UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICACTEDRA: BIOQUIMICA

CONCEPTOS BSICOS DE CINTICA QUMICAEn una reaccin de orden cero, la velocidad de formacin del producto es independiente de la concentracin de sustrato: v = kEn una reaccin de primer orden la velocidad de formacin de los productos es directamente proporcional a la concentracin del sustrato: v = k [A]. As, en la reaccin:sacarosa + agua glucosa + fructosa La velocidad de hidrlisis de la sacarosa es, en todo momento, proporcional a la concentracin de sacarosa. Dicho matemticamente, donde [A] es la concentracin de sacarosa a cada tiempo (t) y k es la constante de proporcionalidad. Se dice que sta es una reaccin de primer orden.

Una reaccin de segundo orden es aquella en la que la velocidad de formacin del producto depende de la concentracin de dos sustratos (como en una reaccin de condensacin): v = k [A1] [A2] del cuadrado de la concentracin de un nico sustrato (reaccin de dimerizacin): v = k [A]2

CINTICA ENZIMTICA La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especificidad de la enzima. La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima.

La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato.En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos.

Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato) en funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reaccin, o simplemente, la cintica de la reaccin. A medida que la reaccin transcurre, la velocidad de acumulacin del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reaccin. Para evitar esta complicacin se procede a medir la velocidad inicial de la reaccin (v0).

La velocidad inicial de la reaccin es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento.

Adems, en estas condiciones no es necesario considerar la reaccin inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequea que la reaccin inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

Para estudiar la cintica enzimtica se mide el efecto de la concentracin inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una grfica como la de la Figura siguiente.

Cuando [S]0 es pequea, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentracin de sustrato, y por tanto, la reaccin es de primer orden. A altas [S]0, la enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reaccin es de orden cero y la velocidad es mxima (Vmax).

El sustrato se une a la enzima en una regin determinada llamada sitio activo. El fenmeno de saturacin junto con otras evidencias llevaron a postular la existencia de un complejo enzima sustrato (E S) como etapa previa a la formacin de productos.En 1913 Leonor Michelis dedujo la relacin entre la velocidad mxima (vm) de una reaccin catalizada enzimticamente en trminos de la formacin del complejo E S. En base a estas consideraciones es lgico suponer que a altas concentraciones de sustrato, todos los sitios activos de la enzima estn ocupados y por lo tanto la velocidad alcanza un mximo.

Una enzima E se combina con un sustrato S para formar el complejo E S, con una constante de velocidad k1. Este complejo E S puede seguir dos caminos:a) puede proceder para formar el producto con una constante de velocidad k3

b) el camino alternativo es disocindose, generando nuevamente E y S con una constante de velocidad k2.

En el esquema anterior k1, k2 y k3 son las constantes cinticas individuales de cada proceso y tambin reciben el nombre de constantes microscpicas de velocidad. Segn esto, podemos afirmar que: v1 = k1 [E] [S] v2 = k2 [ES] v3 = k3 [ES] Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentracin total de enzima [ET], (que es constante a lo largo de la reaccin) es:

[ET] = [E] + [ES] Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

Este modelo cintico adopta la hiptesis del estado estacionario, segn la cual la concentracin del complejo enzima-sustrato es pequea y constante a lo largo de la reaccin. Por tanto, la velocidad de formacin del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociacin (v2+ v3): v1 = v2 + v3

Adems, como [ES] es constante, la velocidad de formacin de los productos es constante:v = v3 = k3 [ES] =constante.Como v1=v2+v3, podemos decir que:k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES], queda que:

siendo en donde la expresin (k2+k3)/k1 se ha sustitudo por Km, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicacin sobre las razones que hacen de la Km un parmetro cintico importante.

Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formacin del producto es:

v = v3 = k3 [ES] = Para cualquier reaccin enzimtica, [ET], k3 y Km son constantes. Vamos a considerar dos casos extremos:A concentraciones de sustrato pequeas ([S]

A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reaccin es independiente de la concentracin del sustrato, y por tanto, la reaccin es un proceso cintico de orden cero. Adems, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parmetro, la velocidad mxima de la reaccin (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzara cuando todo el enzima disponible se encuentra unido al sustrato.

Si introducimos el parmetro Vmax en la ecuacin general de la velocidad, obtenemos la expresin ms conocida de la ecuacin de Michaelis-Menten:

Hay enzimas que no obedecen la ecuacin de Michaelis-Menten. Se dice que su cintica no es Michaeliana. Esto ocurre con las enzimas alostricas, cuya v frente a [S] no es una hiprbola, sino una sigmoide. En la cintica sigmoidea, pequeas variaciones en la [S] en una zona crtica (cercana a la Km) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reaccin.

CLCULO DE LA Km Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA La representacin grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hiprbola. La Vmax corresponde al valor mximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la Vmax.

CONCLUSIONES SOBRE LA CINTICA DE MICHAELISCaractersticas de Km: la constante de Michaelis-Menten es caracterstica de una enzima y particular para un substrato. Refleja la afinidad de la enzima por ese substrato. Km es numricamente igual a la concentracin de substrato a la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la Vmax (Km= Vmax/2). Este parmetro, Km no vara con la concentracin de enzima.Significado de una Km pequea: un valor numrico pequeo de Km refleja una alta afinidad de la enzima por su substrato porque a una baja concentracin del mismo, la enzima a desarrollado ya la mitad de la velocidad mxima.

Significado de una Km grande: el valor numrico grande de Km refleja una baja afinidad de la enzima por su substrato porque a una concentracin elevada del mismo, la enzima desarrolla la mitad de la velocidad mxima.Relacin de la velocidad con la concentracin de enzima: la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin de la enzima a cualquier concentracin de substrato. Por ejemplo, si la concentracin de enzima es disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reaccin (v0) es reducida tambin a la mitad de la original.Orden de la reaccin: cuando S es mas pequea que la Km, la velocidad de la reaccin es aproximadamente igual a la concentracin de substrato.

LINEWEAVER BURKPara determinar grficamente los valores de Km y Vmax es ms sencillo utilizar la representacin doble recproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una lnea recta. Esta representacin doble recproca recibe el nombre de representacin de Lineweaver-Burk . Es una recta en la cual:La pendiente es Km/Vmax La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular grficamente, los valores de Km y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

y = a.m + b

Efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica. Efecto del pH: afecta al estado de disociacin de los grupos, aunque todas las protenas no se ven afectadas de igual forma porque algunas no tienen grupos disociables. La mayor parte de los enzimas tienen un pH ptimo. Si hay pequeos cambios de pH no se desnaturaliza la enzima. El pH puede afectar de dos maneras: - La unin del sustrato es mejor o peor que antes. - Que afecte a la velocidad cataltica de la reaccin.

Efecto de la temperatura: cuando la temperatura sube la velocidad de reaccin aumenta. Existe una temperatura mxima a la cual la protena se desnaturaliza dejando de ser funcional. La mayor parte de los enzimas se desnaturalizan a unos 50C. La ribonucleasa se desnaturaliza a temperaturas superiores a los 70C.