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Tesis de Posgrado

Purificación y propiedades de laPurificación y propiedades de laNAD aldehído deshidrogenasa deNAD aldehído deshidrogenasa de

levadura de panaderíalevadura de panadería(Saccharomyces cerevisiae)(Saccharomyces cerevisiae)

Schwarcz, Martha Norma

1964

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Schwarcz, Martha Norma. (1964). Purificación y propiedades de la NAD aldehídodeshidrogenasa de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae). Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1191_Schwarcz.pdf

Cita tipo Chicago:Schwarcz, Martha Norma. "Purificación y propiedades de la NAD aldehído deshidrogenasa delevadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae)". Tesis de Doctor. Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1964.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1191_Schwarcz.pdf

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES .

' FACULTADpá CÍÉÉCIAS'EXACTñS Y NATÚRALES

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Resúmenpresentado pafá optar al títuln'de Doctora en Quínápa

RESUMEN

Purificggión de la enzigg.Obtención del polvo cetónico gg levadura: de acuerdo a ln

técnica modificada por Stoppani y Milstein (8). Se utiliza leve­dura de panadería (Sachnromyces Cerevisiee) producto comercial,prensado y libre de fécula.

Extracciqnudg_la enzima: con solución de fosfato bipotási­co 0.092 M, en frio, con agitación ocasional durante 5 dias, man­teniendo el pH siempre superior a 6.6 mediante el agregado deamoniaco concentrado.

ggggulgción pqg_gglor de proteina inactiva: se ajusta elpHdel sobrenadante de le extracción a 6.3 con ácido cítrico1 My se calienta a 55°C durante 15 minutos; se enfría rápidamen­te y se centrifuga.

Precipitación_ágidg¿ sobrenadante de la etapa anterior sele baja el pH a 4.5 mediante el agreg do lento de ácido cítrico1 M, agitando continuamente y en frio. Actividad queda en elprecipitado que se redisuelve en solución de fosfato bipotásico0.025 M pH 6.3.

Fraccionggiento salido con sulfato de amonio: se hace me—diante el agregado de solución saturada de sulfato de amonio.El grueso de la actividad cae en el corte entre 45 y 68%de se­turación. Precipitedo se redisuelve en solución amortiguadorade fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTAlmM, pH 7.0.

Filtrggióu a través de gel de dextrgggt Sephedex G-200en una columna de 1.5 cm. de diámetro y 18 cm de largo equili­brada con amortiguador de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro depotasio 0.5 M, EDTAl mM, pH 7.0. Se eluye con el mismo buffer.

Fracciones de mayoractividad especifica se recronatografianpor la misma columna en iguales condiciones.

Propiedadegpde la enzigg.1.- Eggggifieidgd de sustrato: La enzima presenta una es­

pecificidad muyamplia hacia sus sustratos; estos pueden ser a1­dehidos alifáticos o aroméfiicos. Entre los primeros son oxidardos el glicolaldehido, propionaldehido, butiraldehido y oroton­aldehido; entre los segundos el benzaldehido y anisaldehido(p-metoxibeqaldehido). Nose oxidan el gliceraldehido, p-dimetil­aminobenzaldehidoni el salicilaldehido.

Excepto el gliceraldehido, todos los demás aldehidos ensa­yados, aún los que no tienen actividad, se unen a la enzima dardo que son inhibidores del sistema enzimática cuandoéste oxidaal acetaldehido.

2.- Especificidad de coenzigg¿ la aldehido deshidrogenasaademás del NAD reduce al NADP, deamNAD, APADy APdeamAD. El

deamNADes el más activo, la velocidad de la reacción es del

88%respecto a.la del testigo con NAD,la del NADPes del 33%,APdeamAD 18% y APAD 10%. PyAlAD y PyAldeamAD no son reducidos

por el sistema enzinático si bien pueden ser reducidos quimica­mente o por acción de otras íeshidrogenasas.

3.- Necesidad de aptivadores de la enzigg: la NADaldehidodeshidrogenasa necesita cisteina para alcanzar el máximode suactividad, en ausencia de la misma, la velocidad de la reacciónes sólo del 14 al 16%de la correspondiente a la presencia deeisteina l mM.Si en esas condiciones se agrega al sistema enzi­mático aquellos complejantes de metales que en presencia de cis­teina inhiben la acción Catalitica (OP, HOQy DDC)se ve que enausencia de la mismala activan. La adición de cisteina l mMa

una preparación parcialmente activada por OP aumenta ligeramen­te la actividad, pero no tanto comocuando actúa sola. La acti­vación de la enzima en función de la concentración de OPllegaa un máximo, concentraciones de 0P por encima de ese valor(1 mM)producen inhibición.

El cupferrón que no es inhibidor tampoco produce activación.Cuando se cambia el aceptador de hidrógeno por análogos del NAD.

se obtiene que la velocidad inicial de la reacción en ausenciade activador depende de la coenzima presente en el sistema enzi­mática , así con APADla reacción no se produce, con NADy AP­deam ADla velocidad de la reacción enzimática es 9 y con

deanNADes de 18. Los complejantee no tienen el mismo efecto ac­tivador (comparadocon la cisteina) cuando los sistemas enzimá­tieos a los cuales se agregen tienen distintas coenzimasasí,con HOQse tienen las siguientes velocidades: 83 (NAD),72 (de­amNAD), 87 (AIPdeamASD) y 67 (APAD).

El estudio de la cinética de activación indica que la OP

actúa sobre el KNAD,aumentando la asociación de la coenzimaa la enzima.

4.- inhibidores de la reacción de la NADaldehido deshidro­genasa de levadura: La enzima es inhibida por distintas clasesde compuestos, los que se pueden agrupar en: I) coenzima, aná­logos y derivados del mismo, II) sustratos y análogos del sus­trato y III) compuestoscuya estructura no está relacinada nicon el sustrato ni con la coenzimu, este grupo comprende: a)sustancias orgánicas e inorgánicas capaces de formar complejoscon metales, b) hidroxilamina, c) reactivos de tioles.

I) Análogos del NAD.derivados piridinicos y adenílicos:los componentes de la molécula iel NAD,adenina, nicotinamiday sus derivados, asi como los análogos del NAD( ¿PAD, APdean­

AD, NABP)inhiben la reacción enzimática. Se comportan como inhi­bidores competitivos la adenina, nicotinamida, piridina, AMP,ADP, ATP, PyAlAD y PyAldeamAD. NMN,pirofosfato y fosfato nomodifican la velociiad de la reacción enzimática.

II) Inhibición por sustratogy sustancias análogas al sus­trato: los aldehidos oxidados por el sistema enzimático (gli­colaldehido, benzaldehido y anisaldehido) son inhibidores delmismocuando se los agrega junto con acetaldehido. El salieil­aldehido y el p-dimetilaminobenzaldehido.que no son oxidadoepor la enzima.son inhibidores de la misma, especialmente elúltimo de los nombrados, que cuando se agrega concentración i­

gual a la del acetaldehido inhibe el 100%de la actividad. Encambio el glicerqldehido, que no es oxidado, tampoco es un in­hibidor de la enzima. El estudio cinético de la acción de es­tos aldehidos sobre el sistema enzimático, en presencia de a­cetaldehido, no revela un comportamiento definido.

III) Compuestoscuya estructura no está relacionada nicon las coenzimgí ni con el sustrato:a) Sustancias comclejantes de metales: la inhibición por agen­tes orgánicos e inorgánicos capaces de formar complejos gcn¿y

metales indica que hay un metal involucrado en la reacción cata­lizada por la enzima. Son inhibidores la l,lO-fenantrolina, la8-hidroxiquinolina y el dietil-ditiocarbamato; el cupferrón, eldqrí’-dipiridilo y la azida sódica tienen muypoca o ningunaacción.

Estudios detallados de la influencia de la OPsobre la reac­ción de la NADaldehido deshidrogenasa muestran que esta gustan­cia produce dos tipos de inhibición, una instantánea y reversi­ble y otra dependiente del tiempo e irreversible. Tambiénel di­etilditiocurbamato produce una inibición irreversible dependien­te del tiempo. No se obserVa lo mismo con el zincón.

La inhibición irreversible por OPdepende del tiempo de in­cubación, del grado de pureza de la preparación enzimática. cuanto más pura más sensible a la acción del inhibidor y de la tem­peratura de incubación, aumenta con la misma.

Estudios de protección por distintas sustancias de la inhi­bición irreversible por OPconducen a los siguientes resultados;la cisteinc. dietilditiocarbamato y 8-hidroxiquinolino previenencompletamente la acción de la OP; cianuro y EDTAson tambiénfuertemente protectores. De la coenzima. análogos de la mismay mononucleótidos que la componen sólo el PyAlADy el Pynlicxn—ADactúan como protectores, los demás o bien potencian la acciónde la 0P como el NAD. NADP, ADP y APADo no ofrecen ninguna

acción comola adenina. El pirofosfato es ligeramente protector.El único catión que protege totalmente la enzima de la acciónde la 0P es el Zn++3el K+; Rb+ y Sr*+ son algo protectores. Elacetaldehido aumenta lige3amente el efecto inhibidor de la 0P.

Estudios oinóticos de la acción de la 0P, HOQy DDCsobre

los complejos enzima-coenzima y enzima-sustrato muestran que lainhibición instantánea es competitiva con el NADy mixta deltipo competitivo-no competitivo con el acetaldehido. La ciné­tica es consistente con la suposición de que se forma un com­plejo entre el metal unido a la enzima y la OP en el que ambosestín en relación 1:1.

b) Mxilnmina: la inhibición de lo. NADaldehido deshi­drogenasa por hidroxilamina depende de qué análogo del NADactúa como coenzima del sistema enzimática, es del 90%con elAPADo APdeamADpara una concentración de hidroxilamina de 10

mm. En iguales condiciones con el NADo deamNADla inhibición

obserVada es sólo del 15%.E1 estudio cinética indica que la hidroxilanino presenta

una inhibición incompetitIVa respecto de las coenzimas mientrasque para el acetaldehido si la cocnzima es NADo deamNADse ob­

serva una inhibición mixta del tipo competitivo-no competitivo.casi purzuc¡üe competitivo. mientras que cuando el sistema enzi­mática actúa con APADla inhibición es del tipo competitivo.

c) Beastivos de tioles: en un trabajo anterior Stoppani yMilstein encontraron que la NADaldehido deshidrogenasa es sen­sible a los reactivos de tioles (72). Se estudió el comportamien­to de los complejnntes de metales frente a la acción del o-iodo­sobenzoato y del óxido de melarsen: tanto la OP como le HOQaufmentan ln sensibilidad de la enzima hacia los reactivos de tio­les.

También se vió qué efecto tienen los análogos y componen­tes del NADcuando se los incuba en presencia de los mismos; el

NAD, NADP, PyAlAD, PyAldennAD y deamNADactúan protegiendo a la

enzima. E1 ABADy APdeanAD, sustancias que se sabe que se combi­

nan con la enzima, no sólo no la protegen sino que aumentan lainhibición por los reactivos de tiolea utilizados. Los uononu­cleótidos adenilicos AMP.ADPy ATPson protectores, aunque no

tanto comoel dinucleótido; el piridinico es muchomenosefi­082.

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

.PURIFICACION Y PROPlEDADES DE LA NAD ALDEHIDO DESHIDROGENASA DE

LEVADURA DE PANADERIA ( Saccharomyces cerevisiae )

MARTHA NORMA SCHWARCZ

75m; 1 1 8-1

Tesis presentada para optar al título de Doctora en Química

1964

'El presente trabajo se realizó en el Ins­tituto de QuimicaBiológica de la Facultad deCiencias Médicas de la Universidad de Buenos

Aires bajo la dirección del Dr Andrés O. M.Stoppani quien propuso el tema y a quien es­toy profundamente agradecida por su apoyo ydedicación en la conducción del mismo.

Al Consejo Nacional de InvestigacionesCientificas y Técnicas por las becas otorga­das durante los años 1958 y 1959.

Al Dr T. R. Selix del Instituto Nacionalde Microbiologia y al Dr H. Isnardi de laComisionde Investigaciones Cientificas de laProvincia de Buenos Aires, por haber autori­zado al Sr. T. Giovambatista, quienes reali­zaron los estudios de ultracentrifugación.

A las señoritas Lilia B. Viñas y MariaInés Tassara y al Sr Alberto Schwarcz la ayu­da prestada en la preparación de los origina­les.

CAPITULO I

INTRODUCCION

Las aldehido deshidrogenasas catalizan un conjunto de reac­ciones que se pueden resumir en la siguiente ecuación:

n-cso + PN++ AH R-COA + PNH + H+

en el cual PNrepresenta al piridin nucleótido.De acuerdo a la naturaleza de A se puede dividir a estas

enzimas en tres grupos; I) A = OH, es decir el término AHrepre­

senta H20. Históricamente la primera aldehido deshidrogenasa ca­racterizada es la aislada por Racker, a partir de higado de va­cuno (4); esta enzima unida al NAD_oxidauna serie de aldehidosalifáticos y aromáticos. el sistema no es activo con NADP,es es­timulado por mercaptanes y EDTA.De higado de conejo se han ais­lado dos aldehido deshidrogenasas que se asemejan por su ampliaespecificidad de sustrato, pero se diferencian en su sensibili­dad hacia los esteroides, solubilidad en soluciones salinas yefecto que sobre ellas produce el ión magnesio (91). A partirde levadura se han preparado dos aldehidos deshidrogenasas depropiedades bien diferenciadas; una activada por potasio o rubi­dio (2) puede actuar ya sea con NAD como con NADP, aunque con

esta última la reacción es muchomás lenta, ademásnecesita cis­teina para desarrollar totalmente su actividad; la otra activadapor magnesio o calcio (3) es especifica para el NADP.También seincluyen en esta categoria a las semialdehido deshidrogenasas,entre las queise.encuentran las succinico semialdehido deshidro­genasas, enzimas especificas de la oxidación del semialdehidosuccinico a ácido succinico, aisladas a partir de bacterias(93) o de cerebro de mono (93), y la malónico semialdehido CoAdeshidrogenasa presente en el Clostridium kluyveri. La aldehidodeshidrogenasa aislada de Pseudomonasfluorescens (92) tieneuna amplia especificidad de sustrato, requiere arsenato o fos­fato para su actividad asi comotambién un mercaptan; el pro­ducto final es el ácido libre. II) A a fosfato, arsenato o mer­captán. A este grupo pertenece una enzima aislada del Clostri­diumkluyveri (94) que cataliza la oxidación dependiente delNADy de CoAde varios aldehidos alifáticos dando comoresulta­do la formación del derivado acil-CoA respectivo; la formaldehí­do deshidrogenasa de higado de vacuno (95) que cataliza la oxi­dación del formaldehído en presencia de glutation dando como

producto S-formiglutation y la aspártico ssmialdehido deshidroge­naaa de levadura (103) que cataliza 1a conversión de L-aspárticofi-semialdehido a fi»aspartilfosfsto, ligado a fosfato inorgánicoy NADP.III) Aquellas enzimas que combinan otra función con lasarriba mencionadascomopor ejsmllo la decarboxilación'oxidativadel semialdehido malónico (96): la enzima es especifica para laoxidación y decarboxilación del semialdehido malónico a acetil­CoA, reacción que necesita 00A y NADo NADP.

La reacción se puede representar por:

9OOH 983

(¡mz + COASH + m1" a COSCoA + 002 + PNH + H+CHO

La enzima no actúa ni sobre el malonil-COA, ni sobre acetaldehi­do.

Ninguna de las aldehido deshidrogenasas descriptas se obtie­ne suficientemente pura comopara poder estudiar en forma adecuada el mecanismode la reacción que catalizan; por lo tanto parapoder esbozar un mecanismo común de acción de todas las aldehidodeshidrogenasas debe tenerse en cuenta las propiedades comunesa todas ellas. Estas propiedades, que si bien no han sido ensa­yadas 001 todas las enzimas disponibles pertenecientes a estegrupo, son comunes a un número de ellas; son las siguientes;1) Transferencia directa del hidrógeno del sustrato al piridinnucleótido siendo la mismaestereoespecifica para la posición m­del anillo nicotinamida (88, 89).2) Grupos sulfhidrilos. Todas las aldehido deshidrogenasas ensa­yadas son inhibidas por una serie de reactivos de grupos tioles.No todas reaccionan de la misma manera, algunas son más suscep­tibles que otras, y no todos los reactivos tienen el mismoefec­to siendo algunos más inhibidores que otros. Ademásalgunas delas enzimasnecesitan sulfhidrilos exógenospara desarrollar suactividad, mientras que otras son estimuladas por los mismos; esde suponer por lo tanto. que estas enzimas tienen grupos sulfhi­drilos cuya destrucción conduce a la inactivación de las mismas.

Las causas por las que al oxidarse o bloquearse los grupostioles, disminuye o desaparece la actividad de la enzima son va­rias; se pueden producir cambios en la estructura secundaria oterciaria de la proteina, el grupo unido al sufhidrilo puede e­jercer efectos estéricos o quimicos sobre el centro activo o

bien se puede destruir un sulthidrilo presente en el centrode unión del sustrato o la ooenzina. por lo tanto el hecho deque las enzimas sean sensibles a los reactivos de tioles noes una evidencia suficiente para afirmar de que éstas tengan gru­pos tioles en el centro activo.

La protección de 1a enzima frente a la inhibición por reac­tivos de tioles por los sustratos que intervienen en la reacciónse puede interpretar postulando que esos últimos tienen mayorafinidad por un sulfhidrilo particular que el inhibidor. Se sabeque tres aldehido deshidrogenasas de higado de Vacuno y de le­vadura son protegidos por los piridin nucleótidos especificosde la reacción (6, 72),así la enzima de leVaduraiespecifica pa­ra el NADes protegida solamente por el NADy no por el NADP,

en cambio la de higado. que puede actuar con ambos, es protegi­da tanto por el NADcomo por el NADP.El grado de protecciónvaria con la enzima y el inhibidor (6, 72).3) Inhibición por arsenito. El arsenito es un inhibidor de lasaldehido deshidrogenasas a una concentración relativamente bajapero solamente en presencia de mercaptanes exógenos; la inhibi­ción desaparece por adición de dimercaptanes, pero no en presen­cia de monomercaptanes(92). Está claramente establecido que elarsenito forma un complejo relativamente no disociable con gru­pos sulfhidrilos situados muycerca en sistemas de .cetoácidooxidasas ligadas a ácido lipoico. En base a estas obserVacionesse sugiere que la acción inhibidora del arsenito sobre las al­dehido deshidrogenasas se debe a que se combina con dos grupos-SH muycereanos, necesarios para la actividad de la enzima.Comose sabe que en estas enzimas no hay ácido lipoico se pos­tula que los grupos sulfhidrilos involucrados están muypróximosunos a otros comoconsecuencia del enroscamiento de la cadena

proteica (104). La necesidad de mercaptanes exógenos para lainhibición por arsenito, se explica suponiendo que estos reduciwrian una unión disulfuro previamente a la adición del arsenito.

De esto se puede deducir en forma razonable que la activi­dad enzimática no tiene que depender necesariamente de la se­cuencia de aminoácidos de la cadena lineal, sino que puede estarpresente en centros que se encuentran próximos en virtud a laforma helicoidal de la cadena proteica. Por lo tanto la neutra­lización de un grupo -SH o la ruptura de un puente disulfuro

alejados del centro activo puede resultar en un cambio de laconfiguración de la proteina, siendo la nueva configuraciónde la mismacataliticamente inactiva.4) Inhibición por concentraciones relativamente bajas de alde­hido. Este efecto se puede explicar comodebido al bloqueo degrupos sulfhidrilos necesarios para la actividad enzimática,por el exceso de aldehido que sirve de sustrato para la enzimacorrespondiente (88, 92). El hecho de que aparezca un máximoen las curvas de actividad en función de la concentración desustrato, se puede deber a la formación de dos compuestos enzi­ma-sustrato. El primero, activo. constituido por una moléculade acetaldehido, por cada centro activo de 1a enzima; el segun­

dojinactivo, formado por dos moléculas de acetaldehido por cen­tro activo de la enzima (40); la segunda molécula de acetalde­hido bloquearia un grupo esencial para la actividad de la enzi­ma.

5) Enzima, piridin nucleótido y aldehido forman un complejoternario activo. Se ha estudiado la cinética de oxidación de al­dehidos por cuatro enzimas asociadas con piridin nucleótidos,tres de las cuales se obtienen a partir de Pseudomonasy sonespecificas para el semialdchido succinico (93, 99); la otraaislada de levadura oxida aldehidos alifáticos de bajo peso

molecular 69). Los resultados obtenidos son consistentes conla formación de un complejo ternario. enzima, coenzima y sus­trato, comoparticipante activo; se excluye la existencia deun complejo binario.

No exhne una evidencia directa que permita postular laformación ordenada del compuesto ternario. El argumento a fa­vor de un mecanismo de orden ¿ompulsivo se basa en el hecho deque muchas de las aldehido deshidrogenasas deben incubarse conpiridin nucleótido previamente a la adición del sustrato comoes el caso de las aldehido deshidrogenasas de Pseudomonas. Sinembargoeste requisito puede deberse solamente a la naturalezainhibidora de los aldehidos que al combinarse con un sufhidri-.lo de la enzima.necesark>para su unión con la coenzima, inhi­ben la reacción. La preincubación con piridinnucleótido proteygeria a la enzima de la formación de hemimercaptales inactivoscon el sustrato.

De acuerdo con las propiedades enumeradas y teniendo encuenta la gran reactividad de los grupos sulfhidrilos con alde­hidos Yacoby (97) propone el siguiente esquema para representarel mecanismode acción de las aldehido deshidrogenasas:

oH oH |SH R-CHO--Ï-g-S-Ii->G—S-Ó—R -C—R s-c-a

Ï 4*

-——-——% H i (III)PN N PNH

(I) (HI; | íH o I-R-GOQH2 ,L ..;.RI-5H‘* .AÑ\/._/«_a—-*

r-—SH IIR-COOH + L- Rï-S-C-R

'--PNH.(IV)

Es decir, postula la formación de un tiohemiacetal enzimá­tico (II) por la adición directa de un aldehido a un grupo tiolde la enzima o por intercambio con un intermediario del tipode tiohemiacetal que se forma entre glutation y aldehido. Comoresultado de la oxidación se formaría un éstertiólico de la pro­teina (III) el que puede romperse ya sea por hidrólisis o poracción de un mercaptan (por ej. glutation o CoA) para formarla enzima reducida (IV) y el producto respectivo ya sea el á­cido libre o el éster tiólico del mismo.

Una omisión de este esquema cs que no explica le funciónde los dos grupos sulfhidrilos situados muypróximos entre si.A pesar de que el arsenito y el aldehido compiten por el mis­mocentro de la enzima, sugiriendo que existe una relación en­tre la oxidación del aldehido y la inhibición por arsenito, sedebe tener en cuenta que ésta última sólo tiene lugar en presencia de un mercaptan exógeno mientras que la actividad oxidantede la enzima, en muchos casos, se evidencia en :usencia delos mismos. Una forma de eXplicar este efecto es que el sulfhi­

drilo exógeno rompa un puente disulfuro de la proteina dandogrupos tiolcs libres, uno de los cuales estaria disponible paracombinarse con arsenito el cual se uniria además con el sufhi­drilo de la proteina involucrado en la formación del tiohemi­acetal (97). Nirenberg y Jacoby (86) proponen otra explicaciónpara el papel de los dos grupos sulfhidrilos próximos de laproteina, que implica la formación de un compuesto intermedio

enzima-ortoácido.

r--NA.DP NABP vam + NADP—-SH Boi“? s-p-R —-—> S-‘Ï-R :1) s.\ ,R

. OH OH ,‘c\SH SH s OH

B c D

NADPH, Héo r-—NADPH +1,20 l___¿> ______;

H -R—Coorf t SH—R—COOH

S-g-R SHE o F

SHA

Este mecanismono puede diferenciarse experimentalmente delanterior en el que participa un sólo grupo tiol, y es el tiohemi­acetal formadoel que se oxida directamente a tiol-éster.

Por su parte Hacker, estudiando las propiedades de la 3-fos­fogliceraldehido deshidrogenasa (100) observa que cuando se a­grega NADa la enzima, se produce un cambio espectral con un má­

ximo en 360 mu, que coincide con el valor hallado por Van Eysy Kaplan (101) para el complejo NAD-glutation, compuesto que seobtiene en forma no enzimática; Si en esas condiciones se agre­gan al sistema reactivos de tioles, iodoacetato o p-cloromercuri­benzoato o el sustrato, desaparece 1a banda de absorción a 360 mu(102). El cambio de abosrción por agregado de coenzima se inter­pretó comoresultado de la formación de un complejo entre elNADy los grupos sulfhidrilos de la enzima. El primer paso de laadición de sustrato seria una "aldehidólisis" de la unión NAD­

SH, con la formación directa de 1a coenzima reducida y de untiol-éster sobre la enzima, mecanismoque se puede esquematizarde la siguiente manera:

PN r-PNH PNH

+ R-CHO hs-g-rz Hzo ama-00011

Este tipo de mecanismosupone el ataque de un azufre electrone­gativo sobre el C electropositivo del carbonilo. La necesidad dealgunas aldehido deshidrogenasas de ser preincubadns con NADan­tes de la adición de eldehidos y la protección de las enzimas

por la coenzimacontra_la inhibición por los reactivos de tio­les)están de acuerdo con el concepto de aldehidólisis.

Los resultados obtenidos por Stoppani y Milstein (72) estánen total desacuerdo con estos mecanismos dado_que si estos secumplieran con las aldehido deshidrogenasas estudiadas por ellos,el sustrato tendria que ser capaz de preservar a la enzima enforma efectiva de la acción inhibidora de los reactivos de tio­les.

En las tres enzimas ensayadas, dos de levadura y la terce­ra de higado de vacuno, se ha demostrado la presencia de sulfhi­drilos esenciales (72); en ningún caso el acetaldehido fue capazde una protección general frente a todos los reactivos de tioles.

Sólo frente a algunos, la acción protectora del sustrato so­bre la enzima de higado fue suficientemente significativa. Encambio los resultados obtenidos con NADy NADPaldehido deshidro­

genasas de levadura son bien concluyentes especialmente si setiene en cuenta los valores de las constantes aparentes de Micha­elis del complejo enzima-sustrato que,siendo del orden de 10'.5 Mindican que la reacción está netamente desplazada hacia la for­mación del complejo enzima-sustrato. Más aún, los valores de lasconstantes aparentes de Michaelis para el complejo enzima-coenzi­ma son del orden de 10-4M,sin embargo siempre protegieron a laenzima frente a los reactivos de tioles ensayados.

Los experimentos cinéticos realizados con la NADaldehidodeshidrogenasa de leVadura por Stoppani y Milstein (40) conducena dos posibilidades respecto a la acción del acetaldehido, sien­do el resultado final de ambosun complejo ternario activo. Laprimera posibilidad seria que los compuestosbinarios enzima-acet­aldehido y enzima-coenzima se formaran independientemente, pre­valeciendo para el sistema condiciones de equilibrio. Estos com­puestos binarios formarian a su vez el complejo ternario, unién­dose al sustrato o a la coenzima a igual velocidad que la enzimalibre.

La segunda posibilidad, que requiere condióiones de flujoestacionario y coincidencia en algunas constantes, sería que elacetaldehido se uniera al compuesto enzima-NAD,porejemplo através del NAD,proceso que se puede esquematizar de la siguien­te manera:

HO OH 0 .OH\ /0/ -———> ¡1+ + \CH/\ “_ / \CH H CH

3 3

4 H '*

’ CONH

í i 2Ü J

N-HS-E

v á

OH

H_ H H‘ .. (i; x\ /\)\ f. 3

/9H ICONHQ ¿5' ._CONH2

° =°.., + ii ll .P- ¡I ¡ECH3 fl I; : :\

IÏ-HS-E x — HS -ER R'

En un primer paso, la forma aniónica del hidrato de alde­hido se uniría al compuesto enzima-NADa través de la coenzima,ya que el acetaldehido en solución acuosa, a temperatura ambientaestá hidratado en un 60%aproximadamente y el hidrato está enequilibrio con su forma aniónica en solución de pH alto.

En el presente trabajo se continúa con la investigacióndel centro activo de las tres aldehido deshidrogenasas en es­tudio en este laboratorio; NAD(2) y NADP(3) aldehido deshidro­genasas de levadura y NADaldehido deshidrogenasa de higado devacuno (4).

Comose conoce que una serie de deshidrogenasas ligadasa piridin nucleótidos; alcohol deshidrogenasa de hígado y delevadura, glutámico deshidrogenasa de higado y láctico deshi­drogenasa de músculo de esqueleto de conejo (27) contienen

cinc comocomponente estructural y funcional, se pensó que o­tras deshidrogenasas dependientes de nicotinamida adenina dinu­cleótido podrian contener un metal en su centro activo o mante­niendo la estructura activa de los mismos. Por ello se ensayóla presencia de metal en las tres enzimas.

Uncriterio funcional para determinar si ciertos gruposde la enzima son necesarios para su acción catalitica, es verqué efecto producen sobre la actividad enzimática reactivos que

se conocen que actúan especificamente sobre el gripo en estudio.En base a esto se ensayo el efecto que tienen una serie de agen­

tes orgánicos e inorgánicos eapaces de formar complejos coniones metálicos, sobre las aldehido deshidrogenases en estudio.

Se completó además el estudio de las progiedides de laNADaldehido deshidrogenasa de leVadura en relación a 1) especi­ficidad de sustrato, 2) especificidad de coenzima, 3) necesidadde activadores de la enzima, 4) inhibidores de la reacción, en­tre los que se encuentran análogos del NAD,derivados piridini­cos y adenilicos, sustratos y sustancias análogas al sustrato,sustancias complejantes de metales, hidroxilamina y reactivosde tioles. .

En base a los resultados obtenidos se pudieron sacar algu­nas conclusiones sobre; grupos esenciales de la enzima y lacoenzima, mecanismo por el cual actúa la cisteina y mecanismode la reacción de la NADaldehido deshidrogenasa de levadura.

HAB

NADH

NADP

AMP

ADP

ATP

Nm:deamNAD

AÏñD

¿PadáEAD

PyAlAD

PyAldeathIrisOP

OHQ

DDC

BAL

EDTA

DEAE- celulosa

TEAE- celulosa0M - celulosa

ABREVIATURAS

:Nicotinamida udenina dinuoleátido:Nicotinamida adenina dinucleótido reducido:Niootinamida adenina dinuoleótido fosfato:Adenosina monofosfato:Adenosina difosfato:Adenosinatrifosfato:Niootinamida mononucleótido

.:Desamino NAD

:3 aoetilpiridina AD ,:3 acetilpiridina desamino AD:Piridina 3 aldehido AD

:Piridina-3-aldehido desamino AD:2-amino-2-hidroximetilprOpane-l,3-diol21,10 - fenantrolina:8 —hidroxiquinolina:Dietilditiocarbamato:Dimercaptopropanol:Etilendiaminotetraacetato:Dietilamino otil-celulosa:Trietilamino etil-celulosa:Onrboximetil-celulosa

CAPITULO II

MATERIALES Y METOH)S

MATERIALES l

NADy NADH(95 % de pureza) de Sigma Chemical Co.

NADE:(90 % de pureza) de Sigma Chemical Co.Tris: de Sigma Chemical Oo. Tris 7-9

Olorhidrato de cisteina: de la British Drug HousesLtd.01K: de The Coleman and Bell Co. I

Acetaldehido: de la British Drug Houses Ltd.Análogos de NAD:de Pabsm Laboratories Co.

Nucleótidos: de Sigma Chemical Oo. lEDTAy Azida Sódica: de British Drug Houses Ltd.Glicina y Histidina: de Eastman Kodak Co.

Glicil-glicina y Diglicil-glicina: de Hoffman-LaRoche1,10 fenantrolina: Fluka A.G.8 hidroxiquinolina: de RiedelltDietil ditiocarbamato: de B.D.H.

Cupferrón: de la Eastman Kodak Co.Md'-dipiridilo: H;M.ChemicalCo.,grado PHidroxilamina: Anular 4Oxido de melarsen: Mhyy Baker Ltd.;Dagenham,InglaterraSephadex: de Pharmacia Uppsala Sweden

G-25;coarse,Lot No To 8024 0, Wr: 2,5 gffl2qfig.de gel secoG-50;medium,Lot N° To 8341 M, Wr: 4,7 g,E20/g.de gel seco

G-75;medium,Lob N° To 8869 M, wr: 7,3 g.H20/g.de gel secoA-25;finc,Lot N° To 6891 F, Capacidad 2,9 m.cq/g

A-50gmedium,Lot N° 5307874M Capacidad 3,9 mcg/g

G-lOO,140-4OO mesh Lot N° mo 33,w;-: 10 g Ego/gnc gel seco

G-200,40—400mesh Wr: 20 g.H20/g.de gel secoO-iodosobenzoato preparado según Askenasy y Meyer

Oxido de melarsen: May y Baker,Ltd I \Adenina: Nutritional Biochemicals Corporation.Piridina: Merck

BAL: de Boot Pure Drug Co.Nottingham.

Levadura de panadería (Sacharomyces cerevisiae) producto comer­

cial prensado y libre de fécula obtenida de 1a Cía.Argcntina deLevadura E.N.

METODOS

Medición de la concentragiégfprotéiqg: Se midió espectrofo­tométricamente a 280 mAcon corrección para ácidos nucléicos segúniWarburgy Christian (1).

Medición de EH: Se le hizo potenciométricamente utilizandoindistintamente los aparatos de Beckman,modeloH2 y Metrohm,modeloE 166. Las mediciones de pH de extractos enzimáticos se hicieron

colorimétricamonte por comparación con las soluciones buffer deSürensen, utilizando rojo de fenol (pH 6.3-8.0) comoindicador.

Medidasggpectrofotométricas: Se utilizó un espectrofotóme­tro Beckman,modeloD.U. provisto de cámara termostatizada,coneo—

tado a un potenciómetro (10 m V) registrador Leeds y Northrup"Speedomax", modelo G.

Oentrifugación en 35i938eutilizó una centrífuga refrigera­da de la International Equipment Co. modelo PR-2, provista delrotor 840a.

ggperiencias de electroforesis libre:Se llevaron a cabo enun aparato de electroforesis libre del tipo ideado por Tiselius,fabricado por Perkin-Elmer Corp.,modelo 38 A,utilizándose la cel­da de 2 ml de sistema abierto.

Egggrioneia de ultracgntrifugación:8e lleVaron a cabo en unaultradontrifuga Spinco ModeloE.,rotor AN-D.

Determinación de lq‘_actividades enzimáticas: Las activida­des de las deshidrogenasas se midieron por la velocidad de reduc­ción del NADo NADP,medida con el espectrofotómetro, en celdas

de corex de l cm.de espesor óptico, a temperatura ambiente (l7°­25°) siendo el volumen final de la mezcla de reacción 3.0 ml.Sotoma comocororla densidad óptica del blanco (mezcla de reaccióncon todos los componentes menos el aoetaldehido) y la reacciónse inicia añadiendo el acataldehido; a partir de ese instante semide el aumento de absorción cada 10-30 segundos.La medida dela NADaldehido deshidrogenasa de levadura se realiza según'

Black (2). La concentración final de los_reaetivos es la siguien­te: Tris 0.1M, pH8.0; NAD;0.45 mM;01K 0.05 M;cisteina 0.001 My acetaldehido 17 x 10_5M. La medida de la NADPaldehido deshi­

drogenasa de levadura se realiza segun Seegmiller (3) si bien laglicil-glicina se sustituye por Tris. Cohpentracionesfinalesusadas son: Tris 0.915 M, pH 7.7;012 mg 0.015 M;NADP0.12 mMyacetaldehido 0.5 mM.

La medida de la DPNaldehido deshidrogenaea de higado, se

efectúa según Racker (4), con las siguientes concentraciones fi­nales: pirofosfato 0.01 M, pH 9.3, NAD0,45 mMy acetaldehido3.5 mM.

Determinación del acetaldehido (5): Aldehidos pueden ensayar­

se espectrofotométricamente con enzimas relacionadas con NAD,mi­

diendo la absorción del NADHa 340 mk. Se usó indistintamente laNADaldehido deshidrogenasa de higado o de levadura. Cantidadde acetaldehido a agregarse debe estar entre 0.02 y 0.4 micromo­

les; las lecturas de densidad se hacen hasta que la reacción sedetiene. Los cálculos se hacen teniendo en cuenta que la oxidaciónde 0.1 micromoles de acetaldehido producen un cambio de la densi­dad óptica de 0.21.

Métodosgenerales de inhibición y protección de las deshi­grgggnggag: En los experimentos de preincubación de la enzima conlos complejantes de metales se procede de la siguiente manera.En un tubo de ensayo pequeño se coloca Tris 0.1 M; pHBO; ClK0.05 M, el complejante de metales en la concentración que se

indica en cada caso,agua destilada hasta completar un volumen de0.5 m1 y por último la enzima. A1 cabo del tiempo indicado, me­

dido con cronómetro a partir de la adición del extracto enzimá­tico, se toman alicuotas de 0.02 ml que se diluyen en la mezcla

utilizada para medir la actividad enzimática de cuyos componen­tes solo falta el acetaldehido.Cuando se trabaja con reactivos de

tioles se procede de la mismamanera,solo que los tubos de incubación no tienen cloruro de potasio. En cada caso se hace un

testigo que se incuba en las mismas condiciones pero sin comple­jante de metales.

Las actividades (V) se expresan comovariación de densidadóptica a 340 m/ por minuto «AE340 x 103/min). Comola activi­dad decrece a través del tiempo (especialmente con la NADalde­hido deshidrogenasa de levadura) se representan gráficamente lasvariaciones de absorción (ordenadas) en función del tiempo(abscisas) tomandoel valor de la tangente de la curva en elorígen de coordenadas, comola velocidad inicial de la reacción.

La inhibición (I) de la actividad enzimática se calculacon la ecuación:

1% = 100 (1 — Vi/Vt )

donde Vi y Vt representan las actividades de la enzima en presen­cia del infiibidor y del testigo‘respectivamente.El error de I, e tI 100 2 2 2 2

eI — /Vt\\V// e Vi+ (Vi.evt/Vt)

y disminuir Vi. LaPuede verse que e disminuye al aumentar Vvelocidad del testigo está limitada por la: concentraciones delsustrato y de la enzima, mientras que la velocidad de la enzima

inhibida está limitada además,por la concentración del inhibi­dor.

En los experimentos de protección el complejante de metalesse agrega a la enzima en presencia del protector y el porcentaje

de inhibición (I ) se calcula con relación a un testigo tratadocon protector solamente.El porcentaje de protección (P) de la

enzima se calcula de la ecuación p = lOO (IuIP)/Idonde I es la inhibición e I es la disminución de actividad de

la enzimatratada con protector/Ïnhibidor,respecto a la actividadde la enzima con protector solamente.

El error de p,e e = lOO/I e2 i (Ip e2 ) / Ip p IPs Iepaumenta a medida que aumenta I

2

y disminuyeI.Por lo tanto las protecciones observadas frente areactivos de bajo poder inhibidor resultan afectadas de un error

tanto mayorcuanto menores la actividad inicial del testigo yla inhibición observada.

Ereparación de la acetaldehido deshidroggggsa de higadoi3acker2.: Se sigue el método de Hacker (4) modificado por

Stoppani Milstein (6) hasta la etapa de fraccionamiento conetanol inclusive.Se introduce a continuación un fraggiggamigntgcon ácidos nucléicos: por cada 20 ml de sobrenadante que contie­ne 20 mgs de proteina por mililitro se agrega 1.5 ml de soluciónneutralizada de ácido nucléico al 5%. Se ajusta el pH a 5.2 conacético 0.1M, se deja l5 minutos y se centrífuga. El precipita­do formado se descarta. Al sobrenadante se le agrega 5 ml de so­

lución de ácido nucléico por cada 20 ml de extracto originaly se baja el pH a 4.7. Se centrífuga y el precipitado se disuel­ve en solución amortiguadora de pirofosfato 0.05 MpH 8.3 y se

le agrega sulfato de protamina 1%(Roche) en fracciones peque­ñas a pH 6.5 hasta que la relación de absorción de 280 mP/260 mdindique la eliminación del ácido nucléico.

Fraccionagiento con sulfato de amonio: In solución se llevahasta 45%de saturación con solución saturada de sulfato de amo­

nio obteniéndose un precipitado que se centrífuga y se redisuel­ve en un volumen minimo de agua destilada.

Esta solución conservada a -17°C se utilizó en experimentosque se describen más adelante.

Preparación de la NADPaldehido dgghidroggggsa de levgggga

(Seegmiller): Se sigue el método de Seegmiller (3) modificadopor Stoppani y Milstein (6).

gggparación de 1a NADaldggido deshidrogenasa de_levadura(Black): Se procede de acuerdo al método de Black (2) modificada

por Stoppani y Milstein (6) hasta 1a etapa de la coagulación porel calor de la proteína inactiva.La precipitación ácida usadapor cotos aútbreBJSÏha modificado comose describe en el capítu­

lo siguiente. La etapa de precipitación acetónica descripta porlos mismos autores se usó solamente al comienzo en determinacio­nes cinéticae y de la acción de diversas sustancias sopre la en:zima por cuanto permite 1a eliminación de electrolitos. Másade­

lante se lo sustituyó por el método muchomás conveniente decromatografía a través de Sephadex G-25.

CAPITULOIII

PURIFICACIONïgNALISIS FISICOQUIMICO Y ANALISIS DE METALES

DE LA NAD ALDEHIDO DESHIDROGENASA DE_ÉEVADURA.

El sobrenadante proveniente de la centrifugación del ex­tracto calentado a 55° durante 15 minutos de acuerdo al método

de Black (4) se somete a una precipitación ácida: agregandose­le acido cítrico 1Mlentamente y con agitación para evitar con­centraciones locales altas de ácido que desnaturalizan la enzi­ma; hasta alcanzar el pH 4,7 medido con potenciómetro. Sc tra­baja con el extracto en baño de hielo. Se lo lleva a la cámarade 2° donde se lo deja alrededor de dos horas al cabo de lascuales se centrífuga a 0° a 3.500 r.p.m. durante 20 minutos.El precipitado que se forma contiene parte de la enzima. Alsobrenadante se le baja el pH a 4,5 y luego de dejarlo mediahora en la cámara fria se centrífuga igual que en el paso an­terior. Conlos precipitadbo obtenidos a pH 4.7 y 4.5 se pro­cede de la siguiente manera: se los suspende en 30 ml de solu­ción de fosfato bipotúsico 0.025Majustándose el pH a 6.3 conamoniaco 3M, se centrífuga y se vuelve a suspender el precipita­do en la solución de fosfato bipotasico, se centrifuga y el so­brenadante se une con el anterior. La solución contiene la en­zima y se puede conservar bien congelada a -20° durante un mes.No se puede determinar la actividad específica de los extractosresultantes dado que la alta concentración de ácidos nucléicosque contiene, alrededor del 40%, introduce un error muygrandeen la determinación de proteínas por el método espectrofotomé­trico. La actividad especifica aproximadade los extractos ob­tenidos por precipitación ácida es de alrededor de 3.000 unida­des/mg y tiene un promedio de 150.000 unidades/m1.

De acuerdo con el método de Black (4) la etapa siguientees un fraccionamiento por solventes orgánicos, pero la frac­ción acetónica que se obtiene es muyinestable, pierde activi­dad aún durante el transcurso de los experimentos por lo que sebusca un método que dé comoresultado un extracto más estable.

Cromatografía en columna dg_gg¿yoximgtilgglulggg_1_ggég­celulosa del extracto obtenido por precipitación ácida: Entodos los experimentos se usa una CMFcelulosapreparada porWhatman,Floc CM70 que puede utilizarse directamente sin pre­

vio lavado. Para la preparación de las columnas se procede de lasiguiente manera: se suspende la celulosa en amortiguador fos­fato 0.1M, pH 6.8, EDTAlmMen la proporción de l gramo en 50 ml

de amortiguador y se deja en reposo; el materhll que no sedimen­ta en 45 minutos se elimina deeantando la suspensión sobrenadan­te. La celulosa se resuspende en el mismoamortiguador y se eli­mina el aire ocluído colocándolo en un desecador en el que sehace el vacio. Para el llenado de la columna de 1 cm de diáme­

tro interno por 15 cmde largo, se obtura el extremo inferiorde la misma con un pequeño tapón de algodón o de lana de vidrio.A la parte superior de la columna se le ajusta mediante una uni­ón de gomaun reservorio cónico y se llena todo rápidamente con

la suspensión de celulosa en cantidad suficiente comopara queuna vez compactada la columna, tenga la altura deseada (lO cm.),permitiendo simultáneamente que el líquido fluya por la parteinferior. En caso de que el flujo sea demasiado rápido se puede

regular con un tubo de gomaajustado al extremo inferior de lacolumna y una pinza de Mohr.El compactado de la columna se com­pleta mediante la aplicación de una presión hidrostática equiva­lente a 0.05 atmósferas mediante la aplicación en la parte supe­rior de la columna de un tubo de vidrio de un metro de longitudlleno de amortiguador.Antes de utilizarse la columnase lavacon el amortiguador que se va a emplear en la corrida hasta queel pH del efluyente sea igual al del amortiguador usado.Veloci­dad de elusión varía entre 5 y 7 ml en 10 minutos. Se cromatogra­fía el extracto ácido sin dializar,o dializado durante 12 horascontra amortiguador de fosfato de potasio l mMpH 6.8,EDTA l mMen columna de CM-celulosa equilibrada con el mismo amortiguador.En ninguno de los dos casos se adsorbe la enzima,pues eluye enel primer tubo con amortiguador fosfato bipotásico 5 mM,pH 6.8,

EDTAl mM,con una purificación aproximada de dos veces y conun rendimiento del 70%. No se eliminan los ácidos nucléicos.

Extracto ácido dializado durante 12 horas contra amortigua­dor fosfato bipotásico l mMpH 6.8, EDTAl mMse cromatografíaen columna de DEAE-celulosa equilibrada con el mismo amortigua­dor. Enzima eluye en los dos primeros tubos con fosfato hipoté­sico 5 mMpH 6.8 EDTAl mM,purificada una vez y media y se eli­minan completamente los ácidos nucléicos que en el extracto

ácido exceden el 20%.

Los resultados obtenidos por cromatografía del extractoácido a través de columnas de derivados celulósicos no es satis­

factoria, por lo que se ensaya el fraccionamiento con sulfatode amonio.

Fraccionamiento con sulfato de aggjíp: Se debe tener espe­cial cuidado en el control del pH de la solución saturada delsulfato de amonioa utilizar. Los fraccionamientos se llevan acabo mediante el agregado de solución saturada a la temperatura

de precipitación (entre Oy 5°) a pH 7, preparada con soluciónde EDTA5 mM.La concentración de sulfato de amonio se expresa,como es comúnen estos casos, comoporcentaje de saturación to­tal. El cálculo de la cantidad de solución saturada necesariapara alcanzar un dado porcentaje de saturación total se realizacon la siguiente fórmula:

¿”8.235%f

en la que Va es el volumen de solución saturada de sulfato deamonio que es necesario agregar a un volumen VS de solución conun porcentaje de saturación total Si, para que el mismose ele­ve a SÍ. En esta fórmula se consideran despreciables los efectosde la contracción de volumen. El añadido de sulfato de amonio

seïhace lentamente con agitación continua. Se deja en reposo nomenos de 2 horas, generalmente una noche y se centrífuga a 3.500r.p.m. Los precipitados obtenidos se redisuelven en soluciónamortiguadora de fosfato de potasio 0.5 M, EDTA1 mMpH 7.0.Sehacen dos cortes: en el primero se lleva al extracto a 45%desaturación, se procede en la forma descripta y luego a1 sobrena­dante se le agrega solución saturada de sulfato de amoniohastaalcanzar el 68%de saturación. En esta fracción cae el gruesode la actividad con una purificación término medio de tres ve­ces y un rendimiento del 80-85%siempre que se trabaje en presencia de EDTA5 mM.La actividad específica de los extractos obte­nidos es en promedio de 12.000 unidades/mg, la concentración deácidos nucleicos sigue siendo alta, entre lO y 20%, aunque notanto comoen los extractos obtenidos después de la precipita­ción ácida porque gran parte de los mismoscae en el primer cor­te del fraccionamiento.

Eliminación de sales del extracto obtenido por precipita­ción con sulfato de amonio: El paso preliminar para poder cro­matografiar estos extractos es eliminarlos el sulfato de amonioremanente que impide su adsorción en las columnas. Para ello seensayan distintos métodos.ADiálisis: se estudia 1a estabilidadde la enzimadializándola contra distintas soluciones: Tris lO

mMa pH 7.0 y 8.0 y fosfato bipotásico lO mMpH 6.0 solos yagregando a cada uno: EDTAl mMy 50 mM, cisteina l mM, ZnÏÏ x

10-4My KT 50 mM.Se dializa durante 4 horas sin agitación. Nin­guno de los extractos pierde actividad capecifica, la que se man­tiene hasta 3 dias si se lo conserva congelado a -16°C. Los di­alizados contra fiH 6.0 no son estables. Rendimiento es de 70%.á_Precipitación con acetona: se diluye el extracto obtenido luegode la precipitación con sulfato de amoniohasta tener una concen­tración de proteina de 3.5 mg/ml con solución de citrato lO mM,pH 5.4 en presencia de EDTAl mM.La acetona se agrega lentamen­

te cuidando que la temperatura no suba de 0°C. La enzima precipi­ta cuando se alcanza el 45%de saturación con acetona, se centri­fuga a -8°C durante 5 minutos y el precipitado se redisuelve enTris 0.015 MpH 8.0. La actividad específica es la misma que ladel extracto dc sulfato de amonio 68%de saturación y el rendi­miento de la Operación es bajo.c, gramatografia a través de la columna de Sepnadex G:gfi: pre­viamente equilibrada con una solución amortiguadora adecuada, seeluyc con el mismoamortiguador,Este mótodo es altamente satis­factorio puesto que el sulfato de amoniose elimina totalmente,se recupera el 100%de la actividad enzimática, el extracto sediluye muypoco y la operación es muy rapida.

Cromatografía en 1a columna de DEAEx TEAE-celulosa del ex­tracto obtenido por precipitación con sulfato de amonio: el ex­tracto acetónico que se obtiene después del fraccionamiento consulfato de amonio se cromatografía en una columna de DEAE-celu­

losaquuilibrada con amortiguador de Tris 10 mMpH 7.5, EDTAl mM.Secluye con el mismoamortiguador al cual se le agrega01K 50 mM;enzima sale en el segundo tubo con una purificaciónde casi dos veces y un rendimiento del 100%.Laconcentración deácidos nucleicos baja de 26 a 3%.

Si bien la purificación obtenida por pasaje a través decolumna de DEAE-celulosano es satisfactorio, se eliminan casicompletamente los ácidos nucleicos, por lo que se ensaya sepa­rarloe agregando directamente al extracto obtenido por precipi­tación con sulfato de amonioel derivado oelulósico, se dejaequilibrar ea frio durante quince minutos, se centrífuga y sedetermina la actividad del sobrenadante. El método no dá resul­

tado, no se eliminan los ácidos nucloieos y disminuye la acti­vidad especifica.

Se prueba pasar la fracción sulfato de amonio 68%sin di­alizar por una columna pequeña, de l cm de diámetro interno

por 3 cm de alto, de DEAE-celulosa equilibrada con amortigua­dor Tris 10 mM, pH 7.5, EDTAl mM. Se cluye con el mismo amor­tiguador al que se le agrega ClK 50 mM.Actividad comienza a sa­

lir inmediatamente deepuós de agregado el eluyente con EEGgggismiente del 95%y una purificación de 1.3 veces. Los ácidos/seeliminan casi completamente.

También se eliminan los ácid>e nucleieos cuando se cremato

grafía la fracción sulfato de amonio por una columna de TEAE­celulosa equilibrada con amortiguador de fosfato lO mMpH 6.0

EDTAl mM; el eluyente contiene ademas 01K 50 mM. Enzima eluye

inmediatamente después de agregado el mismosin purificarse.Que la enzima no ee adsorba a la columna de DEAE-celulosa

puede deberse a que la fuerza iónica del extracto enzimáticoes alta, por lo que so bajó a 5 mMla concentración de la so­lución amortiguadora de Tris en que se resuspcnde la fracciónque precipita entre 45 y 68%de saturación con sulfato de amo­

nio. Contra esta mismasolución se dializa el extracto obteni­do y con ella se equilibra la columna. Se trabaja a pH 7.7. Enestas condiciones la enzima se adsorbo. Se eluye aumentando lafuerza iónica de la solución amortiguadora de equilibrio me­diante el agregado de cloruro de potasio on concentración cre­ciente; la enzima comienza a eluir con una solución de Tris5 mMEDTAl mMcloruro de potasio 140 mM; los resultados de

la purificación no son satisfactorios: 1.5 veces con un rendi­miento del 50%. Se ensaya la elución con gradiente lineal en­tre concentraciones do Tris 5 mM,EDTAl mMy cloruro de pota­sio 50 nM y Tris 5 mM, EDTAl mMy cloruro do potasio 400 mM

ambos a pH 8.0. La enzima comienza a cluir cuando la concentra­

ción del eluyente llega a 120 mMde cloruro de potasio pero sa­le muydiluída y tanto el rendimiento comola purificación sonmalos. Si se pasa por la columna un extracto mucho más crudo,el que se obtiene después del calentamiento a 55°C, y se eluyecon gradiente lineal en las condiciones anteriores, la coneen­tración de la elución es la misma, la purificación es de 6 ve­ces pero el rendimiento es sólo del 50%, el eluído está muydiluido por lo tanto es muyinestable; no se eliminan los áci­dos nueléicos.

Llama la atención que el rendimiento de las columnas deDEAEsea tan bajo, por lo que se hacen ensayos de estabilidadde la enzima a distintos pH en Trio 5 mM,EDTA1 mM, cloruro

de potasio 50 mm, pH 7.0 y 8.0 y fosfato potásico 5 mM,EDTA

l mM, cloruro de potasio 50 mm, pH 7.0. La enzima es mucho másestable a pH 7.0 tanto en fosfato bipotásico comoen Tris. Lue­go de preeipitar con sulfato de amonio se suspenden alicuotasdel precipitado en cada una de las soluciones amortiguadores yse dializan centra las mismas. La ensima resuspendida y dializa­da durante 12 horas a pH 7.0 mantiene su actividad, no asi laque se encuentra a pH 8.0, la que se va inactivando paulatina­mente;

Se repite la cromatografía en columna de DEAE-celulosa pc­ro equilibrada con fosfato bipotdsico lO mM,EDTAl mMpH 7.0.

La fuerza iónica de los eluyentes se aumenta, aumentando laconcentración de fosfato. Actividad eluye con fosfato bipotási­co 50 mM,EDTAl mM,la actividad especifica se duplica, losrendimientos mejoran notablemente (alrededor del 80%).

El eluido está muydiluido y, al tratar de coneentrarlose pierde parte de la actividad. Se han ensayado distintos mó­todos de concentración: precipitación con solución saturada dosulfato de amonio, diálisis del egtracto contra solución desulfato de amoniode concentración adecuada, liofilizaeión,Plasdone, y pasaje por columna de DEAE-celulosa de dimensionesreducidas pero con todos ellos, excepto con la liofilizaeiónen que la disminución de la actividad cepecifiea es del 14%,la perdida es de 20 a 30%.

Electroforesis de Zona en columna de celulosa: A fin de

aumentar la purificación alcanzada hasta ese momentose ensaya

la electroforesis de zona en columnade celulosa de acuerdo ala técnica de Porath (12). Comosoporte se utiliza polvo de ce­lulosa Whatmanpara cromatografía. Columnaelectroforética uti­lizada tiene un diámetro interno de l cmy una longitud efecti­va de 40 cm. Una vez completada la electroforesis se separa lacolumnaelectroforética del resto del aparato y se eluye el con­tenido de la misma en cámara fria. con el mismo amortiguador conel que se equilibró la columna, recogiendo fracciones de l m1.Se trabaja con los extractos provenientes de la precipitacióncon sulfato de amonio de 68%de saturación que se resuspendeny se dializan contra la solución amortiguadora con la que estáequilibrada la columna de celulosa: Tris 5 mm,EDTAl mM,cloru­ro de potasio 50 mMpH 8.0 y Tris 5 mM,cloruro de potasio 50

mM.EDTAl mMpH 7.0 en sendos experimentos. La electroforesisdura 7 horas con un voltaje de 500 V y un amperaje de 23 mA. la

purificación es de 2 veces y se recupera el 85%de la actividady el 74%de la proteina.

Comola actividad especifica máximaalcanzada es de 20.000unidades/mg. ya sea por el método de electroforesis de zona co­mo por cromatografía a través de columna de DEAE-celulosa, se

estudia el comportamientoelectroforético de muestras obtenidaspor ambosmétodos. Los resultados obtenidos con el extracto cro­matografiado por la columna de DEAEse ven en la figura 4. Elextracto obtenido por electroforesis de zona se precipita consolución saturada de sulfato de amonio, el precipitado se sus­pende en solución amortiguadora de fosfato potásico 0.1 M, EDTA1 mM,pH 7.1 y se dializa contra la misma solución durante 15horas y se estudia su comportamientoelectroforético en el apa­rato de Perkin-Elmer. La actividad específica del extracto an­tes de dializar: 15.000 unidades/m5., concentración de prote­inas: 6.4 mg/ml, concentración de ácidos nucléicos 1%. Las fo­tos obtenidas muestran dos componentesprotéicos.

En vista de los resultados obtenidos, debe continuarse conla purificación a fin de eliminar la probable impureza que seevidencia en los modeloselectroforéticos y de ultracentrifuga­ción.

Egitración a través deggel_gextrang: El métododifierede otros procesos cromatográficos tales comocromatografía de

adsorción o de partición, en que los volúmenes de elución sonmuypequeños y que el gel es insensible a la variación de con­centración de eoluto. Por lo tanto la separación de los componen­tes depende muchode las propiedades fisicas de la columna arma­da. Una zona debe pasar a través de la columna comouna banda an­gosta, sin distorsionarse. Esto requiere un cuidadosopretrata­miento del gel y armado de la columna. Una vez armada una columnapuede usarse durante largos periodos sin necesidad de rearmado.

Para armar una columna de Sephadex se procede de la siguien­te manera: el gel seco tiene un grado de solvatación que dependedel grado de entrecruzamiento y del poder de solvataoión que esfunción de la interacción gel-solvente; por lo tanto al poner elgel en contacto con el agua, se hincha. Por eso un paso prelimi­nar al armado de la columna es el de echar al gel on un excesode la solución amortiguadora con la que se va a equilibrar lacolumna, agitando para evitar la formación de grumos. El equili­brio se alcanza muylentamente por lo que conviene dejarlo nomenos de 24 horas a temperatura ambiente; si no se procede asílas particulas del gel continuan hinchándose una vez en la colum­na lo que conduce.a una velocidad de flujo muybaja o al tapona­miento de la misma.

Durante el proceso de aumento de tamaño del gel es convenien­te eliminar las partículas másfinas. para ello se agita la sus­pensión y se la deja sedimentar hasta que se forma una capa li­mite neta. se decanta el sobrenadante y se repite el proceso has­ta que el sobrenadante quede claro. Generalmente alcanza con 4 o5 tratamientos con un volumen de sobrenadante de 10 a 20 vecesel del gel. Antes de introducirla en la columna, la suspensiónde gel se diluye hasta que su viscosidad sea tal que las burbu­jas de aire puedan pasar a través de ella y se la coloca en undesecador en el cual se hace el vacio para eliminar el aireocluido.

Armadode la columna: 1a columna utilizada es un tubo de vi

drio cilíndrico de 1.5 cmde diámetro interior y 25 cm de largo,uno de cuyos extremos es un capilar y el otro un cierre esmerila­do. Para evitar la dilución de lae zonas durante su remoción dela columna, debe tenerse un cuidado especial con la salida dela misma. Se obtura el capilar con un pequeño tapón de lana de

vidrio de 0.1 mm.Una vez montada la columna en forma perfecta­mentevertical, se cierra la salida. Se la llena hasta un terciocon la solución amortiguadora a usar en este caso fosfato de po­tasio 0.5 M, EDTAl mMy cloruro de potasio 0.5 M, pH 7.0 y secoloca en su sitio la lana de vidrio y las perlitas. Unidoporel esmeril se adiciona un tubo de extensión que termina en unreservorio cónico. Tanto la columna comoel tubo de extensión

se llenan con 1a suspensión de gel, la que comienza a sedimen­tar inmediatamente. Una vez que se ha formado una capa de 2-5

cmse abre la salida dejando pasar una corriente lenta de solu­ción. A medida que el tubo de extensión se vacia de gel, se eli­mina el sobrenadante y se la vuelve a llenar con la suspensión,

cuidando de que en ningún momento haya sedimentado todo el gel

antes de agregar más suspensión. Ésto se repite hasta que el gelalcance la altura deseada en 1a columna. Una vez armada se lava

la columna con la solución amortiguadora a emplearse, hasta queel pHdel efluyente sea igual a la de ésta. Se usa una solución

amortiguadorade fuerza iónica alta para evitar la interacciónentre las moléculas de proteina. Antes de agregar la mezcla secoloca sobre la superficie del gel un disco circular de papelde filtro de diámetro ligeramente menorque el diámetro interiordel tubo de vidrio.

Introducción de la muestra: Se elimina todo el sobrenadante,se cierra la salida y mediante una jeringa se agrega lentamentela muestra. Se abre la salida y se deja que la solución penetreen el gel, en el momentoque desaparece de la superficie se a­

grega un pequeño volumen de eluyente para lavar la misma; unavez que se absorbió se comienza con la elución. Para evitar que

las zonas se extiendan mucho1a velocidad de elución no depeser grande. Se recogen fracciones de 0.5 ml cada 3 minutos.

Se prepararon columnas de l cm de diámetro interno y ll cmde largo de cada uno de los siguientes geles: Sephadex G-2S,

G-50, G-7S, G-lOO y G-200; DEAE-Sephadex A925 y A-SO equilibrav

das y eluidas con amortiguador de fosfato potásico 5 mMpH 7.0,EDTA l mM.

Excepto con los Sephadex G-lOOy 6-200 los resultados ob­tenidos no son muysatisfactorios, los rendimientos son altos,entre 85 y 10o%, pero la purificación no pasa de una vez y me­

dia.Los distintos Sephadexempleados difieren entre si en el

grado de entrecruzamiento de las cadenas de polisacáridos quefonman la red, lo que determina la porosidad de la misma. Delgrado de porosidad depende el rango de tamaños moleculares expre­sados comopesos moleculares, que pueden separarse, asi el Sepha­dex 6-25 que es el de mayor grado de entrecruzamiento separa fra­cciones de pesq molecular de hasta 5.000 mientras que con Sepha­

dex 6-200 muyporoso, se pueden separar fracciones de pesos mo­lecular arriba de los 100.000. Si se observa la figura S se veque los dos componentes proteicos corren muyJuntos, vale decirque sus pesos moleculares no difieren considerablemente; además

la velocidad de sedimentación indica que el peso molecular delos mismosno es bajo. Esto explica por que se obtiene resulta­dos más satisfactorios con el Sephadex G-200.

Las columnas de Sephadex G-lOO y G-200 y las de DEAE-Sepha­

dex separan los ácidos nueleicos, en las dos primeras la separa­

ción es total, primero eluye la fracción con actividad enzimáticay luego los ácidos nucleicos.

Cromatografía en columna de Sephadex G-200 en las condicio­

nes indicadas en las figuras l y 2 conduce a la obtención de unextracto de actividad específica 31.000 unidades/mg. el que so­

metido a un análisis en la ultracentrífuga reVela la presenciaaparentemente de un solo componente.

FIGURA 1

Ï Ï Ï I I l I I I I l(17.500)

0.600- (19.000 -200

ahoo- 4601l

ICC?

(17.500)

(8.000)

l 80

(15.000)

e8 ldadenzimat(12.500)

Densidado'ptíca280;”¡wl l l l l L l l4 e 31012114161820222u

Fracción númeroCromatografía en columna de Sephadex 6-200 de ln NADaldehi­

Act

de deshidrngenasn de levadura.Columna de 18 x 1.5 cm.Se siembran 34 m1 de un extracto quecantiene 150 mgde proteína y 1.250.000 unidades totalas(actividad específica “.200 unidades/mgr).Columns se aluyecon solución amortiguadorn de fosfato de potasia O.5M,EDTA1 mM,clorurn de potasio 0.5M.Se recogen volúmenes de 0.5 m1.Se recupera el 70%de la actividad totu1.Los valores entreparéntesis corresponden a las actividades específicas de ca»da fracción.Fracciones 7,8 y 9 se uniersn,liofilizaron y vol­vieron a cromatografiar.

FIGURA 2

/)x70‘

- l l l l l l L l

o 4012 m 4a 4a zo 22 24

Fracción número

Ls:1 I l I l I l l r

0300 _ _8N ' ' ELÜ " " Ü.20200- _gox x\C) - ‘CJ_ _eoÜ Nbalon- _ Q

TD <1)a — -ao

s — — sQ a :9

.>s:C)q

Cromatografía en columna de Sephadex G - 200de la NADaldehido deshidrogenasa de leVadúra.Iguales condiciones que en figura 1.Eraccionesde mayor actividad específica obtenidos en ce­lumnade ln Fig.l se liéfilizaron y se volvie­ran a cromatografiar.8c siembra l m1. que tie­ne 19 mgr. de preteína y 300.000 unidades (IC­

'tividnd específica 16.000 unidades/mgr.).80 re­cupera el 85%de la protein. y el 100%de ll ac­tividnd total,el 67%del mismocae en las frac­ciones de mayer actividad específica mientrasque 8610 el 37%de la proteína corresponde alos mismeS.Va-loresentre paréntesis cerraspon­den a las actividades específicas de cada frac­cián.

RESUMEM DEL METODO QUE SE EMPLEA PARA PURIFICAR LA NAD ALDEHIDO

DESHIDROGEHASADE ppvwmm.

gptgggión del polvo cetónioo de levadura: de acuerdo a latécnica modificada por Stoppani y Milstein (8). Se utiliza leva­

dura de panaderia (Sacharomyces Cerevisae) producto comercial,prensado y libre de fécula.

' Extracción de la enzima: con solución de fosfato bipotásico

0.092 M, en frio, con agitación ocasional durante S dias, mante-.niendo el pH siempre superior a 6.6 mediante el agregado de amo­niaco concentrado.

Coagulaciónpor calor de proteing_igggtiïg: se ajusta elpH del sobrenadante de la extracción a 6.3 con ácido cítrico l M

y se Calienta a 55°C durante 15 minutos; se enfría rápidamentey se centrífuga.

Precipitación ácida: sobrenadante de la etapa anterior sele baja el pH a 4.5 mediante el agregado lento de ficido cítricol M, agitando continuamente y en frio. Actividad queda en el

precipitado cue se redisuelve andalución de fosfato bipotásico0.025 M pH 6,3

Fraccionamiento salino con sulfato deágmggig: se hace merdiante el agregado de solución saturada de sulfato de amonio.

El grueso de la actividad cae en el corte entre 45 y 68%de sa­turación. Precipitado se redisuelve en solución amortiguadora dcfesfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTA1 mM,pH 7.0.

Filtragión a travég_ge gel de dextrano: Sephadex G-200 enuna columna de 1.5 cm de diámetro y 18 cm de largo equilibradacon amortiguador de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de pota­sio 0.5 M, EDTAl mM,pH 7.0. Se eluye con el mismo buffer. Fra­

cciones de mayoractividad especifica se recrouatografian porla misma columna en iguales condiciones.

FIGURA 3

_Mpdeloelectroforético de la NADaldehido deshidrogengggde levadura de pangfiería correspondiente a la etagg de precipimtación acetónica. Concentración proteica 5.3 mg/ml. Actividadespecifica 3.200 unidades/mg. Amortiguadorutilizado: veronal­veronal sódico pH 8.6, fuerza iónica 0.1. Duración 105 minutos,a 105 V y 7 mA. Temperatura 1° m 2°. Limbo ascendente.

¿«‘IGURA 4

Modelo electroforético de la NADaldehido deshidrogengggde leVadura de panadería purificgfia por crqggtografía en colga­na de QEAE-celulosa. Concentración proteiCa lO mg/ml. Activi­dad especifica 18.000 unidades/mg. Amortiguador utilizado:Tris-citrato 0.1 M, pH 7.35. Duración 30 minutos, a 150 V y 7mA. Temperatura 1° —2°. Limbo ascendente.

ANALISIs_g;g;gggggggggs“pgp_ggnno DE PUREZADE LAS PREPARACIO­

ygg_ggg;g¿ggg¿s_pp LEVADURAQE PANADERIA CON ACTIVIDAD DE NAD

¿EQEDIDO DESHIDROQENASA DE LEVADURA:

1.Enggigentos de Electroforesis: en varias etapas de lapurificación de la enzima se realizaron experimentos de electro“

foresis libre para investigar el comportamientoelectroforéticode los distintos componentesde los extractos obtenidos. Seutilizó a tal efecto el modelo 38 A de Perkin Elmer. Aproximada­mente 3 ml del extracto a analizar se dializan previamente duran

te una noche a O°Ccontra 600 m1 de amortiguador a utilizar cnel experimento.

El extracto proveniente de la precipitación acetónica deactividad especifica 3.000 unidades/mg, muestra una gran hetero­geneidad proteica (Figura 3). El modelo electroforético se sim­plificó bastante (Figura 4) después de cromatografiar el extrac­

to obtenido por precipitación con sulfato de amonio, a travésde una columna de DEAE-oelulosa. Actividad especifica del extrao­to analizado: 18.000 unidades/mg.

II.Estudios de Ultracentrifugación: La preparación obtcniw

da deepués del pasaje a través de la columna de DEAE-cclulosa,fue sometida a un análisis de pureza en la ultracentrifuga. Pa­

ra ello se liofiliza a las fracciones de mayoractividad especi»fica. La actividad específica de los eluidos de columnaes de17,000 y el del liofilizado baJó a 13.000. El lioÍilizado tiene'26.4 mgs de proteina por ml, se lo diluye con solución de clo­rurc de potasio 0.075 Mhasta concentración protóica de 6.15mg/ml. El modelo que se obtiene revela la presencia de 2 compo­

nentes proteicos que corren (Figura 5) muyJuntos, semejantesal modeloelectrofcrético de la figura. 4.

En la figu a 6 se ve los resultados obtenidos al sometera ultracentrifugación la preparación obtenida por cromatogra-.fia a través de la columna de Sephadex G;2OOen las condicionesindicadas en la figura 2. Actividad especifica de los eluidos:29.000 unid/mg; luego de liofilizar la mismabaja a 20.000unidades/mg. Concentración proteica 5.25 mg/ml. El modelo quese obtiene revela la presencia de aparentemente un solo compo­

nente que se desplaza lentamente y no se resuelve en otros componentes a lo largo de su trayectoria.

Observando la figura 5, se Ve que lo que se supone es la

ComportamientoenlaultracentrifugadelaNADaldehidgdeshidrogenasadelevadugg.

“.wi­

Concentraciónproteica6.15mg/ml.Actividadespecíficadelapreparaciónenzimática 13.000unidades/mg.Temperaturadelrotor8°.Velociiaümáxina58.500rpm.Lasedimenta­ ciónprocededederechaaizquierda.Lasfotosfuero:tomaóqscada16minutos.

EMMA

ComportamientoenlaultracentrífugadelaNAD¿ldehidodeshidrogenasadeleVadura.Con­

centraciónproteica5.2mg/ml.Actividadespecíficadelapreparación20.000unidades/mg. Temperaturadelrotor21°.Velocidadmáxima59.000rpm.“asedimentaciónprocededederecha aizquierda.Lasfotosfuerontomadasalos:1,9,17,5,33,41,49,57,73,89,105,121, 137,153,169,185,201,y217minutosdehabersealcanzadolavelocidadmáxima.

FIGURA 6

impureza tiepe aproximadamente dos quintoe de la concentracdónde la enzima. La actividad especifica de esta muestra es 17.000,

por lo tanto la enzimapura_debería tener_una actividad especí­fica de alradedor de 26.000. Esto corroboraría lo observado en1a figura 6.

ANALISÏS DE METALES DE LA NAD ALEQHIDO DESHIDROGENASA DE LEVADU

RA POR ESPECTROGRAFIA DE EMISION. .

El extracto de actividad especifica 28.000 unid/hg, que so­metida a un análisis de pureza en la ultracentrífuga aparentemen­

te revela un solo componente, se recupera y se lo somete a un_análisis cualitativo de metales en un espectrógrafo de emisión.

Se trabaja con un eSpectrógrafo Varrell Ash, modelo Ebert

de 3,40 m de longitud focal; con electrodos rotatorios de gra­fito por lo que no es necesario calcinar la muestra.

Fuente de excitación usada para provocar y controlar lachispa: Varisource, condición: arco interrumpido. Intensidad dechispa: 5A; intensidad de arco: 2A.

Red: 15.000 lineas/pulgada. _Placa fotográfica: Ilford ordinary N° 30.

Se preparó un testigo con 012 Zn 12 X/bl, espectrográfica­mente puro. Comola muestra está disuelta en solución de fosfato

de potasio l My cloruro de potasio 1 M, también se analizan lassoluciones respectivas.

Elementos

Soluciones: K Mg Ag Na Zn Cu Al Fe Si

P0 41m2 + + - + - + .- + + +ClK + + + - p + + + + ­

Extracto + + + + + + + + + +

Estos resultados, si bien no son concluyentes, corroboran1a hipótesis de la presencia de Zn en la enzima.

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m """M'ÚKPÏTIÉO'"HIM"

7 ¿CCION DE AGENTES COMPLEJANTES QE

METALES SOBRE ALDEHIDO DEgfiggROGENASAS

_ La relación que existe entre sistemas que contienen metalo;‘ con los procesos vitales ha sido reconocido desde hace muchotien"

po, ya en 1869 Raulin encontró que el ASpergilus Niger necesita Í

‘ Zn para sulorecimiento. La explicación de la funciénlfirdógica délos metales se ha buscado en su asociación con prcteinas particu&

Iarmente con aquellas que tienen actividad enzimática (14-17). íLSe pueden diferenciar dos grupos de proteinas asociadas con meta}Eles que tienen*ono actividad enzimática (15). '

gggplgigg_ggjgl;pggtgigg. En los cuales la proteina se com?íbina revereiblemente con uno de varios cationes diferentes. Ï. El significado funcional de la asociación entre metales y fpreteina se.ve facilitada cuandola proteina pura tiene función'

enzimática. A este grupo pertenecen los complejos metal-enzimacuya.actividad depende de una combinaciün rápidamente disociablé

I con una variedad de iones metálicose,La constante de asociación del metal con el grupo reactivo

de la proteina es bajo,pon ¡logica¡el metal puede eliminarse fácil­mentepor diálisis con pérdida parcial de la actividad; éstaÏpuede restablecerse por agregado del metal. Diferentes metalespueden sustituirse mutuamenteen la activación de la enzima. Po.

Mg++,Zn++, Mn++ ó Fe++.

Metaloproteina . La proteina está combinada con un dado me

Eeji la enolasa puede activarse con..__...—...

.tal de una manera determinada, de modo que se puede considerara ambas como una entidad.

í Cuando.la proteina que esta unida al metal en las condicio%ïnes de la definición tiene actividad enzimática especifica, se513 denomina metaloenzima.

Él metal, en todos los casos oonócidos hasta ahora, anhi- 5drasa carbónica (18), carboxipeptidasa (19), alcohol deshidrom ¡genasa de levadura (20) y de hígado de caballo (21), glutámico Ïdeshidrogenasa de hígado de vaca (22), láctico deshidrogenasa

(‘- LSLL1 .1de músculo esquelético de conejo (23) y fo asa alcalina deI -u . ñ . . . .irinón de pOÏClHO(¿4), es un grupo reactivo de la analma, La a­

i dición de sustancias que se cónoca que tzenen gran afinidad put;' i

¡el metal y propiedades estéricas compatibles con la configura» í._n. .u .-4._. ._-—-- . .- -.-- .—- ... _ . ... -_-..... ..

ción del centro de localización del metal. da comoresultado unainhibición parcial o total de la actividad enzimática (15). Lainhibición es reversible cuando se forma un complejo disociableentre el inhibidor y el metal y este queda unido a la proteina.

Los dos tipos de interacción metal-enzima probablemfldé secorrespondan con los complejos metálicos y los quelatos metálicosque se encuentran en sistemas más simples. En la formación de

complejos con otros iones o moléculas no cargadas, llamñdes li­gantes, se considera que los iones de metal actúan comoacepto­res de pares de electrones de átomos dadores en el ligante.En el quelato, dos o más átomos dadores de una molécula de li­gante están unidos al mismo ión metálico, lo que los provee deuna estabilidad adicional (25).

En los últimos años se ha dedicado un gran esfuerzo a di­lucidar el rol de los metales en la cetálisis enzimática. Histó­ricamente la inhibición de enzimas por agentes quelantes ha serhvido comoun medio clásico para establecer si un metal es o noesencial en el proceso cetalitico. Ultimamentese sintetizaronVarios agentes complejantes cuyo empleo ha permitido ampliar elestudio de este importante aspecto del comportamiento.del metal.Tales agentes quelantes inhiben la actividad catalitica debidoa una interacción especifica con el metal a través de la forma­ción de un complejo mixto enzima-metal quelante

' [E Tie] + InÉLE Me) InEl empleo de estos inhibidores se basa en su conocida inter­

acción con iones en solución para formar complejos de coordina­ción estables, unido al hecho de que los metales incorporados alas proteinas retienen gran parte de su actividad quimica especi»fica (26).

En este laboratorio (8) se ha estudiado el área activa detres aldehido deshidrogenasas, a saber, NADaldehido deshidroge­nasa de levadura (2), NAD?aldehido deshidrogenasa de levadura(3) y NADaldehido deshidrogenasa de higado de vacuno (4) conrespecto e la presencia de grupos sulffihidridos. El hecho de quese encontró que una serie de deshidrogenasas dependientes de NAD(27) contienen cinc, sugiere que un metal puede ser el campo»nente funcional de otras deshidrogenasas. Por esa razón se probóel efecto de los complejantes de metales sobre las tres enzimasen estudio.

BesultadosSe exPondránpor separado los resultados obtenidos con Cada

una de las enzimas.

NADaldehido deshidrogenasa de levadura. De los complejantefiensayadosla 8-hidroxiquinolina, la l,lO-fenantrolina y el die­tilditrocarbamato tienen acción inhibidora en el orden indicado

(Tabla l). En cambioel cupferrón, eláÏgE'-dipiridilo y la azi­da sódica tienen muypoca o ninguna acción. Estos resultados seobtienen en presencia de cisteina que es necesaria para la acti­vidad de la enzima.

En ausencia de cisteina, la actividad de la enzima es sólodel 14 al 16%de la correspondiente a la presencia de cisteina1 mMen el tubo de medida. Si en esas condiciones se agrega los

complejantes de metales en las concentraciones indicadas en laTabla 2, se ve que la B-hidroxiquinolina, la 1,10-fenantrolina_yel dietilditrooarbamato, que en presencia de cisteina inhibela acción catalitica, en ausencia de la mismala activan aunqueno en la mismaproporción que la cisteina. Es de notar que alorden decreciente de inhibición corresponde un orden decrecientede activación. La edición de cisteína l mMa una preparación par­

“cialmente activada por 1,10 fenantrolina aumenta ligeramente laactividad pero no tanto comocuando actúa sola.

El cupferrón que no es inhibidor tampoco produce activación.Si se estudia cuantitativamente la acción de la fenantroliw

na en presencia y en ausencia de cisteina se vé (Table 3, figuraproyencla de

l) que on/tisteina, la inhibición aumenta con el aumentode con­centración de la fenantrolina, mientras que sin cisteina la ae­tivación llega a un máximo cuando la concentración de OP es apro—ximadamente l mMy luego comienza a decrecer, lo cual es de es­perar si se supone que comoactivadores ambas sustancias actuande la misma manera. En la Tabla 4 se vé comovaria la activacion

de la enzima, en ausencia de cisteína, con la concentracion dedietilditiccarbamato.

NADP-aldehidodeshidrogenagg ie levadura. Esta enzima re­quiere comoactivador esencial un catión bivalente, calcio o mag"nesio, pero comola oxiquinolina precipita en presencia de magnewsio se lo ha reemplazado por calcio en algunos do los experimen­tos. Los rcsu ados obtenidos por la accion de los complejantesse resumen en la Tabla 5, donde se ve que son inhibidores: el

í Tabla l{Acción de agentes complejantes de metales sobre la actividad dqÏ' "‘—-2

i¡la NADaldehido deshidrogenasa de levadura.

Bolug de proteina dieuelta en 3 ml de Tris 0.1 MpH 8.0, en pre;sencia de cisteina 0.001 m, NAD0.45 my, 01K 0.050 M, las edicion

nee que se indican y acetaldehido 17 x 10-5g. Actividad del tee­

“tigo (¿EMO x 103/min.)exp. A: V124, exp. B: 118 y exp. c: 14o.

Adiciones Inhibición enzimática_(%)Exp. A Exp.B Exp. C ;

1,10-Fenantrolina 1.o mM —- -- 7 '

1,10-Fenantrolina 2,5 my —- 24 191,10-Fenantrolina 5.0 mM 42 -- 398-Hidroxiquinolina 1.0 mM -— —— lO

8-Hidroxiquinolina 2.5 mm -- -- 458-Hidroxiquinolina 5.0 mM 87 —- 90

Cupferrón 1.0 mM -- -- 13

Cupferrón 2.5 mE —- ll ——

Cupferrón 5.0 mM 9 -- -­Dietilditiccáz‘bámaio .2.5 mM -— 13 _— Í

Dietilditiocarbemato 5.o un 35 —— 36 ï'

¿CX-°('-Dipiridilo 2.5 m1_VI_ —- o —-

0(-o(’-Dipiridilo 5.o mM 10 -- --'Tiourea 2.5 mE —- 0 - 3

Tiourea 5.0 mM O —— -- ¡

,Azida Bódica 2.5 mM -- 0 P- í

¿Azida sódica 5.o m1]; 7 _— -­

-- á .1 Hb—-.<su n-u-av-- n co. . ans-um“... 'F’v--'v n- v A-Uds \*“_h* -—-’-—-.—

Tabla 2

Efecto de los cgmplejantes de mptales sobre la activacióg gp ln-n...-_

NADaldehido deshidrqgenasa de levadura en ausencia de cisygígí

50 ¡ug de proteína _en exp. A y Ski/ug en exp. B, disuel'ta en 3 mlde Tris 0.1 M pH 8.0 en presenc1a de NAD0u45 mE, ClK 0.059 M,las ediciones en las concentraciones indicadas y acetaldehido17 x 10'5 Magregado al fina].

Exp. Adiciones . v Actividad Actividadïéenzimática en relación

¿3 Ew‘x 10-3.) ‘In. as.-n--.-——a la enzima

min tratada con

of 531;eri na m};

A Ningvxa 39 16

Cisteina l mfi \ 248 100

BWHidroxiquinolina 2.1 my, 154 62

Cupferrón 4 my 34 14

1,10-Fenantrolina 5 mE 126 511,1ümFenantrolina 5mM+ Cisteínal.OmM 156 64

B Ninguna 18 I 14

Cisteína l mm 125 100

Dietilditiocarbamato 5 mM 40 32

Tabla 3Influencia de la concentración de 1.1.-:gnantrqlina sobre la ac“tividad de la NADaldehidodfleshidrogenagg de levadura en presenmcia y ausencia de cisteína.

fiolpg de proteina disuelta en 3 ml de Tris 9,1 MpH 8.0 en pre­sencia de NAD0.45 mM, 01K @.oso M, cisteina 0.001 M (exp.A) y

sin cisteina (exp.B); 1,10 fenantrolina en las concentracicnesindicadas y acetaldehido 17 x 10-5Magregado al final.

AActividad vñnhia"Actividad Actividad

enzimática bición enzimática en rela­Adioianes f E34ex lO % __E34Ox19 016? a la_ ensima

mr“ mÏH tratadacon cis­toína'mM

ma)

Ninguna 145 — 4 3

l,lO-Fenantrolina 10,5 mM 28 81 lO 7l,l®-Fenantrolina 5,2 mM 75 48 42 291,18-Fenantralina 1,3 mM 119 18 61 421,10-Fenantrolina 0,3 mM 98 32 29 20

FIGURA 1

l l l l l l l l l l l

0.2 0,4 0.6 0,8 1.o 1.2 1,4 1.61.823 2.2 ?.4

[1,70- Fenantro/¡na] [mM/Influencia de la cencontración de 1.10-fenantrolina sobrela actividad de la NADaldehido deshidrogenasa de levaduraen presencia y ausencia de cisteína. l7,ug de proteína di­auelta en 3 m1 de Tri: 0.1 M pH QQOen presencia de NAD0945 mM,ClK0.050 M,l,10-fenqntrolina según se indica yacefqldehido 17 x 164%agregado al flnql Línea A.c0n Cigte­inn 1.0 mm;líneq B,sin cisteína.

Tabla 4

Efecto del dietilditiocarbaggto sobre la actividad de La NADa1­"--.-r1-231dehido deshidregenasa de levadura en ausencia de cisteina;

60)pg de proteína disuelta en 3 ml de Tris 0.1 MpH 8.0 en pre­sencia de NAD0.45 mg, ClK 0.650 M. las adiciones en la concentra­ción indicada y ecetaldehido 17 x 18*5Magregado al final.

Actividad Actividad en relación' . . enzimática a la enzima tratadaAdiCiones . ,

GEE x l®3\: con Cistelra mM= 346-) (%;\(-mímr--y

Ninguna 10 7

Cisteína 1.0 mM 145 100

Dietilditiocarbamata 5.0 mM 49 35Dietilditiocarbamatn 2.0 mM 53 38Dietilditiocarbamato 1.0 mE .48 34Dietilditiocarbamato 0.5 mM 40 29Dietilditiocarbamato 0.1 my 32 23

/dietil ditiocarbamato, la renantrolina, el cupferron y ¿lagri­dipiridilo siendo el primero el más fuerte y decreciendc la ac­

, ción en el orden indicado. No tienen acción 1a B-hidroxiquinolinala tiourea y la azida sódica.

NAD-aldehido deshidrogenasa de hígado: Esta enzima es lamás sensible a la acción de los complejantes; el de mayor acciónes el cupferrón y le siguen en orden decreciente el dietilditro­carbamato, la hidroxiquinolina, 1a 1,10 fenantrolina. Muchome­nos efecto tienen la tiourea,ï¿]—dipirirhfijaSanazida sódica.

M3221Las tres enzimas estudiadas son sensibles a la acción de los

complejantes de metales, pero son afectadas en distinto grade porcada complejante. Asi la aldehido deshidroganasa ae hígado y laNADPaldehido deshidrogenasa de levadura, son en general más sen"sibles que la NADaldehido deshidrogenasa de levadura. Además,esta última enzima es inhibida preferentemente por la 1,10 fensa­

.trolina, la hidroXiquinolina y el dietilditiocarbamate, la desmhidrogenasa de levadura especifica para el NAD?es afectada parla 1,10—fenantrolina, el dietil ditiocarbamato y'el cupferrón pe­ro no es sensible a la 8-hidroxiquinolina. Por último la enzima

manos pbr la l,10—fenantrolina.

' Es imposible establecer la naturaleza del metal en base alos resultados obtenidos. Las sustancias que tienen acción in­hibidora muestran afinidad por los elementos del 1er. grupo detransición y del grupo II b de la tabla periódica (Fe, Co, Ni,Be, Mg, Zn, Cd, y Hg) con los que forman complejos fuertemente

asociados; pero no se puede comparar la acción de los complejanétes sobre los metales libres con su acción sobre las metaloenzi­mas pues la naturaleza de los grupos que fijan el metal a la prevteina, o los que lo rodean pueden afectar la constante de asocia­ción del metal al complejante (15). Esto explicaría también ladiferenciación de los complejantes sobre las tres enzimas.

Sin embargocomparandolos resultados de inhibición señaiaidos en'este capitulo con los resultados de Valle y colab (27)con otras deshidrogenasas dependientes de nicotinamida adeninadinucleótido en las que además de la inhibición por los complejan—

tes mencionados, se ha demostrado la presencia de Zn por métodos

Tabla?5

Acción de agentes comglejantes de metales sobre la actividad qela NADPaldehido deggidrogenasa de levadura.

0.4 ng de proteína (exp.A), 0.10 mg (exp B) y 0.50 mg.(exp. C) deproteina disuelta en 3 m1 de Tris 0.1 MpH 7.7 en presencia de

F.NADP®.12 my y 012Mg 0.015 M (exp. AI, B1, y cl) o C12Ca 0.015 M(exp. 32 y 02).lsaa adiciones en la concentración indicada y a­cetaldehido 0.15 myagregadoaal final. Actividad del testigo (Á

E340 x lOB/hin); exp.A 128, exp.B, 64; exp.B 68; exp. Cl, 174y exp.C2, 187.

2)

Adiciones Inhibición enzimática

Exp.A Ema} Exp.%ExpClExp.02

l,lO-Fenantrolina 1.0 mg 55 - 85 —_ __1,10-Fenantrolina 0,5 mM - 72 72 56 631,10-Fenantrolina 0,1 mE - 78 75 65 651,10-Eenantrolina 0.05 mE - —- -- 70 58

l,lO-Fenantrolina_0.01 mg —- - -— 39 _34j,g‘-Dipiridiio 1,0 mm 28 —— 26 -_ ‘33

d\i'—Dipiridilo 0.5 mE —— 22 —— 21 21

gli —Dipiridilo 0.1 mg —— —— —_ 13 _;­

Tiourea 1.0 mM_ o -_ _- __ _.

ázida sódica 1.0 mid O. -- —- -- ——

Cupferrón 1.o my 84.0 -— :‘t —- —_

Cupferrón 0.5 my -- 31 38 -— ——

Cuyferrón 0.1 my . - O O -— -—

Dietilditiocarbamato 1,0 my 63 - 91 —- —­Dietilditiocarbamato 0.5 my - 83 87 -- -­Dietilditiocarbamato 0,1 mg —_ 62 64 ‘46 39Dietilditiocarbamato 0,05 my - m- —— 30 28

¡Dietilditiccarbamato 0.01 mE —- m— -" 31 32—8-Hidroxiquinolina 1,0 my m— —— 7 —— 6

Béïidroxiquinolina 0,5 my —— -é -38 —— _17

8-Hidroxiquinolina 0.1 mg -— -— -27 -- #4

Tabla 6

Acción de agentes eggplejantes de metales sobre la actividad de laNADaldehido Qgghidrogenasa de hígado.

0;16 mg de proteína disuelta en 3 m1 de pirofosfato 0.1 MpH 9.3

en presencia de NAD0.45 my, las adiciones en las concentracionesindicadas y acetaldehido 3.5 mmagregado al fina}:

Actividad enzimática Inhiíïción

Adiciones (A E340 x 103 'x' 7‘....__ , L'mln ’

u ——-«._.. .45 -_

8-Hidroxiquinolina 1 mm 12 73

1,10-Fenantrolina 1 my 24 47¿qïïnipiridilo 1 mE 4o 11Dietilditiocarbamato l QE lO 78anferrón 1 mE 6 87Azida sódica l mM 41 9

Tiourea 1 111M 37 18

quimicos o espectroscópicos, se puede sugerir que las aldehidodeshidrogenasas coaetienen ese metal. Esta hipótesis estaría co­rroborada por el análisis espectrográfioo cualitativo realizadosobre una muestra que presenta un sólo componente durante la ul­tracentrifugación cuyo resultado se informó en el capitulo ante­rior.

Si bien la presencia de metales en las deshidrogenasas espe­cificas para las nicotinamida adenina dinucleótidos parece exten­derse de acuerdo con los resultados obtenidos. ello no constituyeuna regla general pues no se ha podido demostrar la presencia decinc en la láctico deshidrogenasa de corazón de cerdo, de músculode conejo (18), ni de corazón de rata (29); éstas enzimas no soninhibidas por los complejantes de metales.

En el caso de la NADaldehido deshidrogenasa de levadura elcomplejante puede además activar la enzima. siempre que no se en­cuentre presente otro activador comola cisteina. Esta enzima ne­cesita cisteina para su actividad, en ausencia de la mismala ac­tividad es escasa o nula. Stoppani y Milstein (8) señalaron lanecesidad de un activador orgánico y encontraron que la cisteinapuede ser reemplazada por el glutatión y el BAL: el EDTAen con­centración 0.06 mMtambién activa la enzima con igual eficienciaque los reactivos de tioles.

En base a esos resultados, a pesar de que no pudieron postu­lar un mecanismode acción para explicar la activación de la enzima por cisteina y otros agentes que combinan metales pesados su­girieron que la misma se debia a la remoción de metales pesadosque disminuyen la actividad de la enzima.

Según se observó con la NADaldehido deshidrogenasa de leva­dura, aquellos complejantes de metales que actúan como inhibido­res de la actividad en presencia de un actiVador de la enzima,enausencia de la mismala activan. Por otra parte la adición de cis­teina a una preparación_parcialmente activada con 1.10-fenantro­lina, sólo aumenta ligeramente la actividad. la que no alcanzael Valor de cuando es activada por la cisteina solamente. Estehecho unido a que la l,lO-fenantrolina con ausencia de cisteínaes activadora hasta una concentración de l mMy que por encina deesa concentración actúa inhibiendo indica que la cisteina y lafenantrolina actúan sobre el mismocentro de la enzima y que esecentro sería el metal presente en la misma, favoreciendo de esamanera la asociación de la coenzima con el metal. La existen­cia de quelatos cinc-cisteina (30) contribuyen a sostener esta

sun-m..." “ . . ..

hipótesis:­v Chnclusionee

'.‘ F ‘f'.ï:tI.'.".'-Il"‘;:\'r a¿una "‘ '*‘

1° Las tres aldehido deshidrogenasas estudiadas son inhibidas ponios complejantes de metales. s

é° La NADaldehido defihidrogenasa de hígado es la más sensible y?

1a enzima de levadura la menos sensible. É3° La NADaldehido deshidrogenasa de levadura es inhibida prefe-Erentemente pyr 1,10 fenantrolina, 8-hidroxiquinolina y dietil-di;miocarbamato. La deshidrogenasa de levadura especifica para el a?flADPes afectada preferentemente por la 1,10-fenantrolina, el die»kil-ditiocarbamato y el cupferrón. La enzima de hígado es más sen­

Ésible al cupferrón, dietil-ditiocarbamato y 8-hidroxiquinolina.Ï4° En ausencia de cisteína la NADaldehido deshidrogenasa de 1e­vadura es activada por 1,10 fenantrolina, 8 hidroxiquinolina y ‘idietil ditiocarbamato.¿5°La l,10-fenantrolina en ausencia de cisteina, activa a la enzi­ma de levadura especifica para el NAD,en concentración por deban

Ïjo de lmM,a concentraciones mayores actúa inhibiendo la actividad;en7.imática .

CAPITULO V

INACTIVACION IRREVERSLÉ;É_DE LA NAD ALDEHIDO DESHIDROGBNA­

ME LEVADUIQ}.

En algunas deshidrogenasas especificas para la nicotinamidaadenina dinucleótido (33. 32) se pueden distinguir dos tipos deinteracción entre el Zn enzimático y la l,lO-fenantrolina, ambasconducena inactivaciones caracteristicas. El primer tipo esuna combinación instantánea y reversible entre cada átomo decinc de la enzima y una molécula de fenantrolina cuando se leagrega directamente a la mezcla reaccionante.

E43; + 0P:—“ E — Zn —‘0P

Si se preincuba la enzima con el complejante antes de medirla actividad, durante distintos periodos de tiempo, se produceuna inactivación progresiva, irreversible. En el caso de la al­cohol deshidrogenasa de levadura (34) la cinCtica de esta inhi­bición progresiva es consistente con la unión de una segunda mo­lécula de fenantrolina a cada átomo de cinc del complejo inacti-'vo E-Zn-OP

E-Zh + OP-————>E-Zn-(OP)2Probablemente para que el cinc pueda combinarse con otra

molécula de complejante, la proteina debe sufrir cambios irrevcrssibles. Esto ya ha sido demostrado para la alcohol deshidrogena­sa de levadura (34) y la glutámico deshidrogenasa de higado (37).No todas las deshidrogenasas sensibles a la fenantrolina son in­hibidas irreversiblemunte por ésta, comofuera demostrado parala alcohol deshidrogenasa de higado (37). ’

En el capítulo anterior se vió que la NADaldehido deshidro­genasa de leVadura es inhibida instantáneamente y en forma re­versible por la fenantrolina y otros complejantes similares demetales. En eSte capitulo se describe la acción de los mismoscomglejgntes cuando se los preincuba, con la enzima.

ResultadosCuandose preincuba la enzima, en las condiciones descrip­

tas en el capitulo de métodos, con OP, se observa una pérdidaprogresiva de la actividad enzimática. Comose ve en la figural, la inactiVación en las condiciones indicadas es total al ca—bo de 57 minutos. No se observa lo mismo con OHQ, ni con zin­

cón. Con DDC0.3 mMse llega a una inactiVación total a los 60minutos; si se aumenta la concentración del inhibidor a 5 mH,

FIGURA l

70­m\ 50­

% 50­

%} 30­

ESI

Tie/77,00 (mi/7.)

Efecto del tiempo de incubación sobre la inactivación de laNADaldehido deshidragenasa de levadura por la OP,la OHqyel zincóno 0,7 mg. de enzima se incuba a 209G en Tri: 0.1 MpH 8.0 en presencia de ClK 0.05 M e inhibidor en COnCentración0.3 mM.LíneaA.OP¡línea B.zincón y línea C.OHQ.Laactividadenzimática se mide en 0.02 m1 de la mezcla de preincubación,en los tiempos indicados.El testigo (Linea D) se incuba de lamismamanera pero sin el agregado de iphibiuor.

a los 21 minutos 1a enzima ya ha perdido completamente su acti­vidad (figura 2).

La acción de la OP depende de una serie de factores.Seobservó que preparaciones enzimáticas de distinta actividadespecifica son inhibidas en distinto grado en las mismascondi­ciones de incubación. Haciendo la correlación entre la inactiva­ción y la pureza de la preparación se ve que están en razón di­recta: a mayor actividad especifica corresponde una mayor inac­tivación (Tabla l). Esto probablemente se deba a que las prote­inas inactivas presentes en mayor cantidad en las preparacionesmenos puras actúen como protectores de la enzima. Efectivamen­te, cuando se agregi a la mezcla de incubación enzima desnatu­ralizada por calentamiento, la acción de la OPdisminuye casiun 50%(Tabla l). En segundo lugar, la acción de la OPvariacon la temperatura de incubación (Figura 3). Asi para obtenerel 50%de inactivación cuando se preincuba a 30°C, la enzimatiene que estar en contacto con la OPdurante 3l minutos, a 20o'Cdurante 41 minutos, a 10°C durante 132 minutos y a O°C duran­te 200 minutos.

Acción de los componentes del sistema enzimático de la NADaldehido deshidrogenasa de levadura sobre la inactivación porQB. A fin de dilucidar el mecanismo de la inhibición de la OPse han hecho una serie de ensayos del comportamiento de esteinhibidor en presencia de los sustratos y activadores que cons­tituyen el sistema enzimático: NAD,NADH,acetaldehido, ión po­tasio y cisteina; el acetato se omitió en razón de que forma uncompuesto sumamente disociado con la enzima.

Los resultados obtenidos se describen en la tabla 2. Seobserva que solamente la cisteina actúa comoun protector totalde la enzima frente al complejante. El acetaldehido aumenta li­geramente el efecto inhibidor de la OP, el NADen concentraciónmMtambién aumenta en forma significativa el grado de inhibicióndel complejante; a concentraciones más bajas de NADeste efectodisminuye. El ión potasio es ligeramente protector, en los tu­bos de incubación a los cuales no se les ha agregado potasio,ademasdc la notable disminución de la estabilidad de la enzi­ma se observa un ligero aumento de la inhibición por OP.

En vista del fuerte efecto protector de la cisteina enpresencia de OP por una parte, y a su acción activadora de la

FIGURA 2

¡u Q

B

A5340x107mm

¡a 23 30 110 50 ¿o

Tiempo (min)Efecto del tiempo de incubación sobre la inactivacíón de laNADaldehido deshidrogenaua de levadura por el dietil ditioucarbamatoo 0.5 mg de proteína ae incuba a 2090 en Tris 0.1 MpH8.0 en presencia de ClK 0.05 Me inhibidor.Línea Aztesti­go sin inhibidor;línea BzDDC0.3 mM;línea CzDDC5 mm.Lavacti—vidad enzimática se mide en 0.02 ml de la mezcla de preincuba­ción,en los tiempos indicados y

U!

TABLA 1

Efecto de la act1v1_d_at_!capecifig de la enzima sobre la inhibi»

ci‘n- de ¿a NA)aldegdo deshidrogenasa de levadura yor la 0P.

Incupación a 2009, durante 120 minutos en 0.5 m1 de Tria 0.1 IgpH 8.0 con 61K0.05 y y las adiciones indicadas. Enzima calen­tada a lOO°Cdurante S pinutos. Se mide la aQtividad en 0.02 m1

g, unidad enzimática: 0.001 AE34./min.

Efnzima Actividad Adiciones Activlid.enz. l Inhibición

(mgr) específica AE340.103/min. %( u/mg).

IT,60 5083 Ningpna 117 -­

0‘. 60 5083 0.10.3 mig . 3 97_0.60 5083 0.05 1311de enz.

. calentada . 126 —0.60 5083 0.05 m; de eng.

j. cale‘ntn OP 0.3 111MÉS 480.88 1734 ningun 65 -*0.88 1734 0P - 48 - _

A¿“oxÍÜ3/¡77/77.

200

100

50

5‘?

FIGURA 3

I l . J J I L

14D1

60 80 100 120

Tiempo (mín)Efecto de la temperatura sobre la inhibición de la activi­dad de la RADaldehido deshidrogenasa de levadura por laOP. 0.17 mg de enzima se incuba en Tris 0,1 M pH 8,0 enpresencia de ClK 0005 M y OP 0.3 mMa OQC (línea A').IOQC(B‘),209C (CV) y 309G (D')oLíneas A.B.C y D.testigos sin0P.La actividad enzimática se mide sobre 0,02 ml de la mez­cla de preincnbación en los tiempos indicadoso

U.)

TABLA 2

¿ccign ¿rreversible de ¿a 0P en presencia de sugtrüoa z acum­dores de la NAD99535150 desmdrgsegasa de levggura, \

C

8.6 pg de angina Bo 1110111339 230 durgnte 76 min l(exp. A) 6 67 min

(exp. B)en 1.0 de Tris 0.1 _l_d_pm 8.0 con FELK0.95 ¿llly las adi­ciones indicadas. La actividad se mide en 0.02 ml.

Exp. Adiciones Activ.enzimá- Inhibi- Protec­tioa3 ción ción

(AENOJO /1nin) fi 7‘

A -— ¡ 55 ... .._A op 0.3 mg lO 85 ­

A Cisteína m! l 72 -..— ....

A Cisteina mayor!0.3 mg 72 a 190

A Acetaldehído 1,.7xlo'4g l 68 -- .­A Acetaldehído 1,7x10’41g + 020.31% 6 91 -7A Acetaldehidc 8,4 x 10'"4 g l 63 -- -—­

A Acetaldeh‘ído 8.4x10p4y30P 0.3 m! 3 94 -1.'L

A. Sin 01K 0,05 g l 30 -- -­A Sin ClK 0.05 La+ 0P 0.3 mg 3 90 --—

B“ ... ‘ 69 - ...B 0P 0.3 mg 35 50 .-_­

n NAD my. , 57 -—- -­

n NADmig+ or 0.3 m! 5 91 -82

Bs NADHmy; l 59 .... ...

B NADHmg + OP 0.3 m! 29 52 —2

aldehido deshidrogenasa por otra, se buscó relacionar cuantita­tivamente amboshechos. Los resultados se describen en la ta­

bla 3. se ve que hasta concentraciones de 0.01 mMde cisteinase obtiene protección. Hasta 0.05 mMde cisteina existe unarelación cuantitativa entre el poder protector frente al comple­jante y la acción actiVadora de la enzima. Por debajo de esaconcentración el poder protector disminuye más rápidamente queel efecto activador.

Acción de Varios complejantes de metales sobre la inacti­

vación por OP. Comoevidentemente existe una relación entre laacción activadora de la enzimay el efecto protector frente a lainhibición por OPen el caso de la cisteina, y comoen el capi»tulo anterior se ha demostrado que también el DDCy la OHQac­

tivan a la enzima en ausencia de cisteina, se quiere ver qué e­fecto tienen estas sustancias frente a 1a inhibición irreversi­ble por OP. De acuerdo con los datos de la tabla 4 se ve que tan­to el DDCcomo la OHQen concentración l mMprevienen completa­

mente la acción de la OP 0.3 mM.Por el contrario, la azida só­dica, la tiourea, el d¡°¿—dipiridilo y el cupferrón, que no in­hiben la acción enzimática o sólo lo hacen en grado menor y queno activan a la enzima en ausencia de cisteína, no solamente noprotegen a la enzima sino que aumentan el efecto inhibidor de laOP.

Stoppani y Milstein (8) encontraron que también el cianuro,el BAL,el glutatión, el EDTAen concentraciones por debajo del mMy la histidina, son activadores de la enzima en ausencia decisteina.'En la tabla 5 se comparael efecto activador de estassustancias con su poder de protección. Se observa que el cianuroy el EDTAl mMtienen una acción protectora similar al de la cisteína. El glutatión, la histidina y la glicina son ligeramenteprotectores, la glicina sin embargono es activadora. La glicil­glicina y la diglicil-glicina que no son activadores no modifi­can la acción de la OP. El BALque es un actiVador tan eficaz

comola cisteina, presenta un comportamiento_singular, produceuna inhibición irreversible de la enzima,siendo la inactivaciónmenor en el tubo que contiene 0P, comosi ésta protegiera la en­zima de la acción del BAL.

De estos resultados se puede concluir que los activadoresson los únicos complejantes de metales que se comportan como

TABLA 3

Ccnparacign de la acción prgtoctora de la ciateina respecto a 1aOB¿Ícon4}aügggiónde la cisteina agbro 1a actividad de la enziuz_n_a_.

Ex arde pgotección210.36 mgr de proteina se incuba durante 72 nun:en 0.5 m1 de Tris 0.1 g_puzp.o con ClK 0.05 y, OP 0.3 pg y cis­teina, o cisteina solamente. La actividad se mide en 0.02 m1 de

meacla. Actividad del testigo sin cisteína ni CP (¿3E340.lO3/min):53. La inhibición por 0P sa calcula respecto al taatigo con lamismacantidad de cisteína. Expt de activación: 0.;4 mgr de pro­tpina disuelta en 3 ml de Tria 0.1 y pH 8.0; Cl; 0.05 M, NAD­0.45 mgy cisteina en 1a concentración indicada. Acetaldehido seagrega al final en concentiación 17 x lohsnActividad con cistein

na m! (A E34O.lO3/min), 44.T ï

I . .

Exp. de protecciég Eag¿_de agjixaciónCisteína Inhibición Protección Actividad en relación

GnM) Con oia- Con OPy por ciatei- al testigo cpn cie­teina pin ciatei-t na respecto teina my (%).0P (%). na (76). a OP (7€).

p - 79 - 0JIKKY 2} 4 95 100

100 6 20 75 75

50 —2 35 56 61

10 -9 63 21 41

5 -13 80 —l 23

l —6 77 3 5

TABLA 4

Acción de la OPsobre la aldehido deshidrogcnasa de levadura en

presencia de otros cqulejantes degggtales.l I

0.68 ag de enzima se incuba a 22fC durante 90 min. en 0.5 ml deTris 0.1 Mpn;presencia de ClK0.050 y, y las adiciones indicasdas, a pH 8.0. Actividad se mide en 0.02 ml. Lap inhibicionesse calculan respecto al testigo correspondiente.

Adiciones Activ.enz‘ at. l Inhibición Protección¿13340 x lO /min. (%) respecto a

0P (%).

-— l 282 —— .—_

OP 0.} mg 99 65 -a

DDC 1,5 my; I 215 24 - -_—

DDC 1,5 my + 01310.3 mn_II 224 -4 106

OHQ11.5 -_ ,. 234 17 -­

OHQ1.5 mM+OP0.3 m?! 245 -5 101

Tiourea 1,5 my l 221 22 __

Tiourea 1.5 meOP 0.3 m! 26 88 —35

Azida sódica 1,5 mM l 234 17 -—

Azida sódica 1.5 EMÏOP0.3 m! 3 99 -52

¡x,m'-Dipiridilo 1,5 mM_ í 164 42 -—

Nfli‘-Dipiridilo 1.5 meOP 0.3 m! 12 92 -42Cupferrón 1,5 mM 314 -11 -—I

Cupferrón 1.5 mMjOP0.3 mM 94 70 -8

TABLA 5

Comparaciónde la acción protectora de cogglejantea de metales,reapecto a la OP, coa su accigg sobre la ¿gtividgg de la enzima.Exp, de protección: 0.50 mgr (exp. A) ó 0.92 per. (exp. B) deproteina se incuba a 19°C durante 66 min (exp. A) 6 55 mip.(exp.B) en 0.5 ml de Tria 0.1 oa ppesencia de ClK 0.05 H, 0P 0.3 m!y la adición indicada; pH 8.0. La actividad enzimática se mideen 0.02 ml de mezcla. Actividad del testigo sin complejante

(¿:E34O.lO3/nin): 58 (exp. A) y 55 (exp. B). La inhibición por0P se calcula respecto al teatigo tratado cpn la mismacantidaddel aegundp complejante. Ezp. de ¿gtiVación. 52,ng (e;p.A) ó32/ug (exp. B) de proteína disuelta en 3 m1 de Tris 0.1 M_pH8.0.Acetaldehido se agrega al final en concentración 17 x 10-5M. Acti­vidad del testigo tratado con ciateina mg: 45 (exp. A) y 42 (exp.B)¿

E __¿

Ex rotección Exp.activaciónInhibicign Protección'l Actividad res ec

Exp. Adición Con adi, Con 0P por el comp p ­. _ to al testigoclón Sin Y adi’ Pleaante res con cisteina mM0P fi ción ! pecto a OP í

A Ninguna -: 69 -- 18A Cisteina mg 16 O 109 190

A Histidina mg 5. 58 16 62

A Glicina mg —2 57 18 15

A Glicilglicina mg-7 82 -17 9

B Ninguna -— 190 -r T“

B BAL m! 85 67 —- 8}

m Glutatión mg 31 89 lo 16B; Cianuro m! -7 -6 106 3m.

B EDTAmy -g -o 108 on Diglicilglicina m! 16 100 o 7

protectores eficaces, si bien sólo con la cisteína se encuentrauna relación cuantitativa entre ambosefectos. De las tablas

4 y 5 surge que el BAL)CÉdeipiridilo, glutatión, DDC,tiourea,OHQy azida sódica en concentración del orden mMproducen una

inactiVación irreversible de la enzima, comola OP, pero en mu­cho menorgrado. En cambiola histidina, glicina, glicil-glici­na y cupferrón no afectan la estabilidad de la enzima.

Acción del NADy sustancias deriVadgg sobre la inactivaciónpor OP. Se estudió el efecto que tienen los componentes del NADsobre la inhibición de la enzima por la OP, a fin de dilucidarcual es el responsable del aumento de inactivación de la OP enpresencia del NAD.Este efecto disminuye al disminuir la con­centración del NAD,llegando a ser ligeramente protector en con­centración 0.1 mM.

En la tabla 6 se ve que los nucleótidos de la adenina ANP,ADPy ATPtienen un efecto similar en concentración l mMal delNADen la misma concentración, es decir, potenciar la acción

de la OP sobre la enzima, siendo notablementemayor el efectodel ADP(del mismo orden que el NAD)y menos apreciable el del

ATP. El NADBproduce un aumento de la acción de la OP del mis­

mo orden que el del NAD,lo que sugiere que el tercer grupo fos­fato no influye en la inactivación por 0P.

La adenina que es un inhibidor competitivo del NAD,nomodi­fica la inhibición por OP, mientras que la nicotinamida la au­menta ligeramente. El único componente del NADque tiene unaacción ligeramente protectora frente a la 0P es el pirofosfato,que en concentración mMprotege un 21%.

También en relación al NAD se ha estudiado la influencia

de los análogos del mismosobre la inactivación por OP.Los análogos son sustancias que resultan de sustituir el

grupo oarboxamida de la piridina del NADpor un acetilo (APAD)o aldehido (PyAlAD)o de la desaminación de la adenina delNAD (deamNAD) o sus derivados (APdeamAD), (PyAldeamAD).

Comose verá más adelante, todos estos compuestos se com­binan con la enzima, si bien los aldehidos no son reducidos ypor lo tanto no hay reacoión enzimática con ellos. Los resulta­dos obtenidos se consignan en la tabla 7. Tanto el PyAlnDcomoel PyAldeamADque son inhibidores competitivos del NnDpero

que no son reducidos por la enzima protegen a la misma de la

TABLA E

Acción de la 0P sggxe la ENDaldehido deshidgggenaaa de levadura

an presengda de cogponentee del NAD l ‘ l

0.6 mg (exp.A), 2,2 mg (exp.B), 0.2 mg (exp.C), 0.8 mg (exp.D) ‘de enzima ae inpuban a 82°C durante 54 m}n.(exp.A), 63 pin (exp.Q), 25 min (exp.C) y 70 mdn (exp.D) en 0.5 ml de Trie 0.1 M pH

8.0 en presencia de le 0.05 g 0P 0.3 mgy la adicdón indicada 6solo con esta última. Actiyidad se mide en 0.92 m1. Actividad

del teatigo sin 0P (LxE340.103/min): 163 (exp.A); 65 (B); 28 (C)61 (D). La inhibición por 0P se calouda respecto al testigo tra­tado con la mismacantidad de adición.

l Protección

Exp. Adición Inhibición 32:13:63:;Con adición Gan 0P y a- to a OP (%)sin 0P (%) dlción (%)

A Ninguna -— 68 _.

A AMP 3 EM -5 94 -38

A ADP 3 mE 13 99 -46

A ATP 3 my; -4 82 -_2o

B Ninguna - 52 -_

15 AMP mg -12 64 —23

E ADPmy -13 93 -79

B: ATP mg -11 60 -15

C Ninguna - 93 ­Adenina 7 mg O 93 O

Nicotinamida 20 mg 11 100 -7

D Ninguna -- 57 ._

D Pirofosfato my -11 47 21D Pirofosfato 0,5 m! -10 48 19D Pirofosfato 0.1 mg -2 56 2

TABÏA 7

Acción de la OP sobre la NADqigenido_ggggifirogenqsgu g iexeqnggen presencia de análogos del NAD.0,31 mg. de proteina se incuba duranto 66min. (exp. A), 75 min,(exp.B y D) y 73 min. (exp. C) en 0.5 ml de Tris 0.1 N pH 8‘0 enpresencia de ClK 0.05 M, OP0.3mMy la adición indicada ó la adi­ción solamente.Actividad se mide en 0.02 ml.Actividad del testigosin adición ni OP(¿1FBo.10 /min ): 102 (exp. A); 69 (exp. B); 115(exp. C) y 60 (exp. Í. La inhibición por OP se calcula respectoal testigo tratado con la mismacantidad de dinucleótido.

" nhibic ón .. C n 1 u- Ü n i u- Prote001ónExp. Adiciones gggó%%?%) gggó%%%%) (%)

A Nin _- 31 ___,vm_,_.i.A PyAlAD 0.6 mm —1o 18 58A APAD 0.6 mM O 62 -lOO

B' Ninguna —_ 71 __B NAD? 0.6 mM 4 86 —2lB PyAldeamAD 0.6 mg ll 13 82

C Ninguna -- 36 -—C NAD 0.6 mM 3 58 —61C PyAlAD 0.6 mM 3 18 50C APAD 0.6 mM 19 100 -202C DeamAD 0.6 mM 9 59 _64

D Ninguna —— 55 __D APdeamAD 0.6 mM 7 52 6

acción inactivadora de la OP, mientras que el APADy el deamNuD

la eXageran; la APdeamADla modifica escasamente.Acción de varios cationes monoy divalentes sobre la inac­

tivación por 0P. La NADaldehido deshidrogenasa de levadura re­quiere cationes para su actividad, actúa con K+y con Rb+,'y con

NH4+en menor grado. El Na+, Li+, Ca+, Mg++yBa++ son inhibido­res de la misma.

Se ensayó la acción de varios cationes monoy divalentespara ver si tienen acción en la inhibición irreversible por OP.Los resultados se resumen en la tabla 8. Se ve que el único ca —­tión que protege totalmente la enzima de la acción de la OP esel Zn++ puesto que forma ocn la OP instantáneamente un complejo

estable Zn(OP)3 (K = 1 x 10’17 a 25°C) (31) impidiendo de estamanera que se combine con la enzima. E12K+, Rb+y Sr++ son algo

protectores, mientras que el Cs+, Ba++, NH4+y Na+contribuyena aumentar la inestabilidad de la misma.

Discusión

La NADaldehido deshidrogenasa es inhibida por agentes que­lantes de metales ya sea cuando se agregan directamente a lamezda en que se mide la actividad enzimática como cuando se pre­incuban con la enzima antes de medir la actividad.

ste efecto se observa con OP, DDC, OHQ,EDTA, cianuro,

Uuok'-dipiridilo y tiourea. Comparandola inactivación de laNADaldehido deshidrogenasa de levadura con la de la glutámicodeshidrogenasa (34) se ve que la acción relativa de los comple­jantes Varia según la enzima. Estas diferencias se deben a la nn­turaleza de los grupos funcionales vecinos del metal (15).

Como la acción de la OP es mucho más marcada que la de

los otros complejantes, se hizo un estudio más completo con lamisma. La incubación con OPproduce una inactivación irreversi­ble de la NADaldehido deshidrogenasa que depende del tiempoque dura la incubación, de la temperatura a la que se efectúala mismay de la pureza de la preparación enzimática. La irre­versibilidad de la reacción queda demostrada porque al diluir150 veces la mezcla de incubación la inhibición subsiste)noobstante disminuir la concentración de OPa un nivel incapaz deinhibir directamente la enzima comolo demuestran los testigosincubados durante tiempos muybreves o a muybaja temperatura.Esta irreversibilidad sugiere una alteración permanenteen el

TABLA 8

Acción de la OP sobrg_;a NADaldghido dehidrgggnasa de leyggg:_——————__.r— ——._——­

gg en presencia de cationgg_mono x divalentgg. ­0.64 mg de proteina disuelta en 0.5 ml de Tris 0.1 MpH 8.0 in­

cubados-durante 18 minutos ( exp. A)y 0.71 mg de proteina disueltta en 0.5 ml deTris 0.1 MpH 8.0 incubados durante 21 minutos(exp.B)en presencia de OPy cationes en las condiciones indicadasTemperatura de incubación 21°. Actividad se mide en 0.02 m1 de lamezcla de incubación.

Actividad enzim. Inhib. Protec.Exp. Ad1c10nes AE x10 /min (%) (%)34o

a ——- so -_ _A' 0P 0.3 mM 57 29 -—A ClK 50 mM 112 -4o ——A ClK 50 mM + OP 0.3mM 84 22 2oA ClNa 50 mM 94 -17 __A ClNa 50 mM+ 0P 0.3 mM 61 35 -2lA Cle 50 mM . 84 -5 -­A Cle 50 mM+ 0P 0.3 mM 64 24 17A ClLi 50 mM . 71 11 -—A ClLi 50 mM+ OP 0.3 mM 52 27 7A Cle 50 mM 72 lO -—A C105 50 mM + 0P 0.3 mM 7 90 -2oo

A (NO )28r 50 mM 84 -5 -_A (NO ) Sr 50 mM + 0P 0.3mM 68 19 34A c1 a 50 mM - 124 -55 -­A Cl Ba 50 mM + OP 0.3 mM 54 56 -48A Cl Ca 50 mM 76 5 -­A Cl Ca 50 mM + OP 0.3 mM 54 29 -­A olfiH 50 mM . 105 —31 ——

A C1NH4 50 mM + 0P 0.3 mM 60 43 -40

B -—- 186 -- __

B °P_°'3 “M 122 34 -­B c1 Zn 0.1 mM . 124 33 -­

B C12Zn 0.1 mM+ 0P 0.3 mm 129 3 91

centro activo comoconsecuencia de la unión del agente quelante

al átomo de Zn de la enzima. Efectos similares se observaroncon la alcohol deshidrogenasa de levadura y la glutámico deshi­drogenasa de higado (33, 32).

Al estudiar el comportamientode distintos cationes metáli­cos frente a la acción inhibidora de la OP, se observa que sola­mente el Zn++ impide que la enzima sea inhibida. Esto se debea que el ión agregado compite con el Zn enzimático por la OP im­pidiendo de esa manera que ésta inhiba a la enzima. La neutrali­zación de la inhibición de la enzima por la 0P a través de la

formación del complejo Zn (OP)3 confirma la hipótesis de quela inhibición de la enzima por agentes complejantes de metalesse debe a la capacidad de los mismos de formar complejos con

átomos de metal que son enzimáticamente activos.Se vió en el capitulo anterior que la NADaldehido deshidro­

genasa de levadura requiere cisteina u otro complejante de meta­les para alcanzar su máximaactividad. De estos, la cisteina, elDDC, HOQ,EDTAy el cianuro son los más eficaces tinto en su ac­

ción uctivzdora, comoprotegiendo a la enzima completamente con­tra la inhibición irreversible por la OP.En el capitulo ante­rior se habia encontrado una correlación entre la inhibición queejercen estos complejantes sobre la actividad de la enzima cuan­do se los agrega directamente al sistema enzimático y su poderactivador. De las observaciones efectuadas se sugirió que el me­canismo de activación y el de inhibición se efectúa sobre un mis­mo centro activaLa OP activa a la enzima (en incubación cortaen ausencia de cisteina) promoviendo la asociación del NADa la

proteina, domose verá más adelante es posible que los activado­res ejercen su acción a través del mismomecanismo.

Otro componente del sistema enzimático que modifica la ac­ción de la OPes el NAD.Esta sustancia tiene una acción dife­rente según la inhibición por OPsea instantánea o dependientedel tiempo. En el primer caso compite con el inhibidor y dismi­nuye su efecto, en el segundo exagera la acción de la OP. Si lainactivación por 0P se debiera comoen el caso de la alcohol des­hidrogenasa de levadura (34) primero a la formación de un comple­jo reversible En-Zn-OPy luego por una exposición más prolongada

se formaría un segundo complejo En-Zn(0P)n (n) 2), el NADinter­feria en la formación del primer complejo, pero favoreceria la

del compuestoEnz-(OP)nque al ir desnaturalizándose irreversi­blemente, desplaza lentamente el equilibrio en el sentido de laenzima inactiva.

A1 estudiar la acción de los compuestos del NADse encon­

tró que los nucleótidos adenilicos AMP,ADPy ATPejercen lamisma acción potenciadora sobre la OP que el NADen iguales con­centraciones a pesar de que el pirofosfato es ligeramente pro­tector. Igual efecto tienen el deamNADy el APAD,análogos delNADque son reducidos por la enzima. En cambio el PyAlADy el

PyAldeamADque no obstante reaccionar con la proteina, como lodemuestra su acción inhibidora respecto al NAD,no son reducidospor la enzima, la protegen de la acción de inhibidor, el NADPy el APdeamADno la modifican sensiblemente.Existe por lo tantouna relación entre el comportxmientoen el sistema enzimáticapor una parte y sobre la inactivación por 0P, por la otra.

Esta diferencia en el comportamiento del NADy análogosfrente a 1a acción de la fenantrolina es probable que se deba ala influencia del sustituyente piridinico y del grupo aminodela adenina sobre elpirofosfato de la molécula que, consider;ndoque de los componentes del NADes el único que ejerce acciónprotectora frente a la inhibición por OP, se puede suponersea uno de los centros de unión del NADcon el Zn de la enzima.

Asi por ejemplo, el grupo carboxamida del NADforma con elpirofosfato un puente de hidrógeno (35) y disminuye su afinidadpor el Zn. Además, de acuerdo con el esquema de Van Eys y col.

(36) que sugiere que el centro activo de la alcohol deshidroge­nasa de leVadura contiene dos grupos sulfhidrilos no reactivos,probablemente unidos al Zn, al combinarse la coenzima se rompe­rian las uniones S-Zn quedandolibres los dos grupos sulfhidri­los para unirse, uno con el grupo amino de 1a adenina y el otroal N de la nicotinamida y el Zn tendria libres Valencias adi­cionales que permitirían su unión con otra molécula de OP;

Por otra parte, en el NADHy en los análogos aldehidicos,al no tener lugar el puente de hidrógeno con el grupo sustitu­yente de la piridina no se modifica la carga del pirofosfato,por lo tanto hay una mayor afinidad del pirofosfato por el Zn,este efecto contrarrestaria la rotura del puente de sulfuro.

En cuanto al comportamiento del ADPse puede explicar su­giriendo que el grupo amino de la adenina neutralizaria la ac­

ción protectora del pirofosfato.Conclusiones

1) La 0P, DDC, OHQ,EDTA,cianuro, ok,o<'-dipiridilo y tio­urea inhiben a la NADaldehido deshidrogenasa en forma irrever­sible cuando se los incuba con la enzima durante distintos pe­riodos de tiempo. Esta inhibición depende del tiempo que durala incubación, de la temperatura a la que se efectúa y de la pu­reza de la preparación enzimática.

2) Aquellos complejantes de metales ¿ue activan a la enzimaen ausencia de cisteina y la inhiben instantáneamente cuando seagregan directamente al sistema enzimático, actúan Comoprotec­tores de la misma, frente a la acción de la OP.

3) El Zn++ que forma con la OP un complejo muy poco diso­

ciado, protege a la enzima de la inhibición por OP.4) El NADaumenta el poder inhibidor de la OP sobre la NAD

aldehido deshidrogenasa de levadura. De los componentes del NAD,el ADPes el único que ejerce igual acción que este, el AMP,elATPy la nicotinamida aumentan sólo ligeramente el poder inhibi­dor de la OP. El pirofosfato en cambio es algo protector. ElNADHno ejerce ninguna acción, el NADPse comporta igual queel NAD.

5) Aquellos análogos del NAD, PyAlAD y PyAlaeqmgm que sibien son inhibidores comgetitivos del NADno son reducidos porla enzima, protegen a la mismade la acción inactivadora de la0P. En cambio el APADy el deamNADque son reducidos por la en­

zima la exageran

. CAPITULO VI

ACCION DE LOS COMPLEJANTES DE METALES SOBRE LOS COMPUES­

TOS ENZIMAFSUSTRÁTOS DE LA NAD-ALDEHIDO DESHIDROGEHASA DE LE­

Laala. 'La velocidad de las reacciones enztnáticas depende de la

formación de un compuesto activo enzimamsustrato y tanto laactiVación comola inhibición de las mismas se puede explicarpor la acción del activador (inhibidor) sobre el compuestoac­tivo.

Se vió en capitulos anteriores que la NADaldehido deshi­drogenasa.de levadura requiere un activador (2, 8), cisteína uotros complejantes de metales, para desarrollar su actividaden forma completa. Estos mismos complejantes de metales actúansobre la enzima de dos maneráidistintas: a) la inhiben instan­táneamente en forma reversible en concentraciones altas y b)la inhiben irreversiblemente después de un contacto suficiente­mente prolongado con la enzima.

Una visión interna de la forma de interacción se puede ob­tener a través de estudios cinéticos de inhibición que indicansi la reacción es reversible o si se puede prevenir y si existecompetición entre el agente quelante, el sustrato y/o la acen­zima por el centro activo.

En el caso de la NADaldehido deshidrogenasa de levadura,se analizó 1a formación del compuesto activo (39, 40) pero nose pudo demostrar la manera de actuar de los activadores sobreel mismo (8). El haber encontrado que la OP en concentracionesbajas y en ausencia de cisteina tiene la mismaacción que ésta,permite establecer una relación entre la acción de los activa­dores y la formación del compuesto activo enzima-sustrato.

RESULTADOS

l) Necesidad de activadorgpara la reacción enzimática. Enel capitulo IV se vió que algunos complejantes de metales actú­an comoactivadores de la enzima en ausencia de cisteina cuando

el aceptador de hidrógeno es el NAD.Se estudió el comportamien­to de los mismos complejantes cuando se cambia el aceptador dehidrógeno por análogos del NAD; deamNAD,APdeamAD.D0 los re­

sultados que se resumen en la tabla 1 se Pueden sacar variasconclusiones; a) La Velocidad inicial de la reacción en ausen­cia de activador depende de la coenzima presente en el sistema

TABLA l

ActivacióndelaNADaldehidodeshidrogenasadelevaduraporcqulejantesdeggtales

1704ug(exp.A)y50,ug(exp.B)deproteínadisueltaen3mldeTris0.1MpH8.0enpresencigdeClK

b.05M,coenzimas0.45mMyadicionesenlaconcentraciónquese3indican.Acetaldehido17xlOMseagrega

alfinal.Lasactividadesenzimáticasseexpresancomo(QE34Ox10/hin.)

Expo“mms¿33HMDcIÍSÉEÏï'12823%“¿552233¿33??3233¿BÉHZAPADEÏÉÉÉÏÉSfi

ANinguna9141836x9¿100.0ACisteinamM65100501008810024100ACianuromM385861267761875ACianuromM+CisteinamM88135-—----­AEDTAmM7111428-—-—--­AEDTAmM+CisteinamM67103--—---—­AEDTA035mM4975-----­AEDTA0.5mM+cisteínamM70108-----­AEDTA0,25mM—--27549711027112AEDTA0105mM5991-._—_...__-­AEDTA0.05mM+cisteínamM78120----——­AHistidinamM5686387675851875ABALmM77118511009110328117ASNa2mM5686428479902083AOPmM5584408045511354AOHQmM5483367277871667BNinguna1814-—----­BCisteínamM125100-----­BDDC5mM4o32-—-_-_..._..:6Adenina9mM32-—-—----—­

enzimático, así con APADla reacción no se produce; con NADy

APdeamADla velocidad de la reacción enzimática es 9 y con

deamNADes de 18. b) Los complejantes no tienen el mismo efec­

to activador (comparadocon la cisteina) cuando los sistemasenzimáticos a los cuales se agregan tienen distintas coenzimas.Por ej. el cianuro mMproduce las siguientes activaciones (%):58 (NAD), 12 (deamNAD), 76 (APdeamAD) y 75 (APAD), mientras que

con la OHQse obtiene: 83 (NAD). 72 (deamNAD),87 (APdeanaD) y

67 (APAD). c) En el caso del EDTAque en concentración altaproduce inhibición (efecto activador aumentaal disminuir laconcentración de l mMa 0.05 mM), el agregado de cisteina con­trarresta la inhibición. d) Si se agrega al sistema enzimáticosimultáneamente dos complejantes que producen activación signi­ficativa, la velocidad de la reacción es mayor que si se agrega­ra cada uno por separado, pero menor que la suma aritmética delas acciones individuales. e) De los complejantes ensayados conNADcomo aceptor de hidrógeno, el EDTA(0.25-0.05 mM)y el BAL

mMson tan eficaces comola cisteina, la histidina, OP, OHQyel sulfuro activan algo menos mientras que el cianuro y el DDCson muchomenos activadores. La adenina no obstante complejaral cinc, carece de acción activadora.

El hecho de que la cisteina pueda ser reemplazada por otrocomplejante de metales en su acción activadora, que pueda con­

trarrestar el efecto inhibidor a concentraciones altas de EDTAy que no se sumenlos efectos activadores individuales de cis­teina y otro complejante activador cuando se agregan simultá­neamente el sistema enzimático)indica un mecanismo comúndeacción.

2) Acción de los complejantes sobre el complejo enzima­ggggglgg. La cinética de la NADaldehido deshidrogenasa se pue­de analizar en forma simplificada manteniendo constante laconcentración de los componentes del sistema excepto uno (39,40). La velocidad de la reacción es entonces función de la con­centración del sustrato variable y la representación de la re­cíproca de la velocidad en función de la recíproca de la concentración (Método de Lineweaver-Burk (41)) permite calcular cnbase a la ecuación de Hichaelis-Menten (44);

l/v = 1/vm + ¡{NAD/vm (NAD) (1)

el valor de K aparente correspondiente al componenteestudiado;suponiendo que ¿Ste sea el NAD,la ecuación (l) permite el

cálculo de KNADy Vm, es decir, la constante de Michaelis delcomplejo enzima-NADy de la velocidad máxima aparente (Vm) de

la reacción enzimática respecto al NAD.KNADse calcula por larelación entre la pendiente (Km/Vm)y la ordenada al origen(l/Vm) de las rectas respectivas y Vmse obtienen directamentepor el valor de la ordenada al origen.

Acción de la OP en ausencia de cisteina. Comoya se vióen el capitulo IV, concentraciones bajas, O.33-l.3 mm,de 0Paumentanla velocidad de la reacción enzimática; en la figura lse ve que disminuye l/v, si bien todas las rectas se cortan enel mismoValor de la ordenada o sea que todas las reacciones

tienen la mismavelocidad máximaaparente)lo que significa quela OP no actúa sobre la velocidad de descomposición del complejo

ternario activo en productos de reacción. KÑADdisminuye de 13a 2.8 x 10'4ma a la enzima.

M indicando un aumento de asociación de la coenzi­

Si se aumenta la concentración de OP, se pone en manifies­to el poder inhibidor del mismocomose ve en la figura 2. Seobtienen rectas convergentes en el mismovalor de la ordenadao sea que la OP no modifica la velocidad de descomposición delcomplejo; l/v aumenta a medida que aumenta la concentración de0P lo que indica inhibición de la actividad enzimática por elcomplejante y las pendientes de las rectas aumentan, lo que de­termina un aumento de las constantes de Michaelis; la OP influ­ye sobre la formación del complejo enzima-coenzima. dismhmdyerr

do su concentración. Los Valores de KNADvarían de 4 a 19 x 10-4M cuando la concentración de OP aumenta de 1.3 a 10.5 mM.

Acción de la OP en nresencia de cisteína Cuando se trabaja enpresencia de cisteina se obtienen resultados similares, es de­

cir, los KNADaumentan, los valores que se obtienen son 7.4,12.5 y 29 x 10'4

0, 5.2 y 10.5 mM(Figura 3); la Vmpermanece invariable.

M que corresponden a concentraciones de OP de

Si se representan los datos de la figura 3 comoinversasde velocidad en función de la concentración de OP, se obtienenrectas (figura 4) para las distintas concentraciones de coenzi­ma¿que se cortan en un punto correspondiente a V_l= 0.15 x lO­y (0P) = -4.2 x 3.0"3 M. La linealidad de los datos de las in­

2

70"

-4

VX

.lGURA l

50

20

15

10

l l I I I IO

h. .­

A

_ B _

O

_ C q

J l l l l l

20 25 30 35

[NADJ" (M'x 103)OP la actividad ehzlmátiga u varias

n de Cirteínz. Bgflg dcpresencia de C]\

habreNAD en

lacoycentrqciones

deinfluenciade 'ÜUIJQINÍL

I ‘ . - , . » _ . ‘prPLean :1319Lïw en irls 0.1 ¿ ¡d 8.( anC.O5 R y LABen las concentraciones que Ke jmvihaaw. “cgï­ildCHLHO17 X 10-9m se agrega al final. 0P (TF): (,;) (Íí­nea h), G.6? (B) y 1.3 (U).

¿19985.3

I I l l I l .

F- -1

A

5’ _

C

l l l lI

10 15 20 25 30

[NAD/‘x/M‘}1o3)Influencia de OPsobre la actividad enzimática a varias con­

mh­

centraciones de NAD,en ausencia de ciqteína. Condiciones ex;

como en 13 figura I OF;(MM); 10.5 (línea A),Í . ' y,"\B) VJ).

perimeñtalcs5.2

1/"x10-2

Mi l l l

10 20 ¡o

[NA0]" (M1109¿ufïuenciz de 1a “P sobrc la activ1fiafl enzimítica a varias

cancentraciones de NAD.ïyégzde proteína disuelta en í mlda Iris 0.1 h pd 9.0, en presencla de cisteínu mn, 31k 0.05y “¿y en las conCentruciones que se 1nolc2n. n0at.gden4do17 x 10- m se agrega al final 0P: 10.5 (línea «). 5.0 (B) y0 LJ).

versas de la Velocidad cuando se representan en función de laprimera potencia de la concentración de 0P indica que una molé­cula de inhibidor (0P) se combina con cada uno de los centros

activos de la enzima (42). El valor de KoP = 4.2 x 10’3 Mdeter­minado por el método gráfico de Dixon (43) coincide con el ha­

llado a partir de la fórmula Ki = i (KP=Kmen presenciade inhibidor) _ 1

a”La?“

3 M para una concentración de inhibidor de 8 mMigual a 4.2 x 10'y de 3.3 x 10’3mM.

Mcuando la concentración de inhibidor es de 1.5

Si se procede de la misma manera con los datos de la figu­ra 2, se otienen rectas (figura 5) para las concentraciones al­tas de sustratos qie se cortzn en un punto que corresponde av“l = 0.25 x 10"2 y (0P) = -2.3 x io"3K = 2.3 x 10-3M. Para las concentraciones bajas de sustratoOP

y de inhibidor la representación correSponde a una recta, pero

M, lo que equivale a

cuando se aumenta la concentración de 0P se tiene una curva con

la concavidad hacia la abscisa o sea velocidades menores que lasque corresponden a un comportamiento linea1,como si al disminu­ir la concentración de coenzima aumentara la inhibición por OP.Es decir,que cuando se tiene una concentración de sustrato en­tre 0.5 y 0.12 mM,en ausencia de cisteina, deja de cumplirsela relación estequiométrica de mol de inhibidor por mol de cen­tro activo.

Cuandose representan los datos de las inversas de veloci­dad de la figura l, en los cuales la 0P en concentraciones ba­jas y en ausencia de cisteina actúa comoactiVador, en funciónde la inversa de la concentración de activador (Figura 6) paravarios valores fijos de sustrato, se tiene para concentracionesaltas de NAD,1 y 0.5 mM,rectas que se cortan en un punto cuya

abscisa es igual a --l/KA (42). En cambio para concentracionesbajas de sustrato, 0.25 y 0,12 mM,la linealidad sólo se cumplepara las concentraciones más altas de actiVador; 1.3 y 0.67 mM,mientras que para concentraciones más bajas de OP la Velocidades muchomenor que la correspondiente a un comportamiento li­neal, comosi disminuyese la asociación entre la enzima y la co­enzima.

En la figura 7 se ve los resultados obtenidos con OHQen

wx70"

«z Fe

EIGURA 4

JP L ': .’

utxnn}.

l I I I I I I I I ï I ' Í noun_ A 0.or­

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-4 -3 -2 -1 o 1 z 5 4 5 6 7 a 9

[OP] x (10’74)‘ «iwuciín ¿ríflca de la constante deí inhihldor (método de

Jonüiciones ¿Xperimentales comoen la figura 3.

«VLGURVLÁ

25

ZOF- _

15

1/”X70-240- ­

vn I'll“4 0 Z 34

[OP] x(103M/)a? lá constflnfa Jsï inhibidorJeterminación gráfica

(método de Dixon). Cnnüicinnes exporimanï1iov cmwwen la figura 1.

2/4210"Z

¿Q

EÏGURA 7

C

l I ,1

1o 20 .30

[NAD] " (M"x 107Influencia del OHQsobre la ac11vid2d enzimática avarias cnnpentrqciones de WÜU.VR/ág de prnteíra di­suelta en 3 m1 de Tris 0.1 F ph 8.0 en prQSania de31K 0.05 M, C‘steína mmy NADvn las chncentrqvlcnes

. . .. , ")‘. que se 1nd1can. Acetaldenldo 1/ x 10 M :e a¿raga al

final. OHQwfibfi(línea n), l (B) y O ai).

presencia de cisteina, las rectas que se obtienen a distintasconcentraciones de inhibidor tienen el mismoValor de la orde­

nada en el origen mientras que KNADanuenta significativamente;1.5 x 10’4M en ausencia de OHQ; 2.2 x 10’4M (OHQ1 mM) y 4.o x

10‘4M (OHQ 2.5 mM).

Con DDCen presencia de cisteina, el gráfico de LineweavereBurk que se obtiene, corresponde también al de una inhibición

competitiva respecto al NAD(Figura 8). KNADpasa de 3.6 x 10'4M(sin DDC) a 4.3 x 10’4M (DDC 3.o mM) y 5.8 x 10'4M (DDC 626 mM).

Se ha intentado analizar en la forma descripta el efectoactivador de la cisteina pero se ha tropezado con la dificultadde que si bien a concentraciones bajas de cisteina hay activa-u'ción, la actividad decae tan rápidamente que imposibilita elanálisis cinético de la acción de la misma. Con concentraciones

altas (16 mM)no se observa inhibición inmediata de la reacciónenzimática.

3) Acción de los complejgptes de metales qnhrm e] complejo en­gima-acetaldehido. Si en el análisis cinético se mantiene constante la concentración de NADvariando la del acetaldehido y serepresentan los valores obtenidos de acuerdo al método de Line"

weaver- urk (41%se tienen rectas para concentraciones no demasiado altas de sustrato (40) cuyas ordenadas a1 origen dan la inmversa de la velocidad máximade la reacción respecto al acetal­dehido y la relación entre la pendiente y la ordenada al orígen

da el KacetaldehidoLa adición de OP (Figura 9) o de DDC(Figura lO) da como

aparente.

resultado rectas que presentan un aumento mayor de la pendien­te que de la ordenada al origen; las rectas que se obtienen condistinta concentración de inhibidor se cortan en un punto porencimade la abscisa negativa; El inhibidor afecta tanto a lavelocidad máximaaparente o sea la disociación del complejo ac­tivo, comola formación del complejo enzima-sustrato.

5Los valores de Kac obtenidos son de 1.84 x 10- M (sin

OP) y 2.14 x 10-5M (OP ÉÏ6 mM) y de 1.84 x 10-5M (sin DDC),

3.39 x 10'5M (DDC 3.0 mM) y 3.32 x 10"5 M (DDC 8 mM).

'Ée han realizado experimentos similares con concentracio­nes bajas (0.3-l.3 mM)de OP, sin cisteina. Las rectas corres­pondientes dan intersecciones distintas en la ordenada o sea

comoen la inhibición, la OPmodifica Vmrespecto al acetalde­

Ylfiufinwf

l l l l L

A4 e e 1o 42

[NAD]"/M"x 703/TN)’­

«Infïueaciu de DDCsobre la actividad enzimática a varias,

concentraciones de NAD.ISI/kg de proteína disuelta en3 ml dp Tris 0.1 M pH 800 en presencia de 81K 0.05 M,cisteína mmy NADen las concentrficiones que se indian.Acetalflehido 17 x 10 "5 H se agrega al final. DDC(mm):6.6 (MMM). 3 (B) y 0 (c).

v"x10"

EJNÉAÉ

3 ..

2.3- ­

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14- “22.- B _ “

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aal- . l l l l lha 50 v

[Ace ta/ dehíc/o] Ï/M 710")Acción de la OP sobre la actividad enzimátlca 2 vnrlas concen­

30

traciones de acetaldehido. 82/Qg de proteína Riquelta en 3 m1de Tris 0.1 H pH 8.0, en presencia de 01K 0.05 M, NAD0.45 mm,Cisteína mMy acetaldehido agregado al final en Las concentra­ciones que se indican.

10"

-I

VX

1.8

2.6

l l l

40 20 30 40 50

[34cefalc/eh/c/OJ'Í/M'ÏíO‘lDDC

deInfluencia ¿al

aceta en 3 m1 de Tris 0.1

, NAD O.%5

con cc nt m ci “¿7‘35?

concentraciones

cisteíwñ WMen las

(a)y (a).

sobre la activifiiá enzimática a eriasde Urotuína iisuel­

CLK 0.05tu ‘1. ni o Ja1 Ag

M pH “.0, en QFBSGÚCha M,(18

‘É finalmE y wget» dehifim a regado a‘ _‘ _. A; , , - v .1 g,que a4ï_u1}¿c4p. ¡Luj (ma). O (-1nea A),

hide.4)Efecto de los complejgptes sobre la reactividad de los tiolesggzimáticos.'En un trabajo anterior, Stoppani y Milstein (8) de”mostraron que la enzima tiene grupos tioles necesarios para laactividad enzimática por cuanto es inhibida por reactivos que sesabe actúan sobre esos grupos y que probablemente el tiol inter­venga en la unión con la coenzima ya que ésta los protege contralos inhibidores especificos.

Se estudió el comportamiento de los complejantes de meta­les frente a la acción del o-iodosobenzoato y del óxido de me;larsen; los resultados se resumen en la tabla 2; se ve que tan­to la 0P como la OHQaumentan la sensibilidad de la enzima hacia

estos reactivos, comosi liberaran grupos tioles haciéndolos más

accesibles, ya sea a la coenzima (fenómenode activación) ya seaa otras sustancias capaces de reaccionar con ellas,como son losreactivos de tioles.

DISCUSION

Experimentalmente se pueden distinguir Varios tipos de in­hibición por acción de una concentración fija de inhibidor, sobrelas pendientes e intersecciones con la abscisa)de gráficos develocidad inicial de acuerdo almétodo de Lineweaver-Burk (41).

Se pueden interpretar teóricamente incluyend01en el esquema dereacción propuesto por Michaelis-Menten (44) par; una reacción

de un sólo sustrato l/v = l/Vm + KNAD/Vm . (NAD) los compues­

tos EI y ESI,con constantes de disociación KEI y KESI respecti­vamente (45). La relación general toma la forma

l/vo = (1 + i/KESI) / v + (l + i/KEI) Km/V.s

Cuando el agregado de un inhibidor resulta en un aumentode la pendiente pero con una intersección con la ordenada invae

riable, indica una inhibición competitiva (KESI:00), la inhi­bición disminuye a1 aumentar la concentración de sustrato.Pendientes invariables con aumento de ordenada al origen, esdecir gráficos paralelos corresponden a una inhibición incompe­

titiva (KEI=uc.-).La explicación habitual de este tipo de inhi­bición es que el inhibidor se combina solamente con el complejoES (46). Cuando por el agmgadode un inibidor, en el gráfico deLineweaver-Burk se observa que la pendiente comola ordenada alorigen aumentan en 1a misma proporción se tiene una inhibición

TABLA 2

Acción de los complejantes de metales sobre la inhibición de laNADaldgpido dgehidroggnasa de levadura por reactivos de tioles.

0.60 mg ( exp.A y B ), y 0.80 mg (exp.C) de proteína disueltaen 0,5 m1 de Tris 0.1 MpH 8,0 se incuban con las adiciones in­dicadas durante treinta segundos. La actividad se mide en 0.02 mlde la mezcla de incubación.

Actividad enzim. Inhib.Exp. Adiciones AE 34ox10 /min. (%)

A Ninguna 63 -­A o-iodosobenzoato 0.12 DM 6 90A HOQ 5 DM 60 -—A HOQ 5 EM + O-iodosobenzoato 0.12 DM O 100A OP 5 UM 57 -­A 0P 5 BM + O-iodosobenzoato 0.12 UM O 100

B Ninguna 89 -­B 0-iodosobenzoato 0.03nM 50 44B HOQ 5 UM 72 -­B HOQ5 nM+O-iodosobenzoato 0.03 2M 23 68B 0P 5 DM 72 -­B OP 5 DM+ o-iodosobenzoato 0.03 nM 32 55

C Ninguna 63 -­C Melarsen 0.01 EM 23 63C HOQ 5 UM 58 -—C HOQ 5 mM+ nelarsen 0.01 uM 18 69C 0P 5 nM 51 -­C 0P 5 DM+ nelarsen 0.01 UM 9 82

no competitiva__(KEI = RESI), el efecto de un inhibidor no compe­titivo no disminuye por aumentode la concentración de sustrato;

esto podria deberse a una combinación del inhibidor a un centrode la enzima de manera que no influye sobre la unión del sustra­

to a la misma, Kminvariable, pero si sobre la velocidad de des­composicion del complejo activo.

Existen también tipos mixtos de inhibición; aquellos en quese observa proporcionalmente un aumento mayor de 1a pendiente

sque de la ordenada al origen corresponden,al tipo competitivo-no

competitivo (KEI<KESI),el inhibidor afecta tanto la velocidadmáxima como la formación del complejo enzima-sustrato (42). En

cambio cuando el aumento de la ordenada al origen es mayor que

el correspondiente a la pendiente,(KÉi>KESI) se tiene una inhi­bición del tipo no competitivo-incompetitivo (45).

La NADaldehido deshidrogenasa necesita un activador para

alcanzar su máximaactividad enzimática (2,8), Tanto la ciste­ina comootras sustancias que se conoce son capaces de complejar

metales,actúan comoactivadores de la enzima. Se tiene evidenciade que la cisteína actúa sobre el mismomecanismo que los otroscomplejantes de metales por el hecho de que ésta puede anularel efecto inhibidor producido por concentraciones altas de-EDTA.de que se comporta comoprotector frente a la inhibición irre­versible de la enzima por la OP, de que no se suman los efectosactiVadores individuales cuando se agrega simultáneamente ciste­ina y otro activador al sistema enzimático.

La activación de las enzimas por complejantes puede debersea dos causas (8); a la eliminación de metales pesados que conta­minan e inhiben a la enzima, o a la formación de un complejo ac­tivo complejante-enzima. Todas las preparaciones enzimáticas es­tán contaminadas por metales pesados, su completa eliminación esmuydificultosa (47) dependiendo del grado de afinidad que ten­ga la enzima por el metal contaminante, por lo que no se puedeafirmar que la preparación enzimática estudiada no se encuentreincluido en este caso. Sin embargo, el que la 0P en concentracio­nes bajas y en ausencia de cisteina, es decir en las condicionesen que actúa comoactivador. influye sobre la formación del com­

plejo enzima-coenzima disminuyendo el valor del KNADaparente osea favoreciendo la asociación de la coenzima a la enzima, sibien no excluye una posible remoción de metales pesados,indica

que el mecanismode activación implica una acción directa de la

OP sobre la formación del compuesto activo. La variación de KNADdiferencia netamente el efecto activador de los complejantes

del de los iones metálicos (40% que no modifican KNADy si au­

mentan Vm.

Los datos de las figuras 3,7 y 8 indican que la coenzimacompite con la OP, DDCy OHQ,por un centro activo que proba­

blemtne involucra un metal. Además, el hecho de que se obtenganrectas al representar inversas de velocidad en función de laconcentración del inhibidor para distintas concentraciones decoenzima (figura 4),indica que por cada centro enzimático secombina una molécula de inhibidor (42). Resultados similares seobtuvieron con la alcohol deshidrogenasa de higado de caballo(48) y de levadura (34) los que fueron confirmados por medidasespectrofotométricas (49).

Las figuras 9 y lO muestran gráficos de Lineweaver-Burkcuando se varia la concentración de aldehido, los datos que seobtienen, rectas que no se cortan sobre un punto de la ordenadasino que presentan un aumento mayor de la gendiente que de laordenada al origen, de acuerdo con la discusión anterior corres­ponde a una inhibición mixta del tipo competitivo-no competitivo(45).

Resultados semejantes; inhibición competitiva de OP, DDCyOHQrespecto a la NAD,se observaron con 0P y deshidrogenasasque contienen Zn (50, 48, 51). Si se asocia ese efecto a la in»activación irreversible de la enzima por OPtambién similar ala observada con Zn deshidrogenasas (34) y a la inhibición mix­ta competitiVa no competitiVa respecto del acetaldehido descrip­to también para la alcohol deshidrogenasa respecto del etanol(45)>se puede postular de que el Zn juega el mismo papel en laaldehido deshidrogenasa. Sobre esa base se puede aplicar a laaldehido deshidrogenasa los modelos propuestos para la alcoholdeshidrogenasa. Basándose en una hipótesis de trabajo propuestopor TheoreIl y Chance en 1951 (53) se tienen las siguientes e­cuaciones;

E + (NADH);‘—==":> - NADH

E - NADH+ CHBCHO+ ¡{É-mes - NAD + C2H50HE - NAD¿;====E + NAD

E+OP\=————-‘— —0P

Este mecanismono excluye la existencia de complejos bina­rios E-alc. y E-ald. o de los complejos ternarios E-NADH-aldyE-NAD-alc. que se asocian e intercomvierten lo suficientementerápido comopara no influenciar la velocidad máxima. Se postula­ron una serie de mecanismos de acción a partir de datos experi­mentales obtenidos estudiando la cinética de la reacción en pre­sencia y ausencia de inhibidores.

Vallée y ool. (49,50) deducen de los datos obtenidos,quela coenzima se une a la enzima a través del Zn, inhibición competitiva entre OPy coenzimas, mientras que el sustrato al no pre­sentar un comportamiento estrictamente competitivo no puedeestar unido al Zn en complejos ternarios, pero si en sitios cer­canos al mismo, ya sea sobre la enzima (52) o la coenzima (29).

Theorell (54, 55, 56) basándose en un mecanismo de orden

casual,explica la ausencia de una competición estricta entre lossustratos y la 0P de la siguiente manera; el cinc octahódrico seencuentra unido rigidamente a la proteina por tres uniones coor­dinadas de manera que las tres Valencias libros del metal estándirigidas de una manera constante y no son necesariamente equi­valentes. Los ligantes bidentados comola 0P, OHQy‘XfÏ -dipiri—dilo son estrictamente competitivos con el NADcomo es de espe­rarse si hay solamente tres valencias libres y la adenina dela coenzima forma también una unión bidentada a través del gru­

po amino del 06 y del N en posición 7. Al no ser las valenciaslibres equiValentes postula que los ligantes bidentados sólo pue­den usar los mismos dos centros de coordinación que la coenzimapor lo tanto no compiten con el sustrato por el tercer centrode coordinación. El comportamiento parcialmente competitivo deletanol lo atribuye a un efecto estabilizante mutuo del NAD+ydel alcohol (N+—alc-- Zn) en el equilibrio:

I , ——— .

/ ! 0;? / i NAD [5- /5.: ¡Zn _._.___..'; ,Z,n\\.___i l.

/// ¡A <——“‘—‘ ' \\ Í - - n-\..__¿\¿/\\ alc \ c 2H5oM_\ Aun aumentode la concentración de alcohol desplaza el equili­brio hacia la derecha simulando de esa manera un cierto gradode competencia entre el alcohol y la 0P.

Una representación esquemática del complejo ternario de la

alcohol %%shfigrogenasaseria el siguiente:

Dalziel (45) demuestra sobre la base de un mecanismo de ordencompulsivo en el cual la coenzima se une primero a 1a enzima,que un inhibidor que compite con la coenzima en general exhibediferentes tipos de comportamientocon relación al sustrato.El esquema de Dalziel se transforma en z

E + I ¿tilï EIE + C (“‘73 EC

EC + S e_——¿ ECS +==zi EC‘S' Q———4ÏEC' + S'

EC';———4\E + C'

La ecuación de la velocidad inicial en el estado estacio­nario, incluya o no a los complejos ternarios ECSy EC‘S' to­ma la forma:

e/vo =‘Ïo + WI (1 + i/KEI)/b +‘92/s +‘P12(1 + i/KEI)/c.sSi se mantienen constantes las concentraciones de sustrato

y de inhibidor y se varia la de la coenzima¡

e/vo = (‘90 + k{Je/s) + (“Pl 4412/8) (1 + i/KEIVCel efecto del inhibidor va a ser aumentar la pendiente por el

factor (1 + i/KEI) mientras que la intersección con la ordena­da permanece inVariable. o sea un comportamiento competitivo.

Si se mantienen constantes las concentraciones de inhib‘dor y de coenzima, variando la del sustrato:

e/vo = («yo + V1 (1 + 1/KEI)/c] + [x92 Alza + 1/KEI)/c]/sel efecto del inhibidor va a ser aumentar tanto la pendiente cm­mo el valor de la ordenada al origen, pero no necesariamenteen la mismaproporción. El tipo de comportamiento del inhibidorhacia el sustrato va a depender de los Valores relativos de

Kml(constantes de Michaelis aparente para la coenzima) y deKEC(constante del compuesto enzima-coenzima).Si km1: KECau­menta tanto la pendiente comola ordenada al origen en 1a mis­ma proporción,indicando una inhibición no competitiva. Si

Kml(;KÉCla inhibición va a ser competitiva-no competitivao si la desigualdad es muygrande casi puramente competitiva.

O

Si Kml>KECla inhibición va a ser incompetitiva/ho competiti­

va-incompetitiva. Se ha demostrado para una serie de deshidro­genasas que usan como coenzima nicominamida adenina dinucleótidoincluyendo láctico deshidrogenasa (57), alcohol deshidrogenasade levadura (58) y de higado (59, 605 y málico deshidrogenasa

(61) que para NAD+, Km1< KBC mientras que para la NADHKml) KEC.Se llega a la misma conclusión partiendo del mecanismo de

Theorell-Chance en el caso especial en que los complejos terna­rios no sean cinéticamente significativos.

El mecanismo de orden compulsivo provee una explicaciónsimple de los datos experimentales: si el metal fuera el centrode un complejo tornario octahédrico con tres uniones a la pro­teina y dos a la coenzima bidentada no puede haber competiciónentre la OPbidentada y el sustrato monodentadopor el centrode coordinación remanente del complejo enzima-coenzima.

Puede concluirse que la cinética de inhibición con OP pro­vee una evidencia válida de que la coenzima está unida al Zn enel complejo-enzima-coenzima de la NaDaldehido deshidrogenasa deleVadura y es consistente, pero no pureba la unión del sustratoal Zn.

El Zn está unido por tres valencias a la proteina, debidoa que la unión entre el Zn y la enzima es muy fuerte (54) pro­bablemente una o dos de estas uniones sean del tipo zn-sulfuro(36); lo cual se ajusta a las observaciones reseñadas pues loscomplejantes, al liberar los tioles del compuestode coordinacióncon el Zn los harian más sensibles a los reactivos correspondien­tes.

Conclusiones

l) La velocidad inicial de la reacción en ausencia de activador,depende de la coenzima presente en el sistema enzimático. Loscomplejantes no tienen el mismoefecto activador (comparado conla cisteina) cuando los sistemas enzimáticos a los cuales seagregan tienen distintas coenzimas.2) Los efectos activadores individuales de cisteina y otro com­plejante activador no se suman cuando se agregan simultáneamen­te al sistema enzimático.3) La cisteina y los complejantes de metales tienen un mecanis­mo común de acción cuando actúan como actiVadores. El mecanismo

de activación inplica una acción directa de la OP (activador)sobre la formación del compuesto.

4) 0P, DDC, y OHQcompiten con NADpor un centro activo; por

comparacióncon resultados similares obtenidos con otras deshi­drogenasas que contienen Zn, se puede postular que el Zn es uncentro activo de la enzima por el cual compiten el NADy loscomplejantes de metales.5) OPy DDCpresentan hacia el acetaldehido una inhibición mix­ta del tipo 00m5itivo-no competitivo, este resultado es consis­tente con la unión del sustrato al Zn, pero no lo prueba¿6) Tanto la OP como la OHQaumentan la sensibilidad de la enzi­

ma hacia los reactivos de tioles, o-iodosobenzoato y óxido demelarsen.

CAPITULO VII

REACCION DE LA NAD ALDEHIDO DESHIDROGENASA DE LEVADURA CON SUS

SUSTRATOS: NAD, ANALOGOS DEL MISMO Y ALDEHIDOS.­

Kaplan y col. (62, 63) han preparado una serie de sustan­cias a partir del NADya sea sustituyendo el grupo carboxamidaen el núcleo piridinico por un acetilo ( 3-acetilpiridina ¡AD)o un aldehido (piridina-3-aldehidoAD), o bien el grupo amino dela adenina por un hidroxilo (desamino NAD,3acetilpiridina_dosa—minoAD,piridina-3-aldehido desamAD).Estas sustancias resultanmuyútiles en el estudio del mecanismode unión de la enzima conla coenzimaya que la unión implica la interacción de ¿nipos reac­tivos característicos de la enzimay del nucleótido respectiva­mente. Así comomediante el uso de reactivos específicos del gru­po tiol y de complejantes de metales se vió que tanto la presen­cia en la enzima de SHcomoun metal son esenciales para la ac­tividad enzimática; con la introducción de los análogos se pue­de verificar el papel de grupos claves del dinucleótido en launión con la proteina catalítica para formar el compuestoacti­vo del cual depende la velocidad de la reacción enzimática.

RESULTADOS

La reducción de las coenzimas se midió a 340 mp. Comoeldeam NAD,el APADy el PyAlADtienen absorciones específicas li­

geramente distintas al NADen 340 mu, las velocidades iniciales(v) obtenidas en las reacciones respectivas se han corregidomultiplicando por los siguientes factores: deamNADy APdeamAD,1.07, APAD,1.14. Estos factores se han calculado en base a da­tos espectrofotométricos de Siegel y col. (64).

En la figura l y tabla l se ven las velocidades de reac­ción de varios análogos del NADen comparación con la correspon­diente al NAD.De los resultados obtenidos se ve que no todoslos análogos utilizados son reducidos por la enzima. Entre loscompuestos que actúan en la reacción enzimática, NADP,deamNAD,APADy APdeamAD,el deamNADes el más activo. A concentraciones

bajas de nucleótido la velocidad de la reacción es más alta conel deamNADque con el NAD, a medida que se va aumentando la con­

centración se invierte la relación (figura 3) ya que el deamNADalcanza antes la concentración de saturación. Para una'concen­

Tabla 1

Acción de aqálqgos del NADsobre la actividad de la NAD-aldehi­gg deshidrogenasa de levadura.

53¡ug de enzima disuelta en 3 ml de Tris 0.1 M, pH 8.0 en pre­sencia de 01K 0.05 M, cisteína l mM,acetaldehido 0.17 mmy lasadiciones que se indican.

. ADAM? ¿222;1 C10ne S “(A)” (%>NAD 0.45 mM 334 _“ _­

NADP 0.45 mN 112 33 __

DeamNAD0.45 mg 266 79 __

APdeamAD 0.45 mMV 61 18 -­

APAD 0.45 mM, 35 lO -_

PyAlAD 0.45 mM 3 A _­

PyAldeamAD 0.45 mM o o __

NAD 0.45 mM + APAD 0.45 mm 299 9o lO

NAD 0.45 mm.+ NADP 0.45 mM 254 76 24

NAD 0.45 mm L PyAlAD 0.45 mM 88 26 74

NAD 0.45 mM L PyAldeamAD 0.45 mM 78 23 76

FIGURA 1

30/m¡n

390

AEX7

10 20 50 40 ï‘ 60 70 80

Tiempo (seg)Acción de análogos del Nau sobre la actividad delaNnDaldehido deshidrogenasa de levadura. 0.1? mg deproteína disuelta en 3 m1 de Tris 0.1 MpH 8.0, enpresencia de 81K 0.05 M, cisteína 1 mm, aCetaldehi—do 17 x 10’5 m y dinucleótidos 0.45 mm. NAD(lí­nea a), deamNAD (B), NnuP (C), APdeamAD (D) y APAD(E). ‘

360

320

280

240

x103/mín

Acción de análogos del NADsobre la actividad dela NADaldehido deshidrogenaáa dé levadura. 0.12mg de proteína disuelta en 3 m1 de Tris 0.1 M¡B 8.0, en preSencia de ClK 0.05 M, cisteína1 min, acetllráe‘nido 17 x 10'5 ru, NAD 0.45 mmydlnucleótloos 0.45 mm. Línea A (sin adición), B

FIGURA 2

L

lO 20 30 40 50 60 70

Tiempo (seg).

(wm), s (¿.ADP)y D (PynlhD).

FIGURA 3

52OP _

480- ­

Q 4140- ­

úoo- C ­360- B ­...\ ,

(:> 320r. _‘Vx

x 240- —

Lu 200%- _Q160- ­

120- ,4 ­

80 _

4o

l l l l l l l l l l0.4 0.2 0.3 0.4 05 06 0.7 a: a! 1

[Nucle‘otic/o] M x 10”Influencia de 14 conoentrwción de nucleótido sobre laactividad de la NADaldehido deshldrogenasn ña IQVQflu­1m, C.12 mg de rrnteínq disuelta en 3 ml de Tú.s 0.1 MpH SGU, en presenqia de ClK 0,05 M9 cisteína l'mE,ncet—aldehiqo 17 x lO"5 M, APdeamAD (línea A)9 deam NAD (B).y NAD(G) en las concentrqcinnes que se indicnnb

tración de nucleótido de 0.45 mMla velocidad de reacción deldeamNADes del 88 por ciento respecto a la del testigo con NAD.

El APADy APdeamADsi bien son reducidos por la enzima, la velo­cidad de reacción sólo alcanza a lO y 18 por ciento respectiva­mente de la correspondiente al testigo; el NADPreacciona conun 33 por ciento de la velocidad de reducción del NAD.Los deri­vados aldehidicos no son reducidos por la NADaldehido deshidra­genasa de levadura. Estos análogos son reducidos quimicamente(62)o por acción de otras deshidrogenasas comola alcohol deshidro­genasa de higado de caballo y de levadura, la láctico deshidro­genasa de corazón de vacuno y de músculo esquelético de conejoy la glutámico deshidrogenasa (65), aunque en la mayoria de loscasos reacciona muchomás lentamente que los otros análogos. Quelos análogos con función aldehido no sean reducidos por la enzi­ma no implica que no reaccionen con la misma; en la figura 2 ytabla l se ve que estas sustancias son fuertes inhibidores de lareducción del NAD. Tanto el PyAlADcomo el PyAldeamADinhiben

alrededor del 70 por ciento la velocidad enzimática cuando suconcentración es igual a la del NAD,loque indica que estas sus­tancias forman con la enzima un compuesto inactivo combinándose

a los mismos centros ocupados por el NAD,yaque la inhibiciónque se obtiene es competitiva con el mismo (Figuras 6 y 7).

El APADy el NADPa pesar de ser reducidos por la enzima

son también inhibidores de la reacción con el NADdado que loscompuestos que forman con la enzima son reducidos más lentamen­te que el compuesto del NAD.

Comoen el capitulo anterior, se puede tratar la cinéticade la reacción en forma simplificada, manteniendo constante laconcentración de uno de los sustratos del sistema enzimático yvariando la concentración del otro. Este tratamiento permitecalcular los parámetros de la ecuación de velocidad respecto alNADo al análogo; representando la recíproca de la velocidadinicial de la reacción en función de la recíproca de la concen­tración del sustrato variable (nucleótido); se deben obtener rec­tas a partir de las cuales de acuerdo con el método de Linewea­ver-Burk (41) se puede calcular la velocidad máximade reducciónde la coenzima en el compuesto activo ternario cuando la misma

satura la enzima y la constante de Michaelis aparente del com­plejo enzima-NAD.

1'0 1

FLGURA 4

- . c -¡ . J[D/nuc/eot/c/OHMX 70)Oxidación enzimática del acetaldehido con NAD.deamNAuyAPdaamAu0.12 mg de proteína disuélta en 3 m1 de Tris 0.1MlpH8.0, en presencia de 01K 0.05 M, cistefna L mm, acet—'aldchldo 17 x 10"5que se indlcun. ¿PdeamAD (línea n), NAD(B) y deamNAD(C).

M, y bucleótido en las concentraciones

FIGURA 5V

40

_v“‘x70"z

L, l l l l

1o 30 J 5;)xíO/[0' Ïo r'c/J'fiOxidación enzimática del acataldehido_con NAD.NAQBy‘APAD.Gendiciones experimentales iguales que en ‘figura 4, 0,24 mg deuproteína «(ïíneas B.C) y 0.8“ ":

(líneas A,D); NAD( lineas Byüj, NADP(C) y “IAB {A,.Línea A, ordenada derecha; líneas 8,0 y D ordenada izqui«‘r.a'

3.0"

pr­

103

1.31GURA S

[J¡- __

CO

-—— ' .­

Ó

¡—­J l l l l

5 1o 15 20 25 30

[NA 0/ 7M)? 103/Acción del PyAlAD sobre 1% úotividad de la NADaldehidñ ieshi­droq351ïn ¿e Íuvwíwéñ. 0.1% üg ¿e proteína flinweltn en 3 mific Tris 0.1M pH 9.0, en DTQSCÜCÍHde ClK 0.05 M,‘ci:teínq Ï mm,¿hetnïdehido 17 x lO"D My NnDen las cancentracinqes que meindican v kwnlau (my) 0.25 (línea A), 0.05 (B) y O (C).

EULHEÉLZ

I I I l 1O

6.0.. _

A

5.0- _B

ho . ._

A C

3.o_ I _

O

¿0__ ’ I l) ._

1.o_ A _ __O

I‘4/" L l I 1 l

4° [NÁ‘bf’lfí‘x 16‘17ácción del EynlieamnD sobre la ncnividnd de la NADalde­hido deshiárogenasx fic levaüurn. Condiciones experimcnt ­les iguales ¿ze on 11 guru ó. PyAlienmAD (mM)0.2L (lí­fi.

w...J...l{ma A), 0.05 (B), 0.03 Ko) y o (u).

Las figuras 4 y 5 muestran los resultados que se obtienen cor

dos preparaciones enzimáticas distintas. Los valores de Kmpara elNADvarían ligeramente y los valores de Kmde cada análogo debencompararse con el Ki del NADen el experimento respectivo. De la figura 4 se obtienen los siguientes Km (x 10- M) NAD2.1, deamNADO.E

y APdeamAD1.98. Los valores relativos de Vmconsiderando 100 al N1son deamNAD53 y APdeamAD16; es decir los análogos tienen mayor

afinidad por la enzima que el NADlo que explica porqué el deamNADalcanza antes la concentración de saturación.

De la figura 5 se calculan los siguientes valores, Km(x10-4NNAD, 4.7-4.8; NADP1.1 y APAD5.3 Vm (considerando 100 el NAD) NADI50 y APAD. 6.1.

Comoel PyAlADreacciona sumamente despacio-y el PyAldeamAD

\‘no es reducido por el sistema enzimático no se puede calcular directamente las constantes de sus complejos. Dado que estas sustanciasson inhibidores competitivos del NADse puede calcular su constante

de inhibición (K1), que es la constante de disociación del complejcenzima-inhibidor. La determinación de Ki involucra mediciones de velocidades iniciales con distintas concentraciones de inhibidor ysustrato; su valor se puede determinar de varias maneras: a) Si serepresentan los resultados de dos series de medidas en-las que sevaría la concentración de sustrato, una en ausencia de inhibidor yotra en presencia de una concentración constante del mismo, se vana obtener lineas rectas (figura 6) por el método de Lineweaver-Burk

(41). a partir de las cuales se puede calcular Kmy Kp (constantede Michaelis aparente del complejo enzima-sustrato en presencia de

inhibidor) que se define como K5 = Km ( l - i ) ; K se puede ca]icular a partir de la expresión Ki==Ï-¿-- .1 b) Mediante el meto"

.2 — 1Km

do gráfico de Dixon (43) que da Ki directamente. Si se determinanlas velocidades a distintas concentraciones de inhibidor mantenien­do constante la concentración de sustrato, se obtiene una línea recta cuando se representan las inversas de 1a velocidad (ordenadas)en función de la concentración de inhibidor (abcisa). En el caso deinhibición competitiva se determina una segunda serie de valorespara otra concentración de sustrato, cuya representación correspon­de a otra recta que corta la primera comose ve en la figura 8. El

r‘IGURA 8'

z -n.25 0 0.25 0.5

[PyA/AD]x(Mx10 JDetermingción de la constante de inhibicióndel comblejofenzimañPyAlAD (método de Dixon).Condiciones experimentales iguales que en lafigura 6.

punto de intersección corresponde directamente a - Ki. Medianteeste método el Ki calculado para el PyAlADes de 2.7 x 10-4M (fibgura 8). valor que coincide con el obtenido por el método anali­

tico (KÑAD= 3.5 x 10-4M). Procediendo«1e la misma manera con el

PyAldeamADse tiene Ki = 0.9 x 10-4M.A fin de establecer cuales componentes del NADson los res­

ponsables de la unión con_1aproteina catalitica se ha estudiadola acción que tienen sobre la;actividad enzimática los distintoscomponentes: AMP,ADP, ATP, NMN,nicotinamida y pirofosfato. En

la tabla 2 se resumen los resultados obtenidos; se ve que lostres mononucleótidos son inhibidores aunque en grado diferente;el más eficaz es el AMP.“Tambiénla adenina es un inhibidor de

1a reacción enzimática. Llamala atención que si bien la nicoti­namida actúa como inhibidor la NMNno lo es. En cambio dos basespiridinicas, la picolina y la piridina tambiéninhiben pero enmenor grado que la nicotinamida. No son inhibidores el pirofos­fate y el fosfato.

El estudio cinético de 1a acción de estos inhibidores in­dica que los nucleótidos de la adenina son inhibidores competi­tivos del NAD;rectas convergentes sobre un punto de la ordenadao sea velocidad máximainvariable, aumento de pendiente lo que

Conduce a un aumento de Km(figuras 9, 10 y ll). A partir de losdatos de las figuras correspondientes se pueden hallar los K1res­pectivos de acuerdo al método gráfico de Dixon (43). Estos valo­res son ( x 10-4M), 16 (AMP), 19 (ADP) y 20 (ATP), valores pró­

ximos entre si pero mayores que los correspondientes al NAD(3.1, 5.0 y 6.6 en los respectivos experimentos). Las dos basesconstituyentes del NAD,adenina y nicotinamida también inhibenla reacción en forma competitiva respecto del NAD(figuras 12 y

13) siendo los K1 para la adenina (50 x 10-4M) y para la nico­tinamida (43 x lO’éM). Tambiénla piridina es un inhibidor com­petitivo del sistema enzimático (figura 13).

Efecto de la constitución de la coenzimgsobre la reacciónde la enzimg con el acetaldehigg. Manteniendo constante la con-icentración de coenzimay variando la concentración de acetalde­hido si se representan las actividades en función de la concen­tración del sustrato se obtienen curvas que en el caso del NADy del deamNAD(figura 14) presentan un máximo; con los otrosanálogos, APADy APdeamAD,no se encuentran máximos. A los da­

Tabla 2

Influencia de los cquonentes del NADsobre la actividgg de laNADaldehido deshidrogenasa de levadura.

Proteina disuelta en Tris 0.1 MpH 8.0 en presencia de ClK0.050M cisteína mm,NAD0.45 mm, adiciones en las concentraciones in­dicadas y acetaldehido 17 x lOMSMagregado al final.

Exp. Enzima Adición Actividad Inhi­

(ug) ¿3B34ox103 bi;iónmin.

A 72 -- 344 -­

A 72 AMP 2.3 mg 188 45

A 72 AMP 5.o mM 163 51

A 72 -- 280 -- |

A 72 ADP 1.8 mg 215 23

A 72 ADP 3.7 mE 174 38

A 72 ATP 1.3 mM 202 28

A 72 ATP 3.1 mM 186 34

B 52 -— 408 ——

B 52 Adenina 20 mM 94 77

B 52 Picolina 20 mm 325 20

B 52 Nicotinnmida 2o mm 293 28

B 52 Piridinu 20 mm 352 14

C 27 -- 234 __

C 27 NMN 5 mM 246 -6

D 46 —— 12o ——

D 46 Pirofcsfatc 10 BM 130 -8

E 20 -- 330 -—

20 Pirofosfato 50 mg 330 O

E 2o Fosfato 50 mM 33o o

1 0 9

315 o

3c>__ .__

A

2¿5L_ ..

B

l5__ ._

IO___ C _

0. _ o __5 4¡¡' I

4: ­1 l l l l l l l I l l l l

5 1o

-{ _¡[NAD] fo 10’}

Influencia del AMPsobre la actividad de la BADaldehido deshi-«drogenasa de levadufao 0°14 mg de proteína disueltaáeñ 3 m1 deTris 0.1 M pH 8.0, en presencia de CIK 0.05 M. cisteíná 1 mH..HaDen las concentraciones indicadas, acataldehido 17 x lo"5 Iy AMP(mm): 500 (línea A) 2.3 (B) y o (C).

0.5

110

I I I l Ï' T Í I Í I I I T

A "B- -4

. I

A

- I/’Il l l l l I l l l l J l l

5 d q lo[NA D](Mx10)

actividad de ïv Nhfi widcwiininfluencia del «DPsobre la:xpvr1.xdoshidrogenasa de levadura. iguales C0flïïx1”fl””

tales que la figur; 9. “DP (mb) z 3.7 ilínzu A), 1.‘(B) y 0 (C).

GH

¿Ágüfigwll

10"

5 4 1o[NAD] (M'x103/

Influencid del ATPsobre la actividad de la NADa;qehido des­hidrogenasa de levadura. Genciciones experimentales igualesque en la figur¿ 9. ATP (mm); 3.11 (línna A), 1.33 (B) y O (G).

'10"

-{

VX

3.0- , -—

— -—­

P _

L- -—­

lllllllllllll125145678! lo-4 3 ­

[NAD] ./'/O .M /qdeninu sobre la actividau de ía NADal­Influencia de la

levadura. Condicinnos experimen­(mN); O (línea A).

áehido deshidragennsa detales imuales que en la fiqua 9. ¿dañina5 {B} y 10 (C).

SEGURA 1':

V'IX10"

40 20 30 ha 50 60

[NAD]"/M'x íO’ÍLuiLuencia de la nicotinamida y la piridina sobre la acti­vidad de la NADaldehido deshidrngenasa de levadura. Condi­ciones experimentales iguales que en la figura 9. Proteína7O/Á5. Testigo (línea A); piridina 50 mm(B) y nicótinqmiáa50 mm (C).

tos obtenidos se les puede aplicar el tratamiento de Michaelis­Menten (44) si bien con altas concentraciones de aeetaldehido haydesviaciones que requieren un tratamiento particular (40,66). Las

rectas correspondientes permiten calcular el Kacet y la Nmde lareacción. Los resultados que se obtienen en la figura 15 indicanque las constantes de disociación de los complejos enzima-acetal­

dehido varían significativamente según el nucleótido. Los Kacetson (x 10‘5M) NAD, 1.1; deamNA'D, 1.4; APA'D, 6.3 y APdeamAD, 8.o.

Las velocidades máximasaparentes de la reacción también variansegún el nucleótido asi para NADconsiderado lOO corresponde 13.3(deamNAD), 10.3 (APdeamAD) y 10.5 (APAD).

Comportamiento del NLD, análogos y componentes del mismofrente a la acción de los reactivos de tioles.

Stoppani y Milstein (8) demostraron que el NADes un pro­tector de la aldehido deshidrogenasa de levadura frente a la ac­ción inhibidora de los reactivos de tioles. Se quiere ver quefracción de la coenzima es la responsable de la protección. Paraello se ensaya el comportamiento de los distintos análogos y mo­nonucleótidos del NADfrente a la acción del o-iodosobenzoato ydel óxido de melarsen. Los resultados se resumen en las tablas

3 y 4. Actúan como protectores el NAD,NADPy aquellos análogos

que no son reducidos por el sistema enzimático, PyAlADy PyAldeam­AD, siendo el segundo mucho más eficaz. El deamNLDprotege, pero

en menor grado frente al O-iodosobenzoato; con el óxido de melar­

sen se comporta igual que el NAD. En cambio el ¿PAD y APdeamAD,

que son reducidos por el sistema enzimático, no sólo no protegena la enzima sino que aumentan la inhibición por los reactivos detioles utilizados. Los mononuoleótidos adenílicos actúan comoprotectores, el piridínieo es muchomenoseficaz.

Acción de la hidroxilamina sobre la actividad de la NADaldehido deshidrogenasa.

Kaplan y Ciotti (67) estudiando el mecanismode la alcoholdeshidrogenasa de levadura observaron que la hidroxilamina es unfuerte inhibidor de la enzima. Se ensayo la acción de la hidro­xilamina sobre la NADaldehido deshidrogenasa y se obtuvo unainhibición relativamente baja, alrededor del 15%, cuando la coen­zima_del sistema es el-NAD o el deamNAD,en cambio si se los

reemplaza por APADo APdeamAD,la inhibición observada es del 90%,

para una misma concentración de hidroxilamina (lO mM)(Tabla 5).

v‘IGURrLlí

Í l l l l l l I

>)0r- ¡q .­

200- __C

g 180- 8 —

S2 140- _

>< 120“ _O

¡JNEKlOO '­

<1 80 _

60 _

4o C

2 A ,0 __J l l l l l

[Aceta/c/eh/c/OJX 10'77

lnfïuonciq GCla COnCQntraciónde ncetaldehido sobre laactividad de La NADxldehidn deshidrogenasa. 46/4g deïrntefna disuelta en 3 m1 de Tris 0.1 MpH 8.0, en pre­sencia de 31K 0.05 M, cisteína l mM,dinucleótidos 0.45m? : NAD {línea A), daamNAD (B), aneamAD (U), y ABAJ(J). acotaquhido en la concentracián indicada.

1.5

2.2

¿.0

1.8

1.6

1.4

12

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

70"

-1VX

FIGURA 15

o . g/ C­_ A 0 ¿q

1'1 n í l l 111o zo 30 ¿40 so ¿o 70

[Aceta/c/eh/do]"4x 703)

80

- .- ­

I ..¿J 1.1),

acetiAÍCÑlJO. Jondiuionks oxpera u.;urw. ,. _¡ ,‘IV‘ w ly‘v L ‘_".¡ . .1!"l: 11¿:'=íï‘.i; . Lunes mu); ..¿ ¿3, -.»;\¡..A.\!,\JJ;lg ;\. l n .,' . , . A ,- . ‘ . ,3 .NAD; 1.151641 4.), :‘xI‘J'Ïinih al). Luxmeus n J 4.1 AI. ,12 112“! :3 l

‘ r l ‘ _ . ‘ . ‘V ‘ . ' m ,wï,recna, LlULiS u y B OFdUUJuJ n ¿4 31QAlcauu.

116

leí NnDsobre el complsgo enzima-h.‘- jI:.¡Ïe‘aI: ¿zw Ir;

. TABLA 3

¿gpión del NAD.ggálogos y componentes 931 mismo. sobre la inhi­g¿ción de la NADaldehido deshidrogquga de levadura por o-iodo­

sobennggg0.6 mg (exp. Ay B), 1.7 mg (exp. C) y .8 mg (exp. D) de proteí­na disuelta en 0.5 ml de Tris 0.1 MpH .0, se incuban con lasadiciones indicadas durante 30 segundos. La actividad se mide en 0.00.02 ml de la mezcla de incubación.

. Activ. e z. Inh. Prot.Exp. Ad101ones AE} ¡lo min (%) (%)40.

A Ninguna 76 -— -—A o-iodosobenzoato 0.12 mM 32 58 -­A NAD 1.3 mM . 76 —- -­A o-iodosobenzoato O.12mM+NAD1.3mM 54 29 50A APAD 1.3 mM 75 —- -­A o-iodosobenzoato O.12mM+APAD1.3ÜM 26 65 —­A APdeamAD 1.3 mM 93 -- -­A o-iodosobenzoato o.12mM+APdeamAD1.3mM 36 61 -­B Ninguna 80 __ __B o-iodosobenzoato 0.12 mM 33 59 -­B PyAldeamAD 2.6 nM 90 —- -­B o-iodosobenzoato 0.12mM+PyA1deamAD2.6mM102 —- -­B PyAlAD 1. 3 mM 93 ._ -_B o-iodosobenzoato 0.12mM+PyAlAD1.3mM 60 35 40C Ninguna 115 -- —­C ' 'o-Ioúoaobonzoato 0.12 mM 64 44 —­C NAD1.3 mM 120 -- -­Co- o-iodosobenzoato 0.12mM+ NAD1.3 mM 102 15 66C NADP0.7 mM 110 -- -­C o-iodosobenzoato 0.12mM+ NADP0.7mM 96 13 70C' deamNAD0.4 mM 119 -- -­C o-iodosobenzoato 0.12mM+deamNAD0.4mM 78 35 20C AMP 1.3 mM 102 -- -—C' o-iodosobenzoato O.l2mM+ AMP1.3 mM 66 35 20C ADP 1.3 mM 108 -- -­C o-iodosobenzoato 0.12mM+ ADP 1.3 mM 78 28 36C ATP 1.3 mM 102 —- -­

o- iodosobenzoato 0.12mM+ ATP 1.3 mM 78 24 455 Ninguna 130 -- -­D o-iodosobenzoato 0.12 mM 33 75 -­D NMN 5 mM 136 -- -­D o-iodosobenzoato 0.12 mM+ NMNSmM 55 60 20

TABLA 4

Acción del NAD,análogos y componentes del mismo, sobre la inhibi­ción de la NADaldehido deggidrqgenasa de levadura por oxido demelarsen.

1.7 mg (Exp. A y B) y 0.6 mg (Exp. C) de proteina disuelta en0.5 ml de Tris 0.1 M, pH 8.0, se incuban con las adiciones indi­cadas durante 30 segundos. La actividad se mide en 0.02 m1 de lamezcla de incubación.

Activádad Inhibi- Protec­en21m 10a\ ción ciónExp. Adiciones (Éííláoxlo3) % %mln. ­A - 118 -— -­

A Melarsen 0.015mM 66 45 __

A NAD 1.3mM 120 _— ——

A Melarsen 0.015mM+NAD1.3mM 76 37 18A ABAD1.3mM ‘ 119 -- -­

A Melarsen 0.a'015mM+.A.PA.D1.3mM 55 54 ——

A APdeamAD 1-3 mM ' 120 __ __

A Melarsen 0.015mM+APdeamAD1.3mM 30 75 -­

A PyAlAD 1.3mM ’ 118 -- -­

A Melarsen 0.015mM+PyAlAD 1.3mM 70 40 12

A PyAldeamAD 2.6mM 118 —— —­

A Melarsen 0.015mM+PyAldeamAD 2.6mM 88 26 42A DeamNAD 0.4mM _ 120 -— —­

A Melarsen 0.015mM+deamNAD0.43 M 90 25 45

B —— ' 122 —— —_

B Melarsen 0.015mM 60 51 -­B NAD 1. 3mM 114 __ __

B Melarsen 0.015mM+NAD1.3mM 80 30 41

B DeamNAD 0.4mM , 128 - -—B Melarsen 0.015mM+deamNAD0.umM 93 27 47

B NADP 0.7mM ' 128 —— —­

B Melarsen 0.015mM+NADPO.Hflfl 100 22 57

B AMP 1.3mM _ 128 —— ——

B Melarsen 0.015mM+AMP1.3mM 88 31 39B ADP 1.3mM ‘ 132 —- ——

B Melarsen 0.015mM+ADP 1.3mM 78 41 20B ATP 1.3mM - 130 -— —­

B Melarsen 0.015mM+ATP 1.3mM 76 41 20

c —— 180 —— ——

C Melarsen 0.015mM 100 45 -­C NMN SmM 170 -- ¿­0 Melarsen+NMN SmM 100 41 9

Si se hace un estudio cinética de la acción de la hidroxi­

lamina viendo que efecto tiene una concentración fija de la mis­ma sobre las pendientes e intersecciones con la ordenada, de gra­ficos de velocidad inicial de acuerdo al método de Lineweaver­Burk (41) se obtiene, cuando el sustrato Variable es el NAD,deamNADo APAD,pendientes invariables con aumento de ordenada

al origen, es decir gráficos paralelos, lo que corresponde a unainhibición incompetitiva (46), la velocidad máximaaparente dis­minuye por el mismofactor que la constante de Michaelis aparen­te (figuras 16, 18 y 20). La eXplicación de este tipo de inhibi­ción es que el inhibidor se combina solamente con el complejo ES.

Si el sustrato variable es el acetaldehido, los gráficos que seobtienen son, para el NADcomo coenzima (figura 17) y para eldeamNAD(figura 19) del tipo de una inhibición mixta competitiva­no competitiva. casi puramente competitiva, en cambio cuando elsistema enzimática actúa con el APAD(figura 21) la inhibiciónobservada es del tipo competitivo, es decir la hidroxilaminabloquea el centro de unión del acetaldehido.

Acción de los aldehidos sobre la actividad de la NADal­_ghido deghidrogenagg de levadura.

Para completar el estudio del comportamiento de la enzimafrente a sus sustratos, se revisó la especificidad de la mismacon distintos aldehidos. Se ensayaron el benzaldehido, glicolal­dehido. p-metoxibenzaldehido (anisaldehido). gliceraldehido, sa­licilaldehido y p-dimetilaminobenzaldehido¡ los resultados seresumen en la tabla 6. Se ve que de los aldehido ensayados seoxidan el benzaldehido, glicolaldehido y anisaldehido. En cambioel slicaraldehido no es oxidado, contrariamente al comportamien­to de la aldehidc deshidrogenasa de higado. que lo oxida con unavelocidad doble a la del acetaldehido. Tampocose oxida el sa­licilaldehido, ni el p-dimetilaminobenzaldehido. La enzima ade­más oxida al prOpionaldehido. butiraldehido y crotonaldehido(2,68). En la tabla 7 se resumen los datos que se obtienen cuan­do se agregan al sistema enzimático simultáneamente acetaldehi­do y cada uno de los aldehidos indicados. Se ve que excepto elgliceraldehido, los demásinhiben la reacción enzimática en ma­yor o menor grado; asi el pédimetilaminobenzaldehido a pesar deno ser oxidado por la enzima. inhibe totalmente la actividad dela misma cuando su concentración en el sistema enzimático es de

Tabla 5

cción de la hidroxilamina sobre la actividad de la NADaldehidoü. _.—-A.——.-—.-.——-oun-..“

deshidrogqugg de levadura.un;0.21 mg de proteína disuelta en 3 ml de Tris 0.1 MpH 8.0, enpresencia de ClI 0.05 M. coenzimas 0.45 mm. cisteína l mme hi­droxilamina en las concentraciones que se indican. Acetaldehido

517 x 10' M se agrega a1 final. Las actividades enzimáticgs se

expresan como (¿333401103)/hin.

Hidroxil- NAD deamNAD APAD APdeamADamina

¿Ct- 1 AO". I ¿etc I A030 Im“ 0m- 5 ens. 'p' enz. fl enz. 2%

no- 386 .- """ 87 a "‘‘0.05 -- -- -- -- 72 17 97 180.1 o- o- -- - 61 29 92 230.5 -— -- - -- 60 30 86 281.0 -- -- 495 4 49 43 79 34

10.0 340 12 422 18 3 91 15 87

1/"x70'Z

1“ 1 HF45 4'} {.n 4.1,)

v‘n'illrwaïmcu .n K,¿I'ííu <f(>*‘¡('.'ei*.512f"¿iÍ-’)'“‘L‘aíz: "e .4. tu."

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¡"iluU RA 17

V"x70"

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[Aceta/c/ehic/OJYM'X 10’)1EÍIHG*Ü13 d” la\_ hldr0x1laninñ sobre la actiVide mv; .ÏL‘”n varias concentrqciones de acetaldehido. 0.21 ma denq Aiouoltq bn 3 T1 :3 Iris'0.1 K pH9.0. en presencip.05 fl, cisteína .3, NAD0.í5 mM,aceiqïdehi4n en la. CÓR­ccntrzcinntn qu; se inA). 0 (B).

{101? e Hidrnxiïwmjnn (mV): ¿0 (línea\

a de ÉL

q

FLGURA 18

lO

[c/eam NAD]“(M"x 70’)InflJencla de L: uidrowllaminu sobre iq actividad en­zlmítica a varias concentrac:ones de deamNAD =. “.91mg de prñteína tisueïta en 3 ml de Iris 0.1 MpH 8.0,en vmsgxug. cg. .21 0.05 rn. cisíteína 1 mm, acetaldehido17 x lO JM. deañNau en las concentr1c40nes que se i ii»can e Plirnxilixjna (mm) : lO (línga A), O (B).

IO

V"x10"

¿10mm 12

12

60 80

[Aceta/c/eh/c/OJTM'X 70’)Cia

100 120

Influen de la hLdPOXiÏuminasohre la actlvidad enzlmïvarias conecntracinnes de acañu'dehido.

3 ml de Tri: 0.1l díñí?1ï.'li"vlri.u O . 415 1T?N. ,

se indiCun

0.21 mg de prapH8.0. en presencia

acetaldenidn en10 (¿Í

7' xJim .

CentraC1ones hidrox114mína (mm):() (13) .

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L"I(}URA ¿"O

llllllll10

[AP/¡DJYM'X 10’)Influencia de la hidroxilumina sobre la actividad

1.? 14 16 3m

enzimítica a varias concentrac1nnes de :u'úD. 0.?5mg:de proteína disuelta en 3 ml de Iris 0.1 pH8.0, en mesencia de 01K 0.05 Fw,cisteíaa l mm,acetaldehido 17 y; 10-52%, Aval) en las Cr>ncentrac1o—nes que se indican e hidroxilamina (mïaí): 10 (11'­1ea A). O (B).

.1 f‘ (w .1'ÁH .‘Ïw l L___ ..___

de70d

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20 40 60 80 100 120

[Ace talc/eh/dofÏM'} 10’)1 ‘v.‘ ¡»n .'-, ‘L h_w,zuizgx a ut: VLu _ . . ‘.‘4. '.." ‘ .¿mïrox*13m1uuwoïte L. ícïledkv &.“1­

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. _, _¡ r \ #0 P H}, C [11‘].

17 x 10-5M.El salicilaldehido es también un inhibidor pero enmucho menor grado. Los demás aldehidos si bien actúan como sus­tratos de la enzima, son inhibidores de 1a reacción enzimáticapor cuanto son oxidados a menor velocidad que el acetaldehido.

E1 estudio cinético del conportamiento de los distintos al­dehidos activos, de acuerdo a1 tratamiento de Linaweaver-Burk

(41) de los valores de las KInparará. NADcuando se varia 1aconcentración de la coenzima y se mantiene constante la de losdisitintos aldehidos (figura 22). Estos valores son (x 10-4M)4.34 (acetaldehido), 0.5 (benzaldehido) y 1.14 (glicolaldehido).Las velocidades muximassi se considera 100%el correspondientea1 acetsldehido son: 18%para el glicoldtdehido y 12%para elbenzaldehido.

Si se mantiene constante la concentración de NADy se va­

ría la de los distintos aldehidos, se tienen los Kald respecti­vos (figura 23), que son par; el acetaldehido de 6.6 x 10"5 Mpara el benzaldehido de 7.3 x 10-5My para el glicoluldehidode 4.3 x 10“4

100%para el acetaldehido, 13%para el benznldehido y 10%para

M. Las velocidades máximas están en relación de

el glicolaldehido.Si al sistema enzimático con acetaldehido se le agregan

distintos aldehidos; anisaldehido y benzaldehido que son oxida­dos por la enzima y p-dimetilaminobenzaldehido que no es oxida­da, se obtienen las rectas de la figura 24. El benzaldehido dis­

minuye el valor del Kacet de 2.0 x 10-5M (sin benzaldehido) a1.75 x 10’5M (benzaldehido 2.5 x 10‘4M) y 1.94 x 10’5M (benzal­

dehido 10 x 10'4M). El anisaldehido aumenta el valor del Kacctque pasa de 2.0 x 10-5M (sin agregados), a 11 x 10'5M (anisalde­hido 2.5 x 10’4H) y 7.7 x 10‘5M (anisaldehido 10 x 10’4M). Cuan­do se agrega p-dimetilaminobenzaldehido tambien aumenta el va­

lor del Kacet;tración del inhibidor, asi K

-5 . 1 . “cet . -5 -57.3 x 10 M (p-dimetiiiminobenzaldehido 10 M) y 8 x 10 M (p­dimetildminobenzaldehido 5 x 10‘5M).

aumento que se hace mayor para una mayor concen­

es de 2 x 10-5M (sin agregado),

DiscusiónTodos los análogos ensayados se combinan con la NADalde­

hido deshidrogenasa, es decir la enzima es capaz de formar com­plejos con sustancias de estructura análoga al NADen la

TABLA 6

Acción de los aldgg;dos sobre la activngd de la NAD-aldehidodeshidrogenqgg de levadura.

32 pg de proteína disuelta en 3 ml de Tris 0.1 M, pH 8.0 enpresencia de ClK 0.05 M, cisteína l mM,NAD0.45 mMy las adi­

ciones que se indican.

Activ.enzimát. Activ.respec­¿¿E 4o x 103 to al testi­___l________.Adiciones

min. go con acet­aldehido

Acetaldehido 17'x 30" M 276 160Benzaldehido 17 x 10-5M- 108 39

Glicolaldehido 17 x 10'5M 72 26

Anisaldehido 17 x 10’5M 3o 11

Gliceraldehido 17 x 10'5M o5Salicilaldehido 17 x 10' M

p-dimetilamino benzaldehido 17 x 10-2M O

TABLA 7

Acción de los aldgpidos sobre la actividgg de la NADaldehido ¿e2_hidrogqusa de levadura.22%g de proteina disuélta en 3 ml de Tris 0.5 MpH 8.0 en presen­cia de ClK 0.05 M, cisteína l mM,NAD0.45 mMy las adiciones quese indica.

Adiciones Actividad Act.respecto Ienzimátic al testigo %E ,10 con acet.

3É9n

Acetaldehido 17 x 10-5M 272

Acetaldehido 17 x 10-5M + _5gliceraldehido 17 x 10 M 256 94 6Acetaldehido 17 x 10-5M +

gliceraldehido 8.6 x 10 284 —- —

Acetaldehido 17 x 10"5 M + _5glicolaldehido 17 x lO M 276 —- ­

Acetaldehido 17 x 10—%M+ _glicolaïlehido 8.6 x lO 224 82.4 17.6

Acetaldehido 17 x 10’5M + _5benzaldehido 17 x 10 M 206 76 24

Acetaldehido 17 x 10'5M + _4benzaldehido 6.6 x 10 M 152 56 44

Acetaldehido 17 x 10’5M + _5anisaldehido 17 x 10 M 211 77.6 22.4

Acetaldehido 17 x 10’5M + _4anisaldehido 6.6 x lO M 119 43.6 56:4

Acetaldehido 17 x 10'%M + _5salicilalde: 17 x 10 M 240 88 12

Acetaldehido 17 x lO’áfl + _salicilald.'6.6 x lO 4M 190 70 30

Acetaldehido 17 x lo’am + _5p.dimetilamino benzald. 17 x lO M 0 O 100

Acetaldehido 17 x 10—%M+ _5p.dimetilamino benzald. 8.5 x lO M 20 7.35 92.55

Acetaldehido 17 x 10“%n + _5p.dimetilamino benzald. 4.2 x 10 M 78 29 71

ElGUHA 22

V"X70'z

[NADJ" (M'x 10’)

Acción de los aldehidos sobre la actividad de la NADaldehido deshidrogenaaa de levadura. 32 Lg de prote­ína disuelta en 3 ml de Iris 0.1M pH 8.0. en presen­cia de ¿1K 0.05 m, cisteína l mM,NADen las concen­traciones que se indican y aldehido 17 x lfi-5M; gli­:olaldehido (línea A), benzaldehido (B) y acetalde­«ido (C).

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cual los grupos amino en la adenina y carboxamida del anillopiridfnico han sido reemplazados por hidróxilo y acetilo o al­dehido respectiVamente. El hecho de que se formen estos comple­jos no significa que todos los análogos puedan reemplazar alNADen el sistema enzimática; solamente el deamNAD,APADy AP­

deamADson reducidos por la enzima. El PyAlADy el PyAldeamAD

son totalmente inactivos. Esto indica que si bien la unión dela coenzima con la proteína no depende fundamentalmente de losgrupos amino y carboxamida, los análogos del NADse combinancon la proteina catalitica en grado aproximadamentesimilar alNAD, es más aún, el deamNAD, el APdeamADy el NADPaparentemen­

te forman compuestos más estables que el NAD,en cambio para la

reducción de la coenzima la presencia del grupo carboxamida enel anillo piridinico parece ser importante, pues con la enzimasaturada las velocidades de reacción del APADy del APdeamAD

son 7.7% y 15% respectivamente de la que se obtiene con NADy con los derivados aldehidicos no hay reducción. El grupo a­mino de la adenina no parece esencial pues con deamNADse obtie­ne más del 50%de la actividad hallada con NADy con los ace­tildcrivados da mayor actividad el APdeamAD.

Comparandoestos resultados con los obtenidos con otrasdeshidrogenasas se observa que no todas tienen la mismareac­tividad con los análogos (65, 69, 70, 71), asi la alcohol des­hidrogenasa de levadura reacciona con el APADcon un 10%de lavelocidad correspondiente al NADy el PyAlADreacciona a unavelocidad considerablemente menor, con la enzima de higado decaballo el APADy el PyAlADreaccionan más rápidamente en con­

centraciones de saturación que el NAD.La láctico deshidragena­sa de corazón de vacuno reduce más rápidamente al PyAlADque al

APADmientras que con la misma enzima de músculo esqueléticode conejo la reacción es más favorable con APAD.La diferenciaen respuesta de los análogos aún a las mismas deshidrogenasasde distinto origen sugiere la posibilidad de que existan peque­ñas diferencias en su mecanismode acción o en su estructura.

Con gliceraldehido fosfato deshidrogenasa de músculo y de leva­dura, enzimas específicas para el grupo aldehido, se tiene queel APADreacciona con ambos, sin embargo el PyAlADno tieneactividad con ninguna de las dos, a pesar de ser un fuerte in­hibidor de ambas enzimas. Este comportamiento es análogo al ob­

eervado con la NADaldehido deshidrogenasa de levadura. De loanterior se deduce que la falta de reactividad observada conlos análogos aldehidicos no es una propiedad inherente a losmismos (65), más bien podria pensarse que el grupo aldehido dela coenzima se une a un centro de la enzima esencial para lacombinación del grupo aldehido del sustrato (70).

Se puede llegar a la conclusión de que la actividad de laaldehido deshidrogenasa con análogos del NADdepende de la ve­locidad de reducción de la coenzima más que de la posibilidadde formar el compuesto análogo-enzima, ya que tanto el deamNAD

como el APdeamADy el NADPtienen Km menores que el NKQno obs­tante lo cual la velocidad de la reacción es considerablemente

menor. También el PyAlAD y el PyAldeamAD, de acuerdo a sus Kirespectivos, muestran una mayor afinidad por la enzima que elNAD,a pesar de lo cual no son reducidos.

El NADestá formado por dos nucleótidos: el ADPy el NMN,

de acuerdo con la acción inhibidora de los mismos y de sus com­ponentes, el adenilico se une más firmemente a la enzima. Elgrupo pirofosfato parece influenciar de alguna manera la unión

de la adenina dado la diferencia entre el Ki de la misma (50 x10.4M), que disminuye notablemente en los nucleótidos (16-20 x10-4M). Tanto la adenina comolos nucleótidos son inhibidorescompetitivos del NAD.El pirofosfato no tiene acción inhibidorafrente al NAD,si bien posiblemente se una a la enzima dado queactúa comoprotector de la mismafrente a la inactivación por1.10-fenantrolina. A pesar de que el nucleótido piridinico notiene acción inhibidora, la piridina y la nicotinamida si latienen, además exageran fuertemente 1a combinación del nucleó­tido adenilico lo que se pone en evidencia por el menorvalor

del KNADsuponer por lo menos dos puntos de unión entre la coenzima y

respecto al KiAMPo KiADP.Estos resultados permiten

la enzima; los grupos correspondientes a la coenzima serian:la adenina y la nicotinamida. Ya se vió en trabajos anterioresque los probables centros de unión de la proteina involucrangrupos - SH (72) y un metal. .

En base a hechos experimentales similares con la alcoholdeshidrogenasas, distintos autores han.propuesto una serie dehipótesis de trabajo para explicar la unión de 1a mismaa lacoenzima.

Van Eys y col. (36) presentan un esquema en el cual elcinc está unido a la proteina por dos grupos sulfhidrilos e­senciales para 1a actividad enzimática. Por adición de la co­

enzima 1a unión Zn - S se disocia,quedando libre cada uno delos componentes para combinarse con el NAD.Dado que se encon

tró que la fracción adenilica (63) y la piridínica (35) afectanla actividad enzimática y ademásse conocia el efecto comple­jante de metales de los fosfatos y la quelación de fosfatos através del ión metal de la proteina (73), van Eys y col. pos­

tularon que uno de los -SH interactúa con el ión piridiniojmientras que el otro puede unirse al grupo amino de la adeni­na (36);poro el pirofosfato se uniria al Zn:

+2 ‘%\\/H N — P — O — P - N+

¿- ¿— s­

\/-'_‘“-¿> \/

La)

zn\\Wallenfels y Sund (51,74)¿;¿ÉSÍ¿á/áápánán áoz‘tioos de u­

nión entre la proteína enzimática y los piridín nucleótidos:a) Complejos metálicos entre las enzimas que-contienen metalesy los piridin nucleótidos, pero a diferencia de Van Eys y Kap­lan (36) postulan que es la parte adenilica del nucleótido laque está unido al Zn dado que encontraron que compuestos quecontienen esqueletos semejantes a la adenina, como8aminoquino­lina actúan comoinhibidores competitivos de la alcohol deshi­drogenasa; desechan la posible unión del Zn al pirofosfato delnucleótido en base a la falta de inhibición por pirofosfato(51, 54) y la poca influencia del fosfato en la unión del NADcon la enzima. b) Reacción de grupos - SH de la proteina conlas coenzimas, La transferencia de hidrógeno es directa, tienelugar sin la participación del solvente y es estereoespecificaen relación a la posición 4 de la nicotinamida del NAD(75. 76)lo que significa que se elimina la libre rotación de la porciónnicotinamida por unión de la misma con la coenzima. Es proba­ble que haya un grupo -SH de la enzima involucrado en estaunión (74,77,78). De los posibles tipos de unión que pueden e­xistir entre -SH enzimáticos y la coenzima, los autores considaran más probable la formación de una unión hidrógeno entre

el grupo -SH de la enzima y el N del anillo piridínico. El esque­ma Propuesta por Wallenfels y Sund es el siguiente:“lcx O\

ü <í;_v’|U dí’N‘\.I/"N

_ N ¡l ,/Of’c-P—0 ‘Iïí' ‘\N

i u | ,4g s2\ Znfl,"‘ ’\ .

, __o- -«

Gr.7 /,\C0NH2 ió t 1' —‘ 0 NfgcoHS-J

' l

HZC 1/ :74

El esquema propuesto por Theorell y McKinley McKee (56)difiere del de Wallenfels (51,74) por el tipo de unión que pro­ponen de la porción piridínica del NAD.Según estos autores elátomo de Zn en la enzima libre está unido por 3 valencias a laenzima, una o dos de las cuales sean probablemente uniones del

tipo S-andado que la unión entre el Zn y la enzima es muyfuer­te (54); formando un complejo octahédrico (49), las tres Valen­cias restantes del Zn estarian unidas a 3 moléculas de agua, unade las cuales a pH alto (86) pierde un protón transformándose

en un grupo - 0H-. En el isómero naturalfBNAD, el anillo piridi­nico debe también estar cercano al Zn, ejerciéndose una atracciónelectrostática entre el OH.unido al Zn y el N del anillo piri­dinico cargado positiVamente, de alli la mayorestabilidad delcomplejo enzima —NADque la del complejo enzima - NADHen el,

que ésta unión no existe.Esquemáticamente el complejo se representa de 1a siguiente mane­ra:

Una serie de comunicaciones (36,70,77,81) indican que lacombinación de una deshidrogenasa, NADo un análogo del mismoy un compuesto nucleofílico resulte en un compuesto de adiciónque tiene un espectro de absorción similar al espectro exhibidopor el complejo enzima-coenzima reducida. Estas sustancias nu!

cleofílicas)en todos los casos dan reacciones de adición conlos nucleótidos en ausencia de la enzima dando complejos que ,­

tionen espectros de absorción similares al del NADH.Los comple­Jos de adición enzimática muestran invariablemento-un corri­miento del máximode absorción hacia las longitudes de ondamás cortas.cuando se los compara con los espectros de adiciónno enzimáticos (82). Un hecho interesante es que sólo aquellascoenzimas que pueden sustituir al NADen el sistema enzimáticopromueven la formación del complejo sobre la enzima. Sin em­bargOola efectividad relatiVa de un dado análogo para reempla­zar al NADen la catálisis y en la formación de complejos noes idéntica. Por ejemplo, el PyAlADes generalmente un aceptorpobre de hidrógeno (65), por otro lado es el análogo que inva­riablemente forma los complejos más favorables. La habilidadde las coenzimas de formar complejos ternarios aparece relacio­nado con su habilidad de formar complejos de adición no enzimá­tico (62) y a su potencial de óxido —reducción (65). A pesarde que una sustancia nucleofilica puede inhibir la reaccióncuando el sistema actúa con NAD,sin que se observe la forma­ción del complejo correspondiente, se obtiene mayor inhibicióncuando el sistema trabaja con los análogos. La magnitud de lainhibición parece estar relacionada al grado de formación decomplejos (82). Esto explicaría los resultados obtenidos; parauna mismaconcentración de hidroxilamina la inhibición observa­da cuando el sistema enzimático trabaja con NADo deamNADes

del 15%, en cambio con los análogos APADy APdeamAD,la inhibi­ción aumenta a 90%. Asimismo la cinética que se obtiene conAPADcomo coenzima es mucho más definida que la que se obtiene

con NADy deamNAD,dada la mayor asociación de hidroxilaminacon el análogo. Por la disposición de las rectas de los gráfi­cos correspondientes se concluye que la hidroxilamina es uninhibidor incompetitivo respecto a la coenzima, pero es competitivo con respecto al acetaldehido. Estos resultados son simi­lares a los obtenidos por Kaplan y Ciotti (67) con las alcohol

deshidrogenasas de hágado de caballo y de leVadura. Burton yKaplan (83) sugieren el siguiente mecanismopara explicar lareacción entre piridín nucleótidos e hidroxilamina: l) El deriva­do piridínico existe en solución comouna estructura en resonan­cia con una carga positiva distribuida entre las posiciones l, 2,4 y 6. De éstas, la posición 4 es la que parece llevar la mayorcarga positiva, comofuera indicado por Pullman y col. (84) pa­ra la reducción enzimática y quimica del NAD.2) El otro reacti­vo, hidroxilamina, pierde un protón para transformarse en un ióncargado negativamente; 3) El reactivo nucleofilico se combinacon el carbono 4 cargado positivamente, del derivado piridinicoformando e] compuesto reducido. Esta secuencia se puede esquema­tizar de la siguiente manera:

1)

+

/\.CONH2 . -—CONH2 ¡Í’ (:0an / —CONHs'-———>l'l"wi-s ¡2‘ 'C‘__—. ' ' + ‘__-_. + ; <_"_- 'V \_/ \.,/

r.“ 15 IN" ¡YR R R R

2)

- ___r, _NH2OH -+ OH .._\.__.. NHOH + HOH

ÑHDH 7,35 NH-Qo‘

3)

/H

H \:></f N"\(xf. \,,_CONH CONH‘2

De los resultados obtenidos por Kaplan y Ciotti (67,77,85);inhibición competitiva de alcohol deshidrogenasa por hidroxila­mina, preincubación de enzima de higado con NADe hidroxilaminaque resulta en un compuesto inactivo, 1a demostración de que elcompuesto inactivo es un compuesto NAD-hidroxilamina, la somosJunta entre s1 corrimiento espectral del compuestoNAD-hidroxil­amina cuando se combina con la enzima con el observado cuando el

NADHse combina con la enzima libre, se deduce que la enzima

combina y activa a 1a hidroxilamina y al NADy que estos reacti­vos actiVados reaccionan para formar el compuesto inactivo. Demanera similar Burton y Kaplan (83) sugieren la hipótesis de quela enzima une y activa al NADy al etanol y que estas sustanciasactivadas reaccionarian para formar un compuesto intermedio quese podria descomponer en los productos de la rsacción NADHy a­cetaldehido. Esta hipótesis se puede representar de 1a siguien­te manera:

HO\ /,*4

H// \\CH¿

HH/ /° H 0=C

/HH. (D H O-C H -1C H

XH/ \CH3 "un" \CH5 + \CH.6coNH¿ coma camu cosa/2,

n —s I y ——\-I J é u\|\l N

I

R 1k

l

\N/ \NnR

Esta hipótesis está de acuerdo con el esquemade Theorell,Wallenfels y Dalziel (57,36,45) en el cual el Zn combina alNADy al sustrato. La hidroxilamina forma sales con sodio, cal­cio y cinc (86) lo cual refuerza esta hipótesis. Tambiéncon­cuerda con el esquema de Dalziel (45) que postula un mecanismode orden compulsivo. La inhibición de tipo incompetitivo haciael NADindica que la hidroxilamina se une al complejo enzima-,NAD.

Estudios cinéticos realizados por Stoppani y Milstein(40,66) tendientes a dilucidar el mecanismode la reacción nopermitieron decidir categóricamente si el sistema se encuentraen flujo estacionario con formación compulsiva del complejoternario en un orden definido o en equilibrio rápido con forma­ción desordenada del complejo, dado que los datos experimenta­les que obtienen, afectados por un error considerable, satisfa­cen las ecuaciones correspondientes a cualquiera de los dos me­canismos. Si bien los resultados obtenidos en este capitulo noson concluyentes, tienden a reforzar la suposición de que elsistema se encuentra en estado de flujo estacionario‘ Estos he­chos son:

a) El tipo de inhibición que se obtiene con hidroxilamina.b) La variación de los parámetros de los compuestos enzi­

ma-acetaldehido con la constitución quimica de la coenzima; siel acetaldehido se uniera independientementea la proteina, el

Kacet seria independiente de la estructura de la coenzima.c) El hecho de que la estructura de los distintos aldehi­

dps oxidados por la enzima afectan al KNAD,no es contradicto­rio con esta hipótesis, por cuanto las mismaspueden afectar

k3, velocidad especifica de descomposición de complejo, constan.te que en el estado de flujo estacionario está incluido en Km

(E+s:]]:_2_3—>EsJL) E+P;Km=—kz;—lk3- ).De las rectas que se obtienen cuando se estudia la ciné­

tica de inhibición del acetaldehido en presencia de otros al­dehidos, anisaldehido, benzaldehido y p-dimetilamincbenzaldehi-“do, no se puede sacar una conclusión clara de la forma de ac­tuar de las mismas. Al no haber una inhibición competitiva neta,no se puede afirmar que estos aldehidcs actúan sobre el mismocentro catalitico que el acetaldehido,pero tampocose puededeshechar que esto ocurra, unido a una serie de efectos secun­darios, por cuanto hay una diferencia estructural y de tamañomuygrande entre los aldehidos ensayados. La naturaleza de losgrupos sustituyentes del benzaldehido en su carácter de acep­tores o dadores de electrones puede variar considerablementela asociación del aldehido a la enzimay la transferencia del

ión hidruro al C4 del anillo piridinico del NAD.Existen Variashipótesis sobre mecanismosde acción de aldehido deshidroge­nasas (87, 88) que suponen que uno o más grupos nucleofilicos

de la enzima situados en el centro activo, se unen al átomo decarbono del carboniJP del sustrato convenientemente orientado;al mismotiempo el hidrógeno del grupo aldehido ( :H) es repeli«do con una transferencia simultánea, esteraoespecifica del iónhidruro a la posición 4 de la nicotinamida del NAD(89). Porlo tanto grupos sustituyentes del anillo bencénico que "atrai­gan" electrones van a facilitar la unión con el nucleófilo dela enzima, pero pueden entorpecer la transferencia del ión hi­druro lo que se traduce en una inhibición por el sustrato. Porotra parte, los grupos sustituyentes que son dadores de electro­nes aumentan la velocidad de oxidación. También hay que teneren cuenta la posible existencia de efectos estéricos en la re­lación de los sustratos a la proteina enzimática.

Si se analiza el comportamiento del NAD,análcgos y nucle­ótidos componentesdel mismo,frente a la acción inhibidora delos reactivos de tioles, o-iodosobenzoato y óxido de melarsen,el resultado que se obtiene es inesperado, si bien el NAD,NADP,y PyAlADy PyAldeamADprotegen a la enzima de la acción de los

reactivos de tioles, aunque no en la medida informada por Sto­ppanivMilstein (72), el APADy APdeamADque también se unen a

la enzima, no ¿ólo no la protegen sino que aumentan el efectoinhibidor de los mismos. Esto sugiere que los grupos tioles noson esenciales para la unión de la enzima con la coenzima; pro­bablemente la unión de la enzima con la coenzima es el resulta­

do de una serie de uniones débiles de diferente grado de fuer­za; esto parece necesario dado que uniones fuertes producirianinhibición en vez de activación. Podria ser que el grupo susti­

tuyente del 03 de la nicotinamida de la'coenzima condicione lareactividad del resto del anillo piridinico, permitiendo o no,su unión a grupos -SH de la proteinao Asi,suponiendo que en elNADexista una unión entre -SH y un C del anillo piridinico,aunque dicha unión no sea indispensable para la combinación dela enzima con la coenzima, en el APADal variar el grupo susti­

tuyente del C3varia la reactividad del anillo, dicha unión notiene lugar y el -SH quedaria libre para reaccionar con el re­activo de tioles, de ahi el aumentode reactividad observado.

Otra posibilidad seria que la coenzima, al estabilizaruna configuración particular de la enzima, que dependeria delgrupo sustituyente de la misma. haga que los tioles se vuelvan

más o menosaccesibles a los reactivos sapecificos. Con los da­tos de protección de la actividad con los sustratos de la reac­ción enzimática, sin pruebas experimentales directas, no se pue­de sacar conclusiones categóricas sobre el papel de los grupos-SH en el mecanismo de la reacción.

MLUSIONES1) Todos los análogos ensayados, deamNAD,APAD,APdeamADy

PyAlAD y PyAldeamAD, se unen a 1a enzima; pero sólo el deamNAD,

APADy APdeamADson reducidos por la misma. Todos ellos son in­

hibidores competitivos del sistema enzimática cuando este traba­ja con NADcomo coenzima. También son inhibidores competitivos

los mononucleótidos AMP, ADP, ATP y NMNy las bases adenina,

piridina y nicotinamida. _

2) Kacetvarian significativamente con el nucleótido utili­zado.

3) NAD, PyAlAD, PyAldeaInAD y deamAD protegen a la. enzima

de la acción de los reactivos de tioles. El APADy APdeamADno

sólo no la protegen sino que aumentan el efecto inhibidor delos mismos.

4) Hidroxilamina inhibe al sistema enzimático; se observamayor inhibición cuando el sistema actúa con APADy APdeamAD.La inhibición es incompetitiva respecto de la coenzima y compe­titiva respecto del aldehido.

5) Benzaldehido, glicolaldehido y anisaldehido son oxida­dos por el sistema enzimítioo. Gliceraldehido, salicilaldehidoy p-dimetilaminobenzaldehido no son oxidados.

CAPITULOVIII

DISCUSION GENERAL

Resumiendo las propiedades de la NADaldehido deshidroge­

nasa de leVadura encontradas durante su estudio se tiene:1.-Egpecificidgd de sustrato: 1a enzima presenta una espe­

cificidad muyamplia hacia sus sustratos; estos pueden ser al­dehidos alifáticos o aromáticos. Entre los primeros son oxida­dos el glicolaldehido, propionaldehido, butiraldehido y croton­aldehido; entre los segundos el benzaldehido y el anisaldehido(p-metoxibenzaldehido). No se oxidan el gliceraldehido, p-dime­tilaminobenzaldehido, ni el salicilaldehido.

Excepto el gliceraldehido, todos los demás aldehidos en­sayados, aún los que no tienen actividad, se unen a la enzima,dado que son inhibidores del sistema enzimático cuando ésteoxida al acetaldehido.

2.-Egpecificidad de coenzima: la aldehido deshidrogenasaademás del NAD reduce al NADP, deamNAD, APADy APdeamAD. El

deamNADes el más activo, la velocidad de la reacción es del

88% respecto a la del testigo con NAD,la del NADPes del 33%,APdeamAD 18% y APAD10%. PyAlAD y PyAldeamAD no son reducidos

por el sistema enzimático si bien pueden ser reducidos quimi­camente o por acción de otras deshidrogenasas.

3¡-!ggggidgd de activadores de_la enzima: la NADaldehidodeshidrogenasa necesita cisteina para alcanzar el máximode suactividad; en ausencia de la misma, la velocidad de la reacciónes sólo del 14 al 16%de la correspondiente a la presencia decisteina l mM.Si en esas condiciones se agrega al sistema en­zimático aquellos complejantes de metales que en presencia decisteína inhiben la acción catalitica (OP, HOQy DDC)se veque en ausencia de la mismala activan. La adición de cisteinal mMa una preparación parcialmente activada por OP aumentaligeramente la actividad, pero no tanto comoCuandoactúa so­la. La activación de la enzima en función de la concentraciónde OP llega a un máximo, concentraciones de OP por encima deese valor (1 mM)producen inhibición.

El cupferrón que no es inhibidor tampoco produce activa­ción. Cuando se cambia el aceptador de hidrógeno por análogosdel NAD,se tienen los siguientes resultados: la Velocidad i­nicial de la reacción en ausencia de activador depende de la

coenzima presente en el sistema enzimático, asi con APADla re­acción no se produce, con NADy APdeamADla velocidad de la

reacción enzimática es 9 y con deamNADes de 18.Los complejan­

tes no tienen el mismoefecto activador (comparadocon la cis­teina) cuando los sistemas enzimáticos a los cuales se agregantienen distintas coenzimas asi, con HOQse tienen las siguientesvelocidades: 83 (NAD), 72 (deamNAD),87 (APdeamAD) y 67 (APAD).

El estudio de la cinética de activación indica que la OP

actúa sobre el KNAD,aumentando la asociación de la coenzima ala enzima.

4.-lgfiibidores de la reacción de la NADaldehido deshidro­Espasa de levadura: La enzima es inhibida por distintas clasesde compuestos, los que se pueden agrupar en: I) coenzima, aná­logos y derivados del mismo, II) sustratos y análogos del sus­trato y III) compuestos estructuralmente no relacionados ni conel sustrato ni con la coenzima, este grupo comprende: a) sus­tancias orgánicas e inorgánicas capaces de formar complejos conmetales, b) hidroxilamina, c) reactivos de tioles.

I) Agálggqs_del H¿D¿_derivados_pigidinicos y ¿denilicoszlos componentes de la molécula del NAD,adenina, nicotinamiday sus derivados, asi como los análogos del NAD(APAD, APdeamAD,

NADP)inhiben la reacción enzimática. Se comportan como inhibi­

dores competitivos la adenina, nicotinamida, piridina, AMP,ADP,ATP, PyAlADy PyAldeamAD. NMN,pirofosfato y fosfato no modifi­can la velocidad de la reacción enzimática.

II) Inhibición por sustrato y sustancias análqggg_al sus­trato: los aldehidos oxidados por el sistema enzimático (gli­colaldehido, benzaldehido y anisaldehido) son inhibidores delmismocuando se los agrega junto con acetaldehido. El salicil­aldehido y el p-dimetilaminobenzaldehido que no son oxidadospor la enzima son inhibidores de la misma, especialmente elúltimo de los nombrados que cuando se agrega en concentraciónigual a 1a del acetaldehido inhibe el 100%de la actividad. Encambio el gliceraldehido que no es oxidado tampoco es un inhi­bidor de la enzima. El estudio cinético de la acción de estosaldehidos sobre el sistema enzimático, en presencia de acetal­dehido, no revela un comportamiento definido.

III) ComJuestosestructuralmente_no relacionados_ni conlas coenzimas ni con el sustrato:

a) sustancias complejantes de metales: la inhibición por agen­tes orgánicos e inorgánicos capaces de formar complejos conmetales indica que hay un metal involucrado en la reacción ca­talizada por la enzima. Son inhibidores la l,lO-fenantrolina,la 8-hidroxiquinolina y el dietil-ditiocarbamato; el cupferrón,el q,u‘-dipiridilo y la azida sódica tienen muypoca o ningunaacción. '

Estudios detallados de la influencia de la OPsobre la

reaeción de la NADaldehido deshidrogenasa muestran que estasustancia produce: dos tipos de inhibición, una instantánea yreversible y otra dependiente del tiempo e irreversible. Tam­bién el dietilditiocarbamato produceuna inhibición irreversi­ble dependiente del tiempo. No se obserVa lo mismo con el zin­cón.

La inhibición irreversible por OPdepende del tiempo deincubación, del grado de pureza de la preparación enzimática,cuanto más pura más sensible a la acción del inhibidor y de latemperatura de incubación. Aumenta con la misma.

Estudios de protedción por distintas sustancias de la in­hibición irreversible por OPconducena los siguientes resul­tados; la cisteína, dietilditiocarbamato y 8-hidroxiquinolinaprevienen completamente la acción de la OP; cianuro y EDTAsontambién fuertemente protectores. De la coenzima, análogos dela misma y mononucleótidos que la componen sólo el PyAlADyPyAldeamADactúan como protectores, los demás o bien potencian

la acción do la OP como el NAD, NADP, ADP y APADo no ofrecen

ninguna acción,como la adenina. El pirofosfato es ligeramenteprotector. Él único catión que protege totalmente la enzimade la acción de la OP es el Zn++; el K+5 Bb+ y Sr++ son algo

protectores. El acetaldehido aumentaligeramente el efecto in­hibidor de la OP.

Estudios cinéticos de 1a acción de la OP, HOQy DDCso­bre los complejos enzima-coenzima y enzima-sustrato muestranque la inhibición instantánea es competitiva con el NADy mix­ta,del tipo competitivo-no competitivo con el acetaldehido.La cinética es consistente con la suposición de que se formaun complejo entre el metal unido a la enzima y la OP en elque ambos están en relación 1:1.

b).gidroxilaminal la inhibición de la NADaldehido deshi­drogenasa por hidroxilamina depende de qué análogo del NADactúaa como coenzima del sistema enzimática. es del 90%con el APADo APdeamADpara una concentración de hidroxilamina de 10 mM.

En iguales condiciones con el NADo deamNAD¡lainhibición obser­vada es sólo del 15%.

El estudio cinética indica que la hidroxilamina presentauna inhibición incompetitiVa respecto de las coenzimas mientras

que para el acetaldehidq,si la coenzima es NADo deamNADse ob­serva una inhibición mixta del tipo competitivo-no competitivo,casi puramente competitivo. mientras que cuando el sistemaenzimático actúa con APADla inhibición es del tipo competiti­vo.

o) Reactivos de tioles: en un trabajo anterior Stoppaniy Milstein encontraron que la NADaldehido deshidrogenasa essensible a los reactiVos de tioles (72). Se estudió el compor­tamiento de los complejantes de metales frente a la acción delo-iodosobenzoato y del óxido de melarsen; tanto la 0P comolaHOQaumentan la sensibilidad de la enzima hacia los reactivosde tioles.

También se vió qué efecto tienen los análogos y componen­tes del NADcuando se los incuba en presencia de los mismos;

el NAD. NADP, PyAlAD. PyAldeamAD y deamNADactúan protegiendo

la enzima. El APADy APdeamADsustancias que se sabe que se

combinan con la enzima, no sólo no la protegen sino que aumen­

tan la inhibición por los reactivos de tioles utilizados. Losmononucleótidos adenilicos AMP,ADPy ATPson protectores,aun­que no tanto comoel dinucleótido; el piridinico es muchome­nos eficaz.

DiscusiónA partir de estos resultados se pueden sacar algunas con­

clusiones sobre: 1) grupos esenciales de la enzima, 2) gruposesenciales de la coenzima, 3) mecanismopor el cual actúa lacisteína. 4) mecanismo de la reacción de la NADaldehido deshi­drogenasa de levadura.

l) grupggmgggnciales de la enzima.a) Esta}. La NADaldehido deshidrogenasa de levadura es sensi­ble a la acción de varios complejantes de metales. Con 0P y

DDCse obserVan dos tipos de inhibición, uno instantáneo y re­versible; otro dependiente del tiempo e irreversible que puedeprevenirse mediante el agregado de Zn++o de cisteina y otroscomplejantes a los tubos de incubación. Se pueden comparar cswtos resultados con los obtenidos por Vallee y col. (27) con o­tras deshidrogenasas dependientes de nicotinamida adenina dinu­

cleótidosien las que se observan efectos análogos de los comple­jantes de metales y en las que se ha demostrado la presenciade cinc mediante métodos químicos y espectrográficos. En esasenzimas se ha señalado que la acción inhibidora de los comple­jantes se debe a que se combinan con el cinc enzimático, necesa­rio para su actividad, por lo que se puede sugerir que la NADaldehido deshidrogenasa también contiene ese metal. Más aún, elhecho de que el Zn++impide la inhibición irreversible por OPindica que el ión agregado posiblemente compita co¿ el cincenzimático por la OP, impidiendo así que ésta actúe sobre la en­zima. La neutralización de la inhibición de la enzima por la OP

a través de la formación del complejo Zn (OP)3 confirma la hi­pótesis de que la inhibición de la enzima por agentes quelantesde metales se debe a 1a capacidad de los mismos de formar com­plejos con átomos de metal que son enzimáticamente activos.

Esta hipótesis estaría corroborada por el análisis espec­trográfico cualitativo realizado sobre una muestra que presentaun sólo componente durante la ultracentrifugación y que da comoresultado cinc comoúnico metal presente en la proteina enZimá­tica y no en los sistemas amortiguadores en los que ésta se en­cuentra disuelta.

Estudios cinéticos de la acción de los complejantes sobrelos complejos enzima-coenzima y enzima-sustrato demuestran quela inhibición es competitiva respecto del NADy del tipo compe­titivo-no competitivo respecto del acetaldehido. En cambioexperimentos de protección de la enzima de la acción inhibidorairreversible muestran que el NAD, NADP,ADPy APADexageran la

acción de la OP. Es decir, el NADtiene una acción diferentesegún la inhibición por OPsea instantánea o dependiente deltiempo. En el primer caso la coenzima compite con el inhibidorpor un centro activo de la enzima que posiblemente involucre alcinc, disminuyendo la acción de la OP; en el segundo caso laexagera, Posiblemente la inhibición instantánea se deba a la

formación reversible de un complejo E-Zn-OP, que por una mayor

exposición a la OP permitiría la combinación de una segunda mo­lécula de OPal cinc lo que traería aparejado una alteración por­manente en el centro activo.

El hecho de que los distintos análogos se comporten enforma diferente cuando se los incuba con la enzima en presencia

de OP’probablementese deba a la influencia del sustituyente del

C3go. En base a los resultados de los ensayos de protección, el

de la piridina sobre el pirofosfato de la molécula de análo­

pirofosfato es el'único componente del NADque ejerce algunaprotección, se podría suponer ¿ue el pirofosfato sea uno de loscentros de unión del NADal cinc de la enzima, por lo tanto cuan­do el sustituyente piridinico es el grupo carboxamida, al for­marse un puente de hidrógeno entre éste y el pirofosfato dismi­nuye su afinidad por el cinc, mientras que en los análogos alde­hidicos al no existir el puente de hidrógeno, no se modifica lacarga del pirofosfato y la unión al cinc seria más fuerte. Porotra parte, el hecho de que de los componentes del NADel piro­_fosfato es el único que no ejerce ninguna acción sobre la velo­cidad de la reacción enzimática, hace dudar que el pirofosfatosea realmente un centro de unión entre el NADy la enzima.

Resultados similares, inhibición competitiva de OPcon res­pecto a1 NAD,se observaron en varias deshidrogenasas que contie­nen cinc (50, 48, 51); si se asocia ese efecto a la inactivaciónirreVersible de la enzima por QBtambién similar a la observadacon Zn-deshidrogenasas (34) y a la inhibición mixta competitiva­

no competitiva respecto del acetaldehidg,descripto también parala alcohol deshidrogenasa respecto del etanol (45) se podriapostular de que el cinc jugaría el mismopapel en esta enzimaque en la alcohol deshidrogenasa, es decir, seria el contro deun complejo ternario octahédrico con tres uniones a la proteina,dos a la coenzima bidentada y una al sustrato monodentado.b) grupos tioles. Con los datos de que so dispone, sin pruebasexperimentales directas, no se puede dar una interpretación con­cluyente del papel de los tioles en el mecanismode la reacciónenzinática.

La NADaldehido deshidrogenasa posee grupos tioles necesa­rios para su actividad comolo demuestra la inhibición de lareacción enzimática por los reactivos respectivos (72). La pro­

tección especifica de las tres aldehido deshidrogenasas estu­diadas por Stoppani y Milstein (6), por los piridin nucleótidosque les sirven de coenzimas)muastran una relación estrecha entrela coenzima y el tiol enzimático por lo que en base a estos re­sultados y a la falta.de protección especifica de los tiolespor compuestosaldehidicos descartan la posibilidad de que eltiol actúe comomediador de electrones entre el sustnato y lacoenzima, y llegan a 1a conclusión de que la hipótesis más fac­tible sea que los tioles actúen comovinculos entre la enzimay la coenzima. Sin embargo estudios de protección con análogosdel NADseñalan que no todos tienen la misma pro,iedad de prote­

ger a la enziia frente al o-iodosobenzoato y al óxido de melar­sen, as! mientras el NAD, NADP,PyAlAD y PyAldeamADson protec­

tores, el APADy APdeamADque se sabe que se unen a la enzima

y que son reducidos por ol sistema enzimático, no sólo no laprotegen sino que potencian el efecto de los inhibidores. Estoindicaria que los grupos tioles no son esenciales para la uniónde la enzima con la coenzima y el hecho de que se observe protec­ción con algunas coenzimas y con otras no se podria deber a que

el grupo sustituyente del C3 de la nicotinamida condicione lareactividad del resto del anillo piridinico, permitiendo o nosu unión a grupos tioles de la proteina, unión que no necesaria­mente es esencial para la combinación de la enzima con la coen­zima. O bien, que 1a coenzima al estabilizar una configuraciónparticular de la enzima, que dependeria del grupo sustituyentede la primera, haga que los tioles se vuelvan más o menos acce­sibles a los reactivos especificos.

2) grupos esenciales de la cgenzima.' De los resultados obtenidos en el estudio del comportamien­

to de los análogos del NADen el sistema enzimática se puedensacar las siguientes conclusiones. Si bien la unión de la coen­zima con la proteina no depende fundamentalmente de los grupos

amina y carboxamida ya)que los análogos del N5Dse combinan conla proteina cetalitica, en grado aproximadamentesimilar al NAD.en cambio para la reducción de la coenzima la presencia delgrupo carboxamidaen el anillo piridinico parece ser importante,pues con la enzima saturada las velocidades de reacción del AP­ADy del APdeamADson 7.7% y 15% respectivamente de la que se

obtiene con NADy los deriVados aldehidicos no son reducidos,

probablemente debido a que el grupo aldehido de las mismas blo­quea un centro esencial para la unión del aldehido del sustratoa la enzima (70). Por lo tanto parecería comosi la actividadde la aldehido deshidrogenasa con análogos del NADdependierade la velocidad de reducción de la coenzima más que de la posi­bilidad de formar el compuesto análogo-enzima, ya que tanto el

deamNAD como el APdeamAD y NADP tienen Km menores que el NAD,no obstante lo cual la velocidad.da la reacción es considerable­

mente menor. También el PyAlAD y PyAldeamAD de acuerdo a sus Kirespectivos muestran una mayor afinidad por la enzima que elNAD,a pesar de lo cual no son reducidos.

Mediante estudios cinéticos de inhibición de los componen­

tes del NADsobre el sistema enzilático’se encuentra que de losdos nucleótidos que forman la cocnziaa, ADPy NMN,el prtmero seune más firmemente a la enzima. Tanto la adenina como los mononu­

cleótido son inhibidores competitivos del NAD;el pirofosfato notiene acción inhibidora frente al NAD.La piridina y la nicotina­mida son también inhibidores competitivos del NAD,además exage­ran fuertemente la combinación del nucleótido adenilico dado el

menor valor del KNADrespecto al K1 AMPy Ki ADP.Estos resultados permiten suponer por lo menos dos puntos

de unión entre la coenzima y la enzima, siendo los grupos corres­

pondientes a la coenzima, la adenina y la nicotinamida. Esta su­posición se ve reforzada por el hecho de que se ha demostradoque la transferencia de hidrógeno del sustrato a la coenzima esdirecta (88) y es estereoespecífica con respecto a la posición 4de la nicotinamida del NAD(89). Esto significa que la libre r0­tación de la porción nicotinamida se elimina por su unión con lacoenzima,

3) Mecanismopor el cual actúa la cisteina.La NADaldehido deshidrogenasa necesita un activador para

alcanzar su máximaactividad enzimática (2,8). Tanto la cisteínacomootras sustancias que se conoce son capaces de complejar me­

tales, actúan como activadores de la enzima (OP, HOQ,DDC, BAL,EDTA).

Todos los hechos experimentales encontrados: a) cisteinapuede ser reemplazada por otros complejantes de metales, b) enausencia de cisteina, complejantes de metales en concentraciónbaja actiVan; aumentandola concentración inhiben la actividad

enzimática. c) los efectos actiVadores individuales no se su­man cuando se agrega simultáneamente cisteina y otro activadoral sistema enzimático, d) cisteina, DDC,HOQ,y EDTA(todosellos activadores) protegen a la enzima totalmente contra laacción inhibidora irreversible de la OP; señalan que el meca­nismo de activación y el de inhibición tienen lugar sobre unmismo centro de la enzima, presumiblemtne el metal y de quela cisteina actúa sobre el mismomecanismo que los otros com­plejantes de metales.

La activación de las enziaas por los comglejantes de me­tales puede deberse a dos causas (8): a la eliminación de me­tales pesados que contaminan e inhiben a 1a enzima o a la for­mación de un complejo activo complejante-enzima. Todas laspreparaciones enzimáticas están contaminadas por metales pe­sados, su completa eliminación es muydificultosa (47) porlo que no se puede estar seguro de que la preparación enzimá­tica estudiada no se encuentre incluida en ese caso. Sin embar­go, el qle la OPen concentraciones bajas y en ausencia decisteina, es decir en las condiciones en que actúa comoacti­vador, influye sobre la formación del complejo enzima-coenzima,

disminuyendo el valor del KNADaparente o sea favoreciendo laasociación de la coenzima a la enzima, si bien no excluye unaposible remoción de metales pesados indica que el mecanismode activación implica una acción directa de la OPsobre la for­mación del compuesto activo. La existencia de quelatos cinc­cisteína (30) corrobora esta hipótesis.

4) Mgggqiggg de la NADaldehido deshidrogenagggge leva­9252.

Stoppani y Milstein (40, 66) estudiaron la cinética dela NADaldehido deshidrogenasa respecto al acetaldehido y ala coenzima, los datos experimentales concordaban con la exis­tencia de un complejo teranrio (enzima-NAD-acetaldehido) queno condiciona la velocidad de la oxidación del acetaldehido.La teoria del compuesto ternario da ecuaciones que permitenrepresentar la velocidad inicial en función de la concentra­ción de ambos sustratos, esas ecuaciones varian según se con­sidere el sistema en estado de equilibrio rápido o de flujoestacionario. En el primer Caso se pueden presentar tres posi­bilidades, a) la enzima debe unirse primero al NADpara formar

el complejo ternario; b) la enzima debe unirse primero al acet­aldehido para formar el complejo ternario y c) el NADno afectala unión de enzima-acetaldehido. Los datos que se obtuvieronpermitieron descartar las primeras posibilidades y satisfacena la tercera. Si el sistema se supone en estado de flujo estacio­nario, solamente una formación ordenada del complejo ternariode ecuaciones donde la recíproca de la velocidad inicial es unafucnión lineal de la recíproca de la concentración de los sus­tratos; los valores hallados satisfacen esa condición.

Si bien los hechos experimentales reseñados en este trabajono alcanzan para afirmar categóricamente, tienden a reforzarla suposición de que el sistema se encuentra en estado de flu­jo estacionario.

Estos hechos son:

a) El tipo de inhibición que se obtiene con hidroxilamina. Lacinética de inhibición con hidroxilamina indica que ésta es uninhibidor incompetitivo respecto a la coenzima y competitivo res­pecto al acetaldehido o sea que el inhibidpr se combina con elcomplejo enzima-coenzima bloqueando el centro de unión del acet­aldehido.b) La variación de los parámetros de los compuestos enzima-acet­aldehido con la constitución quimica de la coenzima, si el acet­

aldehido se uniera independientemente a la proteína, el Kacet.sería independinte de la estructura de la coenzima. Esto estáen desacuerdo con la condición de que el NADno afecta la uniónde enzima con acetaldehido, lo que permitiriia desechar la posi­bilidad de que el sistema se encuentre en estado de equilibriorápido.

c) La inhibición que se obtiene con OP)que es competitiva res­pecto de la coenzima y competitiva-no competitiva respecto del

acetaldehido'puede explicarse suponiendo un mecanismode ordencompulsivo. (45).d) El hecho de que la estructura de los distintos aldehidos oxi­

dados por la enzhma afectan el KNADno es contradictorio con lasuposición de que el sistema se encuentra en estado de flujoestacionario con formación ordenada del complejo ternario, yaque las mismas pueden afectar la velocidad específica de descom­posición del complejo, que en este caso se encuentra incluido

en la constante de Michaelis aparente del sistema.De la discusión anterior se puede bosquejar un esquema que

conduzca a la formación de un complejo ternario cnzima-coenzimaacetaldehido mediante los siguientes pasos.l) Combinación de la coenzima con la enzima, en la que una delas posibles uniones se estableceria entre el metal que se pos­tula se encuentra en la proteína enzimática y la adenina delNAD.El derivado piridinico existe en solución comouna estruc­tura en resonancia con una carga positiva distribuida entre lasposiciones l, 2, 4 y 6; de éstas, la posición 4 es la que pare­ce llevar la mayor carga positiva según Pullman y col. (84).2) El aldehido se combinaría con la enzima posiblemente a tra—'vés del Zn de la misma, activándose, ya que el Zn es capazde aumentar la polaridad del grupo carbonilo (90).3) El reactivo nucleofílico se combinaría con el carbono 4cargado positivamente del derivado piridínico, formando un com­puesto intermedio que luego se descompondria en los productosde la reacción.

l

Una forma de esquematizar al complejo ternario seria:H

N<-'—----o :__— N

6.7.8.9.lO.ll.

12.

13.

14.

15.16.17.18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

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CapítuloCapítulo

Capítulo

Capitulo

Capitulo

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Capitulo

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INDICE resinaI Introduecidn 4II Abreviaturas ¡3

Materiales ¡qMétodos ¡5

III Purificación de 1a NADaldehido Aadeshidrogenasa de levadura-—-­

Analisis fisicoquimicos de 5 gpureza ' "Análisis de metales_s--—?¿---, 3X

IV Acción de a¿enfes ¿empiejantesde metales sobre las aldehido 3 5deshidrogenasas —-;_-;_.-_---.

V Ihagtivaeióñ:¿ireversibie dé _la NADaldehido deshidrOgenasa _5¿de levadura'--—a-s—-¿-—-—au--—­

VI Acción de los complejantes demetales sobre los compuestos en

zima-sustratos de la NADaldehido ,?Ádeshidrogenasa de levadura —.-—. 'VII Reacción de la NADAldehido deshi

drogenasa de levadura con sus

sustratos;NAD, análogos del mismo S 5y aldehidos.VIIIDiscusiópgeneral............ _. .

Bibliografia Í'íq