobladores pues

representa la posibilidad de transformar recursos relativamente baratos como los

pastos y su mano de obra, en recursos de mayor valor como animales de

reproducción, carne, fibra, abono y animales de carga. Los CSA cumplen además

un rol irremplazable en la relación cultural y social de los pueblos andinos.

El 85% de la producción de camélidos sudamericanos se encuentra en

mano de las comunidades campesinas, donde el sistema de crianza es mixto,

incluyendo también especies rumiantes de origen europeo. La falta de medidas de

prevención y control de enfermedades propios de este sistema de crianza se

refleja en los altos niveles de mortalidad causada por enfermedades de origen

infeccioso (Ameghino, 1990).

Según datos obtenidos de comunidades campesinas, la enterotoxemia seria

una de las causas principales de mortalidad neonatal; así mismo, los problemas

neumónicos y reproductivos, principalmente abortos, son importantes también

(Ameghino, 1990; Ramírez, 1991).

El conocimiento de las enfermedades virales en los CSA es escaso

comparado con otras especies. No muchas enfermedades virales han sido

reportadas en los camélidos sudamericanos desconociéndose muchas veces la

prevalencia, epidemiología, patogenia, etc (Bustinza, 2000). Si bien se conoce que

los CSA son susceptibles a un número importante de enfermedades virales

descritas en el ganado de origen europeo, la dinámica de las enfermedades

infecciosas es aún desconocida (Victorio, et al., 2004). Estudios realizados en

comunidades campesinas (Manchego, et al., 1998) refuerzan la hipótesis de la

habilidad de ciertos virus de utilizar más de una especie en su cadena

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epidemiológica lo que es propiciado por la crianza mixta de las diferentes

especies de rumiantes tanto autóctonos como de origen europeo, característicos

de este tipo de crianza.

Serologicamente, se ha demostrado la exposición de camélidos

sudamericanos a Virus Respiratorio Sincitial Bovino, Parainfluenza tipo 3,

Herpesvirus Bovino tipo 1 y Virus de la Diarrea Viral Bovina (Álvarez, et al., 2002;

Manchego, et al., 1998; Risco, et al., 1998; Rivera, et al., 1987a; Sánchez, et al.,

2003; Victorio, et al., 2004). Sin embargo, no se ha demostrado claramente la

correlación de la presencia de estos virus en procesos neumónicos y abortivos en

alpacas y llamas.

Actualmente, existe la tendencia de reemplazar los modelos de

experimentación in vivo por modelos in vitro por razones económicas y éticas. La

técnica de cultivo celular representa un excelente método para estudiar la

conducta de las células animales libres de las variaciones de un sistema que

podría ocurrir en el animal tanto en condiciones normales de homeostasis como

bajo el stress de un experimento (Wisel, 2000). Lamentablemente, no existe

ninguna línea celular obtenida de CSA, lo que imposibilita la realización de

ensayos en células que permitan obtener el conocimiento de los mecanismos de

control y las funciones específicas de la especie.

El objetivo del presente estudio fue demostrar la permisibilidad de los

cultivos secundarios de Llama y Alpaca a la infección con Herpesvirus Bovino,

Virus de la Diarrea Viral Bovina, Virus Parainfluenza 3 Bovina y Virus Respiratorio

Sincitial Bovino.

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II. REVISIÓN DE LITERATURA.

A.- LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS.

1.-Generalidades.

La técnica de cultivo celular existe desde principios de siglo, actualmente se

encuentra en una fase de especialización en la que la principal preocupación es el

conocimiento de los mecanismos de control y las funciones diferenciadas según el

tipo de célula y la especie a la que estas pertenecen. (Freshney, 1987).

Representa un excelente método para estudiar la conducta de las células

animales libres de las variaciones de un sistema que podría ocurrir en el animal

tanto en condiciones normales de homeostasis como bajo el stress de un

experimento (Wisel, 2000).

Reina (2003), menciona las siguientes ventajas del uso de cultivos

celulares:

a. Permiten un control preciso y fino del medio ambiente.

En un cultivo se pueden controlar todos los factores del medio: físico-

químicos (pH, temperatura, presión osmótica, niveles de O2, CO2, tensión

superficial), y fisiológicos (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular)

b. Caracterización y homogeneidad de la muestra.

Las células en cultivo de una línea celular, o de una línea continua son

homogéneas, con morfología y composición uniformes. Se pueden obtener con

facilidad un número elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave

problema de heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de

animales de experimentación.

c. Economía.

Suponen una economía en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al

realizarse en volúmenes reducidos, y con un acceso directo de las células a la

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droga las concentraciones requeridas son mucho más bajas que en animal

completo.

d. Motivaciones éticas.

La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de muchos miles

de animales de experimentación. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al

ensayo in vivo pero es una alternativa válida en muchas situaciones

2.-Tipos de cultivos de tejidos.

Según Freshney (1987), se puede hablar de tres tipos de cultivos:

a. Cultivo de órganos.

Implica que la arquitectura característica del tejido in vivo se mantiene al

menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los

nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura

tridimensional, en general esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos

celulares diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen, pero

por el contrario no permite su propagación pues el crecimiento, de producirse, se

limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares

embrionarios. La imposibilidad de propagar obliga a partir en cada nuevo

experimento de nuevo material animal lo que conlleva una elevada

hetereogeneidad.

b. Explantes primarios.

Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en

la que proliferan las células de la periferia del explante.

c. Cultivo celular.

Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o

mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa

adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su

propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de

las generaciones. La población celular se hace uniforme y homogénea al

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predominar en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de

crecimiento. A este tipo de cultivo se le puede denominar línea celular, pudiendo

ser finitas o infinitas. A las líneas finitas obtenidas de un subpasaje de células de

un explante primario se les denomina cultivos secundarios.

3.-Aplicaciones del cultivo celular.

Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de

disciplinas y aproximaciones al estudio del fenómeno celular (Reina, 2003; Wisel,

2000).

a. Actividad intracelular.

Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares, como:

transcripción de DNA, síntesis de proteínas, metabolismo energético, entre otras.

b. Flujo intracelular.

Movimientos intracelulares de sustancias y señales asociadas a los

diferentes procesos fisiológicos, como: ensamblaje y desensamblaje de los

diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA: núcleo-citoplasma,

movimiento de proteínas.

c. Ecología celular.

Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de

la funcionalidad celular o de su diferenciación por ejemplo: estudio de las

necesidades nutricionales, infecciones, estudio de la transformación celular

(inducidas por virus o agentes químicos), cinética de la población celular.

d. Interacciones celulares.

Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por

contacto o por adhesión, interacciones célula-célula.

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B.- AGENTES VIRALES CAUSANTES DE CUADROS RESPIRATORIOS Y

REPRODUCTIVOS.

1.- Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB).

El virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB) es un virus RNA de cadena

simple y sentido positivo, perteneciente a la Familia Flaviviridae y al género

Pestivirus. Otros dos miembros de este género son el virus de la Enfermedad de la

Frontera de las ovejas y el virus de la Fiebre Porcina Clásica (Franki, et al., 1991;

Carter, 2005).

El virión consiste de 4 proteínas: la proteína del capside C y 3 glicoproteinas

Erns, E1 y E2; el genoma codifica además 6 o 7 proteínas no estructurales, Npro,

NS2-3, o NS2 y NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b (Lazar, 2003; Silflow, et al.,

2005). La proteína de envoltura E2 es el blanco de anticuerpos neutralizantes y

esta implicada en la adhesión a células, mientras que la NS3 es una proteína

altamente antigénica e inmunogenica (Silflow, et al., 2005).

Basados en comparación de las secuencias genómicas, el VDVB ha sido

dividido en 2 genotipos, VDVB 1 y VDVB 2. La diferencia biológica más importante

entre estos dos genotipos es que ambos son antigenicamente diferentes (Ridpath,

2003). Las cepas de baja virulencia pueden ser encontradas en cualquiera de los

dos genotipos. Las cepas hipervirulentas pertenecen al genotipo 2 (Ridpath, 2005)

A su vez, estos genotipos han sido divididos en subgenotipos; así, el VDVB

1 conformado inicialmente por los subtipos 1a y 1b, esta constituido ahora por 11

subgenotipos 1a - 1j ( Flores, et al., 2003; Vilcek, et al., 2005; Stalder, et al., 2005).

La tipificación del genotipo 2 no ha sido tan extensa debido probablemente a la

menor colección de aislados virales para este tipo de análisis, a la fecha sólo 2 ò 4

grupos genéticos han sido reconocidos para este genotipo (Vilceck, et al., 2005;

Flores, et al., 2003).

El virus posee dos biotipos: citopatogénico (CP) y no citopatogénico (NCP)

en base a su característica en cultivos celulares, pero ambos pueden causar

manifestaciones clínicas similares (Ridpath, 2003). Característica común a todos

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los biotipos CP es la producción de la proteína no estructural NS3, mientras que

en los biotipos NCP sólo puede ser detectada la forma no escindida NS2-3

(Peterhans et al., 2003; Tautz, et al., 1998) In vitro, las cepas citopáticas de VDVB

inducen clásicamente vacuolizaciòn y muerte celular (Grummer, 2001)

Una vez que el genoma penetra el citoplasma, es traducido por ribosomas

del huésped en una gran poliproteína, dicha poliproteína es luego escindida por

proteasas tanto virales como del huésped en las ya mencionadas 10 proteínas

individuales (Carter, 2005). El VDVB es liberado por gemación dentro de la

cisterna del retículo endoplasmático, luego ocurre una maduración en el aparato

de Golgi y la salida del virus por exocitosis o lisis celular, como mecanismo alterno

a la gemación por la membrana celular presentado por otros virus (Grummer,

2001)

La infección con el VDVB ha sido descrita en diferentes especies tales

como porcinos, ovinos, caprinos y rumiantes silvestres. Los signos clínicos en

estas especies son similares a los reportados en bovinos pero el cuadro clínico es

menos común en estas especies (Loken, 1995; Deregt, et al., 2004)

El virus puede estar presente en las distintas secreciones y semen de los

animales infectados. La diseminación es por contacto directo, de un animal

infectado a uno susceptible; o indirecto por medio de personas o instrumentos. El

modo de infección es por ingestión o inhalación (Carter, 2005; Houe, 1995),

incluso se plantea la posibilidad de que el virus pueda ser transmitido por vía

aerógena bajo ciertas circunstancias (Mars, et al., 1999). Las primeras células que

soportan la replicación viral son las tonsilas y otros tejidos linfoides regionales,

posteriormente el virus se disemina por vía sanguínea y linfática ocasionando

diversos síndromes (Baker, 1995).

In vivo, el virus puede ser aislado de células sanguíneas, bazo, riñones,

nódulos linfáticos, cornetes nasales, intestino, pulmón e hígado (Carter, 2005). In

vitro, el virus puede ser replicado de distintas líneas celulares de origen bovino

tales como la línea celular MDBK, proveniente de células de riñón ; en líneas

celulares de riñón de ternero JCK, células pulmonares de embrión bovino BEL,

cultivos primarios de cornete nasal BT(Deregt ,et al., 2004; Makoschey, et al.,

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2004). En cambio, la propagación en células de conejo RK-13 es ineficiente y

resiste algunos pocos pasajes. Los intentos de propagar el virus en células de

riñón porcino PK-15 han sido infructuosos (Deregt, et al., 2004).

Las infecciones por VDVB varían desde cuadros clínicamente inaparentes

hasta la presentación de enfermedad severa que generalmente involucra uno o

más sistemas. Los sistemas más frecuentemente afectados son el respiratorio,

gastrointestinal, inmune y reproductivo (Loken, 1995; Ridpath, 2003; Fulton, et al.,

2005). Históricamente, el VDVB estuvo asociado a enfermedad del tracto

digestivo, incluyendo cuadros de alta mortalidad. Actualmente, el VDVB es

asociado más frecuentemente con enfermedad respiratoria e infecciones fetales

(Fulton, et al., 2005) El virus ha sido asociado con el complejo respiratorio bovino

demostrando su participación en la infección del tracto respiratorio causada por

PI3, HVB-1, VRSB o Pasteurella haemolytica, actuando de manera sinérgica con

dichos agentes ( Peterhans, et al., 2003) Recientemente, cepas del genotipo 2 han

sido asociadas con brotes de una enfermedad altamente fatal caracterizada por

trombocitopenia y hemorragias (Ridpath, et al., 2003). Si la infección ocurre

durante la gestación, las consecuencias dependen de la etapa gestacional y

puede resultar en muerte embrionaria, abortos, nacidos muertos, malformaciones

o el nacimiento de terneros Persistentemente Infectados (PI)( Makoschey, 2004).

A pesar de las gran diversidad de cuadros clínicos causados por el VDVB, se sabe

que la mayoría de infecciones son subclínicas (Carter, 2005).

El aspecto de mayor relevancia de las infecciones subclínicas con el VDVB

es la infección de una vaca durante el primer tercio de gestación (antes de 120

días) con una cepa no citopatogenica (NCP). El resultado de esta infección puede

ser el nacimiento de la cría inmunotolerante al virus e infectada persistentemente

(Mc Gowan y Kirkand, 1995). Los animales con infección persistente (PI) son

incapaces de formar anticuerpos contra la cepa infectante y son los principales

reservorios del virus (Baker, 1987). Muchos de estos animales usualmente mueren

durante los primeros meses de vida debido a infecciones secundarias del tracto

respiratorio o entérico (Bolin, 1990), pero también pueden tener aspecto normal y

llegar a la etapa reproductiva transmitiendo el virus a su progenie.

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Los programas de control a nivel mundial siguen un modelo de Prueba y

Eliminación de animales PI. La vacunación como medida única de control, sin

eliminación de animales PI, no ha demostrado mejorar la situación epidemiológica.

Los animales PI que permanecen en una población convaleciente o inmunizada,

aparentemente representan tal riesgo de infección que las fallas reproductivas

incluyendo el nacimiento de más animales PI continúan ocurriendo (Moenning, et

al., 2005).

En el Perú se han detectado anticuerpos contra el VDVB en ganado vacuno

(Rivera, et al., 1993; Zanabria, et al., 2000) y ovino (Rosadio, et al., 1984); y en

alpacas y llamas de una empresa organizada de la sierra sur, donde se encontró

11% en alpacas (Rivera et al., 1987a) y 8.5% en llamas (Rivera, et al., 1990),

estudios posteriores en CSA en una comunidad campesina de Arequipa, han

demostrado un 14% de alpacas positivas y un 10% en llamas (Manchego, et al.,

1998). No se detectaron anticuerpos neutralizantes contra el VDVB, durante una

campaña reproductiva en alpacas de la estación experimental IVITA Cusco (Risco,

et al., 1998), pero se encontró una prevalencia de 12% en animales

pertenecientes a una comunidad campesina de la misma región (Álvarez, et al.,

2002).

2.- Virus Herpes Bovino 1 (VHB-1) o Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (RIB).

El Virus Herpes Bovino 1, causante de la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina

es un virus que pertenece a la familia Herpesviridae, sub familia Alfaherpesvirinae,

género Varicellovirus. Posee cápside icosaedrica y envoltura. Su material genético

esta formado por ADN de cadena doble (Carter, et al, 2005). Alrededor del 10%

del ADN viral transporta una cola de ADN celular, lo que indicaría que el ADN del

VHB-1 puede recombinarse frecuentemente con el ADN de la célula (Pidone, et

al., 1999).

Todos los herpesvirus codifican un gran número de proteínas implicadas en

el metabolismo de ácido nucleico, síntesis de ADN y procesamiento de proteínas,

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que son expresadas sobre la envoltura viral y sobre la membrana de las células

infectadas (Franco, et al., 2002). Por lo menos 33 de las proteínas codificadas por

el VHB-1 son estructurales; de estas, por lo menos 13 están asociadas a la

envoltura ;y entre las proteínas estructurales al menos 11 son glicoproteínas: gB,

gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK, gL, gM, y gN presentes en la envoltura viral formando

proyecciones y juegan un rol importante en las interacciones virus-célula, como

adherencia, penetración, difusión célula-célula y salida. Estas interacciones

iniciales son primariamente mediadas por las glicoproteínas virales: gB, gC y gD

que son las principales proteínas de la envoltura (OGTR, 2005; Okazaki, et al.,

2005)

La proteína gB participa en la adsorción viral y fusión celular; es

responsable de interferir con proteínas celulares causantes de efectos citopáticos

y de la inducción de anticuerpos neutralizantes (Li, 1996; Pidone, et al., 1999). La

gC es considerada como la principal proteína implicada en la unión e ingreso del

virus a través de receptores similares a la heparina sobre la superficie de las

células blanco (Babiuk, et al., 1996, Pidone, et al., 1999). La gD es la glicoproteína

involucrada en la neutralización, es la responsable de la penetración del virus en la

célula blanco y también se le atribuye participación en la adsorción viral y la fusión

celular (Li, 1996; Babiuk, et al., 1996; Pidone, et al., 1999). Además, esta

glicoproteína sería la responsable de inducir apoptosis en las células infectadas

(Hanon, et al. ,1999). La glicoproteína H es un componente estructural del virion

que forma un complejo con la glicoproteina gL. Los estudios demuestran que la

gH es esencial en el ciclo infeccioso del virus y esta involucrado específicamente

en la penetración viral y en la diseminación célula-célula. El complejo gH/gL es

necesario para la inducción de una respuesta de anticuerpos neutralizantes y el

anclaje de la gL a la membrana plasmática (Meyer, et al., 1998).

Se han definido dos subtipos de VHB-1, en base al análisis de

unión/restricción de enzimas por anticuerpos monoclonales, estos han sido

designados como VHB-1.1 (sub tipo respiratorio) y VHB-1.2 (sub tipo genital). A su

vez el subtipo VHB-1.2 ha sido dividido en VHB 1.2a y VHB 1.2b. El primero puede

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causar abortos, mientras que el último aparentemente no. Ambos han sido

asociados con vulvovaginitis y balanopostitis (Carter, et al, 2005).

La replicación del VHB-1 comparte características comunes a algunos otros

miembros de la familia herpesviridae, la replicación ocurre en células epiteliales

del tracto respiratorio y reproductivo. La adherencia esta mediada por las

glicoproteínas de la envoltura gB y gC , estas interactúan con receptores celulares

de tipo heparina sulfato, aunque se propone que sean mas las proteínas celulares

implicadas en la entrada viral; la interacción de estas glicoproteinas y los

receptores celulares activan la fusión de la envoltura viral con la membrana celular

para la penetración de la nucleocapside en el citoplasma, la cual llega a la

membrana celular por medio de microtúbulos, liberando su molécula lineal de ADN

viral dentro del núcleo a través de los poros de la membrana nuclear, donde se

realiza la transcripción de ARN mensajeros para la síntesis proteica, replicación

del ADN viral para la nueva progenie del virus, y el ensamblaje final de nuevas

partículas virales (Li et al.,1996; OGTR, 2005). El virus adquiere su envoltura

mientras gema a través de la membrana nuclear, es luego transportado en

vesículas intracelulares a la membrana citoplasmática y liberado de la célula

(Babiuk, et al., 1996). La replicación viral completa se asocia con la lisis de la

célula infectada (Mandell, 2005).

La infección ocurre por las vías respiratorias y genitales. El contagio se da

por contacto directo, a través de las secreciones nasales, oculares, genitales,

además de los líquidos y tejidos fetales; o indirecto, por personas o equipos

(Radostits, et al., 2002; Richey, 1994).

El VHB-1 se ha aislado de vacunos, búfalos de agua, cabras y ovejas,

especies en las que causa cuadros clínicos. Se ha demostrado además la

infección de un elefante asiático, Elaphus maximus, antílopes, minks y ferrets,

pero sin cuadro aparente. Experimentalmente solo se ha demostrado la infección

de conejos, siendo imposible infectar cobayos, ratones y ratas, así como

embriones de pollo. (OGTR, 2005)

El Virus Herpes Bovino 1 es capaz de atacar distintos tejidos, pudiendo así

causar una variedad de formas clínicas dependiendo del tejido animal que infecte.

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Los cuadros clínicos causados por el VHB-1 pueden ser agrupados en:

infecciones del tracto respiratorio, infecciones oculares, abortos, infecciones

genitales e infecciones generalizadas en neonatos (Richey, 1994). El VHB-1

infecta células epiteliales del tracto respiratorio alto, mucosa vaginal y prepucial,

tonsilas, conjuntivas, además de linfocitos T CD-4, monocitos y macrófagos

(Lovato, 2003).

En cultivos celulares, el VHB-1 produce la formación de células

multinucleadas con degeneración por tumefacción, edema pronunciado y la

presencia de inclusiones intranucleares tipo Cowdry (Mandell, 2005).

Generalmente el periodo de incubación es de 4 a 6 días y la infección

persiste por 10 a 14 días (Richey, 1994).

La forma respiratoria de IBR es usualmente una infección del hato, con

todos los animales del grupo afectados. Se ven afectadas las vías respiratorias

altas: cornetes y senos nasales, faringe, laringe y traquea. La mortalidad es

inusual a menos que el cuadro se complique con una infección secundaria. El

VHB-1 puede iniciar el complejo respiratorio bovino causando inmunosupresión,

permitiendo infecciones secundarias que causan neumonía severa y muerte

(Lovato, 2003; Searl, 1998). Los casos de abortos pueden ocurrir en cualquier

momento de la gestación, presentándose generalmente en la segunda mitad, la

muerte y absorción fetal pueden ocurrir en gestaciones tempranas y pueden ser

confundidos con problemas de infertilidad. La forma ocular puede ocurrir como

parte de la forma respiratoria o independientemente y se manifiesta como una

severa conjuntivitis (Searl. 1998).

Como otros miembros de la familia Herpesviridae, el VHB-1 pude persistir

en forma latente en las neuronas ganglionares del trigémino o sacro, e incluso en

las tonsilas. Esta propiedad le permite sobrevivir en estado inactivo en ciertos

lugares del cuerpo del animal infectado. Bajo condiciones de stress, como parto o

transporte, el virus pude ser reactivado y causar infecciones usualmente de tipo

subclínica; siendo una fuente de infección para animales susceptibles. La

superinfección con otros virus como el PI3, puede también causar la reactivación

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(Wentik et al., 1993). La reactivación puede ocurrir tras la administración exógena

de corticosteroides (Winkler, 2000).

Actualmente, los programas de erradicación incluyendo vacunación,

aislamiento, control de fronteras y eliminación de animales están implantados en

diversos países europeos. La vacunación puede ser usada para reducir la

severidad de la enfermedad, pero no puede prevenir la infección debido al carácter

endémico del VHB-1 (OGTR, 2005).

La distribución del virus es mundial, la seroprevalencia en bovinos llega al

100% y la mortalidad puede llegar al 10%.

En el Perú, desde su primer reporte, en el año 1965, se ha determinado por

evaluaciones serologicas que la infección esta distribuida en forma subclínica en

varias zonas del país, aunque no se ha hecho reporte de presencia clínica

(Sánchez, et al., 2003). Está considerado como uno de los principales agentes

componentes del complejo respiratorio bovino presente en centros de engorde y

en establos lecheros del país (Rivera, et al., 1994; Zanabria, et al., 2000). En

bovinos lecheros del valle de Lima presenta un 36% de seroprevalencia (Sánchez,

et al., 2003). En contraste con el ganado lechero, el VHB-1 presenta hasta un 75%

de incidencia en toros de centro de engorde del valle de Lima (Zanabria, et al,

2000). El 68% de los bovinos criollos de la provincia de Parinacochas, Ayacucho,

presentaron anticuerpos neutralizantes contra el VHB-1 (Zacarías, et al., 2002); lo

que contrasta con menos del 1% de bovinos de crianza extensiva en el

departamento de Cajamarca presentaron anticuerpos (Villacaqui, et al., 2005).

La presencia del virus ha sido demostrada también en Ovinos de Arequipa,

donde la seroprevalencia alcanzo un 33% (Manchego, et al., 1998).

En camélidos sudamericanos, Rivera (1987a) demostró una

seroprevalencia de 5% en alpacas de una empresa asociativa del departamento

de Puno, mientras que Rosadio (1993) encontró un 16% de animales positivos en

comunidades rurales de la sierra. Además, se ha reportado una seroprevalencia

de 18% en Alpacas y 17% en Llamas de un rebaño mixto de una comunidad

alpaquera de Arequipa (Manchego, et al., 1998). Así mismo en el año 2004 se

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reporto una seroprevalencia de 80% en alpacas de la provincia de Canchis,

departamento de Cusco (Victorio, et al., 2004).

3.- Virus Respiratorio Sincitial Bovino (VRSB).

El Virus Respiratorio Sincitial Bovino pertenece a la Familia

Paramixoviridae, genero Pneumovirus, es un virus envuelto, con nucleocapside

helicoidal. Su genoma consiste de ARN no segmentado de cadena simple y

sentido negativo (Carter, et al., 2005).

El genoma codifica dos proteínas no estructurales la NS1 Y NS2. Las

proteínas no estructurales se encuentran relacionadas al nucleocapside y a la

envoltura. El nucleocápside consiste además de RNA, de la nucleoproteína (N),

Fosfoproteína (P) y RNA polimerasa (L). Dos proteínas mayores de membrana: la

proteína de fusión (F) y la glicoproteína de unión (G); la pequeña proteína

hidrofobica (SH) y la M2, proteína asociada con la envoltura viral (Valentova,

2003).

Las proteínas NS1 y NS2 están involucradas en mecanismos de bloqueo

en la expresión de genes celulares para la producción de IFN alfa/beta, lo que

incrementa la virulencia del virus (Valarcher, et al., 2003; Schlender et al., 2003).

La fosfoproteína P es una proteína polifuncional que juega un rol principal en la

transcripción y replicación del ARN genómico (Khattar, et al., 2001). Las proteínas

G y F estimulan la producción de la respuesta humoral y celular. La glicoproteína

G es la proteína de unión, que hace posible la adherencia a la célula, esta unión

no es especie especifica y existe homologia con la proteína G del Virus

Respiratorio Sincitial Humano, ambas se unen a glucosaminoglicanos de la

superficie celular (Schlender, et al., 2003); la glicoproteína F es responsable de la

penetración a la célula huésped y la difusión del virus en el organismo, esta

también le da la característica de sincitial (Valarcher, et al.2003; Valentova, 2003).

Karger (2001) demostró que virus mutantes carentes de los genes G o SH o

ambos, fueron capaces de completar varios ciclos de crecimiento en cultivos

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celulares, lo que resalta la importancia de la proteína F en la replicación viral. Sin

embargo la coexpresion de los genes F, G y SH es necesaria para inducir la fusión

celular, mecanismo importante en la diseminación del virus (Samal, et al., 1997).

El VRSB infecta naturalmente, ganado vacuno, caprino y ovino. El ganado

infectado es el principal reservorio de la enfermedad y la transmisión se realiza por

contacto directo con secreciones o a través de aerosoles de un animal a otro

(Larsen, 2000; Carter, et al., 2005)

La presencia del VRSB en cultivos de células infectadas se detecta por su

aspecto sincitial característico, el grado de formación de este depende del tipo de

cultivo celular, el medio y la cepa viral (Rosado, 2006)

La velocidad de diseminación de la enfermedad depende del tipo de manejo

productivo, siendo más rápida en aquellos sistemas intensivos, bastando de 3 a 10

días para infectar toda la población. En sistemas extensivos, demora de semanas

a meses en afectar todo el rebaño. Una vez expuesto, se requieren de 2 a 4 días

para que un animal susceptible comience a mostrar signos clínicos. En un brote

de enfermedad respiratoria aguda, es de esperar una tasa de infección del 100 %,

morbilidad del 20 al 50 % y mortalidad menor al 5% (Richey, 2002).

El cuadro clínico presenta dos fases, una fase inicial, de enfermedad leve

que es seguida por una fase aguda con presentación de falla respiratoria severa.

Se postula que la segunda fase es debida a una reacción de hipersensibilidad por

la continua exposición o re exposición al virus (Radostits, 2002).

El BRSV inicia su replicación en las células epiteliales del tracto respiratorio

superior, produciendo alteraciones morfológicas y funcionales en el aparato

mucociliar, luego invade el tracto respiratorio inferior afectando a las células del

epitelio bronquial, bronquiolar y alveolar, produciendo necrosis y descamación.�

La formación de sincitios se observa generalmente en las paredes bronquiolares y

en los alvéolos y tales sincitios presentan siempre VRSB en replicación (Viuff, et

al., 1996). El VRSB infecta también al macrófago alveolar (Li, et al., 1999),

alterando de esta manera los mecanismos de defensa específicos e inespecíficos

del pulmón. De esta manera constituye un agente primario que condiciona la

aparición de agentes oportunistas secundarios desencadenantes de los cuadros

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fatales de la enfermedad (Masot, et al., 2000; Richey, 2002). Experimentalmente

se ha demostrado que el VRSB puede inducir apoptosis en células MDBK, lo que

contribuiría a delinear los mecanismos que regulan la lesión tisular y la potencial

reparación pulmonar tras la infección con VRSB (Cristina, et al.; 2001)

Valentova et al. (2003) demostraron la presencia de ARN en leucocitos

periféricos y mucosa nasal de vacas infectadas en estado convaleciente. Este

descubrimiento podría sugerir la persistencia del virus en células del sistema

inmune.

Los terneros recién nacidos obtienen anticuerpos vía calostro. Sin embargo

la inmunidad calostral no protege ante la enfermedad clínica. Por otra parte, la

inmunidad activa es protectiva ante la enfermedad clínica pero no ante la

reinfección (Larsen, 2000).

En el país, los estudios de seroprevalencia, reportan 56% de animales

positivos en ganado lechero y 42 % en ganado de engorde de Lima (Rivera, et al.,

1987b). En ovinos, se determinó una seroprevalencia de 47.1% en la sierra

(Rosadio, et al., 1984). En alpacas de una empresa asociativa del departamento

de Puno se determinó el 16.6% de animales seroreactores (Rivera, et al., 1987a);

Manchego, et al. (1998), en una comunidad de Arequipa, reportó el 9 % de

alpacas positivas, mientras que Victorio, et al. (2004) encontró una

seroprevalencia de 80.2 % en alpacas de la provincia de Canchis en el Cusco. En

llamas de dos empresas ganaderas del departamento de Puno se obtuvieron 20 y

26 % de positivos, mientras que en tres comunidades del mismo departamento se

obtuvieron seroprevalencias de 5.2%, 25% y 22 % respectivamente (Rivera, et al.,

1990). Mientras que Manchego (1998) no obtuvo animales positivos a serología en

Arequipa. Las pruebas serológicas realizadas en vicuñas en semicautiverio,

demostraron que esta especie no ha sido expuesta al agente (Rivera y Ameghino,

1990).

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4.- Virus Parainfluenza Bovino Tipo 3 (VPI3).

El Virus Parainfluenza Bovino Tipo 3 (VPI3) pertenece al género

Paramyxovirus de la familia Paramyxoviridae. Se distinguen de otros virus dentro

de su propia familia por la presencia de una glicoproteína de envoltura con

actividad de neuraminidasa y hemaglutinina (Mandell, 2005). El virión esta

compuesto por una sola cadena de ARN de polaridad negativa rodeada por una

envoltura lipidica de origen en la célula huésped. Son virus pleomorfos con un

diámetro promedio de 200 nm (Schmidt, et al; 2001).

El ARN del VPI3 codifica 6 proteínas estructurales, la polimerasa viral (L),

la proteína de la nucleocápside (NP), la fosfoproteína (P), la proteína Matriz (M),

Hemaglutinina-Neuraminidasa (HN), proteína de fusión (F); además de tres

pequeñas proteínas no estructurales (C, D, V) (Haller, 2000).

Las proteínas NP, L y P asociadas con el ARN viral forman el core de la

nucleocápside del Virus Parainfluenza. La proteína NP se une al ARN viral

formando un molde que permite que las proteínas L y P transcriban el ARN

mensajero y repliquen el genoma. La proteína M participa en la inserción y

agregación de las glucoproteínas virales HN y F sobre la superficie de la célula

huésped y con la atracción de nucleocápsides completas a estas áreas que pronto

darán brotes para convertirse en viriones. La proteína Hemaglutinina-

Neuraminidasa funciona en la fijación virus-célula huésped a través de receptores

de Ácido siálico y tiene actividad de neuraminidasa. La proteína F participa en la

fusión virus-membrana de la célula huésped, necesaria para la entrada de la

nucleocapside y la infección de la célula huésped. En forma similar, esta proteína

forma parte en la fusión de la membrana entre células huésped (formación de

sincitios) y la hemólisis de eritrocitos. Se ha demostrado que las proteínas HN y F

inducen anticuerpos neutralizantes y células T citotóxicas. También se ha

mostrado que la proteína de la nucleocapside (NP) y de la Matriz (M) inducen

células T citotóxicas (Mandell, 2005).

Según determinación de anticuerpos este paramixovirus esta distribuido

sobretodo en bovinos, otros rumiantes domésticos y salvajes y se presenta

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también con una variante antigénica en el hombre (Dirksen, 2005). La infección

con VPI3 es común en ovejas y probablemente en cabras (Smith, 1990).

Es patógeno sobretodo para terneros no protegidos por la inmunidad

calostral y circunstancialmente también para bovinos jóvenes o adultos. En estos

casos el VPI3 se convierte en el principal agente de la forma más leve, catarral-

viral de la bronconeumonía enzootica (Dirksen, 2005; Ogilvie, 1990).

Además, el VPI3 causa lesiones en los cilios y afecta a los macrófagos

alveolares por lo que se convierte en un decisivo preparador del terreno para

superinfecciones mas graves (BRSV, micoplasmas, pasteurelas, agentes

piógenos y necróticos) causantes de las formas fibrinosas enfisematosas o

purulentas de la BNE; posiblemente en sinergismo con otros virus también juega

un papel secundario en abortos (Dirksen, 2005).

El rol mas importante del VPI3 es predisponer el tracto respiratorio a

infecciones subsecuentes por otros virus y bacterias como P. haemolytica. La

severidad de los signos aumenta con el desarrollo de neumonías bacterianas

secundarias y, si ocurriera la muerte, es generalmente el resultado de infecciones

bacterianas secundarias (Smith, 1990). Los casos mortales generalmente son

complicados por una neumonía bacteriana secundaria; especialmente por P

haemolytica o por P. multocida (Rebhun, 1995).

En células cultivadas in vitro, los primeros cambios morfológicos

observables incluyen redondeamiento focal y aumento del tamaño de citoplasma y

núcleo. Otros cambios que pueden ser observados incluyen vacuolas

citoplasmáticas únicas o multiloculares, inclusiones basófilas o eosinófilas y la

formación de células gigantes multinucleadas. Estas células gigantes

generalmente aparecen en etapas tardías de la infección y contienen entre 2 a 7

núcleos (Henrickson, 2003).

Histológicamente se observan bronquiolitis y peribronquiolitis, además de

cambios proliferativos y degenerativos en las células epiteliales de los bronquiolos

y alvéolos. Corpúsculos de inclusión tanto intracitoplasmáticos como

intranucleares pueden ser hallazgos histológicos (Smith, 1990).

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El virus invade el tracto respiratorio y puede afectar a los macrófagos

pulmonares, lo cual permite la replicación viral así como la disfunción fagocítica

(Ogilvie, 1990).

Los anticuerpos sericos (IgG) o del moco traqueal (IgA), alcanzan su titulo

máximo unas 4 semanas post infección. Las defensas del organismo animal frente

a este virus se basan sobre todo en inmunidad tisular y secretora de las mucosas

respiratorias (Dirksen, 2005).

Los anticuerpos IgA nasales contra Virus Parainfluenza tipo 3

probablemente desempeñan un papel importante en la resistencia a la infección.

Los anticuerpos en las secreciones nasales pueden estar correlacionados más

estrechamente con la resistencia del huésped a la infección que el nivel de

anticuerpos en suero (Mandell, 2005).

La amplia prevalencia de anticuerpos para este virus indica que es ubicuo

en el ganado mundial. Este hallazgo sugiere la posibilidad de infecciones repetidas

o por lo menos persistencia de anticuerpos después de la infección (Smith, 1990).

En el Perú, el 45% de ganado de engorde y 21% de ganado de leche del

valle de Lima, demostró anticuerpos para el VPI3 (Rivera, et al., 1987b).

En Camélidos sudamericanos, la seroprevalencia encontrada en estudios

realizados en el país, encontraron un 35% de alpacas seropositivas en una SAIS

de Puno (Rivera, et al., 1987a); en una comunidad de Arequipa, el 66% de

alpacas fueron positivas (Manchego, et al., 1998) En el año 2004, Victorio

encontró una prevalencia de 67.6% de alpacas seropositivas a VPI3 en el

departamento de Cusco. La prevalencia encontrada en llamas fue de 28 a 54% en

animales de empresas asociativas y de 27 a 75% en tres comunidades

campesinas (Rivera, et al., 1990). Mientras que en vicuñas en semicautiverio de

Puno no se encontraron reactores (Rivera y Ameghino, 1990).

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III. MATERIALES Y METODOS

A.- ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS CELULARES SECUNDARIOS DE

ALPACA Y LLAMA.

1.-Obtención de fetos de Alpacas y Llamas.-

Se obtuvieron 3 fetos de alpacas y un feto de llama, de madres de descarte

aparentemente normales, sin signología clínica. Los cuernos uterinos completos

se obtuvieron durante el faenamiento en un camal de la ciudad de Huancavelica.

Los fetos fueron remitidos al Laboratorio de Microbiología y Parasitología, Unidad

de Virología, conservados en refrigeración a 4oC, para su inmediato

procesamiento.

2.-Establecimiento de cultivo Primario.-

De los fetos se obtuvieron, de manera estéril, los siguientes órganos:

cornete nasal, piel, bazo, pulmón, riñón y testículo, obteniéndose trozos de 1 cm.

cúbico los cuales se conservaron en medio mínimo esencial de Eagle (MEM) con

antibiótico por 2 horas, a temperatura ambiente hasta su uso en la obtención de

células( Fig. 1).

Se utilizó el Método de Explante Primario, descrito por Freshney (1987).

Los órganos fueron trabajados en Flujo Laminar para asegurar la esterilidad del

procedimiento.

Descripción del Método de Explante Primario.

• Los trozos de tejido obtenidos de los fetos son extraídos del medio de

cultivo con antibiótico y lavados con suero fisiológico estéril.

• Se transfiere a una placa Petri donde se separa el tejido no deseado como

grasa y tejido necrotico. El tejido es diseccionado en trozos muy finos, de

aproximadamente 1mm de diámetro.

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• Se realiza un nuevo lavado con suero fisiológico, descartando así células

sanguíneas, restos de tejidos y fluidos que puedan desprenderse.

• Los pequeños trozos de tejido obtenidos son trasladados a frascos de

cultivo celular de 25 cm2, una pequeña cantidad de medio de crecimiento

(10 % de suero fetal) es agregada, aproximadamente 2 ml.

• La suspensión es distribuida uniformemente por toda la superficie de

crecimiento del frasco y es mantenida en incubadora a 370C por 24 a 36

horas.

• Posteriormente a la adhesión de los trozos de tejido, el volumen de medio

puede ser aumentado gradualmente durante los 2 a 3 días siguientes,

hasta alcanzar un volumen de 5 ml para frascos de 25 cm2. El medio debe

ser cambiado semanalmente.

• Una vez que el crecimiento celular alcance el 80 % de la superficie del

frasco, las células estarán listas para el primer pasaje.

3.-Establecimiento de cultivos secundarios.-

Se establecieron los cultivos secundarios a partir de las células obtenidas

de los explantes primarios. Se utilizó el método de desagregación celular descrito

por Freshney (1987)

Las células fueron cultivadas con los medios Eagle Minimal Esencial (MEM)

y Leibowitz L-15 en una proporción de 50:50 suplementado con 10 % de suero

fetal bovino libre de anticuerpos contra los virus de BVD adquirido

comercialmente.

La incubación se realizó a 37 oC, con un nivel de CO2 de 5 % y una

humedad relativa de 65%.

Descripción del método de desagregación celular y sub-pasaje.

• Eliminar el medio de las botellas.

• Lavar con suero fisiológico estéril, 5ml/25 cm2, para eliminar los restos de

medio que podrían inhibir la acción de la tripsina.

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• Agregar la tripsina (0.25%), 3ml/25 cm2, procurando que cubra totalmente

la superficie de crecimiento de la botella. Permitir que la tripsina actúe por

aproximadamente 15 – 30 segundos y luego dejar una cantidad de 0.5 – 0.8

ml suficiente para que cubra toda la superficie de crecimiento de la botella.

• Incubar las botellas a 37oC por aproximadamente 5 minutos, hasta que se

pueda observar desprendimiento de la monocapa y disgregación celular.

• Después de ocurrida la disgregación celular, el medio de crecimiento ( 10 %

de suero fetal) es agregado gradualmente a la botella de cultivo, lavando

con este la superficie de crecimiento de la botella ayudando así a

desprender suavemente las células de la monocapa. Anteriormente se

realiza la dilución para tener una concentración de 400,000 células por ml

de medio, según conteo por cámara de Neubauer.

• Las células desagregadas son resuspendidas utilizando 5 ml de medio

para botellas de 25 cm2 y 15 ml para botellas de 75 cm2 completando así el

pasaje.

B.- ENSAYOS DE PERMISIBILIDAD DE CULTIVOS CELULARES.

Se utilizaron cultivos celulares secundarios de células de alpaca y llama.

Las células utilizadas fueron del tercer o cuarto subpasaje.

Las cepas virales usadas fueron la cepa Cooper de Herpesvirus Bovino 1,

cepa Singer del Virus de la Diarrea Viral Bovina, cepa SF-4 del virus Parainfluenza

Bovino 3 y cepa Mohanty del virus Respiratorio Sincitial Bovino.

Para los ensayos, las células fueron sembradas en placas Petri de 3.5 cm.

de diámetro, en cuyo fondo se colocó un disco cubreobjetos de 1 cm. de

diámetro tratado con poli-L-lisina en una concentración de 10 mg/ml.

Se permitió que los cultivos crezcan y desarrolle la monocapa por 48 horas.

Hasta que se cubra la superficie total de la placa.

Se inoculó con las cepas virales a una concentración de 100 DI50CC.

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Las monocapas inoculadas fueron incubadas por 1 hora a 37 o C, en

agitación constante para permitir la adhesión viral. Transcurrido este tiempo se

eliminó el sobrenadante y se adicionó el medio de crecimiento, en un volumen de

2.5 ml.

Las monocapas inoculadas se incubaron a 37 o C y con 5 % de CO2 por un

periodo de 48 a 72 horas, dependiendo de la cepa utilizada, después de lo cual se

observaron y evaluaron las monocapas.

Adicionalmente y con el fin de comparar los efectos producidos en las

células de las distintas especies, así como el tiempo transcurrido hasta la

presentación de estos, se sembraron en placas de 8 pozos células de cornete

nasal de alpaca, llama y bovino. Dichas células fueron infectadas con cada una de

las cepas virales mencionadas anteriormente y evaluadas 48 – 72 horas post

infección para observar los efectos citopáticos característicos.

C.-OBSERVACIÓN Y EVALUACIÓN DE LAS MONOCAPAS INOCULADAS.

Para la observación de los cambios citopatogenicos acontecidos en las

monocapas celulares como producto de la infección viral, se procedió a la

coloración standard de Hematoxilina y Eosina.

Así mismo como técnica de comprobación de la infección de dichos cultivos

con los virus correspondientes se realizo la prueba de Inmunofluorescencia

Directa, para la detección de antigenos virales.

1.-Determinación de Cambios Citopatogénicos.

Las monocapas fueron evaluadas bajo el microscopio invertido para

determinar el porcentaje de la monocapa que presento cambios citopatogénicos.

Adicionalmente, para la evaluación de los cambios citopatogenicos

causados por acción de la infección viral en las monocapas, se realizó la

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coloración de Hematoxilina Eosina para observar y describir dichos cambios por

microscopia óptica.

2.-Detección de antígenos virales.

Se realizó la prueba de Inmunofluorescencia Directa para determinar

antígenos virales de: Virus Respiratorio Sincitial Bovino (BRSV), Parainfluenza 3 (

PI-3), Herpes Virus Bovino (VHB-1) y Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB)

utilizando anticuerpos policlonales específicos marcados con fluoresceína.

Descripción de la prueba de inmunofluorescencia directa (IF)

• Los discos cubre objetos sobre los cuales se cultivaron las células fueron

fijados en acetona por 5 minutos, y secados a temperatura ambiente.

• Se procedió a agregar el conjugado correspondiente (anticuerpos

policlonales marcados con fluoresceína).

• Cada uno de los discos fue sometido a incubación con 15 ul de antisueros

específicos para identificar antígenos virales perteneciente a los virus

VRSB, PI-3, VHB-1 y VDVB respectivamente.

• Los discos fueron incubados por 30 minutos a 37ºC en una cámara

húmeda, lavados con solución salina de fosfato buffer (PBS) (0.1M, pH 7.2)

por 5 minutos, enjuagados con agua bidestilada y secado a medio

ambiente.

• El montaje fue realizado agregando 1 gota de líquido de montaje específico.

Las lecturas fueron realizadas en microscopio de fluorescencia (marca

Leitz-Alemania).

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IV. RESULTADOS

Los cultivos celulares secundarios de cornete nasal, piel y testículo de

alpaca y llama demostraron alta adaptabilidad al cultivo en las condiciones de

laboratorio descritas en Materiales y Métodos, dichos tipos celulares permitieron

de 8 a 10 sub pasajes; las células provenientes de riñón, pulmón y bazo tanto de

fetos de alpacas como de llamas, mostraron una baja adaptabilidad permitiendo

un máximo de 3 pasajes.

Para los ensayos de permisibilidad se escogieron las líneas celulares

provenientes de cornete nasal y piel de alpaca y llama debido a que presentaron

un mayor crecimiento y homogeneidad de monocapa en comparación con las

células de testículo.

Las células de origen en cornete nasal y piel trabajadas muestran

permisibilidad a la infección por los virus: VDVB, VHB-1, VRSB y VPI3 (CUADRO

1). Mostrando efectos citopatogénicos característicos durante la infección viral.

(CUADRO 2). Las observaciones fueron basadas en pruebas cualitativas, tales

como la presencia de Efecto Citopatogenico (ECP) e Inmunofluorescencia directa

(IF) cuyos resultados se muestran en las figuras 2, 3, 4 y 5.

Los efectos citopatogénicos comunes observados fueron: desprendimiento

de la monocapa e hipercromatosis, dichos ECP fueron observados en las 4 líneas

celulares tras la infección con las 4 cepas. En las células infectadas con el VDVB

se observó una clásica vacuolizaciòn de citoplasma y núcleo. (Fig. 5A, 5B y 5C).

En las monocapas infectadas con PI3 y VRSB se observó la presencia de células

gigantes multinucleadas (Fig: 2B, 2C, 4B, y 4D), así como corpúsculos de

inclusión intracitoplasmáticos (Fig: 2D, 2E). Los ECP encontrados tras la infección

con VHB-1 fueron redondeamiento celular (Fig: 3C y 3D) y la presencia de

corpúsculos de inclusión intranucleares de tipo Cowdry (Fig: 3B y 3E)

Mediante Inmunofluorescencia Directa se confirmó la presencia de antígeno

viral en las monocapas celulares inoculadas con las distintas cepas virales (Fig:

2F, 3F, 4E, 5E y 5F).

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No se encontró diferencia de permisibilidad entre las células provenientes

de alpaca, llama y bovino en el ensayo donde se evaluó la permisibilidad de los

cultivos secundarios de cornete nasal de estas especies. Los tiempos de

presentación de efectos citopatogénicos en los distintos tipos celulares, fueron

similares para cada cepa viral trabajada. (CUADRO 3)

Cuadro 1. Cepas virales y tipo celular utilizados.

Cepa viral. Tipo celular infectado.

Cornete Alpaca Piel Alpaca

Cornete Llama

VDVB Singer

Piel Llama Cornete Alpaca

Piel Alpaca Cornete Llama

VHB-1 Cooper



VRSB Mohanty



VPI-3 SF-4

Piel Llama

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Cuadro 2.Caracterización de ECP en cultivos celulares.

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Cornete Llama

VDVB

Piel Llama

Desprendimiento de monocapa, hipercromatosis, vacuolizacion del citoplasma,

vacuolizacion del núcleo, tumefacción celular.

Positivo


Cornete Llama

VHB-1

Piel Llama

Desprendimiento de monocapa, hipercromatosis,

tumefacción celular, agregados celulares, corpúsculos de inclusión intranucleares

Positivo


Cornete Llama

VRSB

Piel Llama

Desprendimiento de monocapa, Hipercromatosis,

Formación de sincitios, Inclusiones

intracitoplasmáticas,

Positivo


Cornete Llama

VPI-3

Piel Llama

Desprendimiento de monocapas, hipercromatosis,

tumefacción celular, vacuolizacion citoplasma, corpúsculos de inclusión

intracitoplasmaticos

Positivo

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Cuadro 3. Tiempo transcurrido a la presentación de ECP según tipo celular.

Cepa viral inoculada. Tipos celulares infectados

Tiempo transcurrido a la presentación de ECP

Cornete nasal de alpaca. Cornete nasal de llama.

VDVB

Cornete nasal de bovino.

48-52 h.p.i.


VHB-1


20-24 h.p.i.


VRSB


36-40 h.p.i.


VPI-3


36-40 h.p.i

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V. DISCUSIÔN

En el sistema productivo típico en la sierra peruana, la crianza de CSA

conjuntamente con ganado de origen europeo, plantea una situación muy

particular, pues siendo conocida la habilidad de ciertos virus de utilizar mas de

una especie en su cadena epidemiológica (Manchego, 1998), la situación de

dichos sistemas productivos deja abierta la posibilidad de que la salud de los CSA

sea afectada por agentes provenientes del ganado de origen europeo.

Es conocido que dentro de la casuística de enfermedades que afectan a los

CSA, las principales entidades que afectan con pérdidas debido a su alta

morbilidad y mortalidad, son las respiratorias y reproductivas

(Ameghino, 1990; Ramírez, 1991). En la explotación ganadera mundial, es muy

alto el porcentaje de cuadros de este tipo causados por agentes virales; en CSA el

conocimiento de enfermedades virales es escaso, y no se conoce la prevalencia,

epidemiología y patogenia de estos cuadros (Bustinza, 2000).

Mediante el presente estudio se demostró que las células de cornete nasal

y piel obtenidas de las especies domésticas de CSA y cultivadas in vitro, pueden

ser infectadas por 4 cepas virales de conocida prevalencia y rol etiológico en el

ganado de origen europeo, el Virus de la Diarrea Viral Bovina, el Herpesvirus

bovino tipo 1, el Virus Respiratorio Sincitial Bovino y el Virus Parainfluenza 3

Bovino; se caracterizaron además algunos efectos citopatogénicos causados por

estos virus y que guardan relación con aquellos observados en células bovinas

cultivadas in vitro.

En los ensayos realizados, se demostró la adaptabilidad a las condiciones

de cultivo in vitro de las células provenientes de cornete nasal, piel y testículo de

fetos de llama y alpaca. Las células provenientes de cornete nasal y piel fueron

elegidas para los ensayos de permisibilidad debido a que guardan más homologìa

con los tipos celulares infectados in vivo por las cepas virales estudiadas. Por otra

parte, no se pudieron establecer cultivos celulares secundarios de riñón, pulmón ni

bazo. La diferencia en la viabilidad de dichos tipos celulares puede ser resultado

de la técnica utilizada para obtener los cultivos primarios; si bien la técnica del

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Explante Primario es una técnica ampliamente utilizada para la obtención de

células de tejidos de origen epitelial, esta es altamente selectiva (Freshney, 1987)

y podría no ser apropiada para algunos tipos celulares como los mencionados

anteriormente.

En la infección viral, el proceso fundamental es la expresión del ciclo

replicativo del virus en una célula huésped (Brooks, et al.; 1999). La adhesión y

penetración, como primer paso para la replicación viral, requiere la unión del virus

a la superficie celular. Una proteína o glicoproteína de la superficie viral reconoce

receptores específicos de la superficie celular. La presencia o ausencia de estos

receptores celulares determinan el rango de hospederos así como los órganos

blanco dentro de cada hospedero (Restrepo, et al.; 2004).

Los virus lesionan las células del huésped al entrar en la célula y replicarse

a expensas del huésped. El tropismo viral, se debe en parte a la especificidad de

receptores virales como celulares, pero además el tropismo celular es causado por

la capacidad del virus para replicarse en el interior de algunas células y no en

otras. En el presente estudio se demostró no solo que es posible la adherencia y

unión del virus a la célula, si no también el proceso de replicación completo como

evidencia la presentación de efectos citopatogénicos (ECP) característicos

(Brooks, et al.; 1999) y detallados en este trabajo.

Según los resultados obtenidos en el presente estudio, las cepas virales

trabajadas utilizarían vías de adherencia y penetración homologas a las utilizadas

en las células de origen bovino. Las células cultivadas in vitro de llama y alpaca,

presentarían receptores homólogos a aquellos presentes en células bovinas. La

exacta naturaleza de estos receptores debería ser esclarecida en posteriores

estudios.

Para la adherencia del VDVB es necesaria la unión de la proteína E2 con el

receptor CD46 bovino (Maurer, 2004). Además, se ha propuesto que la unión de la

proteína viral Erns a las células es mediante la interacción con glucosaminoglicanos

como el Heparan Sulfato y que el VDVB podría unirse inicialmente a las células

por este mecanismo. Esto sugiere que la infección celular por VDVB puede ser

dependiente de un proceso de pasos múltiples en el cual la unión del virus a las

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células y la internalizaciòn son dos pasos distintos que requieren dos receptores

celulares distintos (Hulst, 1997; Iqbal, 2000). Este virus ha podido ser adaptado a

muchos tipos celulares provenientes de distintas especies animales y parece que

su receptor tiene amplia distribución en diversas células, por ejemplo la línea

celular MDBK, proveniente de células de riñón bovino; en líneas celulares de

riñón de ternero JCK, células pulmonares de embrión bovino BEL, cultivos

primarios de cornete nasal BT(Deregt et al., 2004; Makoschey et al., 2004). La

gran adaptabilidad de este virus a distintos tipos celulares constituye también un

gran problema de contaminación, originada en los sueros fetales bovinos

utilizados ampliamente en la industria de cultivos celulares..

El VHB-1 requiere la unión de las proteínas de envoltura gB y gC con

receptores celulares del tipo Heparan Sulfato (Li et al., 1996). Los datos

disponibles a la fecha sugieren que la unión de los herpesvirus a la mayoría de

células permisivas es un evento complejo que involucra la unión de la proteína gC

al receptor celular Heparan sulfato y la gD a otro receptor aun no definido (Iqbal,

2000; Li, 1995). El VHB-1 es capaz de infectar células epiteliales del tracto

respiratorio alto, mucosa vaginal y prepucial, tonsilas, conjuntivas, además de

linfocitos T CD-4, monocitos y macrófagos (Lovato, 2003).

La glicoproteína G del VRSB es la proteína de unión, que hace posible la

adherencia a la célula al unirse a glucosaminoglicanos de la superficie celular; la

glicoproteína F es responsable de la penetración a la célula huésped (Schlender et

al., 2003).

En la replicación del VPI-3 la proteína HN se une a residuos de ácido N-

acetylneuraminico (ácido siálico) presentes en glicoconjugados de la superficie

celular, además, sialoglicoproteinas y glicolipidos también facilitarían la unión del

virus. La proteína HN contribuye además al proceso mediante el cual la proteína F

produce la fusión de la envoltura viral a la membrana celular (Porotto, et al..

2004;Suzuki, et al., 2001; Zhang, 2005).

En una célula permisible a infección viral, la respuesta a esa infección

puede ser la citopatología celular con la muerte consecuente. Estos distintos

efectos citopatogénicos son resultado de alteración a distintos niveles celulares

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como: efecto sobre la síntesis de macromoleculas, alteración de lisosomas,

alteración de la membrana celular, características todas que indican la toma de la

maquinaria celular por el virus en pos de su replicación (Mandell, 2005).

La tumefacción o hinchazón celular es la primera manifestación de casi

todas las formas de lesión celular. Desde el punto de vista microscópico se

pueden observar pequeñas vacuolas claras en el citoplasma; estas vacuolas

representan segmentos distendidos del retículo endoplasmatico, como se observa

claramente en las células infectadas por VDVB. La tumefacción celular aparece

siempre que las células son incapaces de mantener su homeostasis de iones y

fluidos, como ocurre en una célula cuya membrana ha sido dañada por virus. La

inserción de proteínas virales en la membrana plasmática de las células huésped

lesiona directamente su integridad o favorecen la fusión celular (Cotran, 2000).

La necrosis manifestada en las monocapas infectadas, son resultado de

dos procesos concurrentes, la digestión enzimática de la célula y la

desnaturalización de las proteínas. Las enzimas catalíticas proceden de los

lisosomas de las células muertas, lo que en este caso constituye una digestión

enzimática autolítica. Las células necróticas muestran un aumento de la

eosinofilia, atribuible en parte a la pérdida de la basofilia normal proporcionada por

el ARN en el citoplasma y, en parte, al aumento de la unión de la eosina a las

proteínas intracelulares desnaturalizadas. La célula puede tener un aspecto

esmerilado más homogéneo que las células normales, principalmente como

resultado de la perdida de partículas de glucógeno. Cuando las enzimas han

digerido las organelas del citoplasma, el citoplasma también se vacuoliza y adopta

un aspecto característico. Las células necróticas se caracterizan por una

discontinuidad de las membranas plasmáticas y de las organelas. Los cambios

nucleares se manifiestan como picnosis, caracterizada por constricción nuclear y

aumento de la basofilia. Aquí el ADN se condensa aparentemente en una masa

basofila encogida y sólida. Este patrón coincide con el de necrosis coagulativa, ya

que se preserva el perfil básico de la célula (Cotran, 2000).

Los mecanismos por los cuales los virus destruyen las células infectadas

son diversos, teniendo cada uno su mecanismo de replicación propio según sus

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características génicas; la inhibición del ADN, ARN o la síntesis proteica en las

células huésped es uno de los mas importantes (Cotran, 2000), esto contribuye a

la presentación de ECP característicos según el virus que infecta un cultivo

celular dado.

La rápida replicación viral causa lisis celular de las células huésped. Como

se observó en el caso de VHB-1, cepa viral de rápida replicación que presento

una erosión de la monocapa observable al microscopio de inversión, y coincide

con lo mencionado por Mandell (2005).

In vitro, las cepas citopáticas de VDVB inducen clásicamente vacuolizacion

y muerte celular (Grummer, 2001); ambos efectos citopatogénicos fueron

observados en los ensayos realizados en células de piel y cornete nasal de llama

y alpaca. Los estudios sugieren que el VDVB es liberado por gemación dentro de

la cisterna del retículo endoplasmatico, luego ocurre una maduración en el aparato

de Golgi y la salida del virus por exocitosis o lisis celular, como mecanismo alterno

a la gemación por la membrana celular presentado por otros virus (Grummer,

2001) El daño a las membranas del Retículo Endoplasmatico es observable al

microscopio óptico como una extensa vacuolizacion del citoplasma.

La replicación primaria del VHB-1 tiene lugar en el núcleo de las células y

se completa por el agregado de cubiertas proteicas a medida que el virus

atraviesa la membrana nuclear. La replicación viral completa se asocia con la lisis

de la célula infectada (Mandell, 2005). Entre los ECP se observaron la formación

de células multinucleadas con degeneración por tumefacción, edema pronunciado

y la presencia de inclusiones intranucleares tipo Cowdry características a la

infección por Herpesvirus (Mandell, 2005). Adicionalmente, la literatura menciona

la aparición de vacuolas en el espacio perinuclear, como producto de la liberación

de las cápsides ya envueltas desde el núcleo. Los efectos citopatogénicos

aparecieron con rapidez, en el curso de 24 a 48 horas. Las células se tornaron

redondeadas y aglomeraron con una rápida progresión de efectos citopatogénicos

a través de toda la capa celular.

La presencia del VRSB en cultivos de células infectadas se detecta por su

aspecto sincitial característico, el grado de formación de este depende del tipo de

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cultivo celular, el medio y la cepa viral (Rosado, 2006). El efecto citopatogénico

puede presentarse entre 3 a 7 días (Mandell, 2005). El efecto citopatogénico

predominante en las monocapas de este experimento fue un redondeo inicial de

las células seguido por formación de sincitios alrededor de los 3 dpi.

Cuando el virus Parainfluenza infecta la célula, los primeros cambios

morfológicos observables incluyen redondeamiento focal y aumento del tamaño de

citoplasma y núcleo. Otros cambios que pueden ser observados incluyen vacuolas

citoplasmáticas únicas o multiloculares, inclusiones basofilas o eosinofilas y la

formación de células gigantes multinucleadas. Estas células gigantes

generalmente aparecen en etapas tardías de la infección y contienen entre 2 a 7

núcleos (Henrickson, 2003).

Los hallazgos conseguidos en el presente estudio indican que estos virus

pueden desarrollar una infección productiva en los cultivos celulares provenientes

de alpacas y llamas, pudiendo ser potenciales agentes patógenos y producir

cuadros neumónicos y/o abortivos como lo producen en el ganado europeo.

Adicionalmente, los estudios serológicos han demostrado la continua

exposición de los CSA a dichos agentes virales. Se han reportado

seroprevalencias de: 14% (Manchego, et al.,1998) y 12 % (Alvarez, et al., 2002)

para VDVB en alpacas de Arequipa y Cusco respectivamente; para HVB-1,

Manchego(1998) reportó un 18% de Alpacas y 17% de Llamas en Arequipa, y

Victorio (2004) encontró un 80% de alpacas reactoras en Cusco.; para VRSB,

Manchego (1998) en una comunidad de Arequipa reporto el 9 % de alpacas

positivas, mientras que Victorio (2004) encontró un 80.2 % en alpacas de la

provincia de Canchis en el Cusco. En llamas de dos empresas ganaderas del

departamento de Puno se obtuvieron 20 y 26 %, mientras que en tres

comunidades del mismo departamento se obtuvieron prevalencias de 5.2%, 25% y

22 % respectivamente (Rivera, et al., 1990); para VPI3, la prevalencia encontrada

en llamas fue de 28 a 54% en animales de empresas asociativas y de 27 a 75%

en tres comunidades campesinas (Rivera, et al., 1990) mientras que en una

comunidad de Arequipa, el 66% de alpacas fueron positivas (Manchego, et al.,

1998) y Victorio (2004) encontró una prevalencia de 67.6% de alpacas

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seropositivas. Estos datos serológicos demuestran la presencia de dichos agentes

virales en las poblaciones de CSA, presentando una dinámica de infección en

animales susceptibles. Dichos datos aunados a los obtenidos en el presente

estudio terminarían de demostrar el potencial patógeno de dichos virus en las

poblaciones de CSA.

Si bien es cierto, los datos obtenidos de modelos experimentales in vitro

deben ser extrapolados cuidadosamente con lo que ocurriría en un sistema in vivo,

los resultados obtenidos en el presente estudio son importantes para identificar

las interacciones virus - hospedero iniciales necesarias para la infección por

VDVB, VHB-1, VRSB y VPI3. El conocimiento de la patología de las infecciones

virales en CSA podría ser útil para el efectivo control y tratamiento de las

enfermedades virales que afectan al ganado altoandino.

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VI. CONCLUSIONES.

De los resultados obtenidos se ha llegado a las siguientes conclusiones:

� Los cultivos celulares secundarios de cornete nasal, piel y testículo de

alpacas y llamas son viables y constituyen un modelo apropiado para

ensayos de replicación viral.

� Las células secundarias de cornete nasal y piel de alpaca y llama son

permisibles a la multiplicación viral de VDVB, PI3, HVB-1, VRSB; lo que

sugiere la presencia de receptores celulares similares u homólogos a los

presentados en células bovinas.

� Las células de llamas, alpacas y bovino, reaccionan de igual manera con la

presentación de ECP tras la infección con VDVB, VHB-1, VRSB y VPI3.

Encontrándose similitudes tanto en la naturaleza de dichos efectos, como

en el tiempo de presentación de los mismos.

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Permisibilidad de cultivos celulares secundarios de alpaca ...

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