Cinética Enzimática

Enrique Rivera González

Importancia

• Las enzimas son proteínas capaces de catalizar específicamente reacciones bioquímicas.

• La actividad catalítica de las enzimas depende de su estructura.

Pueden requerir:

1) Sólo su secuencia de aminoácidos y su conformación

2) Un cofactor (iones inorgánicos como Fe2+, Mg2+, Cu2+)

3) Un grupo prostético (porfirinas)

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• Las catálisis enzimática es esencial para sistemas vivos.

• Permite que procesos químicos no favorables energéticamente se lleven a cabo en condiciones biológicas:

Medio acuoso, pH neutro, temperatura y presión bajas.

• Cuando la enzima se desnaturaliza, pierde su estructura y por lo tanto su actividad catalítica.

3

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NH

N N

O

HO

HO

N

N NH

O

HO

HO

O2, Ca2+

Aequorina

+ CO2 + hv (466 nm)

Aequorea victoria

Aequorina

• Una reacción catalizada enzimáticamente se lleva a cabo en el sitio activo, que es el conjunto de residuos de aminoácidos de la enzima que se unen a la molécula que va a transformarse.

• La molécula que se une al sitio activo se denomina sustrato.

• Generalmente un sitio activo es específico para un determinado sustrato y al unirse forman un complejo enzima-sustrato

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Enzima

Sustrato

Complejo enzima -sustrato

Productos

Factores energéticos

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𝑆 → 𝑃

𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆→𝑘2𝑃 + 𝐸

Coordenada de reacción

En

ergí

a li

bre

G Estado de transición

no catalizada

Reacción sin catalizar

Reacción catalizada por enzimas

𝑘1

𝑘−1

catalizada

Cinética de Michaelis-Menten

Observaciones experimentales

• A bajas [S], v0 incrementa linealmente mientras [S] aumenta

• A mayores [S], los incrementos de v0 se hacen menores mientras [S] aumenta.

• Después de una cierta [S], v0 ya no aumenta, alcanzando un máximo Vmax

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[S]

v0

• Para explicar este comportamiento cinético, Michaelis y Mentenpropusieron en 1913 el siguiente mecanismo:

1) La enzima (E) se combina reversiblemente con sus sustrato (S) para formar un complejo enzima-sustrato (ES).

2) En un paso lento el complejo ES da lugar a la enzima libre (E) y a los productos de la reacción (P).

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𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 𝐸𝑆→𝑘2𝐸 + 𝑃

𝑘−1

𝑘1

sitio activo

Se define la ecuación de velocidad total.

En la primera reacción se plantea una situación de equilibrio y las velocidades hacia ambas direcciones se igualan.

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𝑣0 =𝑑[𝑃]

𝑑𝑡0

= 𝑘2[𝐸𝑆]

𝑘1 𝐸 [𝑆] = 𝑘−1[𝐸𝑆] 𝐾𝑠 =𝑘−1𝑘1

=𝐸 [𝑆]

[𝐸𝑆]

𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆→𝑘2𝑃 + 𝐸

𝑘−1

𝑘1

Deducción de la ecuación de velocidad

A cualquier tiempo en una reacción catalizada enzimáticamente, la enzima existe en dos formas: E y ES y su concentración total se expresa:

Despejando [ES].

Sustituyendo [ES] en la expresión de velocidad.

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𝑣0 =𝑑[𝑃]

𝑑𝑡0

= 𝑘2 𝐸𝑆

𝐾𝑠 =𝐸 [𝑆]

[𝐸𝑆]=

( 𝐸𝑆 − 𝐸 0)[𝑆]

[𝐸𝑆]

[𝐸]0= 𝐸 + [𝐸𝑆] 𝐸 = 𝐸𝑆 − [𝐸]0

𝐸𝑆 =𝐸 0[𝑆]

𝐾𝑠 + [𝑆]

=𝑘2 𝐸 0[𝑆]

𝐾𝑠 + [𝑆]

1) Cuando [S] es baja

2) Cuando [S] es alta

Vmax se observa cuando prácticamente toda la enzima se encuentra saturada con su sustrato (formando complejo ES) y un incremento en [S] no tiene efecto en la velocidad de reacción.

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𝒗𝟎 =𝒌𝟐 𝑬 𝟎[𝑺]

𝑲𝒔 + [𝑺]

𝑣0 =𝑘2𝐾𝑠

𝐸 0 𝑆 𝑣0∝ 𝑆

𝑺 ≪ 𝑲𝒔

𝑺 ≫ 𝑲𝒔𝑣0 = 𝑘2 𝐸 0 = 𝑽𝒎𝒂𝒙

[S]

v0

Basándose en el esquema de reacción de Michaelis y Menten, en 1925 Briggs y Haldane propusieron que durante las reacciones enzimáticas, la [ES] se mantiene constante hasta que una cantidad significativa de sustrato ha sido consumida.

Es aplicable la aproximación de estado estacionario para ES

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Cinética de Briggs-Haldane

Se define la ecuación de velocidad total.

Se plantea la diferencial de ES.

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𝑣0 =𝑑[𝑃]

𝑑𝑡0

= 𝑘2[𝐸𝑆]

𝑑[𝐸𝑆]

𝑑𝑡= 𝑘1 𝐸 𝑆 − 𝑘−1 𝐸𝑆 − 𝑘2 𝐸𝑆 = 0

𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆→𝑘2𝑃 + 𝐸

𝑘−1

𝑘1

Deducción de la ecuación de velocidad

La concentración total de la enzima se expresa:

Sustituyendo [E] en la ecuación de estado estacionario.

Despejando [ES].

Sustituyendo [ES] en la expresión de velocidad.

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[𝐸]0= 𝐸 + [𝐸𝑆] 𝐸 = 𝐸𝑆 − [𝐸]0

𝐸𝑆 =𝑘1 𝐸 0 𝑆

𝑘−1 + 𝑘2 + 𝑘1 𝑆

𝑘1( 𝐸𝑆 − 𝐸 0) 𝑆 − 𝑘−1 𝐸𝑆 − 𝑘2 𝐸𝑆 = 0

𝑘1 𝐸 𝑆 − 𝑘−1 𝐸𝑆 − 𝑘2 𝐸𝑆 = 0

𝑣0 =𝑑[𝑃]

𝑑𝑡0

= 𝑘2 𝐸𝑆=𝑘2𝑘1 𝐸 0 𝑆

𝑘1 𝑆 + 𝑘−1 + 𝑘2=

𝑘2 𝐸 0 𝑆

𝑘−1 + 𝑘2𝑘1

+ 𝑆

Aproximación al equilibrio: Aproximación de estado estacionario:

• Michaelis y Menten asumieron que la unión al sustrato y la disociación del complejo ES ocurrían más rápido que la formación de producto (𝑘−1 ≫ 𝑘2).

• Briggs y Haldane no asumieron nada acerca de los valores de 𝑘−1 𝑦 𝑘2.

El modelo cinético de M-M es un caso especial del modelo de B-H.15

𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆→𝑘2𝑃 + 𝐸

𝑘−1

𝑘1

𝑣0 =𝑘2 𝐸 0 𝑆

𝑘−1 + 𝑘2𝑘1

+ 𝑆=𝑘2 𝐸 0[𝑆]

𝐾𝑚 + [𝑆]

𝐾𝑚 =𝑘−1 + 𝑘2

𝑘1𝐾𝑠 =

𝑘−1𝑘1

𝑣0 =𝑘2 𝐸 0[𝑆]

𝐾𝑠 + [𝑆]

De la ecuación cinética de Michaelis-Menten se puede obtener una relación matemática cuando la velocidad inicial es la mitad de Vmax.

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𝑣0 =𝑘2 𝐸 0[𝑆]

𝐾𝑚 + [𝑆]

𝑣0 =𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]

𝐾𝑚 + [𝑆]=𝑉𝑚𝑎𝑥

2

𝑽𝒎𝒂𝒙 = 𝑘2 𝐸 0𝒗𝟎 =

𝑽𝒎𝒂𝒙[𝑺]

𝑲𝒎 + [𝑺]

Ecuación de Michaelis-Menten

[S]

v0

[𝑆]

𝐾𝑚 + [𝑆]=1

2

𝑲𝒎 = 𝑺 𝑐𝑢𝑎𝑛𝑑𝑜 𝒗𝟎 =𝑽𝒎𝒂𝒙

𝟐[S] = Km

Linealización de Lineweaver-Burk

• Experimentalmente el valor de Vmax puede no llegar a obtenerse porque la enzima no se haya saturado completamente.

• La ecuación de Michaelis-Menten puede expresarse algebraicamente de otras formas tales que permitan una práctica determinación de los parámetros cinéticos Km y Vmax .

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𝑣0 =𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]

𝐾𝑚 + [𝑆]

1

𝑣0=

𝐾𝑚𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]

+1

𝑉𝑚𝑎𝑥

Linealización de Eadie-Hofstee

• Es otra técnica similar a la de Lineweaver-Burk para determinar Km y Vmax .

• El principal problema de este método es que tanto la variable dependiente como la independiente dependen de v0 y que un error experimental afectaría a ambos ejes.

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𝑣0 =𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]

𝐾𝑚 + [𝑆]

𝑉𝑚𝑎𝑥

𝑣0=𝐾𝑚 + [𝑆]

[𝑆]

𝑣0 = −𝐾𝑚𝑣0[𝑆]

+ 𝑉𝑚𝑎𝑥

Interpretación de Km

• Representa la [S] a la cual la mitad de las moléculas de enzima se encuentran saturadas, formando complejo ES.

• El valor de Km sugiere la afinidad de la enzima con sus sustrato.

Un valor bajo de Km indica mayor afinidad y por lo tanto una mayor velocidad a cualquier [S].

• Km es utilizado para identificar isoenzimas, las cuales presentan diferente afinidad por el mismo sustrato.

• Km es sensible a condiciones como pH y temperatura, lo cual permite identificar cambios estructurales de la enzima.

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Interpretación de k2

• k2 también conocida como kcat o número de recambio es la constante de velocidad para el paso determinante de velocidad.

• kcat se define como el número de moléculas de producto formadas a partir del sustrato por una enzima en una unidad de tiempo.

• El cociente kcat

K𝑚

, denominado como cociente de especificidad permite

comparar la eficiencia catalítica de diferentes enzimas o de la transformación de dos sustratos diferentes por la misma enzima.

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𝑣0 =𝑘2 𝐸 0[𝑆]

𝐾𝑚 + [𝑆]

21

Los siguientes datos experimentales fueron obtenidos durante un estudio de la actividad catalítica de una peptidasa intestinal con el sustrato glicilglicina de acuerdo a la siguiente reacción:

Sabiendo que [E]=0.3μM, determina la eficiencia catalítica de la enzima.22

[S] (mM) V0 (μM/min)

1.6 0.21

2.0 0.24

3.0 0.28

4.0 0.33

8.0 0.40

16.0 0.45

𝐺𝑙𝑖𝑐𝑖𝑙𝑔𝑙𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎 + 𝐻2𝑂 → 2 𝐺𝑙𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎

Se determinó la velocidad inicial a varias concentraciones de sustrato para una reacción catalizada enzimáticamente de acuerdo con los siguientes datos:

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[S] /105(M) V0 /106(mol/min)

2.5 0.21

4.0 0.24

6.0 0.28

8.0 0.33

16.0 0.40

20.0 0.45

a) Menciona si la reacción sigue una cinética de acuerdo al modelo de Michaelis-Menten.

b) Si kcat es 8.0 𝑥 102, ¿Cuál fue la concentración de enzima utilizada?

c) Calcula v0 cuando [𝑆] = 5.0 𝑥 10−5 y [𝑆] = 5.0 𝑥 10−1

d) Si se duplicara la concentración de la enzima, ¿Cómo se verían afectados los valores de Km, kcat y Vmax?