Curva de fusin

PCR EN TIEMPO REALDiana Carolina VargasQu se necesita?ADNcPrimersTaq PolimerasadNTPsMgCl2Buffer FluorocromoEl calor rompe los puentes de hidrogeno que unen las bases nitrogenadas (esto lo haria una helicasa), La Taq polimerasa es termoestable y soporta las altas temperaturas (70C) y sintetiza la nueva cadena de ADN alineando desoxiribonucleotidos difosfato (dNTPs). Los primers son complementarios a una de las dos cadenas y permiten que la taq polimerasa sintetice la nueva cadena, delimitando el trozo de ADN a amplificar.El Buffer mantiene el pH adecuado para que la ADN polimerasaEl cloruro de magnesio actua como un cofactor, actua como un catalizador 2Fluorocromo (SYBR GREEN)

Fluorocromo

SYBR GreenProductos especficosY productos no especficosEste fluorocromo se une a todas las secuencias de ADN, una vez este se une al producto de la PCR emite fluorescencia que es sensada por el termociclador. El aumento del producto de la PCR conduce al aumento de la fluorescencia emitida en cada ciclo de la PCR, esto permite cuantificar las concentraciones de ADNc.Un limitante es que SYBR green puede emitir fluorescencia para productos especificos y no especificos4SYBR GREENColorante de unin al ADN

EconmicoNo especficoPermite curva de disociacinA mayor producto de amplificacin, habr mayor Fluorescencia

ThresholdBasalControl NegativoCtRnMuestraFluorescenciaProducto PCRNmero de ciclosExponencialCurva de fusin

TMLos productos especificos de la PCR tienen una temperatura de fusin ms alta que los productos no especificos8Thereshold cycle

Thereshold cycle

Metodo de cuantificacinRELATIVA (Gen de referencia)Mtodo del Ct: compara los Ct del gen testeado y del gen de referencia (Ct) en cada muestra, y luego se comparan los Ct de las muestras experimentales con respecto a los calibradores. (EFICIENCIA 100%). r= 2 -(Ctm-Ctc) r= 2 -(Ct)