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NEUROGÉNESIS POSTNATAL EN EL CEREBRO DE PECES DEL GÉNERO AUSTROLEBIAS Anabel Fernández 1,5 , Juan C. Rosillo 1 , Gabriela Casanova 3,4 Silvia Olivera 2 1 Neurofisiología Celular y Molecular (Neuroanatomía Comparada NAC) IIBCE; 2 Neurobiología Celular y Molecular, IIBCE; 3 Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias (FC); 4 Unidad de Microscopía Electrónica de Transmisión, (FC). 5 NAC, Unidad Asociada a la Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay FINANCIADO POR: FINANCIADO POR: Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA) Área Biología, Uruguay Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA) Área Biología, Uruguay AGRADECIMIENTOS: AGRADECIMIENTOS: Dra. Nibia Berois, Mag. María José Arezo, Br. Nicolás Papa, Lic. Marcie Jiménez (Sección Biología Celular, FCIEN), Dr. Marcelo Loureiro (Zoología de Vertebrados, FCIEN), Ing. Dra. Nibia Berois, Mag. María José Arezo, Br. Nicolás Papa, Lic. Marcie Jiménez (Sección Biología Celular, FCIEN), Dr. Marcelo Loureiro (Zoología de Vertebrados, FCIEN), Ing. Martín de los Heros, Ing. Alvaro Martín (Facultad de Ingeniería Eléctrica, UdelaR). email de Contacto: [email protected] Martín de los Heros, Ing. Alvaro Martín (Facultad de Ingeniería Eléctrica, UdelaR). email de Contacto: [email protected] INTRODUCCION Las Austrolebias pertenecen a un genero de peces anuales representado en nuestro país por varias especies. Por su grado de especiación constituyen un modelo valioso para estudios evolutivos. Nuestro grupo ha demostrado en el cerebro de estos peces, la existencia de zonas proliferativas con potencialidad neurogénica. El estudio se realizó en tres especies del género; A. affinis, A. charrua y A. reicherti, estas últimas más cercanas filogenéticamente. El objetivo de este trabajo fue: Identificar, cuantificar y mapear las distintas poblaciones de células proliferantes en cinco regiones principales; Bulbo olfatorio (BO), Ventrículos del telencéfalo (VT), Torus longitudinalis (TL), Téctum óptico (TO) y Cerebelo (CB). PROTOCOLOS PROTOCOLOS A. affinis A. affinis A. charrua A. charrua A. reicherti A. reicherti 24 Hs Disección, Cortes en Vibrátomo (60 µm), ICQ, MET y MC Inyección BrdU (100 mg/kg PV i.p) Fijación por perfusión intracardíaca PAF 10% BF 0.1 M pH 7.4 0 0 50 100 150 200 BrdU+ nuclei x field ** ** * VT CB TO TL BO A. charrua A. affinis A. reicherti Los datos muestran el promedio de núcleos BrdU+ obtenidos en tres cortes sucesivos de cada región. Las especies filogenéticamente más cercanas presentan perfiles proliferativos similares, mientras que la especie más alejada (A. affinis), muestra datos significativamente diferentes a nivel del BO y TL. La comparación entre grupos se realizó mediante test de ANOVA de una cola (p<0.05). 1. Representación topográfica en 3D de las regiones proliferativas estudiadas y distribución de células BrdU+ en el cerebro de tres especies de Austrolebias. Telencéfalo (Tel) 0 50 100 150 BrdU+ nuclei x field VT CB TO TL BO A. charrua 0 50 100 150 BrdU+ nuclei x field A. affinis VT CB TO TL BO 0 50 100 150 BrdU+ nuclei x field VT CB TO TL BO A. reicherti RESULTADOS Golgi CONCLUSIONES La topografía de las regiones proliferativas es similar en las 3 especies. Las diferencias constatadas entre las tres especies en cada zona estudiada concuerda con las variaciones anatómicas, y la distribución de los núcleos en cada cerebro. El estudio cuantitativo muestra que el cerebelo presenta mayor número de células BrdU+ y la comparación entre especies confirma la proximidad filogenética entre A. charrua y A reicherti. Las 5 zonas estudiadas mostraron potencial neurogénico y gliogénico siendo las células S-100+ las células con mas proliferación. ANALISIS DE IMÁGENES Y ESTADÍSTICA Las secciones histológicas fueron analizadas mediante Microscopía Confocal (OLYMPUS FV300) y Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) (Jeol JEM 1010). El análisis estadístico de los datos obtenidos, de las tres especies utilizadas (n=6 para cada una), fueron comparados mediante el test t de student para datos no pareados. RECONSTRUCCION 3D Las secciones transversales seriadas se fotografiaron con una cámara digital NIKON (COOLPIX 995), acoplada al Microscopio óptico. Las imágenes fueron transferidas al Programa Biovis3D (Sitio web: http://www.biovis3d.com) mediante el cual es posible la reconstrucción de órganos y estructuras en tres dimensiones espaciales. A. affinis A. charrua A. reicherti BO BO BO Tel Tel Tel TO TO TO CB CB CB 2. Heterogeneidad celular constatada en dos de las regiones proliferativas: paredes ventriculares del telencéfalo y torus longitudinalis. Golgi 150μ m BrdU-HuC/D LV 10 μ m LV LV LV GFAP HuC-S-100 BrdU-HuC S-100 50 μ m 10 μ m 20 μ m 20 μ m 50 μ m LV I II III 5 μ m Golgi La inmunocitoquímica mostró que las células gliales inmaduras (S-100, color verde) son abundantes en la luz ventricular (LV) y se disponen rodeando con una delgada lámina a las neuronas (HUC+, color rojo). Las glias radiales GFAP+ coexisten con las células S-100+. El método de Golgi revela la naturaleza radial de algunas de las células conectadas a la LV. La MET permitió identificar al menos tres tipos celulares: I) células con núcleo electrondenso de forma irregular, II) células con núcleo de perfil irregular pero con cromatina más laxa y III) células con núcleo electronlúcido provistos de uno o dos nucleolos presentes y con fenotipo claramente neuronal. VT LM BrdU 30 μ m A VT VT VT LM LM NF-S-100-DAPI BrdU-HuC 20 μ m 10 μ m B C D E A. Corte transversal a nivel del Torus longitudinalis (TL). Se observa la distribución de los núcleos BrdU+ (marrón) en la región periférica. B. La presencia de células S-100+ (verde) ubicadas también en la periferia. C. Doble marcado de BrdU-HuC en la periferia del TL. Obsérvese que uno de los núcleos colocaliza con el marcador neuronal (flecha) mientras que el otro no. En D y E se observan dos tipos celulares con el método de Golgi. En D asociamos la morfología a la glía S -100+ mostrada en B, mientras que en E se impregnó una única célula de cuerpo redondo semejante a lo observado con el marcador neuronal HuC. En E también se observa un tabique glial (flecha) en la LM. VT ventrículo tectal; LM línea media; NF neurofilamentos; DAPI contratinción nuclear. Comparación del promedio de células BrdU+ entre las especies.
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NEUROGÉNESIS POSTNATAL EN EL CEREBRO DE PECES DEL GÉNERO AUSTROLEBIAS
Anabel Fernández1,5, Juan C. Rosillo1, Gabriela Casanova3,4 Silvia Olivera2
1 Neurofisiología Celular y Molecular (Neuroanatomía Comparada NAC) IIBCE; 2 Neurobiología Celular y Molecular, IIBCE; 3 Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias (FC); 4 Unidad de Microscopía Electrónica de Transmisión, (FC).
5 NAC, Unidad Asociada a la Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay
FINANCIADO POR:FINANCIADO POR: Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA) Área Biología, Uruguay Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA) Área Biología, UruguayAGRADECIMIENTOS: AGRADECIMIENTOS: Dra. Nibia Berois, Mag. María José Arezo, Br. Nicolás Papa, Lic. Marcie Jiménez (Sección Biología Celular, FCIEN), Dr. Marcelo Loureiro (Zoología de Vertebrados, FCIEN), Ing. Dra. Nibia Berois, Mag. María José Arezo, Br. Nicolás Papa, Lic. Marcie Jiménez (Sección Biología Celular, FCIEN), Dr. Marcelo Loureiro (Zoología de Vertebrados, FCIEN), Ing. Martín de los Heros, Ing. Alvaro Martín (Facultad de Ingeniería Eléctrica, UdelaR). email de Contacto: [email protected]ín de los Heros, Ing. Alvaro Martín (Facultad de Ingeniería Eléctrica, UdelaR). email de Contacto: [email protected]
INTRODUCCIONLas Austrolebias pertenecen a un genero de peces anuales representado en nuestro país por varias especies. Por su grado de especiación constituyen un modelo valioso para estudios evolutivos. Nuestro grupo ha demostrado en el cerebro de estos peces, la existencia de zonas proliferativas con potencialidad neurogénica. El estudio se realizó en tres especies del género; A. affinis, A. charrua y A. reicherti, estas últimas más cercanas filogenéticamente. El objetivo de este trabajo fue: Identificar, cuantificar y mapear las distintas poblaciones de células proliferantes en cinco regiones principales; Bulbo olfatorio (BO), Ventrículos del telencéfalo (VT), Torus longitudinalis (TL), Téctum óptico (TO) y Cerebelo (CB).
PROTOCOLOS PROTOCOLOS
A. affinisA. affinis
A. charruaA. charrua
A. reichertiA. reicherti
24 Hs Disección, Cortes en Vibrátomo(60 µm), ICQ, MET y MC
Inyección BrdU (100 mg/kg PV i.p)
Fijación por perfusión intracardíacaPAF 10% BF 0.1 M pH 7.4
0
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Brd
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A. charrua A. affinis A. reicherti Los datos muestran el promedio de núcleos BrdU+
obtenidos en tres cortes sucesivos de cada región. Las especies filogenéticamente más cercanas presentan perfiles proliferativos similares, mientras que la especie más alejada (A. affinis), muestra datos significativamente diferentes a nivel del BO y TL. La comparación entre grupos se realizó mediante test de ANOVA de una cola (p<0.05).
1. Representación topográfica en 3D de las regiones proliferativas estudiadas y distribución de células BrdU+ en el cerebro de tres especies de Austrolebias. Telencéfalo (Tel)
0
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Brd
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A. charrua
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Brd
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A. reicherti
RESULTADOS
Golgi
CONCLUSIONESLa topografía de las regiones proliferativas es similar en las 3 especies.Las diferencias constatadas entre las tres especies en cada zona estudiada concuerda con las variaciones anatómicas, y la distribución de los núcleos en cada cerebro.El estudio cuantitativo muestra que el cerebelo presenta mayor número de células BrdU+ y la comparación entre especies confirma la proximidad filogenética entre A. charrua y A reicherti.Las 5 zonas estudiadas mostraron potencial neurogénico y gliogénico siendo las células S-100+ las células con mas proliferación.
ANALISIS DE IMÁGENES Y ESTADÍSTICALas secciones histológicas fueron analizadas mediante Microscopía Confocal (OLYMPUS FV300) y Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) (Jeol JEM 1010). El análisis estadístico de los datos obtenidos, de las tres especies utilizadas (n=6 para cada una), fueron comparados mediante el test t de student para datos no pareados.
RECONSTRUCCION 3DLas secciones transversales seriadas se fotografiaron con una cámara digital NIKON (COOLPIX 995), acoplada al Microscopio óptico. Las imágenes fueron transferidas al Programa Biovis3D (Sitio web: http://www.biovis3d.com) mediante el cual es posible la reconstrucción de órganos y estructuras en tres dimensiones espaciales.
A. affinis A. charrua A. reicherti
BOBO BO
Tel Tel TelTOTO
TO
CBCB CB
2. Heterogeneidad celular constatada en dos de las regiones proliferativas: paredes ventriculares del telencéfalo y toruslongitudinalis.
Golgi
150µm
BrdU-HuC/D
LV
10µm
LV
LV
LV
GFAP HuC-S-100
BrdU-HuC
S-100
50µm
10µm 20µm
20µm50µm
LV
I
II
III
5µm
Golgi
La inmunocitoquímica mostró que las células gliales inmaduras (S-100, color verde) son abundantes en la luz ventricular (LV) y se disponen rodeando con una delgada lámina a las neuronas (HUC+, color rojo). Las glias radiales GFAP+ coexisten con las células S-100+. El método de Golgi revela la naturaleza radial de algunas de las células conectadas a la LV. La MET permitió identificar al menos tres tipos celulares: I) células con núcleo electrondenso de forma irregular, II) células con núcleo de perfil irregular pero con cromatina más laxa y III) células con núcleo electronlúcido provistos de uno o dos nucleolos presentes y con fenotipo claramente neuronal.
VT
LM
BrdU
30µm
A
VT
VT
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LM
LM
NF-S-100-DAPI BrdU-HuC
20µm
10µm
B C
D E
A. Corte transversal a nivel del Torus longitudinalis (TL). Se observa la distribución de los núcleos BrdU+ (marrón) en la región periférica. B. La presencia de células S-100+ (verde) ubicadas también en la periferia. C. Doble marcado de BrdU-HuC en la periferia del TL. Obsérvese que uno de los núcleos colocaliza con el marcador neuronal (flecha) mientras que el otro no. En D y E se observan dos tipos celulares con el método de Golgi. En D asociamos la morfología a la glía S -100+ mostrada en B, mientras que en E se impregnó una única célula de cuerpo redondo semejante a lo observado con el marcador neuronal HuC. En E también se observa un tabique glial (flecha) en la LM. VT ventrículo tectal; LM línea media; NF neurofilamentos; DAPI contratinción nuclear.
Comparación del promedio de células BrdU+ entre las especies.
![Presentación Postnatal (Sernam s.o.h.) [Modo de Compatibilidad] (1)](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/55cf8fb1550346703b9ed8b4/presentacion-postnatal-sernam-soh-modo-de-compatibilidad-1.jpg)
