PASO DE DESACILACIÓN DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LAS ALDEHÍDO DESHIDROGENASAS
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PASO DE DESACILACIÓN DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LAS ALDEHÍDO DESHIDROGENASAS González Segura, Lilian , Díaz Sánchez, Ángel G. y Muñoz Clares, Rosario A. Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, UNAM, México, D. F., 04510, México. Correo electrónico: [email protected] Introducción Introducción Las aldehído deshidrogenasas (ALDHs) son un grupo de enzimas ampliamente distribuidas que catalizan la oxidación de una gran variedad de aldehídos a sus correspondientes ácidos carboxílicos con la concomitante reducción de NAD(P) + a NADP(H). El mecanismo de reacción de las aldehído deshidrogenasas involucra tres pasos: a) el ataque nucleofílico de la cisteína catalítica sobre el aldehído formando un intermediario tiohemiacetal; b) la transferencia del hidruro del tiohemiacetal al NAD(P) + resultando en la formación del intermediario tioéster y NAD(P)H; y c) el ataque nucleofílico de una molécula de agua sobre el intermediario tioéster (desacilación) produciéndose el producto ácido. Referencias Referencias Agradecimientos Agradecimientos 1. Muñoz-Clares, R. A., González-Segura, L. and Díaz- Sánchez, A. G. (2011) Chem.-Biol. Interact. en prensa. doi: 10.1016/ j.cbi.2010.12.024 2. González-Segura, L., Rudiño-Pinera, E., Muñoz-Clares, R. A. and Horjales, E. 2008. (2009) J. Mol. Biol. 385, 542- 557. 3. Li, H., Robertson, A.D. and Jensen, J.H. (2005) Proteins 61, 704-21. Trabajo financiado por CONACYT (proyectos 59654 y 101986) y DGAPA, UNAM (proyecto PAPIIT IN204708). Las estructuras cristalográficas de las ALDHs han mostrado la flexibilidad conformacional del residuo glutámico catalítico que es la base general que activa la molécula de agua hidrolítica en el paso de desacilación. En base a las estructuras cristalográficas de ALDHs se han propuesto como hidrolíticas cinco moléculas de agua que ocupan distintas posiciones en el sitio activo. El paso de desacilación requiere: (1) que la molécula de agua hidrolítica se encuentre en la posición adecuada con respecto al carbono carbonílico del intermediario tioéster para llevar a cabo un ataque nucleofílico eficiente, siguiendo la trayectoria de Bürgi-Dunitz, así como con respecto al glutamato al que cede un protón activándose, y (2) que este protón sea liberado posteriormente por el glutamato. Para comprobar cuales de estas moléculas cumplían con estos requisitos modelamos el intermediario tioéster en el sitio activo de la betaína aldehído deshidrogenasa de Pseudomonas aeruginosa (PaBADH). Figura 3. Posición de las moléculas de agua hidrolíticas con respecto al intermediario tioéster modelado en el sitio activo. Nuestros modelos indican que sólo tres (Wat 1 , Wat 2 y Wat 3 ) de las cinco moléculas de agua propuestas como hidrolíticas podrían participar en el paso de desacilación ya que están cercanas al glutámico catalítico y podrían acercarse al carbono carbonílico del intermediario tioéster siguiendo la trayectoria ideal de Bürgi-Dunitz. S - N+ N H 2 O H R O Aldehído NAD(P) + S O - R H N+ N H 2 O NAD(P) + S R O N N H 2 O E NAD(P)H S O - R O H N N H 2 O Intermediario tiohemiacetal Intermediario tioéster Intermediario tetrahédrico NAD(P)H (1)Formación del tiohemiacetal (2) Transferenci a del hidruro (3) Desacilación O H H NAD(P)H Ácid o E E E Aldehído NAD(P) + O - R O Esquema 1. Mecanismo químico de reacción de las aldehído deshidrogenasas [1]. Lys178 Glu476 Glu268 Val453 “adentro” “intermedia” “afuera” “descanso” “ataque” Cys302 Figura 1. Conformaciones del glutámico catalítico en las ALDHs. Las reacciones hidrolíticas catalizadas por enzimas requieren de una base general para aceptar un protón de la molécula de agua hidrolítica. Para una eficiente transferencia de un protón entre dos grupos o moléculas, el pK a del donador y aceptor deben de ser comparables. Esto implica que el pK a de la cadena lateral del Glu catalítico debe ser mayor que su valor típico de 4, mientras que el agua hidrolítica su valor debe ser más bajo que su valor normal de 15.74. Para investigar la factibilidad de que el agua hidrolítica ceda el protón al Glu catalítico y de que éste lo ceda posteriormente a través de un mecanismo que involucra a otro residuo de Glu como se ha propuesto [2], se estimaron valores de pK a teóricos de los grupos carboxilo de ambos residuos de la PaBADH utilizando el programa de cómputo PROPKA 2.0 [3]. Conclusión Conclusión El análisis de las estructuras cristalográficas de las ALDHs, el uso de los modelos de los intermediarios catalíticos y los cálculos teóricos de pK as nos han permitido entender mejor el mecanismo del paso de desacilación de la reacción catalizada por estas importantes enzimas. O O H NH 3 + NH S R O O - H O N H 2 O N + H N H H N H O O O - O H H (II) Glu268 Intermediario tioéster Cys302 Agujero del oxianión Glu476 Lys178 Phe465 Gly464 Asn169 R O - O NH 3 + O H H NH SH O N H 2 O O H O N H N H N H O O O H Producto ácido Glu268 Glu476 Lys178 Phe465 Gly464 Asn169 Cys302 NH S R O O O H O H H O N H 2 NH 3 + O N H N H N H O O O - O H H Glu268 Cys302 Asn169 Agujero del oxianión (I) Glu476 Lys178 Phe465 Gly464 Intermediario tioéster (III) Intermediario tioéster Glu252(268) Cys286 (302) Wat 2 Wat 1 Asn153(169) 2.8 4.1 3.3 3.2 4.2 3.6 “intermedia” Nu – Wat 5 5.6 6.3 Intermediario tioéster Glu288(268) Cys322 (302) Wat 5 Wat 4 Asn184(169) 4.2 3.2 5.2 3.1 2.7 1.9 6.2 2.4 Wat 3 “adentro” Nu – PaBADH (2WME) TtP5CDh (1UZB) Conformación del Glu268 pKa Glu268 Glu476 Lys178 PaBADH Intermedia 9.08 4.67 8.56 Afuera 2.58 5.15 8.12 PaBADH-tioéster Intermedia 9.11 4.67 8.59 Valores de pKas teóricos del Glu catalítico y de los residuos involucrados en la liberación del protón Esquema 2. Mecanismo del paso de desacilación propuesto para las ALDHs [1]. Los cálculos de los pK as teóricos apoyan nuestra hipótesis de que el Glu catalítico sufre cambios importantes en su pK a consistentes con su papel como base general y su papel en el sistema de descarga de protones previamente propuesto por nosotros a partir de observaciones cristalográficas [2]. Esto se logra gracias a los cambios conformacionales que experimenta este residuo durante el ciclo catalítico. “adentro”- conformación del glutámico cercana a la cisteína catalítica. ”intermedia”- conformación en la que podría llevar a cabo la activación de la molécula de agua hidrolítica. “afuera”- conformación en la que libera el protón que había sido tomado previamente a través de un mecanismo de descarga de protones [2]. Figura 2. Posiciones e interacciones de moléculas de agua ordenadas que han sido propuestas como hidrolíticas en diferentes ALDHs. “intermedia” “descanso” “ataque” “intermedia” “adentro” “descanso” “adentro” “ataque”
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PASO DE DESACILACIÓN DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LAS ALDEHÍDO DESHIDROGENASAS. González Segura, Lilian , Díaz Sánchez , Ángel G. y Muñoz Clares , Rosario A. - PowerPoint PPT Presentation
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PASO DE DESACILACIÓN DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LAS ALDEHÍDO
DESHIDROGENASAS González Segura, Lilian, Díaz Sánchez, Ángel G. y Muñoz Clares, Rosario A.
Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, UNAM, México, D. F., 04510, México. Correo electrónico: [email protected]
IntroducciónIntroducción
Las aldehído deshidrogenasas (ALDHs) son un grupo de enzimas ampliamente distribuidas que catalizan la oxidación de una gran variedad de aldehídos a sus correspondientes ácidos carboxílicos con la concomitante reducción de NAD(P)+ a NADP(H). El mecanismo de reacción de las aldehído deshidrogenasas involucra tres pasos: a) el ataque nucleofílico de la cisteína catalítica sobre el aldehído formando un intermediario tiohemiacetal; b) la transferencia del hidruro del tiohemiacetal al NAD(P)+ resultando en la formación del intermediario tioéster y NAD(P)H; y c) el ataque nucleofílico de una molécula de agua sobre el intermediario tioéster (desacilación) produciéndose el producto ácido.
ReferenciasReferencias
AgradecimientosAgradecimientos
1. Muñoz-Clares, R. A., González-Segura, L. and Díaz-Sánchez, A. G. (2011) Chem.-Biol. Interact. en prensa. doi: 10.1016/ j.cbi.2010.12.024
2. González-Segura, L., Rudiño-Pinera, E., Muñoz-Clares, R. A. and Horjales, E. 2008. (2009) J. Mol. Biol. 385, 542-557.
3. Li, H., Robertson, A.D. and Jensen, J.H. (2005) Proteins 61, 704-21.
Trabajo financiado por CONACYT (proyectos 59654 y 101986) y DGAPA, UNAM (proyecto PAPIIT IN204708).
Las estructuras cristalográficas de las ALDHs han mostrado la flexibilidad conformacional del residuo glutámico catalítico que es la base general que activa la molécula de agua hidrolítica en el paso de desacilación.
En base a las estructuras cristalográficas de ALDHs se han propuesto como hidrolíticas cinco moléculas de agua que ocupan distintas posiciones en el sitio activo. El paso de desacilación requiere: (1) que la molécula de agua hidrolítica se encuentre en la posición adecuada con respecto al carbono carbonílico del intermediario tioéster para llevar a cabo un ataque nucleofílico eficiente, siguiendo la trayectoria de Bürgi-Dunitz, así como con respecto al glutamato al que cede un protón activándose, y (2) que este protón sea liberado posteriormente por el glutamato. Para comprobar cuales de estas moléculas cumplían con estos requisitos modelamos el intermediario tioéster en el sitio activo de la betaína aldehído deshidrogenasa de Pseudomonas aeruginosa (PaBADH).
Figura 3. Posición de las moléculas de agua hidrolíticas con respecto al intermediario tioéster modelado en el sitio activo.
Nuestros modelos indican que sólo tres (Wat1, Wat2 y Wat3) de las cinco moléculas de agua propuestas como hidrolíticas podrían participar en el paso de desacilación ya que están cercanas al glutámico catalítico y podrían acercarse al carbono carbonílico del intermediario tioéster siguiendo la trayectoria ideal de Bürgi-Dunitz.
S-
N+
NH2
O
HR
O
Aldehído
NAD(P)+
S
O-
R
H
N+
NH2
ONAD(P)+
S R
O
N
NH2
O
E
NAD(P)H
S
O-
R
O
H
N
NH2
O
Intermediariotiohemiacetal
Intermediariotioéster
Intermediariotetrahédrico
NAD(P)H
(1) Formación del tiohemiacetal
(2) Transferencia
del hidruro
(3) Desacilación
OH
H
NAD(P)H
Ácido
EE
E
Aldehído
NAD(P)+
O-
R
O
Esquema 1. Mecanismo químico de reacción de las aldehído deshidrogenasas [1].
Lys178
Glu476
Glu268
Val453
“adentro”
“intermedia”
“afuera”
“descanso” “ataque”
Cys302
Figura 1. Conformaciones del glutámico catalítico en las ALDHs.
Las reacciones hidrolíticas catalizadas por enzimas requieren de una base general para aceptar un protón de la molécula de agua hidrolítica. Para una eficiente transferencia de un protón entre dos grupos o moléculas, el pKa del donador y aceptor deben de ser comparables. Esto implica que el pKa de la cadena lateral del Glu catalítico debe ser mayor que su valor típico de 4, mientras que el agua hidrolítica su valor debe ser más bajo que su valor normal de 15.74.
Para investigar la factibilidad de que el agua hidrolítica ceda el protón al Glu catalítico y de que éste lo ceda posteriormente a través de un mecanismo que involucra a otro residuo de Glu como se ha propuesto [2], se estimaron valores de pKa teóricos de los grupos carboxilo de ambos residuos de la PaBADH utilizando el programa de cómputo PROPKA 2.0 [3].
ConclusiónConclusión
El análisis de las estructuras cristalográficas de las ALDHs, el uso de los modelos de los intermediarios catalíticos y los cálculos teóricos de pKas nos han permitido entender mejor el mecanismo del paso de desacilación de la reacción catalizada por estas importantes enzimas.
OO
H
NH3+
NH
S R
O
O-
H
O
NH2
O
N+
H
N
H
H
NH
O
O
O
-
O H
H
(II)
Glu268
Intermediario tioéster
Cys302
Agujero del oxianión
Glu476
Lys178
Phe465
Gly464
Asn169
R
O-
O
NH3+
O
H
H
NH
SH
O
NH2
O
O
HO
NH
N
HNH
O
O
O
H
Producto ácido
Glu268
Glu476
Lys178
Phe465
Gly464
Asn169
Cys302
NH
S R
O
O
O
H
OH
H
O
NH2
NH3+
O
NH
N
HNH
O
O
O
-
O H
H
Glu268
Cys302
Asn169
Agujerodel oxianión
(I)
Glu476
Lys178
Phe465
Gly464
Intermediariotioéster
(III)
Intermediariotioéster
Glu252(268)
Cys286(302)
Wat2Wat1
Asn153(169)
2.84.1
3.33.2
4.23.6
“intermedia”
Nu–
Wat55.6
6.3Intermediario
tioéster
Glu288(268)
Cys322(302)
Wat5
Wat4
Asn184(169)
4.2
3.2
5.2
3.12.7
1.9
6.22.4
Wat3
“adentro”
Nu–
PaBADH (2WME) TtP5CDh (1UZB)
Conformación del Glu268 pKaGlu268 Glu476 Lys178
PaBADHIntermedia 9.08 4.67 8.56Afuera 2.58 5.15 8.12
PaBADH-tioésterIntermedia 9.11 4.67 8.59
Valores de pKas teóricos del Glu catalítico y de los residuos involucrados en la liberación del
protón
Esquema 2. Mecanismo del paso de desacilación propuesto para las ALDHs [1].
Los cálculos de los pKas teóricos apoyan nuestra hipótesis de que el Glu catalítico sufre cambios importantes en su pKa consistentes con su papel como base general y su papel en el sistema de descarga de protones previamente propuesto por nosotros a partir de observaciones cristalográficas [2]. Esto se logra gracias a los cambios conformacionales que experimenta este residuo durante el ciclo catalítico.
“adentro”- conformación del glutámico cercana a la cisteína catalítica. ”intermedia”- conformación en la que podría llevar a cabo la activación de la molécula de agua hidrolítica. “afuera”- conformación en la que libera el protón que había sido tomado previamente a través de un mecanismo de descarga de protones [2].
Figura 2. Posiciones e interacciones de moléculas de agua ordenadas que han sido propuestas como hidrolíticas en diferentes ALDHs.
“intermedia”
“descanso”
“ataque”
“intermedia”
“adentro”
“descanso”
“adentro”
“ataque”
