Mintzetan txertaketa bideratzen duten sekuentziak · Mintzetan txertaketa bideratzen duten...

Mintzetan txertaketa bideratzen duten sekuentziak Birus fusio proteinak eta biroprinak

Jakintza-arloa: Natur Zientziak

Egilea: SILVIA SANCHEZ MARTINEZ Urtea: 2007 Zuzendaria: JOSE LUIS NIEVA ESCANDON Unibertsitatea: UPV-EHU ISBN: 978-84-8428-277-5

Hitzaurrea 2003 apirilean Jose Luis Nieva doktorearen zuzendaritzapean tesi-proiektu hau hasi nuen, tesia 2007 otsailan defendatu nuen. Laburpenean azaltzen dudan moduan tesian bi gai ezberdin aztertzen dira, alde batetik poliobirusaren 2B proteinaren egitura-funtzioaren arteko erlazioaren analisia eta bestetik GIB-1-en MAb2F5 eta 4E10 antigorputzek mintzean murgildurik daudenean edo/eta soluzioan daudenean, beraien epitopoak ezagutzeko gaitasunaren azterketa. 2B proiektuak, Aitziber Agirre doktoreak zenbait urte lehenago hasi zuen, Madrilgo Luis Carrasco Doktorearen taldearekin kolaborazioan. Beraz proiektu hau bere lanaren jarraipenean eta oinarrituta dago eta Madrilgo taldearekin kolaborazio bat da. Biroporinak, birusek kodeturiko proteina txiki eta oso hidrofobikoak dira, zelula mintzarekin elkarrekiteko ahalmena daukate eta ondorioz, mintza, ioi eta molekula txikiek irazkor bihurtzen dute. Garai hartan 2B biroporinak mintzaren irazkortasuna areagotzeko erabiltzen zuen mekanismoa ez zegoen oso argi, eta honetan sakontzea beharrezkoa iruditu zitzaigun. Bestalde, beste hipotesi bat frogatu nahi genuen ere; mintzetan poroak eragitea, organismo askok, defentsa zein erasorako erabiltzen duten mekanismo zaharrenetariko bat da, beraz, mintzaren irazkortasuna handitzea animalia-birusen ohiko ezaugarri bat izanik, arraroa zen horrelako produktu zitotoxikorik birus-proteinen artean aurkitu ez izana. Birusek zelulak infektatzean adierazten dituzten produktu zitotoxikoen sekuentzia osoek edo partzialek, zelularen irazkortasuna areagotzeko gaitasuna zuten frogatu nahi genuen. Lan honen ondorioz, 2B biroporinak toxina zitolitiko moduan jarduten duela esan dezakegu. Gaur egun, Madrilgo taldeak biroporinen ikerketan jarraitzen du lanean. Taldean ikerketa lerro nagusi batean lan egiten da bereziki, GIB-1-ren gp41 proteina aztertzen eta proteina hau ezagutzen duten antigorputz neutralizatzaileak aztertzen. Esan bezala, nire tesiaren bigarren proiektua antigorputz neutralizatzaile hauen azterketa da. Garai hartan gero eta ebidentzia gehiago zeuden, Mab2F5 eta Mab4E10-ak ekintza immunologikoa betetzeko, lipidoekin batu behar direla sustatzen zutenak: Lehenengoa, gp41 errekonbinanteak lipido hutsezko mintzekin inkubatuz gero, Mab2F5 eta 4E10-ren ezagupena areagotzen duela ikusi zen. Bigarrena, analisi molekularrak, eta Mab 2F5 eta 4E10-en zatikiak (Fabs), epitopoekin loturik, lorturiko kristal egituraren erresoluzioak kate astunetan CDR3 bigizta luzeen presentzia adierazten zuten. CDR3 loop luze hauetan hondar aromatikoak eta hidrofobikoak aurkitzen zirela, hondar hauek, epitopoekin ez zituzten kontaktu zuzenik ezartzen, beraz, mintzarekin

kontaktuak ezarri beharko zituztenaren posibilitatea zegoen. Dena den, eta behintzat 2F5-aren kasuan, nahiz eta bigizta hauek antigenoarekin elkarrekintza espezifikoak ez izan, antigorputzaren aktibitaterako guztiz beharrezkoak zirela ikusi zen. Mab4E10-ren kasuan aldiz, bigizta honen funtzioa ez zen determinatu, baina mutagenesi saioak burutzen ari ziren garai hartan bigiztaren garrantzia aztertzeko. Hirugarrena, Haynes eta lankideek, ikusi zuten Mab2F5 eta 4E10-ak kardiolipina (CL) fosfolipidoa espezifikoki ezagutzen zuela, MPER-eko epitopoak ezagutzeko erabiltzen zituzten gune berdinak erabiliz. Tesiaren bigarren proiektu honetan, zenbait galdera erantzuten saiatu ginen: -Antigorputzak, mintzekin elkar zitezkeen. -Mintzetan barreiatutako epitopo-sekuentziak ezagutzeko gai al ziren. -Fosfolipidoekin modu espezifikoaz elkarrekiteko gai al ziren. Bi antigorputz hauek, mintz ingurunean dauden epitopo eta fosfolipidoak, bi adaptazio mekanismo ezberdinen bidez ezagutzen dituzte. Taldean, gaur egun, gai honetan ikertzen jarraitzen da.

Silvia Sanchez

2009

Tesi hau Euskal Herriko Unibertsitateko Euskara Errektoreordetzak, “Euskarazko tesiak sustatzeko beka” eta Biofisikako Unitate-ko (CSIC-UPV/EHU) proiektuei atxekituriko beka eta kontratuei esker burutu da.

Aita eta amari,

Aurkibidea

I

AURKIBIDEA ______________________________________________________________________ 1.Kapitulua: SARRERA OROKORRA ETA HELBURUAK 1.1. MINTZ-BIOLOGIKOAK.............................................................1 1.1.1. Mintz biologikoen funtzio eta ezaugarriak..........................1 1.1.2. Mintzaren osaketa.............................................................2 1.1.2.1. Mintz-proteinak....................................................4 1.1.2.2. Lipidoak................................................................5 1.1.2.2.1. Sailkapena................................................6 1.1.2.2.1.1. Glizerofosfolipidoak......................7 1.1.2.2.1.2. Esfingolipidoak.............................8 1.1.2.2.1.3. Esterolak......................................9 1.1.3. Lipido banaketa asimetrikoa mintzetan...........................10 1.1.3.1. Lipido banaketa organulu intrazelular ezberdinen mintzetan zehar................................................................10 1.1.3.2. Lipido banaketa mintz plasmatikoan...................10 1.1.3.2.1. Zeharkako asimetria: Mintz plasmatikoaren kanpoaldeko eta barnealdeko monogeruzak...............11 1.1.3.3. Lipido-domeinuak...............................................15 1.1.4. Bigeruzaren egitura.........................................................17 1.1.5. Bigeruzaren ezaugarri elektrostatikoak............................19 1.1.5.1. Gainazaleko potentzial elektrostatikoa.................19 1.1.5.2. Potentzial elektrostatiko dipolarra.......................19 1.1.5.3. Mintzaren zeharkako potentzial elektrostatikoa...20 1.2. WIMLEY-WHITE-en HIDROFIBIZITATE ESKALA.....................22 1.3. POROAK ERATZEKO GAITASUNA DUTEN PROTEINA ETA PEPTIDO SOLUGARRIAK..............................................................25 1.3.1. Polipeptidoetan oinarritutako poroak...............................26 1.3.1.1. α-Hemolisina.......................................................26 1.3.1.2. Kolizinak.............................................................29 1.3.2. Peptido laburretan oinarritutako poroak..........................30 1.3.2.1. β-Orri egiturako peptidoak..................................31 1.3.2.1.1. A-Gramizidina........................................31 1.3.2.1.2. Defentsinak............................................32 1.3.2.2. α-Helize egiturako peptidoak...............................33 1.3.2.2.1. Alametizina.............................................33 1.3.2.2.2. Zekropinak.............................................35

Aurkibidea

II

1.3.2.2.3. Magaininak.............................................36 1.4. BIROPORINAK.......................................................................38 1.4.1. Biroporinaren definizioa..................................................38 1.4.2. Biroporina egituraren ezaugarri orokorrak.......................39 1.4.3. Mintzaren irazkortasuna aldatzen duten glikoproteina birikoak............................................................................................ 41 1.5. HELBURUAK.........................................................................43 2. Kapitulua: MATERIALAK, TEKNIKA ESPERIMENTALAK ETA PROTOKOLOAK 2.1. MATERIAL EZ-BIOLOGIKOA..................................................47 2.1.1. Peptidoak........................................................................47 2.1.1.1. Peptidoen diseinua..............................................47 2.1.2. Antigorputzak..................................................................48 2.1.3. Konposatuak eta inhibitzaileak........................................49 2.1.4. Lipidoak..........................................................................49 2.1.5. Tanpoiak.........................................................................50 2.2. MATERIAL BIOLOGIKOA.......................................................51 2.2.1. Lerro zelular eukariotoak................................................51 2.2.2. Bakterio-anduiak............................................................51 2.3. ZELULA EUKARIOTOEN MANIPULAZIOA................................51 2.3.1. Kultibo-medioak..............................................................52 2.3.2. Zelulen elektroporazioa in vitro sintetizaturiko RNA erabiliz...............................................................................................52 2.3.3. Zelula eukariotoen mintz-irazkortasun aldaketak: B-Higromizina eta α-Sartzinaren sarrera................................................53 2.3.3.1. Adierazitako proteinen aktibitatea aztertzeko protokoloa..........................................................................................53 2.3.3.2. Peptidoen irazkortasun ahalmena aztertzeko protokoloa..........................................................................................54 2.3.3.3. α-Sartzinaren sarrera..........................................54

2.3.4. Proteinen markaketa erradiaktiboa..................................55 2.3.5. Elektroforesia poliakrilamida geletan...............................55 2.3.6. Fluorografia.....................................................................56 2.3.7. Fluoreszentziazko mikroskopia konfokala........................56 2.3.8. Sintzitio-eraketaren inhibizioa.........................................57

2.3.8.1. Sintzitioen eraketarako protokoloa .....................58 2.3.8.2. Sintzitio-eraketaren inhibizio protokoloa ............58

Aurkibidea

III

2.4. MINTZ-EREDUEN SISTEMAK.................................................59 2.4.1. Liposomak......................................................................59 2.4.1.1. Liposomen prestakuntza.....................................61

2.4.1.1.1. LUV-en prestakuntza..............................62 2.4.1.1.2. SUV-en prestakuntza..............................63

2.4.1.2. Lipidoen kontzentrazioaren determinazioa...........63 2.4.2. Monogeruzak...................................................................64 2.5. SAIO BIOFISIKOAK...............................................................66 2.5.1. Fluoreszentzia bidez egindako neurketak........................66 2.5.1.1. Solutuen askapena.............................................67 2.5.1.1.1. ANTS/DPX saioa.....................................68 2.5.1.1.2. FITC-Dextrano saioa...............................69 2.5.1.2. Solutuen sarrera.................................................70 2.5.1.3. Peptidoko triptofanoen eta dansilo zundaren arteko energi transferentzia...............................................................72 2.5.1.4. Peptidoen fluoreszentzia intrintsekoaren aldaketa bidezko batura-isoterma: ura-mintza banaketaren neurketa.............................................................................................75 2.5.2. Dikroismo zirkularra.......................................................76 2.5.2.1. CD-aren adierazpena...........................................77 2.5.2.2. Egitura sekundarioen determinazioa ..................80 2.6. ELISA....................................................................................81 2.6.1. ELISA zuzena..................................................................82 2.6.2. Liposometan oinarrituriko ELISA.....................................82 2.7. BESTELAKO TEKNIKAK........................................................84 2.7.1. Saio antimikrobianoa......................................................84 2.7.2. Saio hemolitikoa..............................................................85 2.7.2.1. Giza odol-eritrozitroen isolaketa..........................85 2.7.2.2. Hemolisi saioa.....................................................85 3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I. ZELULA-MINTZEAN POROAK ERAGITEKO AHALMENA AURKEZTEN DUEN 2B PROTEINAREN DOMEINUA Aitzinsolasa 89 3.1. SARRERA..............................................................................90 3.1.1. Poliobirusaren 2B proteina..............................................91

Aurkibidea

IV

3.2. ERABILITAKO MATERIALAK, TEKNIKA ESPERIMENTALAK ETA PROTOKOLOEN SAILKAPENA...............................................95 3.2.1. Peptido sekuentziak.........................................................95 3.2.2. Dikroismo zirkularra.......................................................95 3.2.3. Kultibo zelularrekin saioak..............................................96

3.2.3.1. Zelulan espresatzen diren proteinen irazkortasun ahalmena aztertzeko protokoloa.....................................96

3.2.3.2. Peptidoen irazkortasun ahalmena HB-arekiko.....96 3.2.3.3. Peptidoen irazkortasun ahalmena α-sartzinarekiko.................................................................................97

3.2.3.4. TM1 peptidoak eragindako irazkortasunaren inhibizioa................................................................97

3.2.3.5. TM1 eta TM2 peptido biotinilatuen kokapena......98 3.2.4. Lipido-monogeruzekin saioak..........................................98 3.2.5. Lipido-besikulekin saioak................................................98

3.2.5.1. Solutuen askapen saioa......................................99 3.2.5.2. Solutuen sarrera saioa........................................99

3.2.6. AMC eta hemolisi saioak................................................100 3.3. EMAITZAK..........................................................................100

3.3.1. Peptidoen sekuentziak eta aurkezten dituzten egiturak............................................................................................100

3.3.2. Mintz-zelularraren irazkortasunaren handipena peptidoen bidez.................................................................................103

3.3.3. Aktibitatearen kokapena................................................106 3.3.4. TM1 sekuentziaren karakterizazioa................................109 3.3.5. Karga elektrikoaren eragina...........................................117 3.3.6. Peptidoen aktibitate antimikrobianoa eta hemolitikoa....120

3.4. EZTABAIDA.........................................................................121 4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II. GIB-1 BIRUSA NEUTRALIZATZEKO AHALMENA DUTEN ANTI-GP41 2F5 ETA 4E10 ANTIGORPUTZEK BURUTUTAKO FOSFOLIPIDO ETA EPITOPOEN EZAGUMENDUA MINTZ-GAINAZALEAN Aitzinsolasa 129 4.1. SARRERA............................................................................130

4.1.1. 1 motatako giza immunoeskasiaren birusa...................130 4.1.1.1. Birioiaren egitura..............................................130 4.1.1.2. Bizi zikloa .........................................................132

Aurkibidea

V

4.1.1.3. GIB-aren glikoproteinaren egitura eta funtzioa............................................................................................134

4.1.1.3.1. Gp41: azpiunitate integrala…………......135 4.1.1.3.2. Transmintz-aurreko sekuentzia ............136

4.1.1.4. GIB-zelula fusio-mekanismoa............................140 4.1.1.5. Antigorputz neutralizatzaileak...........................141

4.2. ERABILITAKO MATERIALAK, TEKNIKA ESPERIMENTALAK ETA PROTOKOLOEN SAILKAPENA.............................................145

4.2.1. Peptido sekuentziak eta antigorputzak...........................145 4.2.2. ELISA ...........................................................................146

4.2.2.1. ELISA protokolo orokorra..................................146 4.2.2.2. Liposometan oinarrituriko elisa protokoloa........146 4.2.2.3. Lehiaketa elisa protokoloa.................................147 4.2.3. Fluoreszentzia bidez egindako neurketak.......................147

4.2.4. Sintzitio-eraketaren inhibizioaren blokeoa.....................148 4.3. EMAITZAK..........................................................................149

4.3.1. Igarpenak mintz-banaketarako......................................149 4.3.2. Mab-mintza banaketaren azterketa liposometan

oinarritutako ELISA bat erabiliz........................................................154 4.3.3. Peptido-epitopoaren ezagumendua mintzaren

interfasean.......................................................................................157 4.3.4. Fosfolipido-Mab elkarrekintzaren espezifizitatea:

Fosfolipidoaren ezagumendua soluzioan eta mintzetan.....................160

4.4. EZTABAIDA.........................................................................166 5. Kapitulua: LABURPENA ETA ONDORIOAK

5.1. Laburpena........................................................................173 5.1.1. Zelula-mintzean poroak eragiteko

ahalmena aurkezten duen 2B proteinaren domeinua........................173 5.1.2. GIB-1 birusa neutralizatzeko ahalmena duten

anti-gp41 2F5 eta 4E10 antigorputzek burututako fosfolipido eta epitopoen ezagumendua mintz-gainazalean.................................174 5.2. Ondorioak........................................................................176 6. Kapitulua: BIBLIOGRAFIA.......................................179 Autorearen argitalpenak

Aurkibidea

VI

LABURDUREN eta SINBOLOEN ZERRENDA AMP: Saio antimikrobianoa APC: Antigenoak aurkezten dituzten zelulak BCA: Azido bizinkoninikoaren saioa Biot-PE: Fosfatidiletanolamina biotinilatua BSA: Behiaren sero-albumina Ca2+: Kaltzio ioia CBD: Kabeolinara batzen deneko domeinua. Ingelesetik, “Caveolin binding domain” Ci: Kurioa CD: Dikroismo zirkularra CD4+: GIB-ak ezagutzen duen T-linfozitoen giza errezeptorea CHO: Hamster txinatarraren obario zelulak CHO-env: GIB-aren glikoproteina gainazalean espresatzen duten CHO zelulak Chol: Kolesterola CL: kardiolipina Cl-: Kloro ioia Cs+: Zesio ioia Da: Daltona d-DHPE: N-(5-dimetilaminonaftaleno-1-sulfonil)-oa buruan duen 2-Dihexadekanoilfosfatidiletanolamina DilysoCL: Dilisokardiolipina DMEM: Dulbecco´s Modified Eagle Medium DMSO: Dimetilsulfoxidoa DNA: Azido desoxirribonukleikoa DNS: N-(5-dimetilaminonaftaleno-1-sulfonil) edo dansiloa

DOPC: 1,2-Dioleilfosfatidilkolina dsDNA: Kate bikoitzeko DNA DTT: Ditiotreitola Env: GIB-aren gainazaleko proteina aitzindaria ER: Erretikulu endoplasmatikoa Fab: Antigenoa batzen deneko zatikia, ingelesetik antigen binding fragment FD-4: 4.000 kDa-eko fluoreszeina dextranoa FD-10: 10.000 kDa-eko fluoreszeina dextranoa FITC-strep: Fluoreszeinarekin markaturik dagoen estreptabidina FP: Fusio-peptidoa GIB: Giza immunoeskasiaren birusa GM: Gangliosidoa gp160: 160 kDa-eko GIB glikoproteina gp120: 120 kDa-eko GIB glikoproteina gp41: 41 kDa-eko GIB glikoproteina HB: B-Higromizina HC: C-muturreko erregio errepikakorra HeLaT4: Henrietta Lakcs-en uteroaren minbizi zelulak. CD4 errezeptorea eta CXCR ko-errezeptorea espresatzen dituzte HFIP: Hexafluoroisopropanola HN: N-muturreko erregio errepikakorra HPLC: Presio altuko kromatografia likidoa hRBC: Giza-eritrozito zelulak

Aurkibidea

VII

HR1: 2B proteinaren lehengo erregio hidrofobikoa HR2: 2B proteinaren bigarren erregio hidrofobikoa HTLV: Linfozitoen leuzemia eragiten duen birusa IC50: Peptido edo proteina kontzentrazioa zeinetan hemolisiaren %50-a lortzen den IgG: G motatako immunoglobulina HIESA: Harturiko immunoeskasiaren sindromea Kb: Kilobasea Kcal: Kilokaloria kDa: Kilodaltona KX: Itxurazko batura konstantea K+: Potasio ioia LPS: Lipopolisakarido Li+: Litio ioia LUV: Lamela bakarreko besikula luzea LysoPC: Lisofosfatidilkolina LysoPG: Lisofosfatidilglizerola LysobiPA: Azido fosfatidikoaren lisoeratorria L0: Egoera likido ordenatua Lα: Fase lamelar isurkorra Ld: Egoera likido-desordenatua Mab: Antigorputz monoklonala. Ingelesetik, “Monoclonal Antibody” MIC: Hazkuntzaren inhibizioa emateko beharrezkoa den kontzentrazio minimoa MLV: Lamela anitzeko besikula MPER: Mintzari gertu dagoen kanpoaldeko alderdia. Ingelesetik “Membrane proximal external region” mV: Miliboltioa MW: Pisu molekularra NATA: N-azetil triptofanoamida

NBD: 7-Nitrobentzeno-2-oxa-1,3-diazol-4-il nM: Nanomolar NMR: Erresonantzia magnetiko nuklearra Na+: Sodio ioia nm: nanometroa PA: Azido fosfatidikoa PC: Fosfatidilkolina PE: Fosfatidiletanolamina PG: Fosfatidilglizerola PI: Fosfatidilinositola POPC: 1-Palmitil-2-oleilfosfatidilkolina PreTM: Transmintz-aurreko erregioa PS: Fosfatidilserina Rh-PE: B-sulfonil lisamina rodamina baturik duen fosfatidiletanolamina RNA: Azido erribonukleikoa Rb+: Rubidio ioia SDS: Sodio dodezil sulfatoa SDS-PAGE: SDS-aren presentzian egindako elektroforesia poliakrilamida geletan SIV: Tximinoaren immunoeskasiaren birusa Ingelesetik “Simian Inmunodeficiency virus” SLE: Eritematosoa eta sistemikoa den Lupusa SM: Esfingomielina ssRNA+: Kate bakarreko eta polaritate positiboa duen RNA ssRNA-: Kate bakarreko eta polaritate negatiboa duen RNA Strp: Estreptabidina SUV: Lamela bakarreko liposoma txikiak SV: Sindbis birusa Tm: Lipidoen fusio tenperatura

Aurkibidea

VIII

TMD: Transmintz domeinua TM1: Lehenengo transmintz domeinua. 2B proteinari dagokion 35-55 aminoazidoak TM2: Bigarren transmintz domeinua. 2B proteinari dagokion 61-81 aminoazidoak UV: Ultramorea [θ]: Eliptizitate molarra Deg.cm2.dmol-1 6-HB: 6-helize sorta. Ingelesetik, “6 helix bundle” [35S]met/Cys: [35S]metionina/[35S]zisteina marka erradiaktiboa α-HL: α-hemolisina

Ǻ: Angstrom ∆Ψ: Transmintz potentziala Ψ0: Gainazaleko potentzial elektrostatikoa Ψd: Potentzial elektrostatiko dipolarra µF: mikrofaradio λ: Uhin-luzera λexc: Kitzikatze uhin luzera λem: Igorpen uhin luzera πc /πexc: Txertaketarako presio kritikoa π0: Hasierako presioa σ: Gainazaleko karga dentsitatea

Aurkibidea

IX

Aurkibidea

X

1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak

1

______________________________________________________________________ 1.1. MINTZ-BIOLOGIKOAK Mintzarekin batera bizitza jaio zen. Mintza agertu arte ez zen izaki

bizidunik existitzen, soilik osagai biologiko askeak. Bizitzak, mugak behar ditu, zelularen barne-osagaiak sakabanatu ez daitezen eta inguruneko osagaiak sar ez daitezen. Mintza zaindariz beteriko harresi baten modukoa da, mezuak edo energia eramaten dituzten molekulen sarrera eta irteera selektiboa baimentzen duena.

1.1.1. MINTZ-BIOLOGIKOEN FUNTZIO ETA

EZAUGARRIAK Mintz plasmatikoaren egitura azaltzeko, Singer eta Nicolson-ek

(Singer, S. J. eta Nicolson, G. L., 1972) mosaiko isurkorraren eredua proposatu zuten. Eredu honek mintzaren izaera isurkorra eta dinamikoa isladatzen du, fosfolipidoak eta proteinak mintzaren gainzaletik lateralki barreiatzeko ahalmena dutela iradokitzen duelarik. Baina eredu honek ez ditu beste ezaugarri batzuk aintzat hartzen, hain zuzen ere mintza funtzionalki eta egituralki konplexua egiten dituztenak.

Ikuspuntu mekanikotik, mintzak ondorengo definizioa izan

dezake: “Aldamenean dituen bi domeinu likido banatzen dituen materiala, bere kurbatura erradioarekin alderatuz lodiera oso txikia duena eta inguruko medioak eragiten dizkion tentsioak jasateko gaitasuna duena (Bloom, M., Evans, E. eta lank., 1991).


2

1.1. Irudia: Mintzaren egitura.

Eredu orokorrak. A) Singer-Nicolson-en eredua. B) Bertsio eguneratua eta zuzendua (Engelman, D. M., 2005).

Ikuspuntu funtzionaletik,

zelula-mintzek elkar-erlazionaturik dauden lau funtzio orokor betetzen dituzte (Jain, M. K., 1988; Evans, W. H., 1989; Gennis, R. B., 1989; Wilschut, J., 1991):

a) Zelula barneko atal ezberdinak banatzen dituzten hesi fisikoak

dira. Modu honetan atal bakoitzaren osaketa mantentzen da, eta prozesu biokimikoak era egoki batean burutu daitezke.

b) Mintzen egiturak irazkortasun selektiboa baimentzen duenez,

molekulen garraio mugatua ematen da. c) Zelula barneko atalen artean seinale kimikoak edo/eta energia

trukatzen duten interfaseak dira. d) Berauei atxekiturik dauden eta aurreko funtzioak bete behar

dituzten molekulei ingurune egokiaz hornitzen diete. Besteak beste: entzimei, ioi-ponpei, errezeptoreei etab.

1.1.2. MINTZAREN OSAKETA Mintzaren osagai nagusiak lipidoak eta proteinak dira.

Karbohidratoak ere ageri dira, baina glikolipido edo glikoproteina moduan eta mintzaren pisu sikuaren %10 gainditu gabe.


3

Mintz motaren arabera, lipido eta proteinen kantitate erlatiboak

oso ezberdinak izan daitezke. Mintzetan aurkitzen den proteina kantitatea mintzaren dentsitatearekin erlazionaturik dago beraz, zenbat eta proteina kantitatea altuagoa izan, mintzaren dentsitatea altuagoa da (Gennis, R. B., 1989).

Taula 1.1.: Lipido eta proteina osaketa zenbait animali eta bakterio mintzetan.

L/P, lipido/proteina erlazioa pisu sikuan.

Mintzak Lipido nagusienak a L/P (p/p)

Proteina nagusienak

-Mielina (gizakiak) -PC 10% -PE 20% -PS 8,5% -SM 8,5% -Chol 27% -GM 26%

3-4 -Proteina basikoa -Lipofilina (proteolipidoa)

-Eritrozitoak (gizakiak) -PC 25% -PE 22% -PS 10% -SM 18% -Chol 25%

0,75 -3. banda -Glikoforina -Glizeraldehido-3-fosfato deshidrogenasa

-Errezeptore kolinergikoaren mintza (Torpedo marmorata)

-PC 24% -PE 23% -PS 9,6% -Chol 40%

0,7-0,5

-Azetilkolinaren errezeptorea

-Barnealdeko mintza (Escherichia coli)

-PE 74% -PG 19% -CL 3%

0,4

-Mintz purpura (Halobacterium halobium)

-Fosfatidilglizerol-fosfatoa 52% -Glikolipidoak 30% -Lipido neutroak 6%

0,2 -Bakteriorrodopsina

a Erabili diren laburdurak hurrengoak dira: PC, fosfatidilkolina; PE, fosfatidiletanolamina; PS, fosfatidilserina; SM esfingomielina; PG, fosfatidilglizerola; Chol, kolesterola; CL, kardiolipina; GM gangliosidoa. Taula (Gennis, R. B., 1989)-etik moldatua izan da.


4

1.1.2.1. MINTZ PROTEINAK Mintzek, %20-%80 arteko (p/p) proteina-portzentajea daukate.

Mintz-proteinak funtzio aktiboak betetzen dituzten osagaiak dira. Mintzari lau modu ezberdinetan loturik agertu daitezke:

1.- Transmintz-proteinak. Bigeruza erabat zeharkatzen duten

proteinak dira. Bigeruza behin zeharkatu dezakete, glikoforinak egiten duen moduan, edo behin baino gehiagotan, bakteriorrodopsinak egiten duen bezala (1.2 irudia) (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1999).

2.- Mintzera ainguraleku baten bidez batzen diren proteinak.

Ainguralekua aminoazido apolarren hondar zatiki bat izan daiteke. Zatiki hau aurreikuspen metodoen bidez identifikatu daiteke, b5 zitokromo (Takagaki, Y., Radhakrishnan, R. eta lank., 1983) edo TrwB-ren kasuan egin zen moduan (Hormaeche, I., Iloro, I. eta lank., 2004). Gantz azidoak edo fosfolipidoak kobalenteki lotuta dituzten proteinek, gantz azido edo fosfolipido hauek erabiltzen dituzte ainguraleku gisa mintzera batzeko. Azken hauen adibideak, proteina miristilatuak eta palmitilatuak (Resh, M. D., 1994), eta glikosil-fosfatidilinositolera lotuta dauden proteinak dira (Cross, G. A., 1987; Low, M. G., 1987).

3.- Mintzaren gainazalarekin elkarrekiten duten proteinak.

Elkarrekintza elektrostatikoa izan daiteke, mielina proteina basikoan gertatzen den moduan (Cajal, Y., Boggs, J. M. eta lank., 1997), edo hidrofobikoa, zenbait peptido anfipatikoen kasuan (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1999), edo E. coli-ren α-hemolisinaren kasuan bezala (Sanchez-Magraner, L., Cortajarena, A. L. eta lank., 2006).

4.- Mintzean baturik dauden beste proteinekin elkarrekiten

dutenak, adibidez, protoi ATPasa-ren F1 zatikiarekin gertatzen den moduan. F1 zatikia, mintza zeharkatzen duen F0 zatikira batzen da (Pedersen, P. L. eta Carafoli, E., 1987). Beste adibide bat eritrozito zitoeskeletoaren proteinak dira, mintzera “3. banda” transmintz proteinarekin elkarrekiten batzen direnak (Bennett, V., 1985; Hansen, J. C., Skalak, R. eta lank., 1997).


5

1.2. Irudia: Mintz-proteinak bigeruzan batu ahal diren modu ezberdinen

eskema. (1) Behin edo (2) behin baino gehiagotan mintza zeharkatzen dituzten transmintz proteinak. (3) Mintzari lipido batera lotura kobalente baten bitartez batzen diren proteinak. (4) Mintzari beraien egitura sekundariokoaren parte den zatiki hidrofobiko baten bitartez lotzen diren proteinak. (5) Mintzaren gainazalari indar elektrostatikoen bitartez, edo (6) elkarrekintza hidrofobikoen bitartez batzen diren proteinak. (7) Beste transmintz proteina batera batzen diren proteinak. Irudia (Gennis, R. B., 1989)-tik egokitua izan da.

Mintz-proteinak, proteina intrintsekoetan (integralak) edo

estrintsekoetan (periferikoak) sailkatu daitezke. Sailkapen hau, proteina mintzetik erauzteko erabiltzen den tratamenduan oinarritzen da. Proteina estrintsekoak indar ioniko altuko tanpoiekin, pH aldaketekin edo EDTA moduko katioi dibalenteen kelatzaileekin erauzi daitezken proteinak dira. Proteina intrintsekoak erauzteko tratamendu gogorragoak erabili behar dira, askotan mintza ere deusezten dutenak, adibidez, detergenteak edo disolbatzaile organikoak erabiliz (Tanner, M. J. A.). Proteina estrintseko eta intrintsekoen arteko bereizketak, ez du proteina eta mintzaren arteko lotura mota nolakoa den zehazten, baina bai loturaren indar erlatiboa.

1.1.2.2. LIPIDOAK Lipidoak oso talde heterogeneoa osatzen duten sustantziak dira.

Hauen ezaugarri amankomuna, uretan disolbagarritasun baxua daukatela da.


6

Lipidoen definizioetako bat hurrengoa da: “Jatorri biologikoa

daukaten sustantziak dira, kloroformoaren moduko disolbatzaile organikoetan disolbagarriak direnak eta uretan oso gutxi edo disolbaezinak direnak (Voet, D. eta Voet, J. G., 1992).

Mintzaren egitura, bigeruza eratzeko ahalmena daukaten lipido

anfipatikoei (batez ere fosfolipido eta esfingolipidoei) dagokie. Lipidoen ezaugarriei esker bigeruzek kimikoki oso ezberdinak diren bi alde dituzte: nukleo hidrofobikoa eta interfasea. Nukleo hidrofobikoa, fosfolipidoen kate hidrokarbonatuek eta kolesterolak osotzen duten bitartean, interfasea lipidoen buru polarrek osatzen dute.

Mintz biologikoen arteko lipido konposaketa oso ezberdina da,

mintz mota bakoitzaren funtzioaren espezifizitatea modu honetan isladatzen delarik.

Mintz-lipidikoen ezaugarri interesgarri bat, lipido mota ugarietan

aberatsak direla da. Arestian, lipidoen funtzio bakarra bigeruza eratzea zela pentsatzen zen, baina azalpen hau ez da bat etortzen aurkezten duten dibertsitatearekin. Mintz bakar bat ehun bat lipido-espezie ezberdinez osoturik egon daiteke eta mintz mota bakoitzak lipido konposaketa ezberdin bat izango du. Azkenaldi honetan lipidoek mintzarekin erlazionatuta dauden prozesu aktiboetan parte hartzen dutela onartzen ari da, lipido bakoitzak prozesu horietan zenbait zeregin izanik.

Zeregin hauetako batzuk bigeruzaren egitura eratzeaz gain,

hurrengoak dira: -Bigeruzaren seinaleztapen zelularrean parte hartzea. -Bigarren mezulari moduan jokatzea. -Hazkuntza zelularraren erregulazioan parte hartzea. -Erreakzio biosintetikoetan parte hartzea. -Kurbadura negatiboa daukaten erregioak eratzea. 1.1.2.2.1. SAILKAPENA Zelula-mintzak osatzen dituzten lipido nagusienak

diazilglizerolean (fosfolipidoak) eta zeramidan (esfingolipidoak) oinarritzen dira.


7

1.1.2.2.1.1. Glizerofosfolipidoak Fosfolipidoetan glizerolaren hidroxilo primario taldea fosforilatua

dago. 1.2 taulan glizerofosfolipidoen fosfato terminalari batu daitezkeen hondar ezberdinak irudikatzen dira, fosfatidilkolinak, fosfatidilserinak, fosfatidiletanolaminak lortzen direlarik besteak beste. Beste bi hidroxilo taldeak, orokorrean, beste bi gantz azidoei ester lotura baten bitartez loturik egoten dira. Gantz-azido hauen luzera eta asegabetasun maila oso aldakorra izaten da.

1.2. Taula: Glizerofosfolipidoen egitura. Eskuinaldeko irudia: Glizerofosfolipidoen egitura orokorra; X-ak buru polar ezberdinak adierazten ditu. Ezkerreko taula: Buru polar ezberdinen egiturak. (Nelson, D. L. eta Cox, M. M., 2005)-tik egokitua.

Kardiolipinak (CL), 1,2-diazilfosfoglizerido dimerikoak dira eta oso

ugariak dira batez ere mitokondriaren barne-mintzean eta zenbait bakterioen mintzetan (Dowhan, W., 1997).

Glizerofosfolipidoaren izena

X-ren formula

Azido fosfatidikoa

Fosfatidiletanolamina Fosfatidilkolina Fosfatidilserina

Fosfatidilglizerola

Fosfatidilinositola

Kardiolipina

Gantz-azido asea (Azido palmitikoa)

Gantz-azido asegabea (azido oleikoa)


8

1.1.2.2.1.2. Esfingolipidoak Esfingolipidoak esfingosinan oinarriturik daude (1.3 taula).

Zeramidak, glizerolari amida lotura baten bitartez, bigarren gantz-azido bat loturik daukaten esfingosinak dira. Esfingolipido mota ezberdinak, fosfolipidoekin gertatzen den moduan, zeramidaren hidroxilo primarioari lotzen zaion talde polarraren arabera sailkatzen dira.

Talde polarra fosforilkolina denean, esfingolipidoari esfingomielina

deritzaio, azukre arrunt bat denean zerebrosidoak deritzaie eta azido sialiko hondar bat baino gehiagoko oligosakarido konplexuak dituztenean, ostera, gangliosidoak.

1.3. Taula: Esfingolipidoen egitura. Ezkerraldeko irudia: Esfingolipidoen

egitura orokorra, X-ak buru polar ezberdinak adierazten ditu. Eskuinaldeko taula: Buru polarren egiturak (Nelson, D. L. eta Cox, M. M., 2005)-tik egokitua.

Esfingolipidoen izenak

X-aren formula

Zeramida

Esfingomielina

-Glikolipido neutroak: Glukosilzerebrosidoa

Laktosilzeramida

Gangliosidoa GM2

Gantz azidoa


9

1.1.2.2.1.3. Esterolak Esterolak landareen, animalien eta mikroorganismo eukariotoen

mintzetan aurkitzen dira. Kolesterola (chol) animalietan agertzen den esterolik ugariena da. Kolesterola molekula trinko, zurruna eta hidrofobikoa da, hidroxilo talde txikia buru polartzat daukana (1.3 irudia).

Animalien mintz plasmatikoan, lisosometan, endosometan eta

Golgi aparailuan aurkitzen da. Animalien mintz plasmatikoaren %30-a gutxi gorabehera kolesterolez osaturik dago.

1.3. Irudia: Kolesterol molekularen irudikapen molekularra. (Nelson, D. L.

eta Cox, M. M., 2005)-tik egokitua.

Alkilo alboko katea

Nukleo esteroideoa Buru polarra


10

1.1.3. LIPIDOEN BANAKETA ASIMETRIKOA

MINTZEAN 1.1.3.1. LIPIDOEN BANAKETA ZELULA BARNEKO ORGANULU

EZBERDINEN MINTZETAN Zelula eukariotoan, organulu batetik bestera mintzetako lipido

konposaketa asko aldatzen da. Organulu guztiek lipido espezie berdinak dituzte gutxi gorabehera, baina beraien arteko erlazio molarra oso ezberdina da (1.4. taula), organulu bakoitzeko mintzaren osaketa bakarra eta zehatza delarik. Kolesterolaren presentzia adibidez oso altua da mintz plasmatikoan, erretikuluko mintzarekin edo Golgi aparatuko mintzarekin konparatzen baldin badugu.

Lipido gehiena erretikulu endoplasmatikoan sintetizatzen da,

beraz mintzetan agertzen den lipido konposaketa ezberdintasun horrek, lipidoak organulu bakoitzera modu espezifiko batean garraiatuak izan behar direla iradokitzen du (van Meer, G., 1989). PE, PI eta PS, adibidez, erretikuluaren azalera zitoplasmatikoan bakarrik sintetizatzen dira eta bertan geratzen dira; PC-arentzat aldiz, bere translokazioa baimentzen dituzten flipasa espezifikoak daude. Honek zeharkako lipido asimetria bat eragiten du.

Gantz azidoen insaturazio mailari dagokionez, ezberdintasunak

daude organulu ezberdinen artean. PS-aren kasuan adibidez, erretikulu endoplasmatikoan gantz azido insaturatuen portzentajea %45-ekoa da %75-raino heldu daitekeelarik. Golgi aparatuan %36-koa da eta mintz plasmatikoan %29-koa (Keenan, T. W. eta Morre, D. J., 1970).


11

1.4. Taula: Arratoi gibelaren zenbait organulu intrazelularren ohiko lipido

konposaketa. Baloreak lipido bakoitzaren portzentaje molarrari dagozkie. E. D. : Ez detektatua, (van Meer, G., 1989)-tik lorturiko datuak.

Fosfolipidoa Mitokondriaren mintza

Erretikulu endoplasmatikoa

Mintz-plasmatikoa

Lisosomaren mintza

SM PC PI PS PE CL

LisobiPA Chol/fosfolipido

(mol/mol)

0.5 % 40.3 % 4.6 % 0.7 % 34.6 % 17.8 % 0.2 % 0.03 %

2.5 % 58.4 % 10.1 % 2.9 % 21.8 % 1.1 % e.d.

0.08 %

16.0 % 39.3 % 7.7 % 9.0 % 23.3 % 1.0 % e.d.

0.4 %

20.3 % 39.7 % 4.5 % 1.7 % 14.1 % 1.0 % 7.0 % 0.5 %

1.1.3.2. LIPIDOEN BANAKETA MINTZ PLASMATIKOAN ZEHAR Mintz plasmatikoa ez-uniformea eta konplexua den agregatu

makromolekularra da, zelularen egoera fisiologikoaren arabera, bere konposaketa kimikoa eta fisikoa etengabe aldatzen duena. Mintz honetan konposaketa lipidikoan asimetria nabarmen bat agertzen da.

1.1.3.2.1. ZEHARKAKO ASIMETRIA: MINTZ

PLASMATIKOAREN KANPOALDEKO ETA BARNEALDEKO MONOGERUZAK

Mintz plasmatikoaren bi monogeruzak euren konposaketan,

propietateetan eta bertan ematen diren aktibitate metabolikoetan desberdintzen dira. Kanpoaldeko monogeruzak, azalerako markatzaile metabolikoen papera betetzen duten errezeptoreak eta karbohidrato espezializatuak ditu (Akiyama, S. K., Nagata, K. eta lank., 1990; Hakomori, S. eta Igarashi, Y., 1993; Hakomori, S. eta Igarashi, Y., 1995).


12

Barneko monogeruza eta alboan dagoen fase urtsua aldiz, erreakzio metaboliko konplexuak burutzen diren guneak dira. Erreakzio hauek, monogeruza osatzen duten lipidoen banaketa espazialagatik eta osaketagatik mugatuak daude. Zenbait lipido erreakzio hauetan partaide aktiboak dira, kofaktore eta substratu moduan jokatzen dutelako. Honen adibide on bat giro extrazelularretik barne ingurunera gertatzen den seinale transferentzian inplikaturik dauden bigarren mezulariak dira, fosfoinositidoak kasu (Berridge, M. J., 1987; Nishizuka, Y., 1992; Berridge, M. J., 1993). Lipido hauek funtzio zelular garrantzitsuak betetzen dituztenez, mintz plasmatikoan proportzio baxuan agertzen dira eta kontrol metaboliko zorrotz baten menpe aurkitzen dira. Beraz bi monogeruzen konposaketa lipidikoak azalera bakoitzaren funtzioa zehazten du.

Mintzaren kanpo geruzaren funtzioa hesi geldo bat eratzea da.

Orokorrean, kanpo monogeruzaren lipido-osagaiak ez du kanpo medioan dauden molekulekin elkarrekintza espezifikoetan parte hartzen.

PC, SM eta chol-a mintz plasmatikoaren kanpo-monogeruzan

sarrien agertzen diren lipidoak dira, baita glikolipidoak ere, baina maila baxuagoan (1.5 taula). Kolina taldeak oso hidratatuak daude, 25 eta 30 ur molekula daude kolina buru polar talde bakoitzeko; etanolaminaren kasuan 10-12 ur molekula daude buru polar bakoitzeko (Simon, S. A. eta McIntosh, T. J., 1989). PC-aren hidratazio geruzak bi mintzak elkarri hurbiltzea edo beste molekula batzuk mintzarekin elkartzea eragozten du. PC-aren funtzio posible bat mintz plasmatikoaren kanpoko monogeruzan makroegitura hidratatuen kontaktua eragoztea izan daiteke (McIntosh, T. J., Magid, A. D. eta lank., 1989).


13

1.5. Taula: Mintz plasmatikoaren zeharkako asimetria. Eritrozitoen mintz

plasmatikoaren kanpoko eta barneko mintzaren arteko fosfolipidoen banaketa adierazten da. Fosfolipido espezifikoen banaketa determinatzeko zelulak C fosfolipasarekin tratatzen dira. Entzima honek kanpoaldeko fosfolipidoen buru polarrak soilik erauzten ditu, barnealdekoak osorik mantentzen direlarik. Erauzi diren buru polarren proportzioak kanpoaldeko monogeruzaren lipido frakzioaren zenbatekoa ematen digu. Morez, kanpoaldeko monogeruzan banatuta agertzen diren lipido bakoitzaren portzentajeak azaltzen dira, eta arrosaz monogeruza zitoplasmatikoan agertzen direnena. (Zachowski, A., 1993; Nelson, D. L. eta Cox, M. M., 2005)-tik lorturiko datuak.

Mintzeko fosfolipidoak Mintzeko fosfolipidoen portzentaje

osoa

Fosfolipidoen banaketa mintzean

-Fosfatidiletanolamina -Fosfatidilkolina -Esfingomielina -Fosfatidilserina

-Fosfatidilinositola -Fosfatidilinositol-4-

fosfatoa -Fosfatidilinositol-4,5

bifosfatoa -Azido fosfatidikoa

30 27 23 15 5 5 5 5

Kanpoaldeko Barnealdeko geruza geruza

100 0 100


14

Fosfolipido anionikoek proteina ezberdin askorekin elkarrekiteko ahalmena daukatela ikusi da. Beraz, karga kanpo monogeruzan egongo balitz, molekula askoren elkarrekintza bigeruza lipidikoarekin faboratuko litzateke. Mintz plasmatikoaren kanpo-mintzean, kargadun molekulen agerpenak zenbait baldintza fisiologikoetan ematen den lipidoen transferentzia sistemaren erantzun esklusiboa da (Diaz, C. eta Schroit, A. J., 1996). Sistema honetan akatsak emateak, kanpo mintzean fosfolipido anionikoak agertzea dakar (PS-a adibidez), zelula arteko seinale batean bilakatuz, eta honela immunitate-sistemak zelula eliminatu egiten du (Connor, J., Pak, C. C. eta lank., 1994). Kanpo monogeruzan agertzen ohi den karga bakarra glikolipidoek eragindakoa da.

Mintz plasmatikoaren barnealdeko monogeruzak,

kanpoaldekoarekin konparatuz, oso lipido-osaketa berezia aurkezten du eta funtzio ezberdinak betetzen ditu. Barne mintzean ez dago karbohidratoez osoturiko geruzarik, hots, glikokalixaren antzeko zerbait. Geruza babesle honen gabeziak makromolekulek mintzaren gainazala errazago eskuratzea eragiten du. Nahiz eta PC, SM eta Chol monogeruza honetan agertu, PE osagai neutrorik arruntena da. Fosfolipido anioniko anitz eta kantitate altuan agertzen dira, PS eta PI-ren presentzia azpimarratzekoa delarik (1.5 taula). Fosfolipido hauek monogeruza zitoplasmatikoan bakarrik agertzen direnez, aldebakarrekoak direla esan daiteke. Kargadun talde hauek interfasean agertzen direnez, elkarrekintza elektrostatikoak alderdi honetan sarriagoak izaten dira. Beraz, mintz plasmatikoaren barnealdeko azalerara proteina ugari batzeko aukera handitzen da (Heimburg, T. eta Marsh, D., 1995; Leenhouts, J. M., van den Wijngaard, P. W. eta lank., 1995).

Barnealdeko mintzarekin elkarregiteko ahalmena daukaten

proteinek aminoazido kationikoetan oso aberatsak diren domeinu espezializatuak dituzte, nolabait lipido anionikoekin elkarrekintza elektrostatikoa faboratuz (Mosior, M. eta McLaughlin, S., 1992; Buser, C. A., Kim, J. eta lank., 1995; Heymann, J. B., Zakharov, S. D. eta lank., 1996).

Kanpoko monogeruzarekiko, beste asimetria mota bat nabaritu

daiteke, barne mintzean dagoen fosfolipido asegabeen portzentajea altuagoa da. Asegabetasun maila altu honek monogeruzari jariakortasun handia ematen dio, eta honek proteinen txertaketa errazten du.


15

Duela urte gutxi arte, mintzaren lipido-asimetria, bi monogeruzak kokatzeko duten berezko giro asimetriko naturalaren ondorioa zela uste zen. Baina monogeruza batetik bestera ematen den lipidoen difusioa prozesu geldoa da. Geroago, zelula biziek mintzeko fosfolipidoen zeharkako banaketa kontrolatu ahal izateko, mekanismo landu bat garatu dutela aurkitu zen (van Meer, G., 1989; Zachowski, A., 1993; Boon, J. M. eta Smith, B. D., 2002). Fosfolipasa endogenoek, erreazilasek, flipasek, etab hartzen dute parte mekanismo hauetan.

1.1.3.3. LIPIDO DOMEINUAK Aurreko atalean aipatu den moduan, mintzeko lipidoen

zeharkako banaketa ez da uniformea. Mintz-domeinuak, lipidoak mintzaren planoan zehar fase hetereogeneo ezberdinetan banatzen direnean eratzen dira (Simons, K. eta Ikonen, E., 1997). Mintzaren beste alderdi batzuekin alderatuz, propietate fisiko eta konposaketa ezberdinak dituzten erregioak dira. Domeinu hauek mintz plasmatikoetan zein eredu mintzetan ikus daitezke. Lipidoen zeharkako antolakuntza mintzetan kate hidrokarbonatuen ezberdintasunen menpe (Sankaram, M. B., Marsh, D. eta lank., 1994; Garidel, P., Johann, C. eta lank., 1997), eta berezko interfasean gertatzen diren elkarrekintzen menpe dago (Eklund, K. K., Vuorinen, J. eta lank., 1988; Gawrisch, K., Ruston, D. eta lank., 1992; Huang, J., Swanson, J. E. eta lank., 1993).

Kolesterol eta esfingomielinan aberatsak diren domeinuak

adibidez, zurrunak eta ordenatuak dira (isurkortasun txikia dute). Detergente ez-anionikoak erabiliz askoz zailagoak dira solubilizatzen. Egoera likido desordenatuan dauden fosfolipido itsaso batean (Ld), egoera likido-ordenatuan (Lo) dauden SM eta chol-ak baltsa (raft) moduko bat osotuko dute (1.6. irudia). Esfingolipidoen kate hidrokarbonatu luze eta aseek, kate hidrokarbonatu asegabeek baino, elkarrekintza egonkorrago eta zurrunagoak eratzen dituzte kolesterolarekin. Esfingolipidoak bata bestearekin elkartzen dira, ziur aski buruen arteko elkarrekintzen bidez. Esfingolipidoen buruek, kanpo monogeruzaren planoan, berauen kate hidrokarbonatuek (orokorrean aseak direnak) baino azalera handiagoa betetzen dute. Honengatik esfingolipidoek utzitako hutsuneak kolesterol molekulek betetzen dituzte (Simons, K. eta Ikonen, E., 1997).


16

Raft motatako domeinuak ez daude mintzean era zurrun batean

banatuta, honela, mintz-proteinak raft-etatik kanpora eta barnera mugitu daitezke, segundutako denbora eskalan.

Mikrosegundutako eskala batean (prozesu biokimikoekin hobeto

datorrena bat) proteinen gehiengoa raft-etan kokatuta dago. Esperimentu ezberdinek frogatzen dute, proteina hauen arteko seinaleztapena eten egiten dela mintz-plasmatikoan dagoen kolesterola bahitzen bada, lipido-raft hauek deuseztatzen baitira.

1.6. Irudia: Mintz–plasmatikoan aurkitzen diren mikrodomeinuen (raft)

egitura. Elkarketa hauek mintz proteinetan oso aberatsak dira, adibidez, mintzeko kanpo monogeruzako GPI-ra batzen diren proteinetan. Raft motako domeinuak indar atomikoko mikroskopiarekin ikusita: laranja kolorearekin SM-n aberatsak diren raft-ak eta beltzez DOPC-a; lipido bigeruza mika baten gainera transferitu da. Azaltzen diren hori koloreko tontortxoak GPI-ra batzen diren proteinak dira (Fosfatasa alkalinoa batuta daukate). Proteina hauek soilik raft-etan aurkitzen dira. Azpialdean adierazpen grafiko bat irudikatu da: esfingolipido eta kolesterolaren arteko elkarketa egonkorrak mintz plasmatikoan. Laranjaz SPM eta urdinez Chol adierazi dira. Irudia (Saslowsky, D. E., Lawrence, J. eta lank., 2002)-tik egokitu da.


17

Lipido-raft-ak funtzio biologiko ugariekin erlazionatu dira, adibidez, seinale transdukzioarekin, zelularen morfogenesiarekin, zelula-mintzetako trafikoarekin eta birus eta toxinen sarrerarekin.

1.1.4. BIGERUZAREN EGITURA Bigeruza bi erregiotan banatzen dela ezagutzea posiblea egin

duen ebidentzia (interfase eta nukleo hidrokarbonatuan), 1,2-dioleil-sn-glizero-3-fosfatidilkolina (DOPC) lipidoa Lα fasean (fase lamelar isurkorra) kristalografikoki determinatzea izan zen (Wiener, M. C. eta White, S. H., 1991; Wiener, M. C. eta White, S. H., 1991; Wiener, M. C. eta White, S. H., 1992).

DOPC lipidoaren Lα fasearen egitura, lipidoa osatzen duten talde

molekularren banaketa espazialean oinarritzen da (karboniloak, fosfatoak…) (Wiener, M. C. eta White, S. H., 1991). Egiturak guztiz ebazteko, autoreek X-izpietan eta neutroien difrakzioan oinarrituriko teknikak erabili zituzten, leku estrategikoetan metal astunekin markaturiko laginak erabiliz. 1.7 irudian, transmintz ardatzen lipidoa osatzen duten talde molekularren batez besteko banaketa azaltzen da denboran zehar (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1998). Adierazpen honek, bigeruza isurkorrak bi erregioetan banatzen direla iradokitzen du, fase-arteko erregio eta erdiko erregio hidrokarbonatuan. Uraren banaketa, bigeruzaren erditik hurbilen dagoen glizerolatik hasten da eta gero eta altuagoa da bigeruzatik urruntzen den heinean.

Egitura honetatik ateratzen den ondoriorik nabarmenena

ondorengoa da: interfaseak hartzen duen zabalera, gutxi gorabehera erregio hidrofobikoak betetzen duenaren berdina dela da (bakoitzak, guztira 30Å gutxi gorabehera hartzen ditu). Interfasearen erregioa ur-molekulez, fosfolipidoen buru polarrez, glizerolez, karboniloz eta metileno taldeez osoturiko nahasketa konplexu bat da. Mintzaren alde honek peptido eta proteinekin elkarrekintza ez-kobalenteak eratzeko aukera ugari eskaintzen ditu. Bigeruzaren hemigeruza bakoitzaren (monogeruzak ere deituak) interfaseak 15 Å ditu. Tamaina hau nahikoa da α-helize bat (10 Å-eko diametroa duena) bere baitan, bigeruzari paraleloki kokatua moldatzeko (1.7 irudia). Interfaseak heterogeneizitate kimiko altua aurkezteaz gain, polaritate gradiente bat ere aurkezten duten erregioak dira (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1998). Gero eta interfaseko erregioa erdigunetik gertuago egon, giroko polaritatea txikiagoa da (1.7 irudia). Beraz, interfaseak, euren


18

heterogeneizitate kimiko eta polaritate gradienteen eraginez proteina ez konstitutiboekin (adibidez, toxinekin) elkarrekintzak emateko tokirik aproposenak dira (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1999).

1.7. Irudia: DOPC bigeruza baten egitura, egoera isurkorrean. A) Mintza

osatzen duten talde kuasi-molekularren banaketa bigeruzan zehar. Bigeruza barnean, leku espezifiko batean, egitura talde zehatz bat aurkitzeko probabilitatea aurkezten da. B) DOPC bigeruza baten polaritate profila, karga partzialetatik eta fosfolipido talde ezberdinen bolumenetatik kalkulatua izan dena. Interfasearen polaritate gradientea, kargadun mintzen energi-aske elektrostatikoen profilekin bat dator. 10 Å-eko diametroa duen α-helize bat bigeruzari paraleloki kokatu daiteke interfasean. (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1999)-tik moldatua izan da.

Interfasea

Prob

abal

itat

ea

Interfasea Nukleo hidrokarbonatua

Kar

ga d

ents

itat

ea

Zentruarekiko distantzia Å Kolina Fosfatoa Glizerola

α- heli zea


19

1.1.5. BIGERUZAREN EZAUGARRI

ELEKTROSTATIKOAK Mintzekin erlazionatutako hiru potentzial mota daude:

gainazaleko potentzial elektrostatikoa (ψo), potentzial elektrostatiko dipolarra (ψd) eta mintzaren zeharkako potentzial elektrostatikoa (∆ψ) (1.8 irudia).

1.1.5.1. GAINAZALEKO POTENTZIAL ELEKTROSTATIKOA Gainazaleko potentzial elektrostatikoa, mintzaren gainazalean

dauden molekula kargadunen ondorioa da. Barnealdeko mintz-gainazalak, lehen aipatu den bezala, negatiboki kargaturik daude, bertan dauden proteinen karga negatibo eta fosfolipidoen eraginagatik (Gennis, R. B., 1989). Lipidoetako fosfatoen talde anionikoak gainazalean finko daude, eta dagozkien kontra-ioiekin neutralizatuak daude. Kontra-ioiak mugikorrak dira eta ez daude mintzaren gainazalean finkaturik; mugikortasun hau dispertsio entropikoen indarren eta kargen erakarpen elektrostatikoen arteko orekaren emaitza da. Beraz, kontra-ioiak ez dira gainazalean bertan kokatzen, baizik eta mintzetik distantzia batera, geruza elektriko bikoitza sortuz (1.8 irudia).

1.1.5.2. POTENTZIAL ELEKTROSTATIKO DIPOLARRA Potentzial elektrostatiko dipolarra mintzaren barneko potentzial

bat da. Potentzial hau, glizerola eta gantz azidoen edo/eta interfasean dauden ur molekulen arteko ester loturetatik dator (1.7 irudia). Talde hauek modu berezi batean orientatuak daude, eta orientazio honek mintzaren nukleo hidrofobikoa, kanpoaldeko fase urtsuarekin konparatuz, positiboa izatea baimentzen du. Potentzial dipolarrak ehuneko mV-tako balorea dauka (Honig, B. H., Hubbell, W. L. eta lank., 1986). Bigeruzaren barnealdean dagoen potentzial positibo bat denez, mintzean zehar anioien mugimendua laguntzen du katioien mugimenduarekin konparatuz (5.5 kcal.mol-1–eko energi desberdintasun batekin) (Gennis, R. B., 1989).


20

Pisu molekular baxuko anioi eta katioien irazkortasuna mintzean

zehar oso altua da baina, baldintza normaletan bi ioi mota hauen irazkortasun koefizienteetan potentzial elektrostatiko dipolarrak ez dauka eraginik, oso txikiak baitira (Gennis, R. B., 1989).

1.1.5.3. MINTZAREN ZEHARKAKO POTENTZIAL

ELEKTROSTATIKOA Mintzaren zeharkako potentzial elektrostatikoa, mintzak banatzen

dituen bi fase urtsuen potentzial elektrostatikoen arteko ezberdintasuna bezala definitzen da (1.8 irudia). Mintzean potentzial elektrostatiko bat eratzeko zenbait modu daude: ohikoena ioi mota baterako espezifikoa den garraiatzaile (edo ionoforo) bat erabiltzea da. Balinomizinak adibidez, K+-a selektiboki garraiatzen du mintzean zehar (Ovchinnikov, Y. A., 1979). Transmintz potentzialek prozesu oso garrantzitsuetan eragin handia daukate, adibidez kloroplasto eta mitokondrien mintzetan ATP-aren sintesia (Nicholls, D. G., 1982). Mintzaren zeharkako potentzialak, zenbait peptidoek, Nisina kasu, mintzarekin daukaten elkarrekintzan eragina izan dezake (Moll, G. N., Clark, J. eta lank., 1997).


21

1.8. Irudia: Mintzaren potentzial elektrostatiko ezberdinak. Karga positibo

batek lipido-bigeruza batean dauden eremu elektrostatikoekin izan ahal duen elkarrekintzaren profil energetikoa adierazten da. Proteinen edo kargadun lipidoen presentziak eragiten duen gainazaleko karga dentsitateak, σ, mintzaren gainazalean potentzial elektrostatiko bat sortarazten du (ψo). Mintzeko geruza dipolarrak barneko potentzial dipolar bat eragiten du, ψd , PC bigeruzetan 250 mV-tako balorea hartzen duena. Potentzial dipolarra, bigeruzaren nukleo hidrokarbonatua fase urtsuarekin konparatuz positiboa izatearen erruduna da. Bigeruzaren bi aldeen artean karga banaketa bat dagoenean, transmintz potentzial elektrostatiko bat sortarazten da, ∆ψ. Argitasun gehiagorekin ikusteko karga eta dipoloak mintzaren alde batean bakarrik adierazi dira, irudia (Cafiso, D. S., 1991)-tik moldatua izan da.

Gainazaleko karga dentsitatea (σ)

Geruza dipolarra

ψo


22

1.2. WIMLEY-WHITE-en HIDROFOBIZITATE

ESKALA Eskala honek solugarriak diren mintz proteinak, fase urtsutik

lipido bigeruzara banatu ostean, mintzetan era egonkor batean txertatzeko duten ahalmena azaltzen du (Engelman, D. M., 1996). Zenbait aminoazido sekuentziek berez gordetzen dute mintzera banatzeko ahalmena (Parker, M. W., Pattus, F. eta lank., 1989; Engelman, D. M., 1996; Shatursky, O., Heuck, A. P. eta lank., 1999): ikuspuntu termodinamiko batetik, energetikoki faboragarriagoa baita lipido-proteina konplexua eratzea, proteina solugarriaren egitura tertziarioa edo kuaternarioa mantentzea baino.

Erakarpen edo aldarapen elkarrekintza elektrostatikoen gabezian,

mintzera ematen den banaketa, aminoazidoen alboko kateen izaera hidrofobikoa, lotura peptidikoaren transferentziaren gastua eta bigeruzaren efektuagatik energetikoki zuzendua egongo litzateke (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1999). Proteinen deskribapen kuantitatibo bat egiteko, uretatik mintzera banatzeko eta bertan tolesteko oinarrizko betebehar bat hidrofobizitate eskala apropos bat izatea da. William Wimley eta Stephen White-k 1996-ean 20 aminoazido eta euren arteko lotura peptidikoarentzat hidrofobizitate eskala bat garatu zuten. Eskala hau egiteko, POPC-zko LUV-etara peptido txikiez osaturiko bi peptido familien banaketa neurtu zuten.

Eskala hauek aurkezten duten berritasun garrantzitsu bat,

lotura peptidikoaren banaketa mintzen interfasera emateko behar den gastu energetikoa kontuan hartzen dutela da. Lotura peptidikoaren gastu energetikoa aspartiko aminoazidoak daukanarekin konparagarria da. Honek, lotura peptidikoaren transferentzia mintzetara prozesu ez-faboragarri bat dela iradokitzen du. Ohiko hidropatia indizeetan ekarpen hau ez da kontuan hartzen, hauek aminoazidoen alboko kateen sarrera fase apolarrera kontuan hartzen baitute bakarrik (Kyte, J. eta Doolittle, R. F., 1982).


23

1.6. Taula: Hondar osoren hidrofobizitate eskalak. Interfasera (POPC) transferentzia gertatzeko behar den energi askea eta n-oktanoletik uretara pasatzeko behar dena (Wimley, W. C., Creamer, T. P. eta lank., 1996; Wimley, W. C. eta White, S. H., 1996).

AMINOAZIDOA Interfaseko eskala ∆G (kcal/mol)

Oktanol eskala ∆G (kcal/mol)

Ala (A) -0.17 ± 0.06 -0.50 ± 0.12

Arg (R) -0.81 ± 0.11 -1.81 ± 0.13

Asn (N) -0.42 ± 0.06 -0.85 ± 0.12

Asp (D) -1.23 ± 0.07 -3.64 ± 0.17

Cys (C) 0.24 ± 0.06 0.02 ± 0.13

Gln (Q) -0.58 ± 0.08 0.77 ± 0.12

Glu (E) -2.02 ± 0.11 3.63 ± 0.17

Gly (G) -0.01 ± 0.05 0.02 ± 0.13

His (H) -0.96 ± 0.12 -2.33 ± 0.11

Ile (I) 0.31 ± 0.06 1.12 ± 0.11

Leu (L) 0.56 ± 0.04 1.25 ± 0.11

Lys (K) -0.99 ± 0.11 -2.80 ± 0.11

Met (M) 0.23 ± 0.06 0.67 ± 0.11

Phe (F) 1.13 ± 0.08 1.71 ± 0.11

Pro (P) -0.45 ± 0.12 -0.14 ± 0.11

Ser (S) -0.13 ± 0.08 -0.46 ± 0.11

Thr (T) -0.14 ± 0.06 -0.25 ± 0.11

Trp (W) 1.85 ± 0.06 2.09 ± 0.11

Tyr (Y) 0.94 ± 0.06 0.71 ± 0.11

Val (V) -0.07 ± 0.05 0.46 ± 0.11


24

Ohiko eskala eta Wimley-White eskalen arteko beste

ezberdintasun garrantzitsu bat, Wimley-White eskalak mintzen interfasearen alderdia kontuan hartzen duela da. Bi ezberdintasun hauek aminoazido hauen hidrofobizitate ekarpen erlatiboan adierazita ikusten dira erabili den eskalaren menpe (1.7. taula). Ikerketa osatzeko asmoarekin Wimley eta laguntzaileek (Wimley, W. C., Creamer, T. P. eta lank., 1996) eskala osagarri bat garatu zuten. Eskala honek aminoazidoen transferentzia n-oktanoletik (bigeruzen nukleo hidrokarbonatuen antzeko ingurune apolarra ematen duena) uretara emateko behar den energi askea neurtzen du.

1.7. Taula: Aminoazido aromatiko eta zenbait aminoazido hidrofobikoen

hidrofobizitate maximoaren ekarpen erlatiboa, hidropatia indize ezberdinak kontuan hartuz.

AMINOAZIDOA WW1 KD E

Trp 100 (1)2 40 (10) 79 (5)

Phe 81 (2) 81 (4) 95(2)

Tyr 76 (3) 35 (12) 71 (10)

Ile 60 (5) 100 (1) 100 (1)

Val 50 (9) 97 (2) 92 (3)

Leu 67 (4) 92 (3) 92 (4)

1: WW, (Wimley, W. C. eta White, S. H., 1996); KD, (Kyte, J. eta Doolittle, R.

F., 1982); E, (Eisenberg, D., Schwarz, E. eta lank., 1984). 2: Parentesi artean dauden zenbakiak aminoazidoen kokapenari dagozkie,

hidrofobikotik hidrofilikora ordenatzen direnean. Wimley-White eskala esperimentalean aminoazido aromatikoak

hidrofobikoenak diren bitartean beste eskaletan erdiko hidrofobizitatea aurkezten dute, tirosinaren kasua nabarmena izanik.

Azkenik Wimley eta White eskala gehigarria den bitartean besteak

hidrofobizitate balio normalizatuetan oinarritzen dira (Kyte, J. eta Doolittle, R. F., 1982; Eisenberg, D., Schwarz, E. eta lank., 1984). Wimley-White-en eskalak, neurketa termodinamiko errealak eta absolutuak isladatzen ditu (0-ak oreka egoera adierazten du) (1.6 eta 1.7 taulak). Gehigarritasun honek, proteinen sekuentzia zehatzak teorikoki aztertzea baimentzen du (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1999).


25

1.3. POROAK ERATZEKO GAITASUNA DUTEN PROTEINA ETA PEPTIDO SOLUGARRIAK

Poroak eratzen dituzten proteinak, solugarriak edo mintz-

intrintsekoak izan daitezke. Solugarrien artean gehiengoak toxinak dira, eta proteina luze edo peptido kationiko txiki moduan aurkitu daitezke. Poro mintz-integralak eratzen dituzten proteinak, orokorrean ez dira lipido bigeruzatik kanpo aurkitzen; oso arraroa da proteina hauek ingurune urtsu batean ondo tolestea eta ondoren mintzean txertatzea. Horregatik, azken hauek genetikoki kodetuak izan ostean itu mintzera bidali behar dira bertan txertatzeko. Normalean proteina hauek ioi kanalak eratzen dituzte. Modu zorrotz batean adierazita ioi-kanalak poroak dira, baina esan daiteke ioi-kanalak ioi konkretu batekiko selektiboak direla, zabaldu eta ixteko ahalmena daukatela, eta ahalmen hau erregulatua egon daitekeela. Poroak aldiz, ez dira hain selektiboak, ez-ionikoak diren molekulekiko irazkorrak izan daitezke, eta ez daukate zabaltzeko eta ixteko ahalmenik. Poroak eratzeko gaitasuna aurkezten duten proteina solugarriak eta mintz intrintsekoak diren proteinak ezaugarri amankomun bat aurkezten dute: mintza egoera normalean zeharkatu ezin dezaketen molekulei pasabide bat baimentzen dietela (Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002).

Kapitulu honen hasieran adierazi den bezala, mintz

plasmatikoaren funtzio garrantzitsu bat zelulari irazkortasun selektiboa duen hesi batez hornitzea da. Edozein sustantziaren eraginez zelulak bere irazkortasun hesia galtzen badu, metabolismorako beharrezkoak diren osagaiak galduko lituzke, barneko osaketa ionikoa aldatuz eta heriotz zelularra ekarriz. Arrazoi honengatik, zelulei (bai prokariotoei, bai eukariotoei) defentsarako edo erasorako hornitzeko, eta baita bizirauteko ere, naturak tresna bat diseinatu die, hots, mintzaren irazkortasuna handitzeko ahalmena, ezaugarri amankomun bezala daukaten zenbait proteina. Orokorrean proteina hauek uretan solugarriak diren arren, beraien sekuentzia primarioan mintzarekin elkarrekiteko informazioa daramate. Gaitasun bikoitz honek, ez du esan nahi, molekula derrigorrez anfipatikoa izan behar denik (Lesieur, C., Vecsey-Semjen, B. eta lank., 1997). Dena den, mintzekin elkarrekiten duten peptido eta proteina gehienak anfipatikoak dira, edo beraien sekuentzian zehar anfipatikoa den zatiren bat aurkitzen da (Kaiser, E. T. eta Kezdy, F. J., 1987).


26

Mintzaren irazkortasuna handitzen duten proteinak eta peptidoak izen asko jaso dituzte: Zitolisinak, mintzean kalteak eragiten dituzten proteinak, mintzean azaleko ekintza daukaten proteinak, poroak eta kanalak eragiten dituzten proteinak, toxinak etab. Talde oso hetereogeneoa osatzen dutenez, sailkatzeko arazo handi bat dago.

1.3.1. POLIPEPTIDOETAN OINARRITURIKO POROAK 1.3.1.1. α-HEMOLISINA α−hemolisina (α-HL) Staphylococcus aureus-ek jariaturiko toxina

solugarria da (Bhakdi, S. eta Tranum-Jensen, J., 1991). Espezie solugarri hauek itu gainazalean batzen dira eta bertan agregatu, konformazio aldaketa bat pairatzen dutelarik. Konformazio aldaketa honen ondorioz proteina oligomerizatzen da, β-kupel heptameriko bat eratuz (Menestrina, G., 1986; Belmonte, G., Cescatti, L. eta lank., 1987; Montoya, M. eta Gouaux, E., 2003).

Beraz, poro funtzionala heptamero bat da, 1-2 nm-tako barne

diametroa daukana eta 3000 Da-etako molekulak mintza zeharkatzea ahalbidetzen duena.

Ikerketa biokimiko, biofisiko eta genetikoetan oinarrituz poroa

eratzeko lau fase ematen direla iradoki da. Soluzioan, α−HL monomerikoa, N eta C domeinuak glizinetan aberatsa den bigizta baten bidez loturik daude (119-143 aminoazidoko hondarrak). α−HL mintzaren gainazalera monomero gisa batzen da, zazpi monomeroko subunitateak batzen dira eta litikoa ez den poro aitzindariaren konplexua eratzen da ondoren. Zazpi azpiunitateak mintzean txertatu eta litikoa den poro heptamerikoa eratzen da. Transmintz poroa glizinetan aberatsa den sekuentziaz gaineztaturik dago.


27

Toxinaren egitura kristalinoa detergenteen presentzian, perretxiko

itxura daukan heptamero homoligomeriko bat dela adierazten du (1.8 irudia) (Song, L., Hobaugh, M. R. eta lank., 1996). Proteina konplexuaren dimentsioak 100 Å x 100 Å dira. Kanalaren diametroa luzeran eta zabaleran 46 eta 14 Å dira hurrenez-hurren.

Toxinaren arkitektura hiru domeinutan banatuta dago, kapelan,

ertzan eta zurtoinean. Kapelak 48 Å-eko altuera dauka eta hidrofilikoa da, 7 β−sandwich eta protomero bakoitzaren amino muturrak osatzen dute. Ertz domeinua, zelula mintzetik kanpoalderantz zuzentzen da, kapelaren beheko aldean kokatzen delarik eta 3 β−orriez osaturik dago.

Zurtoina 14 β−orrik osatzen dute eta kanalaren transmintz zatikia

definitzen du. Protomero bakoitzak kupelean bi β−orriekin parte hartzen du. Zurtoinak 52 Å ditu altueran eta 26 Å (Cα–Cα) zabaleran.

β-kupelaren barnealdea hidrofilikoa den bitartean, kanpoaldea

gerriko hidrofobiko bat dauka (Song, L., Hobaugh, M. R. eta lank., 1996; Gouaux, E., 1998; Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002; Tilley, S. J. eta Saibil, H. R., 2006).


28

1.8. Irudia: Staphylococcus aureus-en α-hemolisinaren egitura. A) Alboko bista. Perretxiko itxura daukan heptamero homo-oligomerikoa 14 β orriez osaturik dago. Kolore ezberdinez protomero ezberdinak adierazi dira. Heptameroak gutxi gorabehera 100 Å-eko altuera dauka. B) Heptameroaren goi-aldeko bista. C) Protomeroaren egitura. β-sandwich-ak protomeroaren nukleoa eratzen du, hiruki itxurako erregioa, zurtoinaren β-orriak eta nukleoa batuz. Irudia (Montoya, M. eta Gouaux, E., 2003)-tik moldatua izan da.


29

1.3.1.2. KOLIZINAK Kolizinak Citrobacter freundii eta Escherichia coli-k ekoizturiko

bakterioen kontrako toxinak dira. 600 aminoazidoez osoturik daude eta plasmidoetan kodetzen dira, bakterioari immunitatea emanez. B-kolizinek bakterio sentikorren barne mintzetan boltaiarekiko menpekoak diren kanalak eratzen dituzte, horrela, mintza despolarizatu eta ondorioz bakterioaren heriotza eragiten dute (Cramer, W. A., Heymann, J. B. eta lank., 1995).

Kanalaren diametroa 8 Å-etakoa da, barneko K+ ateratzeko

nahiko handia delarik (Stroud, R., 1995). Kolizina mintzarekin batu ahal izateko, karga negatibodun

fosfolipidoak kanpo mintzean egotea beharrezkoa da (van der Goot, F. G., Didat, N. eta lank., 1993). Kolizina eta mintzaren artean ematen den lehendabiziko elkarrekintza, proteinaren alde batean dagoen karga positibodun eraztuna eta negatiboki kargaturik dauden fosfolipidoen buru polarren artean izan behar dela uste da (Lakey, J. H., Parker, M. W. eta lank., 1994). Kolizina mintzean batu denean, partzialki zabaltzen da eta “molten globule” deritzon (globulu urtua) egitura hartzen du. Egitura zabalik dagoenean hidrofobikoak diren azalerak aurkezten dira eta elkarrekintza tertziarioak galdu egiten dira, baina egitura sekundarioak (batez ere α helizeak) mantenduz (van der Goot, F. G., Gonzalez-Manas, J. M. eta lank., 1991)(1.9. irudia). Transmintz potentzial bat ezartzen denean kanala zabaldu egiten da zenbait helize mugitzen direlako, bai translokatzen direlako, bai mintzean txertatzen direlako (Slatin, S. L., Qiu, X. Q. eta lank., 1994). Kanala eratzen duten helizeak nola kokatzen diren oraindik argitzeke dago. Kanala eratzeko zenbait kolizina molekula, hots, oligomero bat, beharrezkoa izan arren, badira emaitza esperimentalak kolizina molekula bakarra nahikoa izan daitekeela kanala eratzeko iradokitzen dutenak (Cramer, W. A., Heymann, J. B. eta lank., 1995).


30

1.9. Irudia: Mintzean E1 kolizinaren txertaketa emateko proposatu diren

bitartekariak. A irudian “labana” eredua aurkezten da eta B irudian “euritako” eredua. E1 kolizina hauetako bi bitartekarietan bilakatu daiteke. Zilindroek kolizinak osatzen dituzten α-helizeak adierazten dituzte. Berdez irudikaturiko α-helizeak, “euritako” eredua jarraituz txertatzen den urkila hidrofobikoarekin bat datoz. Transmintz potentzial baten presentzian gorriz irudikaturik dauden helizeak mintzean txertatzen dira edo translokatzen dira. Horiz eta zuriz margoturik agertzen diren helizeak, ∆ψ-a ematerakoan mintzaren albo berdinean geratzen dira. Irudia (Kim, Y., Valentine, K. eta lank., 1998)-etik egokitu egin da.

1.3.2. PEPTIDO LABURRETAN OINARRITURIKO

POROAK Zelula hiltzeko, peptido litiko ugari erabiltzen dituen mekanismo

bat mintzaren irazkortasuna areagotzea da. Ikasketa ugari egin diren arren, peptido hauen akzio-mekanismoa ez da guztiz ezaguna eta itu zelularekiko espezifikotasuna zertan oinarritzen den ez da ezagutzen. Kasu gehienetan, peptidoen jokamoldeak zelula mintzaren lisi zuzena dakar. Aktibitate antimikrobianoa aurkezten duten peptidoak espezie guztietan defentsa sistema natural gisa existitzen dira. Hauetako peptido asko gizakiak agente terapeutiko moduan erabiltzen ditu (adibidez magaininak eta eratorriak), batez ere antibiotiko topiko gisa.

Peptido antibiotikoen garapenak, bakterioak garatzen ari diren

antibiotiko arruntekiko erresistentzia arindu dezake etorkizun hurbil batean. Lisi mekanismoa ulertzeak, peptido molekula indartsuagoak garatzeko orduan asko lagunduko luke. Naturan aurkitzen ditugun peptidoak, zekropinak, magaininak, melitina eta defentsinak adibidez, molde moduan erabil daitezke diseinu berriak gauzatzeko.

A B


31

Peptido hauek lerro tumoraleko zelulak lisatzeko ere selektibotasuna aurkeztu dezakete, hots, minbiziaren kontrako aktibitatea izan dezakete (Andreu, D., Merrifield, R. B. eta lank., 1983; Chen, H. M., Clayton, A. H. eta lank., 2001; de Jong, A. S., Melchers, W. J. eta lank., 2004).

1.3.2.1. β-ORRI EGITURAKO PEPTIDOAK 1.3.2.1.1. A-GRAMIZIDINA A-gramizidina Bacillus brevis bakterioak sintetizaturiko peptido

hidrofobiko bat da. Peptido hau 15 aminoazidoz osoturik dago (Bernheimer, A. W. eta Rudy, B., 1986; Wallace, B. A., 1998) eta kanalak eratzen dituzten peptidoen artean hoberen karakterizatu dena da.

Bere egitura primarioa ez da oso arrunta, bere konfigurazioan L

eta D aminoazidoak tartekatzen baitira. A gramizidina ez da uretan solugarria, bai ostera disolbatzaile organikoetan. Peptido hau erraztasun handiarekin txertatzen da mintzetan, egitura β-helikoidalak eratuz. Egitura β-helikoidal hauetan, aminoazidoen alboko kateak lipidoen kate azilikoetara zuzentzen diren bitartean, karboniloak helizearen barnealdean babesten dira. Mintzetan A-gramizidinaren bi egitura aktibo existitzen dira: (1) helize dimerikoaren egitura, eta (2) helize bikoitzaren egitura, DNA-ren harizpi bikoitza gogora ekartzen duena (1.10. irudia). Helize dimerikoa bi gramizidina molekulez osoturik dago, bakoitza bigeruzaren alde batean kokatua, kanal ioniko bat eratzen dutelarik. Helize bikoitzaren egiturak, hain sarri ematen ez dena, poroen eraketa dakar (Wallace, B. A., 1998).


32

1.10. Irudia: A-gramizidinak mintzetan izan ditzakeen egiturak. (A) Helize

bikoitzaren egitura eta (B) Helize dimerikoaren egitura. Helize bikoitzaren egiturak mintzetan poroak eratzen ditu eta, helize dimerikoak aldiz, kanalak eratzen ditu. N eta C letrak amino eta karboxilo muturrei dagozkie. Irudia (Wallace, B. A., 1998)-tik egokitua izan da.

A-gramizidina kanalaren (helize dimerikoaren konformazioa)

ezaugarri garrantzitsuenak hurrengoak dira: (1) Katioi monobalenteekiko irazkorra da, hurrengo ordenean, Cs+ > Rb+ > K+ > Na+ > Li+, (2) Cl- guztiz baztertzen du, nahiz eta kanalaren tamaina Cl- -ak zeharkatu ahal izateko nahiko handia izan (4 Å), eta (3) kanala ireki egiten da dimeroa eratzen den momentuan, 10 ms eta 1 s tarteko erdibizitza duelarik; denbora hau nahikoa da 106 eta 108 ur molekulek kanala zeharkatzeko.

1.3.2.1.2. DEFENTSINAK Hiru defentsina mota ezberdin existitzen dira: α-defentsinak, β-

defentsinak eta intsektu-defentsinak (White, S. H., Wimley, W. C. eta lank., 1995).

A B


33

Defentsinak peptido kationiko txikiak dira; 29-35 aminoazido hondarrez osaturik daude, arginina hondar kationiko nagusiena delarik. Berezitasun moduan, sei zisteina hondar dituzte, beraien artean hiru disulfuro zubi eratzen dituztenak (Ganz, T. eta Lehrer, R. I., 1995; White, S. H., Wimley, W. C. eta lank., 1995).

Nagusiki β−orri egitura daukate, disulfuro zubien bitartez

egonkortua. Azken ezaugarri honek, beste peptido antimikrobianoetatik ezberdintzen ditu, ia gehienek helize anfifilikoak eratzen baitituzte.

Defentsinak mintzera elektrostatikoki batzen dira eta ondorioz

poro multimerikoak eratzen dituzte. Defentsinen espektro antimikrobianoa oso zabala da, bakterio gram positiboak eta gram negatiboak, onddo ugari eta gainazaladun zenbait birusekiko aktiboak direlarik (Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002).

1.11. Irudia: 3. giza α-defentsina.

Aminoazido kationiko eta hidrofobikoen taldeak domeinu ezberdinetan. Gorriz, aminoazido basikoak (positiboki kargaturik daudenak). Berdez, aminoazido hidrofobikoak.

1.3.2.2. α-HELIZE EGITURAKO PEPTIDOAK 1.3.2.2.1. ALAMETIZINA Alametizina, 20 aminoazidoez osoturiko eta Trichoderma viride

onddotik isolatutako peptido antimikrobiano bat da (Meyer, P. eta Reusser, F., 1967). Aminoazido hidrofobikoez osoturik dago, eta azpimarratzekoa da zortzi α-metilalanina aminoazidoen presentzia (Cafiso, D. S., 1994; Bechinger, B., 1997). Bigeruza lipidikoari α-helize egiturarekin batzen da, baina bere orientazioa hidratazio graduaren eta lipido/proteinaren erlazio molarraren menpe dago (Wu, Y., He, K. eta lank., 1995; He, K., Ludtke, S. J. eta lank., 1996).


34

Proteina/lipido erlazio molarra 0.025 balorea baino altuagoa

denean (lipido/proteina < 40) alametizina mintzean txertatzen da (1.12A irudia). Transmintz potentzial ezberdintasun bat (∆ψ) ezartzen denean, aldiz, kanal ionikoak eratzen ditu (Cafiso, D. S., 1994). Hau gramizidinarekiko ezberdintasun bat da, ez baitu transmintz potentzial ezberdintasun bat behar kanalak eratzeko. Alametizina kanalak zenbait peptido monomeroez osoturik daude (1.12B, C irudia).

1.12. Irudia: Alametizinaren egitura bigeruzetan. A) Irudian, alametizina

monomeroaren egitura aurkezten da, POPC besikuletan txertatua dagoenean. B) 6 alametizina molekulez osoturiko kanala, POPC bigeruzetan txertaturik ere. C) Kanalaren barneko aldea aurkezten da. A eta B irudietan peptidoaren egitura aurkezten da bolatxoen bidez, urdin kolorekoak nitrogenoari dagozkie, gorri kolorekoak oxigenoari eta grisak karbonoari. Lipidoaren kate azilikoak lerro berdeekin irudikatzen dira, eta bola berdeak lipidoaren karboniloei dagozkie. B irudian, baita ere, lipidoaren buru polarrean agertzen diren beste talde batzuk irudikatu dira. Horiz fosforoa eta gorriz oxigenoa (bai lipidoarenak, bai alderdi horretan aurkitzen diren ur molekulenak ere). B panelean dauden marra urdinak ur molekulak ordezkatzen dituzte. C panelean, alametizinaren α-helizeak irudikatzen dira urdin argiarekin, helize hauen Gln-en alboko kateak berdez, eta ur molekulak gorriz. Irudi guztiak dinamika molekularraren teknikaz 300 K-tan lortu ziren. Panelak (Tieleman, D. P., Sansom, M. S. eta lank., 1999)-etik egokituak izan dira.

A B C


35

Alametizina kanala eratzeko behar diren molekulen kopurua kanalaren eroankortasuna eta kooperatibitatetik kalkulatzen da, 2 eta 11 molekulen artekoa izan daitekeelarik, bigeruzaren zabaleraren arabera (Eisenberg, M., Hall, J. E. eta lank., 1973; Hall, J. E., Vodyanoy, I. eta lank., 1984). Ez da ezaguna kanala irekitzeko mekanismoa, baina alametizinaren dipolo helikoidala eta transmintzaren eremu elektrikoaren artean elkarrekintza bat gertatu behar dela uste da (Bechinger, B., 1997).

1.3.2.2.2. ZEKROPINAK Zekropinak, identifikaturiko lehenetariko peptido

antimikrobianoak dira. Hyalophora cecropia sitsetik isolatu ziren hasiera batean (Hultmark, D., Steiner, H. eta lank., 1980; Steiner, H., Hultmark, D. eta lank., 1981; Hultmark, D., Engstrom, A. eta lank., 1982). Zekropinaren analogoak, intsektu espezie askotik (Maloy, W. L. eta Kari, U. P., 1995), eta ugaztunetik ere (txerria) (Lee, J. Y., Boman, A. eta lank., 1989) isolatu dira. Familia gisa, zekropinak 31-39 aminoazido hondarrez osaturik daude. Amino mutur basiko eta anfipatiko bat daukate eta karboxilo mutur hidrofobiko bat.

Dikroismo zirkularrarekin egindako azterketek, zekropinek

soluzioan daudenean ez dutela egitura zehatzik aurkezten iradokitzen dute, baina hexafluoroisopropanol (HFIP), lipopolisakarido besikula (LPS), SDS mizela edo liposomen presentzian, α-helize egitura hartzen dute (Sato, H. eta Feix, J. B., 2006). NMR-arekin egindako ikerketek, %15 HFIP presentzian ondo bereizten diren bi α-helizeen presentzia adierazten dute. Helizeak, bata bestearekiko, 5-21 hondarrak eta 24-37 hondarrak hartzen dituzte, hau da, amino muturrari dagokion domeinua eta karboxilo muturrari dagokion domeinua (Holak, T. A., Engstrom, A. eta lank., 1988). Bi helizeak 70-100º-tako angeluarekin orientaturik daude, gly23-pro24 giltzarriarekin bat datorrena (Sipos, D., Andersson, M. eta lank., 1992; Sato, H. eta Feix, J. B., 2006).

Mintzean poroaren mihiztadura aztertzeko, oinarri fisiko-

kimikoak erabili dira, modelo informatiko bat garatuz. Modelo honek, peptidoaren amino eta karboxilo muturrek eratzen dituzten helizeek, biek, poroa eratzeko gaitasuna aurkezten dutela iradokitzen du. Poroa, “barrel stave” egitura aurkezten duen oligomero bat da (Silvestro, L., Weiser, J. N. eta lank., 2000; Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002; Sato, H. eta Feix, J. B., 2006).


36

Zekropinek aktibitate antibakteriano zabala aurkezten dute

bakterio gram positibodun eta gram negatibodunen aurrean. Leishmania, C. albicans eta malaria sortarazten duen parasitoa, Plasmodium falciparum-en kontra aktibitatea ere aurkezten dutelarik. Zenbait lerro tumoralen zelulen kontra aktibitatea dauka. Kontrara, zelula eukariotiko normalen kontra toxizitate baxua eta aktibitate hemolitiko baxua daukatela ikusi da (Sato, H. eta Feix, J. B., 2006).

1.3.2.2.3. MAGAININAK Magaininak Xenopus laevis igel afrikarraren azaletik eta

hesteetatik isolatu dira. Aktibitate antimikrobiano eta antifungiko zabala aurkezten dute. Peptido kationiko eta anfipatikoak dira eta mintz gainazalera batzen direnean α-helize egitura hartzen dute. Kontzentrazio altuetan lipido matrizea irazkortzen dute, nm-tako tamaina daukaten poro toroidalak eratuz, eta zelularen heriotza ekarriz (Leontiadou, H., Mark, A. E. eta lank., 2006). Fosfolipido anionikoak dituzten bigeruza naturalak eta mintzak irazkortzeko lehentasuna aurkezten dute. Esperimentalki ikusi da, mintza irazkortzeko peptido kontzentrazioa nahikoa denean, peptidoan orientazio aldaketa bat gertatzen dela, eta mintzari paralelo egotetik, peptido kopuru bat perpendikularki jartzera pasatzen dela. Fenomeno hau, lipidoen flip-flop-arekin eta mintzean zehar peptidoaren translokazioarekin loturik dago.

Poroaren ezaugarri bat, hidrofilikoa dela da. Uste da peptidoek

poroa egonkortu dezaketela, poroa inguratzen duten lipidoen buru polarrekin elkarrekintzak eratuz.


37

1.13. Irudia: Ekintza antimikrobianoa zehaztasun atomikoan. Magainina

peptido antimikrobianoak eragindako poroaren bat-bateko eraketa. Peptido/lipido erlazioa 1/32 da. Hasiera batean peptidoa fase urtsuan aurkitzen da (t=0 nsg), peptidoa agregatzen doa mintzarekin batzen den heinean (t=10 nsg). Mintzari batuketa gertatu ostean, peptidoa bigeruzaren barnealdera translokatzen da (t=30 nsg). Honek estresa sortarazten du mintzean eta poroaren eraketa gertatzen da (t= 40 nsg). Poroak egitura toroidala hartzen du. Peptido bat mintzean txertatuta ikus daiteke, eta beste bat poroaren zabalgunearen inguruan (t=60 nsg). Azkenengo egitura hau egonkorra mantentzen da simulaziorako. Alboko kate garrantzitsu eta funtzionalak nabarmendu dira (goiko panela). Lipido isatsak grisez daude, eta ur molekulak urdin zian kolorekoak. Buru polarrak urdinez (kolina), purpuraz (fosfatoak) daude goiko panelean, edo larrosaz/purpuraz (fosfatoak) beheko panelean. (Leontiadou, H., Mark, A. E. eta lank., 2006)-tik egokitua.

1.4. BIROPORINAK


38

Birusek zelulak infektatzen dituztenean, itu zelulan zenbait kalte

sortarazten dituzte. Hauetako kalte batzuk zelula-mintzean eragin zuzena daukate, adibidez, mintz-plasmatikoa eta zelula barneko sistema besikularra aldatzea. Behatu daitekeen ohiko efektua, mintzaren irazkortasunaren handipena ematen dela da (Carrasco, L., 1995). Zenbait birus-proteina aldaketa hauen eragileak dira, adibidez, proteasak (Chang, Y. S., Liao, C. L. eta lank., 1999; Blanco, R., Carrasco, L. eta lank., 2003), glikoproteinak (Arroyo, J., Boceta, M. eta lank., 1995; Tian, P., Estes, M. K. eta lank., 1995; Newton, K., Meyer, J. C. eta lank., 1997; Ciccaglione, A. R., Marcantonio, C. eta lank., 1998) eta biroporinak (Carrasco, L., 1995).

1.4.1. BIROPORINAREN DEFINIZIOA Biroporinak, birusek kodeturiko proteina txiki eta oso

hidrofobikoak dira, zelula mintzarekin elkarrekiteko ahalmena daukatenak eta, honen ondorioz, mintzaren irazkortasuna aldatzen dutenak. Mintza, ioi eta molekula txikiekiko irazkor bihurtzeko ahalmena daukate beraz (Carrasco, L., 1995).

Biroporinak existitzen zirela orain dela zenbait urte iradoki zen,

zenbait birus-zelula sistemetan mintzaren irazkortasuna handitzen zela ikusi zenean (Carrasco, L., 1978). Birusek zelula infektatzen dutenean mintzaren irazkortasunaren aldaketa bi momentu ezberdinetan eman daiteke, lehenengoa zolduraren lehendabiziko momentuetan, birusaren sarrerarekin lotuta dagoena, eta birioiak berak eraginda; bigarrena, zoldura aurrera doan heinean eta zenbait birus osagai kodetu direnean. Birusaren geneekin kodetzen diren osagai hauen artean biroporinak aurkitzen dira, zolduraren fase berantiarrean mintzaren irazkortasunaren handitzearen eragileak direlarik (Fernandez-Puentes, C. eta Carrasco, L., 1980; Carrasco, L., 1994).


39

1.4.2. BIROPORINA EGITURAREN EZAUGARRI OROKORRAK

Orokorrean 50-120 aminoazido kopurua daukaten proteinak dira

eta α-helize bat eratzeko gaitasuna daukan 20 aminoazido inguruko domeinu hidrofobiko bat izaten dute. Biroporinek, mintzean txertatu ostean oligomeroak eratzeko gaitasuna aurkezten dute. Oligomero hauek poro hidrofiliko bat eratuko lukete, aminoazido hidrofobikoak bigeruzaren fosfolipidoekin kontaktuan jarriz eta hondar hidrofilikoak poroaren barnealderantz orientatuz (Grice, A. L., Kerr, I. D. eta lank., 1997; Pinto, L. H., Dieckmann, G. R. eta lank., 1997; Agirre, A., Barco, A. eta lank., 2002; Melton, J. V., Ewart, G. D. eta lank., 2002; Wilson, L., McKinlay, C. eta lank., 2004). Poro hauen eraketa, gehienetan tetrameroak direnak (nahiz eta beste egitura oligomerikoak posibleak izan), ioi eta pisu molekular baxuko konposatuen pasabidea baimentzen dute era ez-espezifiko batean (Carrasco, L., 1995).

Zenbait biroporinek bigarren transmintz domeinu bat daukate,

Orokorrean aminoazido basikoz osoturik dagoena eta eremu anfipatikoak eratzen dituena. Erregio anfipatiko hauek oso arruntak dira bakteriofagoen mintz-toxinetan eta lehen aipatu diren jatorri birala ez daukaten peptido litikoetan, magaininetan eta zekropinetan adibidez (Young, R., 1992; Matsuzaki, K., 1998). Erregio hauek mintzaren irazkortasunaren aldaketetan parte hartu dezakete lipido bigeruza desegonkortuz.

Orain dela gutxi mintzekin elkarrekin dezakeen beste domeinu

bat aurkitu da biroporinetan. Aminoazido aromatikoetan aberatsa da eta bigeruzaren interfasean txertatzeko ahalmena aurkezten du, mintzaren desegonkortasuna indartuz eta bere irazkortasuna handituz (Sanz, M. A., Madan, V. eta lank., 2003).

Biroporinen funtzio nagusiena zoldurik dauden zeluletatik birus

berrien irteera baimentzea da (Carrasco, L., 1995). Birusek, mintz-plasmatikoa lisatzeko ahalmenarekin gene pare bat izatea oso garrantzitsua da (batez ere gainazalik ez daukaten birusen kasuan).

Bi kasuetan mintzak eraldatuak izango ziren biroporinek

eragindako poroengatik (Carrasco, L., 1995). Beraz, nahiz eta proteina hauek beharrezkoak ez izan birusen erreplikaziorako, beraien presentziak birus-partikulen eraketa modu adierazgarri batean handitzen du (Klimkait, T., Strebel, K. eta lank., 1990; Harada, T.,


40

Tautz, N. eta lank., 2000; Watanabe, T., Watanabe, S. eta lank., 2001; Takeda, M., Pekosz, A. eta lank., 2002; Kuo, L. eta Masters, P. S., 2003).

1.8. Taula: Biroporinen sailkapena.

Birus familia Birusa Biroporina Aminoazido kopurua

-Polio 2B, 3A 97,87

-Coxsackie 99

Picornaviridae (ssRNA+)

-Hepatitis A

2B

107

-Sindbis 55

-Semliki Forest 60

Togaviridae (ssRNA+)

-Ross River

6K

62

Retroviridae (ssRNA+) -GIB-1 Vpu 81

-C hepatitisa p7 63 Flaviviridae (ssRNA+) -Entzefalitis japoniarra

NS2B 131

-Arratoiaren hepatitisa

83 Coronaviridae (ssRNA+)

-SARS

E

76

Paramyxoviridae (ssRNA-) -Arnas-sintzitial birusa

SH 64

Ortomyxoviridae (ssRNA-) -A motako gripea M2 97

Rhabdoviridae (ssRNA-) -Behi-sukar birusa p10? 88

-Hegazti reobirusa p10 98 Reoviridae (dsRNA) -Bursitis infekziosoa VP5 149

Phycodnaviridae (dsDNA) -Chlorella birusa Kcv? 94

Papillomaviridae (dsDNA) -Giza papiloma birusa

E5? 83

Poxviridae (dsDNA) -Vaccinia birusa A14.5L? 53


41

Orokorrean, biroporinak birusaren egituran ez dira agertzen,

mintz plasmatikoan oso kantitate baxuetan agertzen direlarik (Klimkait, T., Strebel, K. eta lank., 1990; Loewy, A., Smyth, J. eta lank., 1995; Watanabe, T., Watanabe, S. eta lank., 2001; Hatta, M. eta Kawaoka, Y., 2003; McInerney, G. M., Smit, J. M. eta lank., 2004).

Funtzio honetaz aparte, zoldurik dauden zelulen gain mintzaren

potentziala xahutu eta heriotz zelularra gertatu baino lehen, proteina hauen espresioak efektu kaltegarriak eragiten ditu. Eragin hauek, zelularen morfologia eta besikulen garraio sistemaren eta metabolismoaren aldaketen agerpenarekin adierazten dira besteak beste (Carrasco, L., 1995).

Biroporinen taldea 1.5 taulan erakutsi diren proteinez osatua

dago.

1.4.3. MINTZAREN IRAZKORTASUNA ALDATZEN DUTEN GLIKOPROTEINA BIRIKOAK

Zenbait birusen glikoproteinek mintzaren irazkortasuna

sustatzen dute. Hauen artean, Semliki forest birusaren E1 proteina, C hepatitis birusaren E1 proteina, Rotabirusaren NSP4 eta VP7 proteinak, Bluetongue birusaren NS3 proteina, Vaccinia birusaren A38L proteina, Zitomegalobirusaren US9 proteina, Ebola birusaren GP proteina eta GIB-1 birusaren gp41 proteina (Arroyo, J., Boceta, M. eta lank., 1995; Maidji, E., Tugizov, S. eta lank., 1996; Sanderson, C. M., Parkinson, J. E. eta lank., 1996; Tian, P., Ball, J. M. eta lank., 1996; Charpilienne, A., Abad, M. J. eta lank., 1997; Dong, Y., Zeng, C. Q. eta lank., 1997; Yang, Z. Y., Duckers, H. J. eta lank., 2000; Ciccaglione, A. R., Costantino, A. eta lank., 2001; Nyfeler, S., Senn, K. eta lank., 2001; Han, Z. eta Harty, R. N., 2004). Hauetako glikoproteina batzuen arkitekturak, oligomerizazioa gertatu ondoren poro físiko baten eraketa ekarriko luke. Poro hauek fusio peptidoz eta transmintz domeinuen elkarrekintzagatik osatuak egongo lirateke.

Mintza desegonkortzen duten fasearteko motiboak deskribatu

dira. Motibo hauek transmintz erregioaren alboan kokatzen dira (Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Garry, R. F. eta Dash, S., 2003; Nieva, J. L., Sanz, M. A. eta lank., 2004).


42

Birusak bi taldetan sailkatu daitezke genoman ohiko

biroporinaren genearen presentzia edo gabezia kontuan hartuz. Biroporina bat kodetzen duten birusek, mintzaren irazkortasuna areagotzeko gaitasuna duen glikoproteina bat ere kodetu dezakete. Kasu honetan mintzean eragindako kaltea zolduraren azkeneko denboratan, bai biroporinek eraginda, bai glikoproteinek eraginda izan daiteke. Beste aukera bat izan daiteke, zolduraren hasieran ematen den mintzaren irazkortasunaren handitzea glikoproteinen ondorioa izatea eta azkenengo faseetan gertatzen dena, nagusiki biroporinen eraginagatik izatea.

Biroporinaren genea aurkezten ez den birusetan beste molekulek

betetzen dute bere funtzioa. Adibidez, GIB-2 birusaren kasuan, ez da Vpu biroporina kodetzen eta gp41 proteinaren transmintz domeinuak irazkortasuna aldatzeko ahalmena bere baitan darama (Arroyo, J., Boceta, M. eta lank., 1995; Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003). Ebola moduko beste animalia-birusek ez dute biroporinarik kodetzen, baina glikoproteinak dituzte mintzen irazkortasuna aldatzeko ahalmenarekin (Saez-Cirion, A., Gomara, M. J. eta lank., 2003).


43

1.5. HELBURUAK Tesiaren lehengo lan hipotesiak ezartzen du: Birusek zelulak infektatzen dituztenean, produktu zitotoxikoak

adierazten dituzte eta produktu hauen sekuentzia osoek edo partzialek mintz zelularren irazkortasuna areagotzeko gaitasuna dute.

Hipotesi hau kontrastatzeko, 2B proteinaren sekuentziatik

eratorriak diren peptidoen aktibitatea aztertuko da in vitro, 2B-ren domeinu litikoa kokatzeko asmoz. Modelo-mintzen kasuan, txertaketa monogeruzetan eta liposomen irazkortasunaren aldaketa neurtzeko teknikak erabiliko dira. Animali zelulen kasuan, B-higromizinaren sarrera eta ondorioz sortarazten duen proteina zelularren sintesiaren inhibizioa aztertuko da. Biotinadun sekuentziak erabiliz, peptidoen kokapena aztertuko da zelulan, mikroskopia konfokala erabiliz.

Tesiaren bigarren lan hipotesiak ezartzen du: Mab2F5 eta Mab4E10 antigorputz neutralizanteek, gp41

proteinaren kanpo-domeinuko sekuentziak ezagutzen dituzte mintzean murgildurik daudenean. Hipotesia kontrastatzeko, ezagumendu prozesuan kanpo mintzaren azalerak daukan efektua aztertuko da. Modelo-mintzak erabiliko dira bi antigorputz hauek mintzaren interfasera transferitzeko, eta bertan dauden epitopoak ezagutzeko daukaten ahalmena aztertzeko


44


45


46

2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak

47

______________________________________________________________________ 2.1. MATERIAL EZ-BIOLOGIKOA 2.1.1. PEPTIDOAK Tesi honetan erabili diren peptido sintetikoak, Pompeu Fabra

Unibertsitateko Proteomika zerbitzuak sintetizatu zituen, 433A peptido sintetizatzaile (Applied Biosystems) bat erabiliz. Hauek, erresoluzio altuko kromatografia likidoarenbitartez (HPLC) purifikatu ziren. Pisu molekularrak, MALDI-TOF Voyager STR (Applied Biosystems) masa espektrometro baten laguntzaz kalkulatu ziren.

2.1.1.1 PEPTIDOEN DISEINUA 2B proteinaren sekuentzian oinarrituz TM1, TM2 N-ter1, N-ter2,

TURN eta C-ter peptidoak sintetizatu ziren. NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK (2F5preTM) sekuentzia

GIB-1-ren gp41 proteinatik dator. Zekropina “bachem” etxe komertzialera erosia izan zen. Peptido soluzioak dimetilsulfoxidoan (DMSO, gradu

espektroskopikoa, Merck) prestatuak izan ziren eta kontzentrazioak azido bizinkoninikoaren mikrosaioarekin (BCA, Pierce, Rockford, IL, USA) determinatu ziren.


48

2.1. Taula: 2B eta gp41 sekuentzietatik eratorriak diren peptidoak.

Aminoazidoen kokapena adierazten da

2.1.2. ANTIGORPUTZAK Erabili diren Mab2F5 eta Mab4E10 antigorputz neutralizanteak,

IgG1 birkonbinatu gisa CHO zeluletan ekoiztu ziren (Kunert, R., Steinfellner, W. eta lank., 2000). Beroiek isolatzeko GIB-1-rekin infektaturik dauden, baina sintomarik aurkezten ez dituzten gaixoen odol-zelula mononuklearrak erabili ziren.

Fosfatasa alkalinoa konjugatua daukaten antigorputz

sekundarioak Pierce-ra erosiak izan dira. ELISA teknikarako 1:10.000 diluzioan erabili ziren.

Peptido izena

aa kokapena

Sekuentzia

2B 2B (1-97) GITNYIESLGAAFGSGFTQQISDKITELTNMVSTITEKLLKNLIKIISSLVIITRNYEDTTTVATLALLGCDASPWQWLRKKACDVLEIPYVIKQ

N-ter1 2B (1-22) GITNYIESLGAAFGSGFTQQIS

N-ter2 2B (23-46) DKITELTNMVSTITEKLLKNLIK

TM1 2B (35-55) KTITEKLLKNLIKIISSLVIITWKK

Turn 2B (46-69) KIISSLVIITRNYEDTTTVAT

TM2 2B (59-82) KKKTTTVATLALLGCDASPWQWLR

C-ter 2B (73-97) DASPWQWLRKKACDVLEIPYVIKQ

Zekropina 1-37 KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK

2F5preTM Gp41 (656-683)

NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK

2F5ep Gp41 (656-671)

NEQELLELDKWASLWN

ELDKWA Gp41 (662-667)

ELDKWA


49

2.1.3. KONPOSATUAK ETA INHIBITZAILEAK FITC-estreptabidina (Sigma): Streptomyces avidinii bakteriotik

datorren proteina ez glikosilatua da. Biotinari afinitate altuarekin batzen da. Estreptabidina proteina bakoitza (52,8 kDa) biotina batzeko lau gune ditu. Kasu honetan fluoreszeina isotiozianato fluoroforoari baturik dago. Immunofluoreszentzia saiorako 1:300 diluzioan erabili zen.

Azido 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonikoaren gatz disodikoa

(ANTS) eta p-xileno-bis-piridinio bromuroa (DPX), solutuen askapen saioan erabili ziren eta Molecular Probes-era (Eugene, OR, EE.UU.) erosi ziren. Liposoma barnean enkapsulatu ez den zunda kentzeko “Sephadex G-75” erretxina (Amershan Pharmacia) erabili zen.

Mintzak solubilizatzeko erabili zen Triton X-100 detergentea eta

solutuen askapen saioan erabili ziren 4 eta 10 Kda-etako FITC-dextranoak eta “Sephacryl 500-HR” erretxina Sigma-koak (St. Louis, MO, EE.UU.) ziren. LUV-ak prestatzeko erabili ziren polikarbonatozko filtroak, Nucleopore-koak (Cambridge, MA, EE.UU.) izan ziren.

Proteinen markaketa erradiaktiboa egiteko Amersham-eko trans

(35S)-label ((35S) metionina/(35S) zisteina, >1000 ci/mmol), erabili zen. Kultibo zelulen irazkortasun saiorako erabili ziren B-Higromizina

eta α-sartzina Boehringer Mannheim-ra erosi ziren. Tween 20 Merck etxe komertzialekoa zen eta “Cell dissociation

buffer”-a GIBCO-tik lortu zen. Gainerako erreaktiboak kalitate analitikoa zeukaten. 2.1.5. LIPIDOAK Fosfatidilkolina (PC), kardiolipina (CL), fosfatidilserina (PS),

fosfatidilglizerola (PG), fosfatidilinositola (PI), lisofosfatidilkolina (lysoPC), lisofosfatidilglizerola (lysoPG), dilisokardiolipina (dilysoCL), fosfatidiletanolamina biotinilatua (biot-PE) eta N-(B sulfonil rodamina) fosfatidiletanolamina (N-Rh-PE) Avanti Polar Lipids-era (Birmingham, AL, USA) erosi ziren, eta aldiz N-(5-dimetilaminonaftalenoa-1-


50

sulfoniloa)-1,2-dihexadekanoil-sn-glizero-3-fosfoetanolamina (d-DHPE) Molecular Probes-era (Junction City, OR, USA).

2.1.6. TANPOIAK -ANTS/ DPX tanpoia solutuen askapen saiorako: 12.5 mM ANTS,

45 mM DPX, 5 mM Hepes eta 30 mM NaCl, 0.205 osm/kg, pH 7.4. -Dikroismo zirkularrerako tanpoia: 2 mM Hepes pH 7.4. -Fluorografia tanpoia: Sodio salizilato 1 M. -Gel Finkatzailea: %7.5 azido azetikoa, %20 etanola. -Proteinen zama tanpoia elektroforesirako: 0.37 mM Tris-HCl (pH

6.8), %17 glizerola, 0.1 M ditiotreitola (DTT), %1 SDS, %0.024 bromofenol urdina.

-PBS tanpoia: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 eta

1.5 mM KH2PO4, pH 7.4. -SDS-PAGE 10X tanpoia: 200 mM glizina, %1 SDS (p/v), 25 mM

Tris-HCl, pH 8.3. -SuperBlock blocking buffer: Liposometan oinarrituriko ELISA-n,

leku ez-espezifikoak blokeatzeko erabili zen. Pierce-ko tanpoi komertziala da.

-Tanpoi arrunta: 100 mM NaCl, 5 mM Hepes, 0.205 osm/kg, pH

7.4. -Hemolisi saiorako tanpoi fisiologikoa: 125 mM NaCl, 5 mM KCl,

32 mM hepes, 5 mM glukosa, 1 mM MgSO4.7H2O, 1 mM CaCl2.2H2O, pH 7.4, 0.300 osm/kg.


51

2.2. MATERIAL BIOLOGIKOA 2.2.1. LERRO ZELULAR EUKARIOTOAK Tesi honetan erabili egin diren lerro zelular eukariotoak

hurrengoak dira: -BHK-21 (ATCC CCL 10), hamsterraren giltzurrun zelulak. -CHO-Env, lerro zelular honek GIB-1 birusaren env genearen

sekuentzia darama, beraz gainazalean gp41-gp120 proteinak espresatzen dituzte (C. Weiss eta J. White-i esker lortua, NIH AIDS Research and Reference Reagent Program-etik (ARRRP))

-HeLaT4+, lerro zelularra CD4 eta CXCR4 ko-errezeptoreak

espresatzen ditu (R. Axel-i esker lortua, NIH AIDS Research and Reference Reagent Program-etik (ARRRP)).

2.2.2. BAKTERIO-ANDUIAK Saio antimikrobianoa burutzeko erabili zen anduia Escherichia

Coli BL21 izan zen. Bakterioak LB (Luria Broth, Pronadisa) medioan saturaziorarte

hazi ziren, 37 ºC-tan eta irabiaketa motelarekin. 2.3. ZELULA EUKARIOTOEN MANIPULAZIOA 2.3.1. KULTIBO-MEDIOAK Zelula guztiak 37 ºC-tan eta %5 CO2 atmosfera batean hazi ziren.

CHO-Env eta HeLa T4 zelulen propagazio medioa, DMEM (GIBCO) medioa G418 500 µg/ml gehigarri gisa zuelarik, izan zen.


52

BHK zelulak hazteko DMEM medioa erabili zen (Dulbecco, R. eta Freeman, G., 1959). DMEM medioari %5 (v/v) txahalaren sero fetala (Flow), penizilina 50 U/ml, estreptomizina 50 U/ml eta 0.2 mg/ml azido p-hidroxibentzoikoaren ester butirikoa (Sigma) gehitu zitzaion. Oinarrizkoak ez diren aminoazidoak eta 4 mM glutamina (Merck) ere gehitu zitzaiolarik.

Zelulak nitrogeno likidoan kontserbatu ziren, %20 txahalaren

sero fetalarekin eta %7 DMSO kriobabesle moduan duen DMEM medioan.

Proteinen [S35]Met/Cys markaketa metabolikoa burutzeko,

metionina eta zisteina gabeko DMEM medioan zelulak hazi ziren. 2.3.2. ZELULEN ELEKTROPORAZIOA IN VITRO

SINTETIZATURIKO RNA-ekin Teknika hau birusen proteinen espresioaren efektua aztertzeko

erabili zen. Jarraitu zen protokoloa Liljeström eta lankideek araturikoa izan zen (Liljestrom, P. eta Garoff, H., 1991) aldakuntza txiki batzuekin. RNA-k in vitro itzulpenaren bidez lortu ziren eta kontzentrazioa determinatua izan zen.

BHK-21 zelulak erabili ziren saio honetan. -Zelulak 24 ordu lehenago erein egin ziren eta subkonfluentziararte

hazi ziren. -Zelulak tripsinarekin altxatu ziren eta 2000 rpm-tara 2 minutuz

zentrifugatu ziren. -3 ml PBS tanpoi hotzarekin garbitu ziren, berriro zentrifugatzeko.

Zentrifugazio honen ostean 2.5 x 106 zelula/ml lortzeko behar zen PBS tanpoian birreseki ziren.

-Elektroporazioa giro tenperaturan burutu zen eta 0.4 ml zelulei itzulpen nahasketaren 50 µl gehitu zitzaien. Nahasketa 0.2 cm-tako elektroporazio kubeta (Bio-rad) batera transferitu zen, eta jarraian bi pultsu eman ziren (1500 V, 25 µF y R= ∞) elektroporadore batean (Gene Pulser, Bio-Rad).

-Elektroporaturiko zelulak kultibo medioan diluitu ziren (0.7 ml) eta zentrifugatu ziren.

-Geroago nahi izan zen kultibo medio bolumenean birreseki ziren eta plaketan erein ziren.


53

2.3.3. ZELULA EUKARIOTOEN MINTZ-

IRAZKORTASUN ALDAKETAK: B-HIGROMIZINA ETA α-SARZINAREN SARRERA

Mintz-plasmatikoan irazkortasunaren aldaketak gertatzen diren aztertzeko, proteina zelularren sintesiaren inhibizioa aztertu genuen.

Zeluletan B-higromizina antibiotikoaren (HB) (Mr= 0.527 kDa.)

edo α−sartzinaren (Mr=16.8 kDa) sarrera gertatzen denean proteina zelularren sintesia inhibitu egiten da.

Hiru protokolo jarraitu ziren, lehenengoa, elektroporaturiko RNA-

ak espresatzen zituzten proteinak mintza HB-ari irazkorra bihurtzeko ahalmena zuten aztertzeko, bigarrena kanpoaldetik gehituriko peptidoak mintza HB-ari irazkorra bihurtzeko ahalmena zuten aztertzeko eta hirugarrena peptidoek mintza α-sartzinari irazkorra bihurtzeko ahalmena zuten aztertzeko.

2.3.3.1 ADIERAZITAKO PROTEINEN IRAZKORTASUN

AHALMENA AZTERTZEKO PROTOKOLOA: -Lehenbizi, zelulak, in vitro itzuli diren RNA-ekin elektroporatzen

dira eta L24 plaketan ereiten dira. -Elektroporazio osteko denbora ezberdinetan 1 mM HB-a gehitu

zen, 15 minutuz, edo ez ziren HB-arekin tratatu (HB-ren kontrol negatibo moduan).

-Jarraian proteinen markaketa erradiaktiboa burutu zen [35S]metionina/[35S]zisteina-rekin ([35S]Met/Cys), 2.3.4 atalean azaltzen den modura..

-Proteinen sintesia SDS-PAGE bidez, fluorografia eta autorradiografia bidez aztertu ziren.

-Proteinen bandak densitometria bidez aztertu zen GS-710 calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad) dentsitometroarekin.


54

2.3.3.2. PEPTIDOEN IRAZKORTASUN AHALMENA AZTERTZEKO PROTOKOLOA:

-BHK zelulak 16 mm-tako putzuetan erein ziren eta gau osoan

zehar hazten utzi ziren. -Zelulak txahalaren sero fetal gabeko DMEM medioarekin garbitu

ziren. -Peptidoak, zegokion kontzentraziotan, DMEM medioan disolbaturik

gehitu ziren. Ordu batez 37 ºC-tan C02 inkubadorean inkubatu ziren. -Zelulak, peptido kontzentrazio bakoitzarentzako bi putzutan erein

ziren, honela putzu batean 1 mM HB gehitu zen eta bestean ez (HB-ren kontrol negatibo moduan). HB-arekin 15 minutuz inkubatu ziren.

-DMEM medioarekin garbitu ziren eta 10 µCi/µl [35S]Met/Cys-rekin markatu ziren 40 minutuz.

-Inkubazioaren ostean proteinen karga tanpoian laginak jaso ziren, 5 minutuz 95 ºC-tan irekin ziren.


-Proteinen bandak densitometria bidez aztertu ziren GS-710 calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad) dentsitometroarekin.

2.3.3.3. α-SARTZINAREN SARRERARAKO PROTOKOLOA α-Sartzinak erribosomaren 60S subunitatea inaktibatuz, itzulpen

zelularra inhibitzen duen 16.8 kDa-etako RNAsa bat da. Inhibitzaile zelular hau erabili zen, TM1 peptidoak eragiten duen poroak zelula barnealderantz makromolekulen sarrera ematen den edo ez aztertzeko.

α-Sartzina, B-higromizinarekin konparatzen badugu, B-

higromizina antibiotiko txikia da (0.527 kDa), eta honek bai TM1-ek eragindako poroak zeharkatu ditzazke eta itzulpen zelularra inhibitu. Gaitzik gabeko zelulak α-sartzinara irazgaitzak dira.

-BHK zelulak peptidoekin inkubatu ziren (5 µM sero gabeko DMEM

medioa) 1 h-z eta 37 ºC-tan. -Ondoren α-sartzinarekin 20 minutuz aurretik tratatu ziren (10

µg/ml), peptidoa kendu barik. -Medioa kentzen da eta proteinen markaketa erradiaktiboa egiten

da 10 µCi/µl [35S]Met/Cys–rekin. Marka metionina eta zisteina gabeko


55

DMEM medioan disolbatzen da α-sartzinaren presentzian (+) eta gabezian (-), 40 minutuz.

-Proteinen sintesia SDS-PAGE bidez (%15), fluorografia eta autorradiografia bidez aztertu ziren.


α-sartzinaren sarreraren kontrol positibo moduan, zelulak SV-

rekin (Sindbis birusa) infektatu ziren, birus honen endozitosi bidezko sarrerarekin batera, kultibo medioan dauden makromolekulak sartzen sartzen baitira.

-Zelulak SV-rekin 10 eta 100 pfu/zelula infektatu ziren 1 h-z eta 37 ºC-tan (birusaren adsortzioa eta sarrera baimentzeko denbora) α-sartzinaren presentzian 10 µg/ml (birusaren sarrerarekin batera inhibitzailearen sarrera eman dadin).

-Ondoren medioa kendu eta proteinen markaketa erradiaktiboa egin zen.

2.3.4. PROTEINEN MARKAKETA METABOLIKOA -Proteinen markaketa erradiaktiboa egiteko, zelulei 1 µl

([35S]Met/Cys (10 mCi/ml [35S]metionina/[35S]zisteina) nahasketa 200 µl metionina eta zisteina gabeko DMEM medioan gehitu zitzaien.

-Zelulak markarekin 30-40 minutuz inkubatu ziren, laginak proteinen zama tanpoian jasoz.

2.3.5. ELEKTROFORESIA POLIAKRILAMIDA

GELETAN Proteina-laginak poliakrilamida geletan baldintza

desnaturalizatzaileetan elektroforesi bidez aztertu ziren (SDS-PAGE, (Sambrook, J., Fritsch, E. R. eta lank., 2001). Erabili ziren gelak %15 poliakrilamida zeramaten.

-Proteinen zama tanpoian jaso ziren laginak 95 ºC-tan irakin ziren

5 minutuz. -Laginak %15 poliakrilamida geletan kargatu ziren eta gelak 45 mA


56

konstantepean migratu ziren SDS-PAGE tanpoia elektrolito moduan erabiliz.

2.3.6. FLUOROGRAFIA [35S]Met/Cys-ekin markatu eta SDS-PAGE bidez aztertu ziren

proteinak fluorografiarekin tratatu ziren, seinale erradioaktiboa areagotzeko.

-Gelak %7.5 azido azetiko, %20 etanola eta ur distilatua zeukan

disoluzio batekin finkatu ziren 15 minutuz. -Ur distilatuarekin garbitu eta gero, 1 M sodio salizilato disoluzio

fluorografikoan inkubatu ziren ordu batez. -Gelak 3 mm-tako Whatman orrietan lehortu ziren, 80 ºC-tan gel

lehorgailu batean. -Gelak film autorradiografikoetan (Kodak) errebelatu ziren. 2.3.7. FLUORESZENTZIAKO MIKROSKOPIA

KONFOKALA Azken urteetan mikroskopia optikoan eman den aurrerapen

handienetariko bat, fluoreszentziako mikroskopia konfokala izan da. Teknika honekin zelula biziak, zelula finkatuak eta ehunak

zehaztasun handiarekin ikustea lortzen da. Bestalde, laginen bai kanpoaldeko, bai barnealdeko hiru dimentsiotako azterketa egitea eta materiale zehatz batzuen kasuan erreflexio ikerketak egitea ahalbidetzen du.

Mikroskopia mota honen beste aplikazio bat zelularen alderdi

batean markatzaile ezberdinen kokapena aztertzea da. Laser iturri anitzak erabiliz uhin luzera ezberdinetan, aldi berean lagina kitzikatzea lortzen da.

Mikroskopia konfokalaren teknika asko hobetu da, ordenagailuen

aurrerapenak, informazioa gordetzeko teknologiaren aurrerapenak direla, laser sistema berrien ondorioz, interferentzia filtroen agerpenagatik, itu espezifikoen kontrako fluoroforoen garapenagatik. Garapen guzti hauek fluoreszentzia teknikarik erabiliena bihurtu dute.


57

-BHK zelulak aurretik sugarrean esterilizaturiko porten gainean

erein ziren. -Kubreak 16 mm-tako putzuetan kokatu ziren eta gau osoan zehar

hazten utzi ziren. -Txahalaren sero fetal gabeko medioan garbituriko zelulei 10 µM

peptido gehitu zitzaien (DMEM medioan disolbaturik). Ordu batez inkubatu ziren 37 ºC-tan eta C02 inkubatzailean.

-Zelulak finkatu baino lehen, hiru bider PBS tanpoiarekin garbitu ziren.

-Zelulak finkatzeko %4 paraformaldehido erabili zen 10-25 minutuz eta berriro PBS-z garbitu ziren.

-Zelulak irazkortzeko %0.1 Triton X-100 zeraman PBS tanpoia erabili zen.

-Zelulak irazkortu ostean, FITC-estreptabidinadun tanpoiaz ordu batez inkubatu ziren ilunpetan. konposatua zegokion diluzioan (1:300) %0.1 triton X-100 eta %1 BSA zeraman PBS tanpoian gehitu zen.

-Irazkortu gabeko zelulak, finkatu eta PBS-rekin garbitu ostean, FITC-estreptabidina gehitu zitzaien.

-Bi kasutan zelulak berriro PBS tanpoiarekin garbitu ziren eta kubreak portetan prestatu ziren Mowiol-az (Calbiochem) finkatuz.

-Zelulak Radiance 2000 (Bio-Rad/Zeiss) mikroskopio konfokalean 63X/1.4 oil Plan-Apochromat (Zeiss) objetiboa erabiliz aztertu ziren.

2.3.8. SINTZITIO-ERAKETAREN INHIBIZIOA Sintzitioen eraketa GIB-1 birusaren zikloan zehar agertzen den

ezaugarri bat da, batez ere gaixotasuna aurrera doanean CXCR4 errezeptore menpekoa delarik.

Esperimentu honen bidez (Muster, T., Steindl, F. eta lank., 1993)

bi zelulen arteko fusioa ematen dela ikus dezakegu. CHO-Env zelulak gp41-gp120 proteinak gainazalean espresatzen dituzte, GIB-1 birioia emulatuz. HeLaT4 zelulek aldiz, CD4 errezeptorea eta CXCR4 ko-errezeptorea espresatzen dituzte, zelula ostalaria imitatuz. Bi lerro zelular hauek batera ereiten direnean, fusioa gertatzen da eta nukleo anitzeko zelulak agertzen dira. Esperimentu honen bidez, konposaturen batek edo antigorputzen batek sintzitioen eraketa inhibitzen dutenentz azter daiteke.


58

2.3.8.1. SINTZITIOEN ERAKETARAKO PROTOKOLOA -CHO-Env eta HeLaT4 lerro zelularrak bakoitza bere aldetik eta

dagokien kultibo medioan hazten dira T-75 batean. -%70-80-ko konfluentzia lortu dutenean, CHO-Env zelulei 6 mM

sodio butirato (Sigma; St. Louis, MO, EE.UU.) gehitzen zaie, eta 16 orduz inkubatzen dira. Sodio butiratoarekin gainazaleko proteinaren espresio altuagoa lortzen da.

-Denbora hori igaro ondoren, zelulak proteasa gabeko medio batekin altxatzen dira, “cell dissociation buffer”-arekin (Gibco invitrogene) hain zuzen.

-Zelulak zenbatu direnean, zelula mota bakoitzetik 35.000 zelula/putzu bakoitzeko ereiten dira, 96 putzuetako plaketan.

-MSX gabeko GMEM gehitzen zaie eta 6 orduz inkubatzen dira. Denbora hau pasa ondoren sintzitioak ikus daitezke, orduan in situ argazkiak ateratzen dira Camedia C-5050 kamara digital batez (Olympus-Europe, Hamburg, Germany) ekipatuta dagoen Olympus CKX41 mikroskopio alderantzikatu (Olympus-Europe, Hamburg, Germany) batekin eta fase kontrastea erabiliz. Zelulak hain labilak direnez ez dira finkatzen ezta tindatzen sintzitioak altxatzen direlako.

-Esperimentu guztia 37 ºC-tan eta %5 CO2 duen inkubadore batean burutu zen.

2.3.8.2. SINTZITIO-ERAKETARAREN INHIBIZIO

PROTOKOLOA -Peptidoak eta antigorputz neutralizatzaileak zelulen fusioa

inhibitzeko gaitasuna zutela aztertzeko, aurreko protokoloa jarraitu zen baina antigorputza edo peptidoak CHO-Env zelulekin 90 minutuz inkubatuz. Ondoren HeLaT4 erein zen eta plaka 6 ordu ostean aztertu zen.

Inhibizio efektuaren itzulpena ikusteko, hots, inhibizioaren

blokeoa, hurrengoa egin zen: -CHO-WT zelulei Mab-ak gehitu baino lehen, hauek peptido edo

fosfolipidoekin 90 minutuz inkubatu ziren giro tenperaturan. -Ondoren CHO-Env zelulak 90 minutuz nahasketarekin inkubatu

ziren.


59

-Denbora hori pasata HeLaT4 zelulak CHO-Env zelulekin erein

ziren. -Zelulak 6 orduz inkubatu ziren 37 ºC-tan eta %5 CO2 duen

inkubadore batean. -Sintzitio-eraketaren protokoloan egiten den bezala, in situ

argazkiak ateratzen dira Camedia C-5050 kamara digital batez (Olympus-Europe, Hamburg, Germany) ekipatuta dagoen Olympus CKX41 mikroskopio alderantzikatu (Olympus-Europe, Hamburg, Germany) batekin eta fase kontrastea erabiliz.

2.4. MINTZ-EREDUEN SISTEMAK Mintz-eredu sistema ugari diseinatu egin dira lipido puruak,

lipido-nahasketak eta lipido-proteina nahasketen propietateak aztertzeko. Mintz-eredu hauek erabiltzearen helburua, mintz biologikoen dinamikan eta lipido-proteinen arteko elkarrekintzetan gehiago sakontzea da. Bigeruza artifizialak eta zelula-mintzak egitura anisotropikoak dira, mugikortasuna murriztua daukate mintzaren planora, bertan lipidoak bi dimentsiotan mugitzen direlarik. Bigeruza artifizialak oso eredu arruntak dira, baina zelula-mintzek dauzkaten ezaugarri jakin batzuk zehaztasun handiarekin imitatzen dituzte.

Lipido-besikulak eratzeko metodo ezberdinak, lipidoek

bigeruzaren oinarrizko egitura hartzeko ahalmenean oinarritzen dira. Jokabide hau lipidoen izaera anfipatikoaren ondorioz da. Lipidoaren alde hidrofilikoa ingurune-urtsura begira kokatzen da, lipidoaren kate hidrokarbonatuak ingurune honekin ahalik eta kontaktu azalera txikiena aurkeztuz.

Mintz-eredu hauek, energetikoki faboragarriak diren

monogeruzetan, bigeruza lauetan eta liposometan antolatzen dira (Gennis, R. B., 1989).

2.4.1. LIPOSOMAK Liposomak mintz-eredu sistema oso erabilgarriak dira,

biokimikan, biofisikan, farmakologian eta kosmetika arloetan besteak beste.


60

Liposomak, bigeruza batez edo gehiagoz osoturiko besikula

artifizialak dira (New, R. R. C., 1990). Liposomen barnealdea, prestatuak izan direneko, soluzioaren bolumena gordetzen dute (Gennis, R. B., 1989; New, R. R. C., 1990). Lipidoak ingurune urtsu batean sakabanatzen direnean, liposomak berez eratzen dira. Sortzen diren besikulen populazioa, bai tamainan, bai forman, eta bai lamela kopuruan ezberdinak izan daitezke. Liposomek osagai solugarriak enkapsulaturik, edo mintzera baturik osagai liposolugarriak garraia ditzakete. Mintz-ereduak sistema moduan garrantzi handikoak dira, osagai naturalekin sortu daitezkeelako eta zelula-mintzaren lipido osaketa eta proportzio berdinarekin prestatu ahal direlako (New, R. R. C., 1990).

Liposomak tamainaren arabera eta lamela kopuruaren arabera

sailkatu daitezke (2.1 irudia ikusi) (Moscho, A., Orwar, O. eta lank., 1996):

-SUV-ak: Lamela bakarreko besikula txikiak dira (ingelesetik

Small Unilamellar Vesicles). SUV-ak fosfolipidoek eratu ditzaketen tamaina txikienetariko besikulak dira. Tamainaren muga inguruko indar ionikoaren eraginez edo mintzaren lipido-osaketaren eraginez aldatu daiteke. Normalean 10-50 nm-tako diametroa daukate.

-LUV-ak: Lamela bakarreko besikula handiak dira (ingelesetik,

Large Unilamellar Vesicles). LUV-en tamaina 100-500 nm ingurukoa izaten da.

-MLV-ak: Lamela ugariak dituzten besikulak dira (ingelesetik,

Multilamellar Vesicles). Tamaina ezberdineko besikulak dira, 100-1000 nm tartekoak eta zentrokideak diren 7-10 lamela edo bigeruzez osatuta daude.

-GUV-ak: Lamela bakarreko besikula erraldoiak dira (ingelesetik,

Giant Unilamellar Vesicles). Lipido osaketaren arabera tamaina ezberdina hartu dezakete, 25 µm-tik 100 µm-tara (Akashi, K., Miyata, H. eta lank., 1996).

SUV-ek kurbadura erradio handia daukatenez lipidoak bi

monogeruzetan era ezberdinetan sakabanatzen dira, lipido totalen %40-a barnealdeko monogeruzan kokatzen delarik eta %60-a kanpoaldeko monogeruzan (Chapman, D., 1984). Besikulen tamaina zenbat eta handiagoa izan, bi monogeruzen azalera gero eta lauagoa den geometria


61

bat hartuko du, bi monogeruza hauetan dauden lipidoen banaketa homogeneoagoa eginez (%49 barneko monogeruzan eta lipidoen %51 kanpoaldeko monogeruzan, 100 nm-tako tamaina daukaten LUV-etan (Mayer, L. D., Hope, M. J. eta lank., 1986).

2.1. Irudia: Liposoma mota ezberdinen eraketa: MLV: Lamela anitzak

dituzten liposomak; LUV: Lamela bakarreko liposoma handiak; SUV: Lamela bakarreko liposoma txikiak. Lipidoek bigeruzan izango luketen parakuntza adierazteko bigeruzaren eremu bat handitu da.

2.4.1.1. LIPOSOMEN PRESTAKUNTZA -Etxe komertzialek lipidoak hautsetan eta liofilizaturik bidaltzen

dituzte. Hautsetan dauden lipidoak, disolbatzaile organikoetan disolbatzen dira, orokorrean kloroformo:metanolean (2:1, bol:bol) edo kloroformoan soilik (Merck).

-Prestatu nahi ditugun liposomen osaketa eta kontzentrazioa kontuan hartuz, lipido kantitate ezberdinak nahasten dira.

-Fase organikoa lurruntzen da nitrogeno gas korronte batekin edo errotabapore batekin (lurrundu behar den bolumenaren arabera). Lurrinketa prozesu endotermiko bat denez, lipidoa daraman saiodia


62

hozten da, beraz batzuetan saiodia pixka bat berotu behar da prozesua errazteko.

-Lipido-filma saiodiaren beheko aldean eratzen denean, saiodia 1-2 orduz huts ponpa bati konektaturik dagoen lehorgailu batean uzten da. Azkenengo pausu hau disolbatzaile organikoaren arrastorik ez geratzeko ematen da.

-Lipido filma tanpoi arruntean (edo zundak enkapsulatu behar direnean, dagokion tanpoian) bireseki egiten da trantsizio tenperaturarik (Tm) altuena daukan lipidoaren Tm-a baino 5 ºC altuagora.

-Nahasketa bortex batean bost minutuz irabiatzen da, lipido-filma saiodiko paretetatik altxatu arte. Lortzen den esekidura, zuria eta homogeneoa izan behar da. Esekidura hau, MLV-z osaturik dago eta Tm altuena daukan lipidoaren Tm-a baino 5 ºC gehiagotan mantendu behar da.

-MLV-en lamela zentrukideak kongelazio eta deskongelazio zikloak eginez desegonkortzen dira, lagina nitrogeno likidotik (-180ºC) fusio tenperatura altuena daukan lipidoaren tenperaturara dagoen bainu batera pasatuz. Prozesu hau 10 bider errepikatu behar da; honela lortzen diren egiturei FTMLV-ak deritze (ingelesetik, Freeze and Thaw Multilamellar Vesicles).

Liposomei tamaina eta itxura egokia emateko Hope-ek (Hope, M.

J., Bally, M. B. eta lank., 1985) deskribaturiko estrusio metodoa erabiltzen da. Metodo honetan besikulak polikarbonatozko filtroetatik pasatzen dira (Nucleopore Cambridge, MA, EEUU). Polikarbonatozko filtro hauek, laser baten bidez diametro zehatzeko poroak egin zaizkien polimero lamina meheak dira. Poroaren diametroa aldatuz tamaina ezberdineko besikulak egin daitezke. Poroaren diametroa ez da bat etortzen besikulen tamainarekin, 100 nm-tako poroen kasuan izan ezik (Hunter, D. G. eta Frisken, B. J., 1998). Hau, fosfolipido besikulek daukaten malgutasunagatik gertatzen da; besikulek konformazioa aldatu dezakete eta porotik itzuri. Dena den, poroa baino diametro handiagoa daukaten liposomak prozesuan apurtu egiten dira, besikulen batez besteko diametroa gutxituz.

2.4.1.1.1. LUV-en prestakuntza -Tesi honetan LUV-ekin buruturiko esperimentuetarako, 100 nm-

tako bi polikarbonato mintz erabili ziren (Nucleopore, Cambridge, MA, EEUU). LUV zurien edo ANTS/DPX barnean enkapsulaturik dituzten LUV-en kasuan, eta 200 nm-takoak FITC-dextranoak barnean enkapsulaturik


63

zituzten LUV-ak prestatzeko. Mintzak bata bestearen jarraian jarri ziren liposoma populazio homogeneo bat lortzeko.

-Liposomak, 200 psi nitrogeno gasa erabiliz estrusore batetik pasarazten dira. Estrusoretik pasatzen den esekiduraren abiadura, liposomen tamaina, kontzentrazioa, kolesterolaren edukia eta fosfolipidoen insaturazio mailaren menpe dago, bigeruza isurkorragoa aurkezten duten liposomak zailago apurtzen direlarik.

-Zundak enkapsulatu nahi izan zirenean, lipido filma zundadun tanpoian birreseki zen. Beti kontuan izanik tanpoia, saioko tanpoiarekin isotonikoa izan behar zela eta, beraz bi tanpoien indar ionikoa doitu egin zen. Izozte/desizozte zikloak egin ostean, prestakina irazpen molekularreko zutabe batetik pasatu zen, kanpoaldean enkapsulatu gabe geratzen zen zunda kentzeko. ANTS/DPX zundak enkapsulatu nahi izan zirenean, “Sephadex G-75” erretxina erabili zen eta FITC-dextranoak enkapsulatu nahi izan zirenean “Sephacryl HR-200” erretxina.

2.4.1.1.2. SUV-en prestakuntza -SUV-en prestakuntzarako, MLV besikulak 10 minutuz sonikatzen

dira. -Jarraian 13.000 rpm-tara, 10 minutuz eta 4 ºC-tan lagina

zentrifugatzen da, sonikatzerakoan, zundatik erori izan ahal den zundaren metala kentzeko.

SUV-en desegonkortasuna dela eta, prestatu eta hurrengo 12

orduetan erabili ziren. 2.4.1.2. LIPIDOEN KONTZENTRAZIOAREN DETERMINAZIOA Liposomen kontzentrazioa zuzenean determinatzea nahiko zaila

da. Erabiltzen den metodoa ez-zuzena da, eta sistemako fosforoaren kuantifikazioan oinarritzen da (Bartlett, G. R., 1959). Kuantifikazio hau egiteko erabiltzen den aldaera erabiliena Bottcher eta lankideek garatutakoa da (Bottcher, G. J. F., Van Gent, C. M. eta lank., 1961).

Metodo honetan laginean dagoen fosfolipidoen fosforoa, fosfato

inorganikora liseritzen da. Amonio heptamolibdatoak, fosfolipidoen fosfatoa azido fosfomolibdenikoan bihurtzen du. Azido hau, azido askorbikoarekin nahasterakoan erreduzitzen da, urdin koloreko


64

konposatu bat emanez. Kolorearen intentsitatea espektrofotometro batean neurtzen da, eta zuzen patroi batekin konparatu egiten da, fosforo kontzentrazioa lortuz.

Erreaktiboak: -%70 azido perklorikoa (HClO4) -Amonio heptamolibdato erreaktiboa: litro bat Amonio hepatamolibdatoa [(NH4)6Mo7O24.4H2O] 2,2 gr Azido sulfurikoa (H2SO4) %95-98, 14,3 ml -%10 azido askorbikoa (p/b) Garapena: 1mM-tan dagoen NaPO42-.H2O disoluzio batekin zuzen patroia

prestatzen da, bolumen ezberdineko alikuotak jarriz. Saioa hiru ataletan banatzen da: a) Liseriketa: Saiodi bakoitzari HClO4 70 % 0.5 ml bota

zitzaion eta 45 minutuz 204 ºC-tan inkubatu ziren. b) Kolorea ematen duen erreakzioa: Saiodi bakoitzari 4

ml molibdato erreaktiboa bota zitzaion eta jarraian 0.5 ml azido askorbiko, laginak bortex baten laguntzaz nahastu zirelarik. Saiodiak 10-15 minutuz 100 ºC-tan inkubatu ziren.

c) Irakurketa: Philips (Philips analytical, Cambridge, EB)

kolorimetro batean absorbantziak neurtu ziren uhin luzera 812 nm-tan finkatuz.

2.4.2. MONOGERUZAK Langmuir monogeruzak oso erabiliak izan dira, maila

molekularrean informazio ugari ematen baitute. Monogeruza hauek, uretan disolbaezina den eta anfipatikoa den konposatu bat, adibidez fosfolipido bat, azalera urtsu batean sakabanatzean eratzen dira. Fosfolipido molekulak azalera urtsuaren interfasean kokatzen dira eta molekula bakoitzeko azaleraren arabera antolatu eta orientatu egiten dira. Kate hidrofobikoak airerantz begira eta buru polarrak ingurune urtsura begira kokatuko dira.


65

Lipidoz osaturiko monogeruzak, peptidoek eta proteinek

mintzekiko ezartzen dituzten elkarrekintzak aztertzeko oso tresna garrantzitsuak dira (Maget-Dana, R., 1999). Liposomekin gertatzen ohi ez den bezala, lipido-monogeruzetan, lipido osaketak ez du eraginik monogeruzaren egoera fisikoan, beraz ezin dira fase lamelarrak edo fase hexagonalak eratu (Micol, V., Sanchez-Pinera, P. eta lank., 1999); are gehiago, lipidoen paketamenduaren dentsitatea aukeratu daiteke.

Molekula batek gehitzen den monogeruzarekiko afinitatea

aurkezten badu, monogeruza interfasearen azalera-presioan aldaketak (∆π) ematen dira. Azalera-presioaren aldaketa, monogeruzan txertatzen den proteina kantitatearekin erlazionaturik dago (Fidelio, G. D., Maggio, B. eta lank., 1986). Hasierako azalera-presioaren funtzioan gertatzen diren ∆π aldaketak aztertuz, proteinaren presio kritikoa (πc) edo esklusio presioa (πexc) atera daiteke. πc honek proteina edo peptidoa monogeruzan edo mintzean zein π −tik gora ezin den txertatu adierazten digu (2.2 irudia). Zentzu honetan, peptidoak edo proteinak mintz biologikoek aurkezten dituzten presioetan txertatzeko gai diren edo ez aztertu dezakegu.

Gainazaleko presio aldaketa µTrough S (Kibron, Helsinki,

Finlandia) sistemarekin eta Wilhemy-ren metodoa erabiliz aztertu zen (Davies, J. T. eta Rideal, E. K., 1963). Wilhemy-ren metodoa, monogeruza batekin kontaktuan dagoen zunda batek detektatzen duen pisu aldaketen neurketan oinarritzen da. Zunda, kontrako muturretik elektro-balantza batera loturik dago. Hortaz, balantzak hiru indarren emaitza den pisua detektatzen du; grabitatea, azalera-tentsioa eta likidoaren bultzada, azken indar hau beste bien kontra egiten duelarik. Neurketak egiten ari diren bitartean pisua eta likidoaren bultzada aldatzen ez direnez, detektatzen diren aldaketak azaleko tentsioaren aldaketen ondorioa dira soilik.

-Neurketak irabiaketa konstantepean eta azalera konstantea zuen

kubetan egin ziren. -Kubetaren diametroa 2 cm-takoa zen eta 1 ml-tako bolumena

zeukan. -Fase-urtsu modura tanpoi arrunta (Hepes 5 mM, NaCl 100 mM, pH

7.4) erabili zen. -Kloroformotan (Merck) disolbaturik zeuden lipido nahasketak,

fase-urtsutik sakabanatzen dira nahi den hasierako azalera-presioan (π0). 10 minutu itxaron zen kloroformoa guztiz lurrintzeko eta monogeruza egonkortu zedin.


66

-Peptidoa subfasean injektatu zen, “Hamilton” mikroxiringa baten laguntzaz.

Azalera-presioaren aldaketak denboraren funtziopean neurtu

ziren. Peptidorik gabe, tanpoiaren bolumen berdinak injektatuz, ez zen inolako presio aldaketarik behatu.

2.2. Irudia: Peptido baten txertaketa fosfolipidoz osaturiko monogeruza

batean. Peptidoaren txertaketak azalera-presioaren handipena dakar, interfasean dauden molekulen paketatzea handitzen delako.

2.5. SAIO BIOFISIKOAK 2.5.1. FLUORESZENTZIA BIDEZ EGINDAKO

NEURKETAK Fluoreszentzian oinarrituriko espektroskopia teknika oso erabilia

da, batez ere, proteina eta peptidoek mintzekin dituzten elkarrekintzen prozesu biofisikoak aztertzeko orduan. Proteinen berezko ezaugarriek (fenilalanina, tirosina eta triptofano aminoazidoak fluoroforoak baitira), zunda fluoreszenteak erabili ahal izateak (lipido fasean txertaturik erabiliz, besikula barneko ingurune urtsuan sarturik, edo proteinetara lotura kobalenteen bidez loturik erabiliz) fluoreszentziari erabilera handia ematen diote. Teknika honen bidez oso ikasketa ezberdinak


67

burutu daitezke, adibidez eta batzuk aipatzeagatik, bigeruzen isurkortasuna neurtzea (Lakowicz, J. R., 1983), besikulen irazkortasunaren aldaketa eta hauen fusioa aztertzea (Ellens, H., Bentz, J. eta lank., 1985), mintzen lipido-nahasketa aztertzea (Struck, D. K., Hoekstra, D. eta lank., 1981), mintzetara proteinen batuketa aztertzea (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1998), proteinen oligomerizazioaren azterketa (Rapaport, D. eta Shai, Y., 1991) eta proteinen tolespenaren azterketa (Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S. eta lank., 2000).

Mintzen egitura eta dinamikaren azterketarako, zunda

fluoreszenteen erabilpena ohikoena da. Hala ere, zundek zenbait ezaugarri bete behar dituzte emaitzak fidagarriak izan daitezen:

1-Mintzen ezaugarrietan ezin dituzte aldaketarik eragin. 2-Lipido monomero bakoitzaren mugimenduetara sentikorrak

izan behar dira, neurketa fluoreszenteak ematen diren denbora eskalan. 3- Estintzio koefiziente altua eta etekin kuantiko ona izatea. 4-Xurgapen eta igorpen limite zabalak izatea. 5-Bigeruzaren paketamendu naturalean ahalik eta gutxien

elkarregitea. 6-Modu zuzen batean orientatu behar dira. Jarraian azaltzen dira tesi honetan erabili diren fluoreszentzian

oinarrituriko tekniken metodo esperimentalak. 2.5.1.1. SOLUTUEN ASKAPENA Liposomen barnealdean enkapsulaturiko solutuen askapen

saioarekin, kanpoko eragile batek liposomaren irazkortasun hesia apurtzeko gaitasuna neurtu daiteke. Prozesu hau (Ellens, H., Bentz, J. eta lank., 1985) garaturiko metodoarekin neurtu zen. Metodoa, partikulen kolisioaren eraginez ematen den energi transferentzian oinarriturik dago.


68

2.5.1.1.1. ANTS/DPX saioa p-xileno-bis-piridinio bromuro molekulak (DPX) 8-

aminonaftaleno-1,3,6-trisulfoniko azidoarekin (ANTS) talka egiterakoan, azkenengoaren fluoreszentzia moteltzen da (2.3 irudia). ANTS molekularen kitzikapen eta igorpen maximoak 355 eta nm-tan aurkezten ditu hurrenez-hurren. Liposomen barnealdean bi molekulak batera enkapsulatzen direnean (DPX:ANTS ~ 4:1, MW= 422 eta 427 Da. hurrenez hurren), ANTS-aren igorpena DPX-ek moteltzen du, eta neurtzen den fluoreszentzia minimoa da. Mintzaren irazkortasuna handitzen baldin bada, bi konposatuak liposometatik aterako dira, eta kanpo medioan diluituko dira, kolisio fenomenoak murriztu egiten direlarik. Beraz, DPX-ak ANTS-aren gainean eragiten duen atenuazio fenomenoa desagertzen denez, ANTS-aren fluoreszentzia igorpenaren seinalea handituko da. Mekanismo hau hurrengo irudian adierazita agertzen da.

-ANTS/DPX LUV-ak prestatzeko, 2.4.1.1 atalean adierazi den

moduan jarduten da, baina lipido filma ANTS/DPX tanpoian birresekiz (ikusi 2.1.5 atala).

-LUV-ak prest daudenean, esklusio molekularreko zutabe batetik pasatu ziren (Sephadex G-75, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suedia), honela besikulen kanpoaldean geratu den zunda baztertu zen.

-Irazkortasun saioan erabiltzen den tanpoi arrunta, ANTS/DPX tanpoiarekin orekan egon behar da, liposomak apurtu ez daitezen. Honetarako bi tanpoien osmolaritatea osmometro batean doitu zen (Osmomat 030, Gonotec).

Askatzen den zundaren portzentajea hurrengo ekuazioarekin

kuantifikatu zen: % Askapena=[(Ff – F0)/ (F100 – F0)] x 100 (1) Ff, peptidoa gehitu ostean fluoreszentziaren baloreari dagokio, F0

liposomen hasierako fluoreszentzia balorea da, peptidoa gehitu baino lehenagokoa; eta F100 triton X-100 detergentea gehitu ostean lortzen den ANTS-aren fluoreszentzia maximoa. Triton X-100-ekin liposomak erabat solubilizatzen dira eta barnealdean dagoen zunda guztia kanpoaldera ateratzen da.


69

2.3. Irudia: Solutuen askapen saioaren adierazpen eskematikoa. Hasiera

batean molekulak besikulen barnealdean aurkitzen dira, hauen kontzentrazioa altua izanik, beraz ANTS eta DPX molekulen arteko kolisioak faboratzen dira. Ondorioz, DPX-ak ANTS-aren fluoreszentzia moteldu dezake. Sistemari molekula litiko bat gehitzen zaionean, liposomaren irazkortasun hesia apurtzen da eta bi zundak kanpoaldean askatu eta diluitzen dira. Diluzioaren ondorioz DPX-ak ANTS-ari eragiten dion moteldura desagertu egiten da eta ANTS-aren fluoreszentziaren igorpena handitzen da. Goiko panelean zunda hauen egitura molekularrak adierazi dira. λex eta λem ANTS molekulak uretan aurkezten dituen kitzikapen eta igorpen uhin luzera maximoak direlarik.

2.5.1.1.2. FITC-Dextrano saioa Kasu Honetan liposomen barnealdean FITC-dextranoak sartu

ziren (4.000 eta 10.000 Da.). Saioaren oinarria, aurrekoaren berdina da, talka bidezko energi transferentzia gertatzen da, baina kasu honetan dextranoak berak, bere buruarekiko. Molekula honen igorpen eta


70

kitzikatze uhin luzerak oso gertu daudenez (λexc= 490 nm eta λem= 530 nm), dextranoa bere burua moteltzen du.

Lehen bezala, dextranoa liposomen barnealdean dagoenean

neurtzen den fluoreszentzia minimoa da baina mintzaren irazkortasuna handitzen baldin bada, konposatua liposometatik aterako da kanpo medioan diluituz eta talka fenomenoak murriztuz.

Dextranoak barnealdean gordetzen dituzten besikulak

prestatzeko 2.4.1.1. protokoloan aldaera batzuk sartu behar dira: 1-Dextranoak tanpoi arrutan 100 mg/ml-ko kontzentrazioan

disolbatzen dira, eta lipido filma disoluzio honetan birreseki egiten da. Kasu honetan LUV-en barnealdeko eta kanpoaldeko osmolaritate ezberdinatuna 10 mosm direnez tanpoiak ez dira doitu behar.

2-Hamar izozte/desizozte ziklo egin beharrean, 20 ziklo egiten dira zundaren enkapsulazio etekina emendatzeko.

3- LUV-ak prest daudenean, ANTS/DPX-ekin egiten den moduan esklusio molekularreko zutabe batetik pasatu behar dira (Sephacryl 500-HR, Sigma) besikulen kanpoaldean geratu den zunda baztertzeko. Kasu honetan besikulak derrigor %0.6 rho-PE-rekin markatu behar dira, zutabetik eluitzean begi bistaz ikusi ahal izateko.

Kasu honetan ere askatzen den zundaren portzentajea (1)

ekuazioarekin lortzen da. 2.5.1.2. SOLUTUEN SARRERA Ditionito sodikoaren sarrera-saioak, peptidoek eragindako

besikulen irazkortasuna, denboran zehar egonkorra den efektu baten eraginez den aztertzea baimentzen digu. Ditionito sodikoak eragiten duen NBD zunda fluoreszentearen nitro taldearen erredukzioa, zundaren fluoreszentziaren murrizpena neurtuz jarraitu daiteke (McIntyre, J. C. eta Sleight, R. G., 1991) (2.4 irudia).

Horrela, LUV simetrikoek (hots, NBD-a bi monogeruzetan

dutenak) irazkortasun hesiaren osotasuna mantentzen baldin badute, ditionitoak soilik kanpoaldeko monogeruzan dagoen NBD-a erreduzitu dezake. Irazkorrak diren besikulek soilik (poroen eraketaren ondorioz adibidez) ditionitoaren sarrera baimenduko dute eta ondorioz,


71

barnealdeko monogeruzan dagoen NBD zundaren erredukzioa emango da (NBD zunda totalaren erredukzioa, hain zuzen ere) (2.5 irudia).

2.4. Irudia: NBD nitro taldearen erredukzioa, amino talde batera

ditionitoaren eraginagatik. Ditionitoak NBD-aren nitro taldea (fluoreszentea dena) 7-aminobentzeno-2-oxa-1,3-diazol-4-il (ABD) konposatua (fluoreszentea ez dena) erreduzitzen du (McIntyre, J. C. eta Sleight, R. G., 1991).

-%0.6 NBD-PE-dun besikulak prestatu ziren, 2.4.1.1 atalean

adierazten den moduan. Modu honetan zunda fluoreszentea simetrikoki besikulen bi monogeruzetan banatzen da.

-Sodio ditionitoa 1 M-eko kontzentrazioan prestatu zen, pH 7.0-an zegoen 1M Tris-HCl tanpoian. Ditionitoa 4 ºC-tan eta argitik babestua mantendu zen denbora guztian.

-Ditionitoak eragiten duen fluoreszentziaren murrizpena konparatu zen besikula soiletan eta peptidoekin inkubaturiko besikuletan.

-Neurketak, NBD zundaren igorpen uhin luzera jarraituz egin ziren (λem=530 nm). Kitzikatze uhin luzera 465 nm finkatu zen eta 515 nm-tako filtro bat erabili zen argiaren dispertsio efektua ekiditzeko.

Besikulen barnealdean dagoen NBD-aren erredukzioaren

portzentajea hurrengo ekuazioarekin determinatu zen: % NBDi erreduzitua= [(Fd-Fx)/Fd-F100)]x100 (2) Non, NBDi barnealdeko monogeruzaren NBD-aren erredukzioa

den; Fd ditionitoz trataturiko besikulen fluoreszentziaren balorea den; Fx lehenbizi peptidoekin inkubatuak eta gero ditionitoa gehitu zaien besikulen fluoreszentziaren balorea. F100, ditionitoarekin tratatuak izan diren besikulei, Triton X-100 gehitu ostean lortzen den fluoreszentziaren balorea den.


72

2.5. Irudia: Solutuen sarrera saioaren adierazpen grafikoa. Hasiera batean

ditionitoak bakarrik kanpoaldeko monogeruzan dagoen NBD-a erreduzitu dezake. Besikulak molekula litiko batekin inkubatuz gero, ditionitoa besikularen barnealdera sar daiteke eta barnealdeko NBD-a erreduzitu.

2.5.1.3. PEPTIDOKO TRIPTOFANOEN ETA DANSILO

ZUNDAREN ARTEKO ENERGI TRANSFERENTZIA Mintzaren interfasean peptidoaren barneraketa ematen den edo

ez aztertzeko, peptidoaren Trp-tik, gainazalean dagoen d-DHPE zundara ematen den energi transferentzia jarraitu zen (Ruiz-Arguello, M. B., Goni, F. M. eta lank., 1998).

N-(5-dimetilaminonaftaleno-1-sulfonil)-1,2-dihexadekanoi-

fosfatidiletanolamina lipidoa (dDHPE) bere buru polarrean, dansilo (DNS) zunda loturik dauka (2.6 irudia). Zunda hau kitzikatzeko erabiltzen den uhin luzera (335 nm) triptofanoaren igorpen uhin luzerarekin gainezartzen da (330-350 nm). Beraz, bi fluoroforoak hurbil baldin badaude, kitzikatuta dagoen triptofanotik (λex ≈ 280 nm) dansilo zundara energi transferentzia fenomeno bat gertatzen da. Energi transferentzia honek triptofanoaren igorpen-fluoreszentziaren murrizpen bat dakar, DNS-aren igorpen fluoreszentziaren areagotzearekin batera (520 nm-tan igorpen maximoa). Lipido hau bi


73

monogeruzetan (kanpoko edo barneko monogeruzan) txertatuta edo asimetrikoki bakarrik kanpoko monogeruzan txertatuta, erabili daiteke. Peptidoa mintzean txertatzen bada, peptidoaren triptofanoa, mintzaren kanpo monogeruzaren interfasetik gertu dagoen edo barneko monogeruzaren interfasetik gertu dagoen jakin daiteke saio honen bidez (Jelokhani-Niaraki y cols., 1998).

-Tesi honetan liposoma simetrikoak erabili dira, eta hauek

prestatzeko, DNS-DHPE-z markaturik dagoen lipidoa, kloroformoan disolbatzen da eta fase organikoan dagoen lipido nahasketari dagokion erlazio molarrean gehitzen zaio (%6 sunda, lipido totaleko).

-Nahasketa erabiliz, 2.4.1.1. atalean deskribatzen den bezala liposomak prestatzen dira.

-Zuzenduriko espektroak SLM Aminco espektrofluorimetro batean jaso ziren. Espektrofluorimetroa irabiagailu magnetikoa eta kubeta berotzeko bainua zeraman.

-Kitzikatze uhin luzera, 280 nm-tan finkatu zen eta igorpen uhin luzera 350 nm-tan. Slit-en zabalera 5 nm-tan finkatu zen bi kasutarako.

-Lipido-peptido nahasturak 30 minutuz inkubatu ziren espektroak jaso baino lehen.

Energi transferentziaren eraginkortasuna (E) hurrengo

ekuazioaren bitartez kalkulatzen da (3) (Stryer, L., 1978): E = 1- (QT / Q0) (3) Non, Q0 eta QT triptofanoaren fluoreszentziaren intentsitateak

diren DNS moteltzailearen presentzian eta gabezian, hurrenez-hurren.


74

2.6. Irudia: Triptofanoa eta dansiloaren arteko energi transferentzia

saioaren adierazpen eskematikoa. Goikoaldean DNS zundaren egitura molekularra DHPE lipidoaren buru polarrari baturik adirazi da. Sunda mintzean txertaturik dagoenean mintzaren interfasean kokatzen da. Mintzean txertaturik dagoen sundaren kitzikatze eta igorpen uhin luzerak adierazten dira. Dansiloaren hasierako seinalea handitzen doa, peptidoa mintzaren interfasearekin elkarregiten duen heinean.


75

2.5.1.4. PEPTIDOEN FLUORESZENTZIA INTRINTSEKOAREN

ALDAKETA BIDEZKO BATURA-ISOTERMA: URA-MINTZA BANAKETAREN NEURKETA

Proteina edo peptidoen hondar fluoreszenteak polaritate baxuko

ingurugiro hidrofobiko batean aurkitzen badira, igorpenaren uhin luzeran desplazamendu bat urdinalderantz (uhin luzera baxuagotara) eta intentsitatearen handipen bat behatu daiteke. Ezaugarri hau erabiliz, fluoroforo naturalen fluoreszentzia intrintsekoa jarraitzen bada besikula kantitatea gehitzen den heinean, mintzerango itxurazko banaketa konstatea (KX) determinatu daiteke.

-Banatze-kurbak, lipido kontzentrazioaren titulazio bat eginez

gertatzen den Trp-aren igorpen fluoreszentziaren aldaketarekin, zenbatetsiak izan ziren.

-Peptido gehi liposoma nahstura 30 minutuz eta 37 ºC-tan inkubatu ziren neurketa egin baino lehen, sistema orekara heldu dadin (seinalearen egonkortasuna denboran).

-Kitzikatze uhin luzera 280 nm-tan finkatu zen eta igorpen uhin luzera 350 nm-tan.

-Seinalea diluzioarekin zuzendua izan zen eta barneko filtroaren zuzenketa NATA trp-aren analogoarekin egin zen (NATA ez da mintzetan banatzen).

KX-a balio esperimentalak hurrengo ekuaziora doituz kalkulatua

izan zen (4): [(Fmax/F0)-1] [L] F/F0 = 1 + -------------------- (4) K+ [L] non, L lipido kontzentrazioa den, F0 liposomen gabezian lortzen

den fluoreszentzia, F liposoma kontzentrazio bakoitzerako lortzen den fluoreszentzia eta K lipidoaren kontzentrazioa zeinean peptidoaren frakzioa 0.5 den. Beraz, Kx= [W]/K, non [W] uraren kontzentrazio molarra den, [W] = 55.3M izanik (Eckert, D. M. eta Kim, P. S., 2001).


76

2.5.2. DIKROISMO ZIRKULARRA Dikroismo zirkularra (CD) egitura sekundarioa eta tertziarioan

ematen diren aldaketa egituralak behatzeko eta biomolekulen egonkortasun konformazionala determinatzeko teknika sentikorrenetarikoa da. Metodo enpiriko bat izateaz gain, peptido edo proteina baten egitura sekundarioan gertatzen diren aldaketak zuzenean neurtu daitezke.

Proteinen CD espektroa ultramore urrunean (far-UV) oso sentikorra da proteinaren egitura sekundarioa determinatzeko. Ultramore hurbileko espektroa aldiz (near-UV) proteina eta peptidoen alboko kate aromatikoen eta disulfuro zubien kontribuzioa adierazten du (Perczel, A. eta Hollósi, M., 1996).

CD-a oso teknika erabilia da, analisia erraza delako eta erabili

behar den produktu kantitate oso txikia delako. Baina teknika honen bitartez ezin da proteinaren egitura tridimentsionala determinatu.

Dikroismo zirkularraren fenomenoa, ingurune asimetriko batean

dauden bi kromoforo argi polarizatuarekin elkarregiten dutenean ematen da. Proteinaren kasuan, prozesu honetan parte hartzen duten lotura peptidikoen amida taldeek eta alboko kate aromatikoek talderik anitzenak dira. Amida taldeen nπ eta ππ* transitzioen kiralitatea eta hauen arteko elkarrekintza kirala, peptidoen kromoforoek aurkezten dituzten antolamendu espazialen menpe daude. Peptidoen kromoforoen alderdian (<240 nm), gainezarrita dauden nπ* eta ππ* espektroen bandengatik osaturik dago. Gainezarrita dauden nπ* eta ππ* espektroen banda hauek kate polipeptidikoaren zenbait alderdi konformazional edo/eta konformeroen nahasketen emaitzak dira. Polipeptidoek eta proteinen kromoforoak antolamendu errepikakorra aurkezten dituzten konformazio lokalak dituzte. Antolamendu errepikakor hori α helizeak eta β orriei dagozkie. Ordenazio ezberdinetan lotura peptidikoak hartzen duten orientazioen menpe, amida taldeen transitzio optikoak, transitzio anitzetan banatu daitezke. Transitzioen uhin luzerak (λ) aldatu daitezke eta intentsitateak handitu edo gutxitu. Guzti honen ondorioz, egitura sekundarioko egiturek, α helizeak, β orriak, β birak eta poli-L-prolina (P2), berezko CD espektro bereziak dituzte (2.8. irudia).


77

α-helize batek minimo bikoitz bat aurkezten du 222 nm eta 208-

210 nm-tan eta maximo handi bat 191-193 nm-tan. Banda hauen intentsitateek, aztertzen diren peptido edo proteinen eliptizitate proportzioa adierazten dute. CD espektroa β egitura ezberdinen artean asko aldatu daiteke. Orokorrean, β orri konformazioek, minimo bakar bat aurkezten dute 210-225 nm-tan eta maximo bakar bat 190-200 nm-tan, hauen intentsitatea α−helizeei dagokienak baino baxuagoak direlarik. P2 elementu egiturala, 205 nm-tan banda negatibo handi bat izateagatik bereizten da. Azkenik, egitura desordenatuak, 200 nm-tik hurbil banda negatibo handi bat eta positiboak edo negatiboak izan daitezkeen zenbait banda ahul 220 nm eta 230 nm tartean izateagatik bereizten dira.

2.8. Irudia: Egitura sekundario ezberdinei dagozkien CD espektroak.

2.5.2.1. CD-aren ADIERAZPENA Linealki polarizatua dagoen argiak bi osagai ditu: (1) Ezkerretara

zirkularki polarizatua dagoen osagaia (rpc) eta (2) eskuinetara zirkularki polarizatua dagoen osagaia (lpc). Rpc osagaiaren bektore elektrikoa, argi sortaren norantza daukan ardatz perpendikular baten inguruan birak ematen ditu, erloju baten ardatzen kontrako norantza hartuz. Lcp

200 220 240

λ (nm)

[θ] (

Deg

.cm

2 .dm

ol-1

)

200 220 240

λ (nm)

[θ] (

Deg

.cm

2 .dm

ol-1

)


78

osagaia aldiz, erloju baten ardatzen norantzan biratzen du. Konposatu kiral batek aktibitate optikoa aurkezten duenean, rcp-aren xurgapena eta lcp-aren xurgapena berdinak ez direlako da. Dikroismo zirkularra, argi polarizatuaren rcp eta lcp osagaien xurgapenaren ezberdintasuna bezala definitu daiteke. Lambert-Beer-en legea kontuan hartuz gero (UV-ikuskorra espektroskopiaren transitzio elektronikoa definitzen duena), xurgapen ezberdintasun hauek hurrengo formularekin adieraz daitezke:

∆A=A1-Ar=(εl c l)-(εr c l)= ∆ε c l (5) non, c solutu kiralaren kontzentrazio molarra den, ε estintzio

molarraren koefizientea den eta l argiaren hari-neurria den;

∆ε = εl -εr izanik. Argi polarizatuak ingurugiro kiral bat zeharkatzen duenean,

bektore elektrikoek, ardatz nagusiarekiko biraketa angelu bat eratzen dagoen elipse bat deskribatzen dute. Osagai zirkularren bektore elektrikoek norantza berdina daukatenean, beraien magnitudeen baturak elipsearen ardatz erdi-nagusia sortzen dute. Aurkako norantza daukatenean, beraien magnitudeen ezberdintasunak, elipsearen ardatz erdi-txikia sortzen dute. CD-a ardatz erdi-nagusiaren eta erdi-txikiaren erlazioa bezala definitzen da. Erlazio hau, eliptizitate bezala ezaguna den θ angeluaren tangentea da (2.9 irudia).


79

2.9. Irudia: Eliptikoki polarizatua dagoen argia. Eliptizitatea θ angelua da,

angelu honen tangentea elipsearen ardatz nagusia eta txikiaren arteko erlazioa da. α angelua, elipsearen ardatz nagusiaren eta argiaren polarizazio planoaren arteko angelua da eta biraketa optikoa adierazten du.

Angelu hau orokorrean oso txikia denez, θ−ren tangentea θ−ren

berdina da eta xurgapenarekin hurrengo adierazpenaren bidez erlazionatzen da:

θ (deg) = 32.98 ∆A (6)

Argiaren pasabidearen eta solutuaren kontzentrazio molarraren

arteko menpekotasun lineala kentzeko, eliptizitate molarra hurrengo moduan definitzen da:

[θ] = 100 θ /c l (7)

(5) eta (6) ekuazioak (7) ekuazioan ordezkatuz hurrengo

adierazpena lortzen da:

[θ] = 3298 ∆ε (8) non, laginak azaltzen duen dikroismoaren magnitudea estintzio

koefizienteen ezberdintasunaren menpe dagoen definitzen den.


80

Polipeptido eta proteinen CD-an ostera, hondar bakoitzeko eliptizitate molarraren adierazpena erabiltzen da (7. ekuazioa). Hondar bakoitzeko eliptizitate molarra deg.cm2.dmol-1.hondar-1 unitateak ditu eta eliptizitate molarra, peptidoak edo proteinak dituen n aminoazido hondarrengatik zatitzerakoan lortzen da.

Bi peptidoen arteko elkarrekintza aztertu nahi dugunean, beraien

aldetik bi peptidoak emango lituzketen espektroak neurtu behar dira eta bi peptidoen espektroak batzerakoan ematen duen espektroa, biak batera benetan neurtzean ematen duen espektroarekin konparatu behar da. Eliptizitate molarra 7. ekuazioan adierazten den bezala kalkulatuko litzateke baina, bi peptidoak kontuan hartu beharko lirateke eta bien aminoazido hondarren kopurua.

Aintzakotzat hartu daiteke, xurgapen elektronikoa eta dikroismo

zirkularraren espektroa zenbait bandaz osaturik daudela. Banda bakoitza oinarrizko egoera batetik elektronikoki kitzikatua dagoen egoera batera ematen den transitzioari dagokio. Banda bakoitza zenbait parametroen bidez bereiz daiteke. Lehenengoa, uhin luzerak edo maiztasunak zehazten duten kokapenean oinarritzen da. Orokorrean λmax edo νmax moduan adierazten da, eta CD-aren xurgapenak balore maximoa erdietsi egiten duen uhin luzera edo maiztasuna dira. Bigarren parametroa intentsitatea da, εmax modura adierazten dena xurgapenerako eta ∆εmax CD-erako, eta muturreko banden baloreak direnak.

2.5.2.2. CD BIDEZ EGITURA SEKUNDARIOEN

DETERMINAZIOA BURUTZEKO PROTOKOLOA Tesi honetan burutu diren CD neurriak, Jasco J-810 dikroismo

zirkularrerako espektropolarimetroan neurtu ziren. Espektropolarimetroa tenperatura kontrolatzeko Peltier sistema bat darama eta azido (1S)-(+)-10-kamporsulfonikoarekin maiz kalibratzen da.

-Peptidoen stock-ak dagokien kontzentrazioan DMSO-n disolbatu

ziren eta gau osoan zehar liofilizatzen utzi ziren. Neurketak burutu baino lehen, peptidoak 0.03 mM kontzentrazioan 2 mM Hepes (pH, 7.4) tanpoian disolbatu ziren.

-Espektroak 1 mm-ko pasu optikoa duen kuartzozko kubeta batean 37 ºC-tan neurtu ziren.


81

-Neurketak 180-260 nm tartean jaso ziren. -Erabili ziren neurketa–baldintzak hurrengoak izan ziren:

-100-eko sentikortasuna -1 nm-tako banda zabalera -1 s-tako erantzun denbora -0.0025 nm-ko eta 20 nm/minutuko abiadura -Lorturiko espektroa, 20 espektroen batez bestekoa izan

zen. -Espektroak jaso ostean tanpoiaren seinalea kendu zitzaien eta

lorturiko mgrad-etan (ε ) zegoen seinalea, batez beste hondarren eliptizitatera [θ] (gradu.cm2.dmol-1) aldatu egin zen hurrengo formularekin:

(θ)= ε (mgradu)/(10.C.n.l) (9)

non, C peptidoaren kontzentrazio molarra den, n peptidoaren

aminoazido kopurua eta l kubetaren pasu optikoa cm-tan. 2.6. ELISA ELISA (ingelesetik, Enzyme Linked Immunoabsorvent Assay), oso

teknika erreza eta sentikorra da. Orokorrean immunologian erabiltzen den teknika bat da, seroko antigorputz kontzentrazioa (GIB edo West Nile birusen testarako adibidez) determinatzeko edo antigeno baten presentzia detektatzeko erabiltzen delarik. Beste zenbait aplikazio ditu ere, adibidez janari industrian alergeno potentzialak detektatzeko (esnean, kakahuetetan, almendretan, intxaurretan etab.).Metodoa aplikazio oso handia izan du batez ere antigorputzen bidez, produktuen kuantifikazioa egin behar den alorretan: diagnostiko klinikoan,birusen detekzioan,antigorputzen sailkapena isotipoetan, antigorputz monoklonalen bilaketan etab.

Teknikaren oinarria, antigenoa fase solido baten gainean geldiaraztea da eta bi antigorputz erabiliz detektatzea da. Erabiltzen den lehenengo antigorputza antigeno-espezifikoa da, eta bigarrena antigeno-antigorputz konplexuarekin erreakzionatzen du. Bigarren antigorputzak orokorrean entzima bat loturik darama, koloredun edo fluoreszentedun sustrato bat sortarazten duena.


82

2.6.1. ELISA ZUZENA -DMSO-an disolbaturik dauden peptidoak (kasu honetan

2F5preTM) PBS tanpoian disolbatu ziren 1 µM-eko kontzentrazioan. -Putzu bakoitzeko 100 µl-tako lagin bolumena bota zen “C96

Maxisorp microplate wells” (Nunc, Denmark) plaketan eta gau osoan zehar inkubatu ziren giro tenperaturan.

-Hurrengo goizean plaka %0.05 Tween 20 (Merck) zeraman PBS tanpoiarekin garbitu zen, 200 µl putzu bakoitzean jarriz.

-Putzuan geratu ahal izan diren peptido gabeko tokiak %3 BSA zuen PBS tanpoiarekin blokeatu ziren, 300 µl putzu bakoitzean, bi orduz eta giro tenperaturan.

-Plaka blokeatu ostean birritan garbitu zen eta %1 BSA, %0,02 Tween 20 zeraman PBS tanpoian antigorputzak disolbatu ziren eta plakara gehitu.

-Plaka antigorputzekin 4 orduz eta giro tenperaturan inkubatu zen. -Denbora hori pasata plaka birritan garbitu zen eta antigorputz

sekundarioa gehitu zitzaion (untxi-kontrakoa, Pierce, Rockford, IL, USA). Antigorputz sekundarioa %1 BSA eta %0.02 Tween 20 zeraman PBS tanpoian eta dagokion diluzioan (1:10000), putzuetara gehitu zen eta ordu batez inkubatu zen giro tenperaturan.

-Ondoren plaka hiru bider garbitu zen. -Antigorputz sekundarioak fosfatasa alkalino bat konjugatua

dauka, beraz entzima honen sustratoa, p-nitrofenilo fosfatoa (Sigma, St. Louis, MO, USA) gehitu zitzaion.Antigorputzek peptidoa ezagutzen dutenean fosfatasa alkalinoak katalizatzen duen erreakzio bat ematen da, bere sustratoaren presentzian kolore horia ematen duena.

-Plaka Synergy HT microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., VT, USA) plaka lektorean 405 nm-tako uhin luzeran irakurri zen.

-Balore positibotzat hartu ziren, hiru bider balore negatiboen desbiazio estandarrak zirenak.

-Balore negatiboak BSA kontrolak izan ziren. 2.6.2. LIPOSOMETAN OINARRITURIKO ELISA Mab-mintza elkarrekintza aztertzeko Liposometan oinarrituriko

ELISA erabili zen. SUV-ak %1 Biotina-PE-rekin markatzeak, estreptabidinaz gaineztaturiko mikroplaterretara (Nunc, Denmark) espezifikoki batzea ahalbidetzen du.


83

%5 N-Rho-PE lipidoarekin markaturik zeuden liposomak erabiliz,

kalibratu zen saioa. -Protokolorako, 100 µΜ lipido besikulak estreptabidinaz

gaineztaturiko mikroplaterretan landatu ziren, 100 µl/putzu-ko. -2 orduz giro tenperaturan inkubatu ziren agitazio oso motelarekin.

Denbora honetan SUV-ak plakako esteptabidinara batuta daude. -Plaka hiru bider tanpoi arruntarekin garbitu zen. -Plakan geratzen diren leku ez espezifikoak blokeatzeko

blokeatzeko “SuperBlock” tanpoi komertziala erabili zen (Pierce). -Hemendik aurrera hiru protokolo ezberdin jarraitu ziren: 1-Mab eta mintzaren arteko elkarrekintza aztertu nahi izan zenean: -MAb-ak zegokien kontzentrazioan gaineratu ziren tanpoi

arruntean disolbaturik. Lau orduz giro tenperaturan inkubatu ziren. 2-Antigorputza bere epitopoa mintzean txertatua dagoenean nola

ezagutzen duen aztertzeko: -Liposomak landaturik zeudela peptidoa 1 µM kontzentrazioan

gehitu zitzaion tanpoi arruntean disolbaturik, gau osoan zehar giro tenperaturan inkubatu zelarik.

-Ondoren Mab-ak zegokien kontzentrazioan gaineratu ziren tanpoi arruntean disolbaturik. Lau orduz giro tenperaturan inkubatu zirelarik.

Emaitza berdinak lortu ziren Liposomak eta peptidoa elkarrekin

soluzioan ere inkubatuz eta ondoren plaketara batuz edo aurreko moduan bezala, lehenengo liposomak plakara batuz eta ondoren peptidoa botata.

3-Lehiaketa ELISA -Antigorputzak peptidoekin soluzioan inkubatu ziren ordu erdiz eta

giro temperaturan. -Ondoren plaketara gehitu ziren eta lau orduz giro tenperaturan

inkubatu ziren Ondoren protokolo berdinarekin jarraitzen da hiru kasutan: -Inkubazioaren ostean plakak tanpoi arruntarekin garbitu ziren.


84

-Antigorputz sekundarioa tanpoi arruntean 1:10.000 diluzioan disolbaturik gehitu zen ordu batez inkubatzeko.

-ELISA arruntean bezala, antigorputz sekundarioak fosfatasa alkalinoa konjugatua dauka eta beraz sustratoa bota ostean plaka lektorean xurgapena 405 nm-tan neurtu zen.

Protokolo guztian zehar ez zen Tween 20 erabili liposomak ez

apurtzeko. Itxurazko afinitate konstatea (K) lortzeko, batura balore

maximoen erdira estrapolatu ziren. Batura balore hauek, balio esperimentalak hurrengo ekuaziora doituz lortu ziren (Doms, R. W. eta Moore, J. P., 2000):

Abs = Absmax=[MAb]/(K+[MAb]) (10) Non, Abs xurgapena den, Absmax xurgapen maximoa eta [MAb],

antigorputz primarioaren kontzentrazioa. 2.7. BESTELAKO TEKNIKAK 2.7.1. SAIO ANTIMIKROBIANOA (AMP) Peptidoen aktibitate antimikrobianoa, E. coli BL21 anduian

mikrodiluzioei sentikortasuna aztertzen duen test baten bidez aztertu zen (Oren, Z., Hong, J. eta lank., 1999; Oren, Z., Lerman, J. C. eta lank., 1999).

-Bakterioak saturaziorarte hazi ziren eta 96 putzu esteril dituen

plaka batean (nunc, Denmarck), 50 µl bakterio 106 CFU /ml kontzentrazioan jarri ziren (620 nm-tan 108 CFU/ml bakterio 0.35-eko dentsitate optikoa aurkezten dute (Silvestro, L., Weiser, J. N. eta lank., 2000)).

-DMSO-an disolbaturik zeuden peptidoak gau osoan zehar liofilizatu ziren eta ur distilatu esterilean errekonstituitu ziren zegokien kontzentrazioan.

-Hodietan, 100 µM-etik hasita peptidoen diluzioak egin ziren.Putzuetara diluzio bakoitzetik 50 µl peptido gehitu zen.


85

-Plaka 37 ºC-tan 4 orduz inkubatu zen eta bakterioen hazkuntza Synergy HT microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., VT, USA) plaka lektorean 492 nm-tako uhin luzeran neurtu zen.

Kontrol modura, bakterioak peptido gabe hazi ziren eta LB

medioa bakterio eta peptido gabe. Aktibitate antimikrobianoaren kontrol positibo modura zekropina peptido antimikrobianoa erabili zen.

2.7.2. SAIO HEMOLITIKOA Peptidoen aktibitate hemolitikoa aztertzeko gizaki eritrozitoak

erabili ziren (hRBC, ingelesetik Human red blood cells). Eritrozito mintzen lisiaren adierazle modura, hemoglobinaren irteera erabili zen.

2.7.2.1. ODOL-ERITROZITOEN ISOLAKETA -Giza eritrozitoak odoletik erauzteko, 3.5 ml odol 30 ml hemolisi

tanpoi fisiologikoan (ikusi 2.1.5 atala) diluitzen dira. Tanpoia ioien kelatzailea den eta koagulazioa ekiditen duen EDTA ez darama, extrakziorako erabili ziren tuboak bazeramatelako.

-Tuboa 300 xg-tara 10 minutuz zentrifugatu zen, 4 ºC-tan. Pausu honetan, gainjalkinean, plaketak geratzen dira.

-Jalkina, jalkinaren bi bolumen diren hemolisi tanpoi fisiologikoan oso leunki birreseki zen.

-Odola berriro zentrifugatu zen 1000 xg-tara 10 minutuz. -%5 hRBC lortzeko, jalkina 20 bider bere bolumena zuen hemolisi

tanpoi fisiologikoan birreseki zen. %5 hRBC, 333 milioi eritrozito/ml dira eta 412 nm-tan 0.5 a.u.

dira (Oren, Z., Hong, J. eta lank., 1999; Oren, Z., Lerman, J. C. eta lank., 1999; Zelezetsky, I., Pacor, S. eta lank., 2005).

2.7.2.2. HEMOLISI SAIOA Saio antimikrobianoan egin zen moduan, peptidoen aktibitate

hemolitikoa hauen mikrodiluzio test bat eginez aztertu zen. Eritrozitoen


86

hemoglobinaren irteera 412 nm-tan neurtu zen Synergy HT microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., VT, USA) plaka lektore batean.

-DMSO-an disolbaturik zeuden peptidoak gau osoan zehar

liofilizatzen utzi ziren. -Hurrengo egunean zegokien kontzentrazioan hemolisi tanpoi

fisiologikoan berrosatu ziren. -Hodietan peptidoen diluzio jarraituak prestatu ziren. Eppendorf

bakoitzean 50 µl %5 hRBC eta 50 µl peptido zegokion kontzentrazioan nahastu ziren eta 30 minutuz giro tenperaturan inkubatu ziren.

-Hodiak 800 xg-tara 10 minutuz zentrifugatu ziren eta gain-jalkinak, kontu handiarekin “C96 Maxisorp microplate wells” (Nunc, Denmark) plaketako putzuetara transferitu ziren.

-Plaka, 412 nm-tan Synergy HT microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., VT, USA) plaka lektorean neurtu zen.

Azterturiko peptidoak aktibitate hemolitikoa izanez gero,

eritrozitoetatik hemoglobina askatuko litzateke. Hemolisi totalaren kontrol modura, % 1 triton X-10 erabili zen

(eritrozitoen mintza erabat solubilizatzen duelako eta beraz, hemoglobina guztia askatuko da). %0 hemolisi kontrol moduan %5 hRBC erabili zen (Oren, Z., Hong, J. eta lank., 1999; Oren, Z., Lerman, J. C. eta lank., 1999; Zelezetsky, I., Pacor, S. eta lank., 2005).


87


88


89

______________________________________________________________________

AITZINSOLASA: Birusek, mintzak desegituratzeko mekanismo desberdinak garatu

dituzte, modu honetan zelula barnera sartu, bertan erreplikatu eta bertatik atera daitezkeelarik. Pikornabirusen 2B proteina ez-egiturala, birusaren erreplikaziorako beharrezkoa da eta zolduraren fase berantiarretan gertatzen den mintz plasmatikoaren irazkortasunean zerikusi handia dauka. Tesi honetan prozesu honen mekanismo molekularrari ikuspegi berria ematen zaio. Poliobirusaren 2B proteinaren sekuentziatik eratorriak diren bi transmintz domeinuak, peptido gisa erabili dira poroak eratzeko aurkezten duten aktibitatea aztertzeko.

Zitopatikoak ez diren kontzentrazioetan TM1 peptidoa (2B-ren

sekuentzian 35-55 aminoazidoak) kultiboan dauden zelulak irazkortzeko gaitasuna aurkezten du (IC50 ≈ 4x10-7 M), B-Higromizina, pisu molekular baxuko solutua (MW: 527.5) zelula barnera sartzen delarik.

Dikroismo zirkularrarekin lorturiko emaitzak, bat datoz peptido

honek, mintzak helize moduan zeharkatzeko daukan ahalmenarekin. TM1 peptidoa poroak eratzeko gaitasuna duen domeinua dela

frogatzeko, 2B sekuentzia osoa hartzen duen peptido bilduma erabiliz irazkortasun-aktibitatea kokatu da. Zelula kultiboak eta mintz-modeloak erabili dira TM1 peptidoa poro hidrofilikoak eratzeko gaitasuna duela aztertu ahal izateko. Poro hauetan zehar pisu molekular baxuko solutuek mintza zeharkatu dezakete.

Poliobirusaren 2B proteinak toxina zitolitiko moduan jarduten

duela eta, hortaz, poroak eratzeko gaitasuna duten proteinen artean sailkatu daitekeela ondorioztatzen da.

3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I

90

3.1. SARRERA Mintzetan poroak eragitea, organismo askok, defentsa zein

erasorako erabiltzen duten mekanismo zaharrenetariko bat da (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Gouaux, E., 1997; Shai, Y., 1999; Parker, M. W. eta Feil, S. C., 2005). Animalia-zelulen mintz plasmatikoan poroak eratzeko gaitasuna daukaten proteina eta peptido zitolitikoak, bakterioetan, ornodunetan (immunitate sistemaren osagai bezala), itsaso-anemonetan, amebetan eta onddoetan ekoizten dira. Peptido eta proteina zitolitiko hauek, artropodo eta sugeen pozoietan ere aurkitu daitezke (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Kuhn-Nentwig, L., 2003; Hecht, O., Van Nuland, N. A. eta lank., 2004; Parker, M. W. eta Feil, S. C., 2005). Produktu zitotoxiko hauen sekuentzien artean oso homologia baxua egon arren, denek egitura irazkorrak eta aldagaitzak sortarazten dituzte. Egitura hauek, mintzean zehar esklusio limite zehatz bat daukaten solutu txikien eta ioien fluxu pasiboa baimentzen dute kasu askotan (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Shai, Y., 1999; Gilbert, R. J., 2002; Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002; Parker, M. W. eta Feil, S. C., 2005).

Orain arte produktu hauen artean birus-jatorria daukan

homologo funtzionalik ez da aurkitu. Mintzaren irazkortasuna handitzea animalia-birusen ohiko ezaugarri bat izanik, arraroa da orain arte horrelako produktu zitotoxikorik birus-proteinen artean aurkitu ez izana (Carrasco, L., 1995).

Birusaren erreplikazioa ematen ari denean behatzen diren

hainbat fenomeno hala-nola, mintzaren irazkortasunaren areagotzea eta zelularen aldaketa morfologikoak, (nukleoan gertatzen diren aldaketak, zitoeskeletoaren desantolaketa eta mintz-besikulen agerpena) birusak eragindako efektu zitopatikoak dira (Penman, S., 1965; Penman, S., 1965; Penman, S. eta Summers, D., 1965; Castrillo, J. L. eta Carrasco, L., 1985; Doedens, J., Maynell, L. A. eta lank., 1994; Doedens, J., Maynell, L. A. eta lank., 1994). Birus biluzien kasuan, autore batzuen ustetan, zelula barnean gertatzen den birus-partikulen pilaketa edo birus-produktuen espresio ugariak, mintzean sortarazten diren kalte ez-espezifikoen eragileak dira. Kalte hauek, mintzaren irazkortasuna areagotuko lukete eta zelularen lisia eragin, honela birus berrien irteera baimenduko litzatekeelarik (Koch, F. eta Koch, G., 1985; Castrillo, J. L., Vanden Berghe, D. eta lank., 1986).Baina ideia honen kontra, mintza zuzenean irazkortzeko ahalmena daukaten eta birusek


91

kodeturiko zenbait produktu existitzen dira (Carrasco, L. eta Smith, A. E., 1976; Carrasco, L., 1978; Carrasco, L., 1981). Are gehiago, mintza irazkortzeko prozesuan poro-antzeko egiturak eratzen direneko ebidentziak daude eta funtsa ematen diote azken ideia honi.

Birus biluzien infekzioaren tarteko fasean gutxi gorabehera,

mintzetik zenbait solutuen askapena gertatzen dela behatu da. Askapen hau ioi eta molekula txikietarako espezifikoa da (adibidez nukleotidoak, azukreak, aminoazidoak eta pisu molekular baxuko inhibitzaileak), baina ez makromolekuletarako. Birus biluziek kodetzen dituzten zenbait gene eta produktuen bakarkako espresioa zelula sistemetan, prozesu hauek errepikatzen dituztela ikusi da (Barco, A. eta Carrasco, L., 1995; Doedens, J. R. eta Kirkegaard, K., 1995; Aldabe, R., Barco, A. eta lank., 1996; van Kuppeveld, F. J., Galama, J. M. eta lank., 1996; Aldabe, R., Irurzun, A. eta lank., 1997; Van Kuppeveld, F. J., Hoenderop, J. G. eta lank., 1997; Van Kuppeveld, F. J., Melchers, W. J. eta lank., 1997; Barco, A. eta Carrasco, L., 1998; Madan, V., Garcia Mde, J. eta lank., 2005).

3.1.1. POLIOBIRUSAREN 2B PROTEINA Poliobirusa Picornaviridae familiako enterobirus bat da.

Picornaviridae familiaren barnean birus biluzi eta zitolitiko ugari sailkatu dira. Poliobirusaren genoma 7.5 Kb eta polaritate positiboa daukan RNA molekula bakar batek osatzen du. RNA honek 220 kDa-etako poliproteina bat kodetzen du (Porter, A. G., 1993; Wimmer, E. eta Nomoto, A., 1993). Poliproteina birus-proteasen eraginez prozesatzen da lau egitura-proteina emateko (kapsidearen proteinak) eta hamar proteina ez-egitural. Proteina ez-egituralen artean 2B, 2BC eta 3A proteinek, zeluletan espresatzen direnean, mintzak irazkortzeko ahalmena aurkezten dute (3.1. irudia) (Lama, J. eta Carrasco, L., 1992; Barco, A. eta Carrasco, L., 1995; Doedens, J. R. eta Kirkegaard, K., 1995; Aldabe, R., Barco, A. eta lank., 1996; Doedens, J. R., Giddings, T. H., Jr. eta lank., 1997; Sandoval, I. V. eta Carrasco, L., 1997; Van Kuppeveld, F. J., Hoenderop, J. G. eta lank., 1997; van Kuppeveld, F. J., Melchers, W. J. eta lank., 1997).


92

3.1. Irudia: Polio-birusaren genoma eta poliproteinaren prozesamendua. Birusak daukan polaritate positibodun RNA-ren itzulpenaren ondorioz

poliproteina aitzindari bat kodetzen da. Poliproteina hau proteasen bidez prozesatzen da, P1, P2 eta P3 bitartekariak sortzen direlarik. 2B proteina P2 bitartekaria prozesatzerakoan sortzen den produktu bat da

Pikornabirusen zoldurak, zelula-mintzetan aldaketa egituralak

eta funtzionalak eragiten ditu. Aldaketa hauen artean, zelula barneko mintzen birmoldaketa behatzen da. Mintzen birmoldaketa honek besikula-sistemaren funtzionamendu zuzena inhibitzen du (Cho, M. W., Teterina, N. eta lank., 1994; Carrasco, L., Guinea, R., Irurzun, A. y Barco, A., 2002; Carrasco, L., Guinea, R. eta lank., 2002; Egger, D., Gosert, R. eta Bienz, K., 2002). Ondorioz, glikoproteinen garraioa blokeatzen da eta zitoplasman besikula txikien metaketa ematen da. Besikula txiki hauetan birusaren erreplikaziorako konplexuak aurkitzen dira (Guinea, R. eta Carrasco, L., 1990; Bienz, K., Egger, D. eta lank., 1992; Doedens, J. R. eta Kirkegaard, K., 1995; Suhy, D. A., Giddings, T. H., Jr. eta lank., 2000; Rust, R. C., Landmann, L. eta lank., 2001). 2BC aitzindariak, sekrezio bidean sortu diren besikula hauen produkzioan paper garrantzitsu bat jokatzen duela proposatu da (Bienz, K., Egger, D. eta lank., 1992; Cho, M. W., Teterina, N. eta lank., 1994; Aldabe, R. eta Carrasco, L., 1995; Doedens, J. R. eta Kirkegaard, K., 1995; Rust, R. C., Landmann, L. eta lank., 2001).


93

2BC aitzindaria poliobirusaren proteinarik irazkorrena da, 2B-k

hartzen duen konformazioagatik, 2BC eta 2B artean ematen den kokapenaren ezberdintasunagatik, edo 2BC-k bere baitan gorde dezakeen aktibitate ezezagun batengatik izan daitekeelarik (Aldabe, R., Barco, A. eta lank., 1996; Barco, A. eta Carrasco, L., 1998). 2B edo 2BC-ren espresioa, nahikoa da Ca2+ intrazelularra (ER eta Golgitik) askatzeko eta mintzaren irazkortasuna ioi honekiko eta pisu molekular baxuko konposatuekiko handitzeko (Lama, J. eta Carrasco, L., 1992; Aldabe, R., Irurzun, A. eta lank., 1997; Van Kuppeveld, F. J., Hoenderop, J. G. eta lank., 1997). Azkenaldi honetan atera diren ikasketa batzuetan demostratu da, Coxsackie birusaren 2B proteinak eragiten duen Ca2+ intrazelularraren homeostasiaren aldaketak, zelula ostalariaren apoptosiaren erantzuna, ziklo infektiboaren erdialderantz ezabatzen duela (Campanella, M., de Jong, A. S. eta lank., 2004). Postulatu egiten da, 2B-ren funtzio anti-apoptotikoa, ER eta mitokondriaren arteko Ca2+ fluxuen seinaleztapenaren beherapenagatik ematen dela (Van Kuppeveld, F. J., de Jong, A. S. eta lank., 2005).

2B proteinak mintzaren irazkortasuna areagotzeko erabiltzen

duen mekanismoa oraindik ezezaguna da. Poliobirusarekin zoldurik dauden zeluletan, 2B proteina erreplikazio konplexuak aurkezten dituzten mintzetan aurkitu da (Bienz, K., Egger, D. eta lank., 1987; Schlegel, A., Giddings, T. H., Jr. eta lank., 1996; Rust, R. C., Landmann, L. eta lank., 2001). 2B bakarrik espresatzen denean, ER mintzean eta Golgi aparailuaren mintzean aurkitzen da (Sandoval, I. V. eta Carrasco, L., 1997; de Jong, A. S., Wessels, E. eta lank., 2003). Van Kuppeveld eta lankideek iradokitzen dute, Coxsackie birusaren 2B proteinak zelula barneko mintzak zuzenean irazkortzen bere lana burutuko zuen bitartean, mintz-plasmatikoaren irazkortasuna areagotzeko beste mekanismo ezezagun baten bidez gertatu behar da (de Jong, A. S., Melchers, W. J. eta lank., 2004). Dena den 2B proteinan, Golgi eta ER mintzen irazkortasunean eragina daukaten mutazioak eragitean fenomeno hauek batera gertatu behar direla demostratu da mintzaren irazkortasuna ere gutxitzen dela ikusi baitute (Campanella, M., de Jong, A. S. eta lank., 2004).


94

3.2. Irudia: Poliobirusaren 2B proteina ez-egituralaren sekuentzia. A) Polio-

birusaren genomaren adierazpen grafikoa. B) 2B-ren sekuentzia primarioa. Goiko aldean bi hidropatia plot irudikatu dira: marra beltzez, bataz besteko hidrofobizitateari dagokio, Wimley eta White oktanol eskalarekin eta 11 aminoazidotako leihoa erabiliz kalkulatua izan dena, marra ez jarrai gorriarekin, α-helize konformazioari dagokion momentua. Beheko aldean agertzen diren bi zilindroak, iradokitzen diren bi transmintz domeinuak adierazten dituzte.


95

3.2. ERABILITAKO MATERIALAK, TEKNIKA

ESPERIMENTALAK ETA PROTOKOLOEN SAILKAPENA

3.2.1. PEPTIDO SEKUENTZIAK 3.4 eta 3.8 irudietan agertzen diren, TM1, TM2, N-ter1, N-ter2,

TURN eta C-ter peptidoak 2B-ren sekuentziatik eratorriak dira. Peptido hauek (tesiaren bigarren kapituluan azaltzen den bezala, 2.1.1 atala), beraien C-karboxiamida muturretik hasita, Fmoc “fase solido” sintesiaren bidez lortu eta HPLC-z purifikatuak izan ziren, Pompeu-Fabra-ko Unibertsitatean (Barcelona, Spain) .

Zekropina peptido antimikrobianoa, lehen aipatu den bezala

komertzialki lortu zen (Andreu, D., Merrifield, R. B. eta lank., 1983). 3.2.2. DIKROISMO ZIRKULARRA Kapitulu honetan azaltzen diren CD saioak 2.5.2.2 atalean

adierazi den moduan burutu ziren. -Peptido laginak zegokien kontzentrazioan gau oso batez liofilizatu

ziren. -Liofilizatua 2 mM Hepes tanpoian 0.03 mM kontzentrazioan

berrosatu zen. SDS-rekin buruturiko espektroetan liofilizatua 10 mM edo 50 mM SDS zeraman 2 mM hepes tanpoian berrosatu zen.

-Neurriak Jasco J-810 dikroismo zirkularrerako espektropolarimetroan burutu ziren.

-Espektroak 1 mm-takoa pasu optikoa zuen kuartzozko kubeta batean neurtu ziren.

-Neurketak 37 ºC-tan burutu ziren. -Datuak 1 nm-tako banda zabaleran eta 20 nm/min abiaduran

jazo ziren. Lorturiko espektroa, 20 espektroen batez bestekoa izan zen.


96

3.2.3. KULTIBO ZELULARREKIN SAIOAK Kapitulu honetan kultiboan dauden zelulekin egindako saio

guztiak Luis Carrasco-ren laborategian, Vanessa Madan eta Miguel Angel Sanz-en kolaborazioarekin, Madrileko Unibertsitate Autonomoan (CBM-UAM) burutu ziren.

Kapituluan zehar zenbait protokolo ezberdin jarraitu dira azaltzen

diren esperimentu ezberdinak burutzeko. Esperimentu guztietan BHK-21 lerro zelularra erabili zen.

-BHK-21 zelulak 37 ºC-tan hazi ziren Dulbecco-k eraldaturiko Eagle

medioan (DMEM); gehigarri moduan, %5 txahal sero fetala (FCS) eta funtsezkoak ez diren aminoazidoak gaineratu zirelarik.

-Peptidoek eragindako mintzaren irazkortasuna aztertzeko 2.3.3. atalean azaldu diren protokoloak jarraitu ziren.

3.2.3.1. ZELULAN ESPRESATZEN DIREN PROTEINEN

IRAZKORTASUN AHALMENA AZTERTZEKO PROTOKOLOA -Zelulak, in vitro itzuli diren RNA-ekin elektroporatu eta L24

plaketan landatu. -Elektroporazio osteko denbora ezberdinetan zelulak 1 mM HB-

rekin 15 minutuz (HB+) edo gabezian (HB-) tratatu ziren. 3.2.3.2. PEPTIDOEN IRAZKORTASUN AHALMENA HB-arekiko: -BHK zelulak 16 mm-tako putzuetan erein ziren eta gau osoan

zehar hazten utzi ziren. -Gau osoan zehar hazten egon diren zelulak FCS gabeko DMEM

medioarekin garbitu ziren. -Peptidoak, zegokion kontzentraziotan, DMEM medioan disolbaturik

gehitu ziren. Ordu batez 37 ºC-tan C02 inkubadorean inkubatu ziren. - 1 mM HB-rekin 15 minutuz (HB+) edo gabezian (HB-) tratatu ziren.


97

3.2.3.3. PEPTIDOEN IRAZKORTASUN AHALMENA α-

SARTZINAREKIKO -Zelulak peptidoekin inkubatu ziren (5 µM sero gabeko DMEM

medioa) 1 h-z eta 37 ºC-tan. -Ondoren α -sartzinarekin 20 minutuz aurretik tratatu ziren (10

µg/ml), peptidoa kendu barik. -Medioa kentzen da eta proteinen markaketa erradiaktiboa egiten

da. α-sartzinaren sarreraren kontrol positibo moduan, zelulak SV-

rekin (Sindbis birusa) infektatu ziren. -Zelulak SV-rekin 10 eta 100 pfu/zelula infektatu ziren 1 h-z eta

37 ºC-tan α-sartzinaren presentzian 10 µg/ml. -Ondoren medioa kendu zen eta proteinen markaketa erradiaktiboa

egiten zen 10 µCi/µl [35S]Met/Cys-rekin, 40 minutuz (Sanz, M. A., Madan, V. eta lank., 2003; Madan, V., Garcia Mde, J. eta lank., 2005).

-Inkubazioaren ostean proteinen zama tanpoian laginak jaso ziren, 5 minutuz 95 ºC-tan irekin ziren.



3.2.3.4. TM1 PEPTIDOAK ERAGINDAKO

IRAZKORTASUNAREN INHIBIZIOA -Bi protokolo erabili ziren: A) TM1 10 µM eta estreptabidina 0.1 edo 1 µM nahastu ziren 15

minutuz. Ondoren nahasketa zelulei gehitu zitzaien eta 37 ºC-tan inkubatu ziren ordu batez.

B) Lehenbizi zelulak TM1 peptidoarekin 15 minutuz inkubatu ziren eta gero estreptabidina gehitu egin zen, ordu batez inkubatzeko 37 ºC-tan.

-Zelulak 20 minutuz HB-ren presentzian (+) edo gabezian (-) 37 ºC-tan inkubatu ziren, eta erradioisotopoarekin 40 minutuz markatu ziren.

- Laginak SDS-PAGE bidez prozesatuak izan ziren.


98

3.2.3.5. TM1 ETA TM2 PEPTIDO BIOTINILATUEN KOKAPENA -BHK-21 zelulak beirazko portetan hazi ziren. -Zelulak 1 µM TM1 edo 1 µM TM2 peptidoekin ordu batez eta 37

ºC-tan inkubatu ziren. -Zelulak finkatzeko %4 paraformaldehidoa erabili zen. -Finkapenaren ostean, zelulak FITC-estreptabidinarekin 1:300

erlazioan inkubatu ziren 45 minutuz eta giro tenperaturan. -Azkenik laginak DABCO mowiol-a erabiliz prestatu ziren eta

Radiance 2000 (Bio-Rad/Zeiss) mikroskopio konfokalaren bidez behatu ziren.

3.2.4. LIPIDO-MONOGERUZEKIN SAIOAK Peptidoen txertaketa monogeruzetan aztertzeko, azalera

zirkularra eta finkoa duen kubeta batean azalera-presioa neurtu zen (µTrough S System, Kibron, Helsinki).

-Neurketak 37 ºC-tan eta agitazioarekin burutu ziren. -1 ml tanpoi arrunta erabili zen fase-urtsu moduan. -Behar den hasierako presioa (π0) kloroformotan disolbaturik

dagoen lipidoa gainazaletik barreiatuz lortu zen. Aire-ur interfasean aplikatzen den lipido kantitatea aldatuz gero, hasierako presioa moldatzen da.

-Peptidoak fase-urtsuan injektatu ziren Hamilton mikroxiringa baten laguntzaz.

-Erabili ziren peptido kontzentrazioak, aire-ur interfasean ez zuten presio nabarmenik eragin. TM1 0.25 µM eta gainontzeko guztiak 0.5 µM.

π0 funtziopean gertatzen diren ∆π aldaketak aztertuz, peptidoen

azaleko presio kritikoak πc lortu ziren. 3.2.5. LIPIDO-BESIKULEKIN SAIOAK -Lamela bakarreko PC-zko eta PI-zko besikula handiak (LUV)

extrusio metodoaren bidez prestatu ziren (2.4.1.1. atala ikusi) (Mayer, L. D., Hope, M. J. eta lank., 1986).


99

3.2.5.1. SOLUTUEN ASKAPEN SAIOA Besikulen irazkortasuna ANTS/DPX eta FITC-dextranoak

besikulen barnealdean enkapsulatuz aztertu zen (Ellens, H., Bentz, J. eta lank., 1985). Saioa 2.5.1.1. atalean adierazi den moduan burutu zen.

-LUV kontzentrazioa finko mantendu zen 50 µM-tan eta koartzozko

kubetan erabili zen bolumen finala 1 ml-takoa izan zen. -Peptidoak DMSO-an disolbaturik kubetara gehitu ziren zegokien

kontzentrazioan (Peptidoak gehitu ziren bolumenetan DMSO-a eraginik ez zeukalarik besikulen gain)

-30 minututako zinetikak neurtu ziren, 37 ºC-tan eta irabiaketa konstatenpean.

-ANTS/DPX saioaren kasuan finkatu ziren uhin luzerak; λexc= 355

nm eta λem= 520 nm izan ziren. Argiaren dispertsio efektua sahiesteko 475 nm-tako filtro bat erabili zen. Zunda hauen pisu molekularra 422 eta 427 Da. Dira hurrenez hurren.

-FITC-dextranoen askapena neurtu zenean erabili ziren uhin

luzerak; ; λexc= 490 nm eta λem= 530 nm izan ziren. Argiaren dispertsio efektua sahiesteko 515 nm-tako filtro bat erabili zen. 4000 eta 10000 Da.-eko dextranoen askapena aztertu zen.

Askatzen den zundaren portzentajea bigarren kapituluan

deskribatu den (1) ekuazioarekin kuantifikatu zen: % Askapena=[(Ff – F0)/ (F100 – F0)] x 100

3.2.5.2. SOLUTUEN SARRERA SAIOA Irazkortasun saioak osatzeko asmoarekin ditionitoaren sarrera

besikulen barnealdera jarraitu zen, McIntyre eta Sleight-ek (McIntyre, J. C. eta Sleight, R. G., 1991) deskribatu zuten moduan eta Agirre eta lankideek (Agirre, A., Barco, A. eta lank., 2002) erabilitako aldaketekin.


100

-Saio hau 2.5.1.2. atalean adierazten den moduan burutu zen. -%0.6 NBD-PE-dun PC besikulak prestatu ziren, 2.4.1.1 atalean

adierazten den moduan. LUV kontzentrazioa 50 µM-eko izan zen. -LUV-ak peptidoarekin 30 min-z eta 37 ºC-tan inkubatu ziren,

ondoren 20 mM ditionito sodikoa gaineratzeko. -Neurketak, NBD zundaren igorpen uhin luzera jarraituz egin ziren

(λem=530 nm). Kitzikatze uhin luzera 465 nm finkatu zen eta 515 nm-tako filtro bat erabili zen argiaren dispertsio efektua ekiditzeko.

Ditionitoak eragiten duen fluoreszentziaren murrizpena

konparatu zen besikula soiletan eta peptidoekin inkubaturiko besikuletan. NBD-aren %55-ren erredukzio bezala kanpoaldean kokaturiko NBD-aren erredukzioa aintzakotzat hartu zen. Barnealdeko NBD portzentaje erreduzitua bigarren kapituluan deskribatu den (2) ekuazioarekin lortu zen.

% NBDi erreduzitua= [(Fd-Fx)/Fd-F100)]x100 3.2.6. AMP ETA HEMOLISI SAIOAK Aktibitate antimikrobianoa eta hemolitikoa bigarren kapituluko

2.7 atalean adierazi den moduan aztertu ziren.

3.3. EMAITZAK Pikornabirusen proteinak, poliproteina aitzindari bakar baten

proteolisitik datoz (3.1 eta 3.2A irudiak). Animali zeluletan espresaturiko espezie errekonbinanteak erabiliz ondorioztatu den arabera, 2B produktu ez-egituralak, 2BC aitzindariaren eratorria dena, mintzak irazkortzeko aktibitatea bere baitan darama (Aldabe, R., Barco, A. eta lank., 1996; Van Kuppeveld, F. J., Hoenderop, J. G. eta lank., 1997).


101

3.3.1. PEPTIDOEN SEKUENTZIAK ETA AURKEZTEN

DITUZTEN EGITURAK Egitura primarioari analisi bat egiten badiogu (van Kuppeveld, F.

J., Galama, J. M. eta lank., 1996; van Kuppeveld, F. J., Melchers, W. J. eta lank., 1997), bigizta motz baten bidez loturik dauden bi sekuentzia hidrofobiko desberdindu daitezke, TM1 eta TM2 izendatuak (3.2B irudia). TM1 domeinuaren amino mutur alderdian dauden hiru lisinek aldizkako helizitatea aurkezten dute, eta honek domeinuari anfipatizitatea eman diezaioke (van Kuppeveld, F. J., Galama, J. M. eta lank., 1996; Nieva, J. L., Agirre, A. eta lank., 2003). Sekuentzia hauek oktanoletik uretara banatzeko behar duten energi aske nahikoa aurkezten dutenez, transmintz helize moduan bigeruza gurutzatzeko, eta bertan poro oligomeriko bat eratzeko iradoki daiteke (Nieva, J. L., Agirre, A. eta lank., 2003).

2B proteinak, bi sekuentzia hauen eraginez, mintz plasmatikoan

poroak eratzeko gaitasuna daukala onartuz, bi peptido diseinatu ziren, TM1-a eta TM2-a (3.4A irudia). Lisina hondar gehigarriak jarri dira domeinu hauei solugarritasuna emateko. Sekuentzien muturretan jarri daitezkeen lisina hondar minimoak Deber eta lankideek deskribatu dituzte (Melnyk, R. A., Partridge, A. W. eta lank., 2003; Partridge, A. W., Melnyk, R. A. eta lank., 2003). Autore hauen iritziz lisina-buztan hauek solugarritasuna ematen diote sekuentziari, mintzetan TMD-aren egoera natiboa oztopatzen ez duten bitartean.


102

3.3. Irudia: A) Poliobirusaren 2B proteinaren TM1 sekuentziaren helize

itxurako modeloa. Kolorearen eskala, panelean aurkezten den Wimley-White oktanol eskalari dagokiena da. B) 2B proteinak mintzean hartzen duen egituraren modeloa. Ezkerrean, α-helize-bigizta-α-helize motiboa mintzean. TM1 helize anfipatikoaren alde hidrofobikoa (beltza) eta hidrofilikoa (zuria) adierazi dira. TM2, grisez adierazten den helizea da. Transmintz poroa osatzen duten monomeroen kopurua, solutuen askapen saioen emaitzekin egindako modelo matematikoen bidez eta SDS-PAGE gelen bidezko oligomerizazioa saioen bidez kalkulatu da. (Nieva, J. L., Agirre, A. eta lank., 2003)-etik egokitua.

3.4B irudian TM1 eta TM2 peptidoen dikroismo zirkularreko espektroak adierazten dira, detergente mizelen presentzian eta gabezian. Bi sekuentzia hauen jarrera kontrakoa da, TM1-ak soluzioan egitura gradu txiki bat aurkezten duen bitartean, TM2-a egitura gabe azaltzen da. Are gehiago, TM1-ak SDS mizelen presentzian egitura α-helikoidala aurkezten du, eta TM2-k aldiz, aurkezten duen helizitatea baxuagoa da. Gainera, TM2-k ≈205 nm-tan minimo bat aurkezten du eta 200 nm-tik beherantz positibo bat, egitura flexibleagoa hartzen duenaren adierazlea dena.


103

3.4. Irudia: 2B proteinaren transmintz sekuentziatik eratorriak diren

peptidoen izendapena eta egitura. A) 2B transmintz peptidoen sekuentziak. B) TM1 eta TM2 peptidoen CD espektroak tanpoian (puntutxudun marra), eta 10 mM SDS detergentea duen tanpoian (marra ez jarraia) edo 50 mM SDS tanpoian (marra jarraia).

3.3.2. MINTZ-ZELULARRAREN IRAZKORTASUNAREN

HANDIPENA PEPTIDOEN BIDEZ 3.5, 3.6 eta 3.7 irudietan TM1 eta TM2 peptidoek zelulak

irazkortzeko daukaten ahalmena azaltzen da. Poliobirusaz infektaturik dauden zelulek B-higromizinarekiko (HB), proteinen sintesiaren inhibitzailea dena, irazkorrak bihurtzen dira infekzioaren erdialdeko faseetan (Carrasco, L., Guinea, R. eta lank., 2002). Alfabirusaren erreplikoia (2.3.2 eta 2.3.3.1. atalak ikusi) erabiliz, 2B proteina bakarrik zelula barnean espresatu daiteke, aurreko efektu berdina lortuz (3.5 irudia).

TM1 mediora gehitzerakoan zelulak HB-ra eraginkorki irazkorrak bihurtzen dira. TM2-ak aldiz, ez du eraginik aurkezten (ezkerraldeko panela).


104

3.5. Irudia: BHK-21 zelulen mintz plasmatikoaren irazkortasun aldaketa

2B transmintz peptidoen eraginez. Mintza irazkorra bihurtzen bada, HB, proteinen sintesiaren inhibitzailea dena, zelula barnera sartu daiteke eta proteina zelularren sintesiaren inhibizioa ikus daiteke. Ezkerraldeko panela: zelulak, TM1 eta TM2-rekin 30 minutuz inkubatu ziren, ondoren higromizina gehitzeko. TM1-ekin tratatuak izan ziren zelulak bakarrik bihurtu ziren antibiotikoari irazkorrak. Kontrol modura peptidoekin tratatu gabeko zelulak erabili ziren, higromizinari irazgaitzak direnak. Bestalde peptidoak berez ez dute proteina zelularren inhibiziorik sortarazten (-HB). Eskuinaldeko panela: 2B proteinak, "repC+2B" Sindbis birus (SV) erreplikoiarekin espresaturiko 2B proteinak eragindako mintzaren irazkortasuna. Ia zelula gehienak ondo transfektatu ziren, SV birusaren kapsidearen proteina (C) eta 2B bakarrik detektatu ahal direlarik.

Bestalde, TM1 peptidoaren gehipenak ez du eragiten α-sartzina

(16.8 kDa.) molekularen sarrera zelula barnera (3.6 irudia). Behaketa honek zera iradokitzen du: mintzak jasotako kaltea ez dela eragin ez-espezifiko baten ondorioa izan, baizik eta garatu diren zenbait zentzuzko eta tamaina zehatzeko egituren ondorioa. Ikuspuntu honen alde, TM1-ren eraginez HB-ra guztiz irazkorrak bihurtu diren zeluletan ez da ikusten inolako aldaketa morfologikorik, 2 ordutako tratamenduaren ostean (3.7 irudia).


105

3.6. Irudia: Peptidoek zelula mintzetan eragindako α−sartzina

proteinarekiko irazkortasuna. BHK zelulak, adierazten den modura, TM1 ala TM2-z tratatu ziren. α-sartzinaren sarrerarako kontrol positibo modura, SV-rekin zoldurik dauden BHK-21 zelulak erabili ziren, 10 edo 100 pfu/zelula infektatuak erabiliz. Birusaren sarrera ematen denean, zelulak proteina honekiko irazkor bihurtzen dira.

3.7. Irudia: TM1

peptidoaz trataturik izan diren BHK-21 zelulen morfologia. BHK: TM1 peptidoaz tratatu gabeko zelulen kontrola. TM1: zelulak TM1 2µM-ekin inkubatu ziren 2 orduz eta fase kontraste bidez behatu ziren. SV: Infekzioaren ondorioz behatzen diren aldaketa morfologikoak. Zelulak SV birusarekin infektatu ziren 5 pfu/zelula kontzentrazioan.


106

3.3.3. AKTIBITATEAREN KOKAPENA TM1 peptidoaren aktibitatea espezifikoa zen ikusteko, 20

aminoazidotako peptido serieak sintetizatu ziren (N-ter1, N-ter2, TURN eta C-ter). Peptido hauek, TM1 eta TM2 barne, 2B-ren sekuentzia osoa esku hartzen dute (3.8A irudia).

Peptido bilduma guztiarekin, 3.8 irudiko B panelean zelula

mintzak irazkortzeko ahalmena aztertzen da. Datu hauekin baieztatzen da TM1-k duen eraginkortasun altua. Beste peptidoak TM1-rekin konparatzen baditugu, eragiten duten zelula mintzen irazkortasuna ez da hain nabaria.

Saio hauetan peptidoak medio urtsutik, monogeruzean hazten

ari diren zelula mintzetara banatzen dira. Baldintza esperimental hauen menpe eta peptidoek zelularen mintz plasmatikoan txertatzeko duten ahalmena aztertzeko, lipido monogeruzetan peptido bakoitzaren txertaketa aztertu zen (3.8C panela eta 3.1. taula). Prozesuaren mekanismo zinetikoa, txertaketa ahalmena, peptidoek mintzak irazkortzeko ahalmenarekin bat datorrela adierazten du, TM2 peptidoaren kasuan honela ez delarik.

TM2 peptidoak mintzetan txertatzeko ahalmen altua aurkezten

du baina ez ordea zelula mintzak irazkortzeko ahalmena. N-ter2 eta C-ter peptidoek tarteko portaera aurkezten dute. Txertaketarako presio kritikoak (πc, sekuentziak monogeruzan txertatu ezin direneko azalera-presioa) TURN peptidoa bakarrik mintzetan ezin dela txertatu (πc ≥ 30 mN/m) adierazten digu.


107

3.8.

Iru

dia:

2B

pep

tido

bild

umak

min

tza

iraz

kort

zeko

dau

kan

ahal

men

aren

azt

erke

ta.

A)

2B a

min

oazi

dose

kuen

tzia

eta

hor

ren

azp

ian

era

bili

den

pep

tido

bild

um

a. B

) Pe

ptid

o bi

ldu

mak

era

gin

dako

zel

ule

n i

razk

orta

sun

mai

l a(p

epti

doak

zel

ule

kin

10

µM-e

ko k

ontz

entr

azio

an i

nku

batu

zir

en).

C)

20

mN

/m-t

ako

has

iera

ko p

resi

oan

pep

tido

eker

agit

en d

ute

n a

lbok

o az

aler

a-pr

esio

aren

ald

aket

ak P

C m

onog

eru

zeta

n (e

rabi

li de

n ko

lore

kod

ea,

B g

rafik

an e

rabi

li de

nbe

rdin

a da

). Pe

ptid

oak

0.5

µM-e

ko k

ontz

entr

azio

an in

jekt

atu

zir

en s

ubf

asea

n.


108

Azterketa estrukturala burutu zen ondoren. Orokorrean, N-ter1, N-ter2, TURN eta C-ter peptidoek ez dute aurkezten egiturarik soluzioan (3.9. irudia). N-ter1 peptidoak, α−helize konformazio nabarmena hartzen du SDS mizelen presentzian. N-ter2 eta C-ter sekuentziek egitura hartzen dute baina ez da N-ter1 peptidoak hartzen duen egitura bezain nabarmena (3.1 taula). Bestalde TM1 eta TM2 lotzen dituen bigiztak (TURN peptidoa) ez du egiturarik aurkezten SDS mizelen presentzian.

3.9. Irudia: 2B proteinaren sekuentziatik eratorriak diren peptidoen

egitura soluzioan eta SDS mizelen presentzian. Peptidoen CD espektroak adierazten dira. Puntutxudun marrarekin, peptidoak Hepes 2 mM tanpoian aurkezten duten egitura adierazten da. Peptidoak 10 mM SDS detergentea duen tanpoian (marra ez-jarraiak) eta 50 mM SDS detergentea duen tanpoian (marra jarraia) hartzen duten egiturak adierazten dira.


109

Laburbilduz, 3.8 irudian eta 3.1 taulan ematen diren emaitzetan

irazkortasun aktibitatea transmintz domeinu anfipatikoak (TM1) gordetzen duela ikus daiteke. Emaitzek ere iradokitzen dute TM1-TURN-TM2 motiboaren saihetsetik aurkitzen diren sekuentziek, mintzekin elkarrekiteko ahalmena daukatela baina ez mintzak irazkortzekoa.

3.1. Taula: 2B peptidoen txertaketa PC-zko lipido monogeruzetan.

Peptidoa ∆π20 (mN/m)a T1/2 (s)b πc (mN/m)c

Helize (%) SDS/sold

N-ter1 N-ter2 TM1

TURN TM2 C-ter

3.4 4.1 14.1 3.1 8.4 5.9

693 80 406 397 113 103

33.2 32.9 44.1 <25 37.9 32.6

4.5 1.9 -

0.5 2.5 2.6

a: Azalera-presioaren handipena peptidoak 20mN/m-ko hasierako presioa

duen monogeruza batean gehitzen direnean. b: Presio totalaren erdia lortzeko behar den denbora. c: Txertaketarako presio kritikoa. d: 222 nm-tan ematen den xurgapenaren handipena, soluzioan dauden

peptidoei SDS mizelak gehitzen zaizkienean. TM1 jadanik egitura aurkezten zuen soluzioan (3.4 irudia ikusi).

3.3.4. TM1 SEKUENTZIAREN KARAKTERIZAZIOA Prozesuaren karakterizazio sakonago bat egiteko asmoz, TM1

sekuentziak eragindako irazkortasuna zelularen mintz-plasmatikoan poro irazkor diskretuen sorkuntzaren ondorioa dela aztertu nahi zen (3.10-3.16 irudiak). 3.10A irudiko titulazio esperimentuan azaltzen da, 1 µM baino baxuagoak diren kontzentrazioak nahikoak dira kultibo zelulak HB-ra irazkorrak bihurtzeko. Dosi-menpekotasunak itxurazko 400 nM-eko IC50-a adierazi zuen (B panela).


110

3.10. Irudia: Zelula-mintzen irazkortasuna TM1-ren eraginez. A) TM1-aren

dosi menpekotasuna, HB-ren sarrerak eragiten duen proteina zelularren sintesiaren inhibizioarekin aztertzen da. B) Aurreko grafikoan behatzen den efektuaren kuantifikazioa. TM1-ek eragiten duen HB-ren sarrera (zirkuluak eta marra jarraiak) TM2-k eragiten duen HB-ren sarrerarekin konparatuz (karratuak eta marra ez-jarraiak). 3 saio ezberdinen desbiazio estandarren baloreak ploteatu dira.


111

TM2, kontrol negatibo espezifiko moduan erabili zen, mintzetan

txertatzeko ahalmena duelako (ikusi 3.10. irudia) baina ez ditu maila eraginkor batean zelulak irazkortzen kontzentrazio altuetan (10 µM) (B panela). TM1-en kasuan zelula monogeruzaren irazkortasun mekanismoaren zinetika (3.11 irudia) bat dator lipido monogeruzaren txertaketa mekanismo zinetikoarekin (3.8 irudia eta 3.1 taula). Zazpi minutu inguruko t1/2-ak neurtuak izan ziren bi prozesuetarako. Honek iradokitzen du, medio urtsuan disolbaturik dagoen TM1 peptidoaren mintz-txertaketa urrats mugagarria dela zelulen irazkortasunerako.

3.11. Irudia: TM1-ek eragindako zelula mintzaren HB konposatuarekiko

iragazkortasunaren zinetika. TM1 zelulekin denbora ezberdinetan inkubatu zen. Erabili zen TM1 kontzentrazioa 5 µM izan zen.


112

3.12 irudian aurkezten diren emaitzetan ikus daiteke, TM1-ek

eragindako zelula-mintzaren irazkortasuna, errezeptore bidezko endozitosia inhibitua dagoen baldintzetan, hots 4 ºC-tan, ere ematen dela. Beraz, dosiaren menpekotasuna, mekanismo zinetikoak eta tenperaturaren efektuak iradokitzen dute zelularen mintz plasmatikoan gertatzen den irazkortasuna TM1 sekuentziaren txertaketaren fenomenoagatik dela. Susmo hau 3.13 eta 3.14 irudietan agertzen diren emaitzek sustatzen dute.

3.12. Irudia: TM1-ek eragindako HB-ren sarrera 4 ºC-tan. Zelulak 4 ºC-tan

10 minutuz preinkubatu ziren eta ondoren TM1 peptidoa gehitu zitzaien (5µM) eta 30 minutuz inkubatu ziren. 0 denboran medioa kendu zen eta zelulak erradiaktiboki markatu ziren HB-ren gabezian (-) edo presentzian (+) (HB 1 mM, 30 minutuz eta 37 ºC-tan), edo 90 minutuz 37 ºC-tan inkubatu ostean medioa kendu zen eta HB-aren gabezian (-) edo presentzian (+) (HB 1 mM, 30 minutuz) erradiaktiboki markatu ziren.

Fluoreszentziako mikroskopia bidez TM1 peptidoaren kokapena

mintz plasmatikoan ezagutu zen (3.13 irudia). Detekzioa burutzeko fluoreszeinaz markaturik dagoen estreptabidina erabili zen. Estreptabidina, peptidoaren karboxilo muturrera itsatsita dagoen biotinara batzen da. TM2 sekuentzia ere mintz plasmatikoan kokatzen da, baina mintzean ematen den txertaketa hau, irazkortasuna gertatzeko nahikoa ez denaren ideia eutsiz.


113

3.13. Irudia: TM1 eta TM2-ren kokapena zelularen gainazalean. A)

Biotinilaturik dauden TM1 eta TM2 peptidoen kokapena FITC-estreptabidina konposatu fluoreszenteaz baliatuz burutu zen. Zelulak peptidoekin 15 minutuz inkubatu ziren eta ondoren FITC-strep gehitu zitzaien (1:200 erlazioan) eta ordu batez inkubatu ziren. Jarraian %4 paraformaldehidoarekin fixatu ziren 10 minutuz, eta fluoreszentziazko mikroskopio konfokal batean behatu ziren. Zelularen mintz plasmatikoa markaturik agertu zen bi kasuetan. Kontrol modura zelulak FITC-strp-rekin soilik inkubatu ziren. B) TM1 peptidoak eragindako irazkortasunaren inhibizioa. Bi protokolo erabili ziren: “a” TM1 10 µM eta estreptabidina 0.1 edo 1 µM nahastu ziren 15 minutuz. Ondoren nahasketa zelulei gehitu zitzaien eta 37 ºC-tan inkubatu ziren ordu batez. “b” Lehendabizi zelulak TM1 peptidoarekin 15 minutuz inkubatu ziren eta gero estreptabidina gehitu zen, ordu batez inkubatzeko 37 ºC-tan. Zelulak 20 minutuz HB-ren presentzian (+) edo gabezian (-) 37 ºC-tan inkubatu, eta erradioisotopoarekin 40 minutuz markatu ziren. Laginak SDS-PAGE bidez prozesatuak izan ziren.


114

Estreptabidina biotinadun peptidoen aktibitatea inhibitzen dituen

aztertzeko erabili zen. Estreptabidina molekula irazgaitza da (A panela), beraz TM1-ek eragiten duen mintzaren irazkortasuna mintz plasmatiko mailan gertatu behar da (B panela). Estreptabidina peptidoarekin soluzioan inkubatuz gero, TM1-ek eragindako irazkortasunean inhibizio efektu altuagoa ikusten da (“a” protokoloa). Baina inhibizio efektu hau ere behatzen da zelulak lehenik TM1 peptidoarekin inkubatzen direnean honen txertaketa baimentzeko (“b” protokoloa) ondoren estreptabidina gehituz. TM1-ek mintz plasmatikoan zelularen irazkortasuna areagotzen duten poro oligomerikoak eratzen dituela ondorioztatu daiteke.

3.14. Irudia: PC LUV-en irazkortasuna TM1, TM2 eta N-ter1 peptidoen

eraginez. A) Besikulen barnealdean dauden solutuen askapena (ANTS/DPX saioa) denboraren funtziopean. TM1 peptidoa marra urdinekin, TM2 marra berdeekin eta N-ter1 marra beltzekin adierazi dira. Kurbak lipido:peptido 1:1000 erlazioan lortu dira. B) 30 minututara lortzen diren ANTS/DPX solutuen askapenak, peptido:lipido erlazio ezberdinetara. Kasu guztietan erabili den lipido kontzentrazioa 50 µM izan da. Datuak bi esperimentuen batez besteko balioak dira.

3.14 irudian agertzen diren emaitzek, TM1 peptidoak lipido-

besikuletan poroak eratzeko ahalmena duelaren ebidentzia sustatzen dute. A panelean alderatu egiten dira, TM1 (mintzetan txertatzen dena eta hauek irazkorrak bihurtzen dituena), TM2 (mintzetan txertatzen dena, baina irazkorrak bihurtzen ez dituena) eta N-ter1 sekuentzien (kontrol inaktiboa) ahalmenak PC-zko LUV-en osagai urtsuen askapenean.


115

TM1-ek ANTS solutuaren askapena eragiten du peptido:lipido

proportzio (Ri) baxuetan 1:10000 erlazioan solutuen %16-a askatzen da, eta 1:1000 erlazioan %50 baino gehiago. Hain erlazio baxuetan askapena ematen baldin bada, besikulen apurketa peptido kantitate masiboen gehipenaren ondorioz ez dela, iradokitzen du. Mintzaren irazkortasuna mekanismo espezifiko baten ondorioz izan behar da. TM2 peptidoaren kantitate berdinak gehitzerakoan askapen adierazkorrik ez da gertatzen.

Hurrengo irudietan lortzen diren emaitzek TM1-ek eragiten duen

solutuen askapena peptido:lipido erlazio baxuetan poro litiko, egonkor eta diskretuen eraketaren bidez denaren ideia sendotzen dute. TM1-ek ANTS solutua (425 Da.) enkapsulatuta duten besikulak (peptido:lipido) erlazio baxuetan) oso ondo irazkortzen ditu, baina aldiz, FD-4 (MW:4000) eta FD-10 (MW:10000) solutuak enkapsulatuta dituzten besikulak erlazio berdinetan ez ditu ondo irazkortzen (3.15 irudia). Honek besikuletatik askatzen diren solutuak esklusio tamaina bat izan behar dutela iradokitzen du.

3.15. Irudia: TM1 peptidoak eragiten duen PC LUV-en irazkortasuna. A)

Tamaina ezberdineko solutuen askapena. Erabili den TM1:PC erlazioa 1:5000 da. B) Peptido:lipido erlazio ezberdinetan behatzen den ANTS/DPX askapena (zirkuluak eta marra jarraia), FD-4 (karratuak eta marra ez jarraia) eta FD-10 (hirukiak eta puntutxudun marra).

Solutu sarreraren esperimentuen bidezko, 3.15 irudiko emaitzek,

TM1 peptidoak poroak eragiten dituela ondorioztatu daiteke. Peptidoaren txertaketaren ondorioz eratzen den poroa, solutuen pasabidea baimenduko luke, mintz plasmatikoaren osotasuna galdu


116

gabe. Solutuen sarrera lagatzen du orekara heldu ostean ere, hots, besikuletatik ANTS solutuen askapen osoa gertatu denean.

Solutuen sarrera, kanpoaldetik gehitutako ditionitoak, besikulen

NBD portzentajea erreduzitzeko duen ahalmenaren bidez aztertu zen. NBD-z simetrikoki markaturik dauden besikuletan, ditionitoak gutxi gorabehera besikulen kanpoaldean dagoen NBD-a erreduzitzen du kanpoaldetik gehitzen baldin bada (fluoreszentziaren %50-ren murrizpenarekin bat datorren prozesua, CTL kontrola). Balore hau solutuen sarrera gertatu ez denean, hots sarreraren %0-a da. Aldiz detergenteekin besikulak solubilizatzen direnean lortzen den balorea sarreraren %100-a da.

3.16. Irudia: Solutuen sarrera peptidoek irazkorturiko PC besikuletan

(Ditionitoren sarrera saioa). A) Ditionitoaren sarrerak eragiten duen NBD zundaren erredukzioa. CTL: Ditionitoarekin trataturiko PC:NBD-PE besikulen kontrola (30 s-tara gehitua). TM1 eta TM2: dagokien peptidoekin 30 minutuz eta 37 ºC-tan preinkubatu izan diren PC:NBD-PE besikulak peptido:lipido 1:500 erlazioan; ondoren ditionitoarekin trataturik izan dira. B) Ditionitoaren sarrera, TM1 eta TM2 dosiaren gehikuntzaren ondorioz irazkorturik dauden PC besikuletara (TM1 zirkulu urdinak eta TM2 karratu berdeak).

3.16 irudian agertzen diren zinetikek, TM1 peptidoarekin tratatu

diren besikulek solutuen sarrera baimentzen dutela ondorioztatzen dute. Bestalde, TM2-rekin tratatu diren besikulek ez dute hain eraginkorki solutuen sarrera gertatzea baimentzen. Laburbilduz, datu guzti hauek kontuan hartuz, iradokitzen da, besikulen mintzetan denboran zehar egonkorrak diren konexio urtsuak eratzen direla, irazkorrak bihurtu diren zeluletan ikusten diren ezaugarri (sekuentzia espezifikotasuna, solutuen tamaina zehatza eta egonkorra) berdinak dituztenak.


117

3.3.5. KARGA ELEKTRIKOAREN ERAGINA Infekzioaren prozesuan zehar, 2B proteina, mintz plasmatikoaren

barneko monogeruzean txertatu behar dela iradokitzen da. Beraz, TM domeinuak, negatiboki kargatuta dagoen mintz-interfasera transferitu beharko lirateke. Hori dela eta, TM1 eta TM2-aren txertaketa eta poro-eraketan fosfolipido anionikoek duten eragina aztertu zen baita.

3.17. Irudia: TM1 eta TM2 peptidoen txertaketa monogeruza

anionikoetan. TM1 eta TM2-k eragindako presioaren aldakuntzaren baloreak adierazten dira. Datuak, presioaren handipena saturaziora heldu diren zinetiketatik lortu dira. Erabili ziren TM1 eta TM2 kontzentrazioak 0.25 µM eta 0.5 µM izan ziren hurrenez-hurren.

3.17 Irudian erakutsi den modura, bai TM1-ak, bai TM2-ak; PS,

PI edota PG fosfolipido anionikozko lipido monogeruzetan txertatzeko gaitasuna erakutsi zuten. Gainera, biak, 30 mN/m baino presio altuagoetan konprimituta zeuden monogeruzetan txertatzeko gai ere baziren. Beraz, mintz zelularretan aurkitzen diren alboko presioak jasaten dituzten fosfolipido anionikozko geruzetan txertatzeko egokiak direla ondorioztatu daiteke.


118

3.15. Irudia: PI besikula anionikoen irazkortasuna peptidoen funtziopean.

Peptido:lipido erlazio ezberdinetan behatzen den ANTS (MW: 425, eskuinaldeko panela) eta FD-10 (MW: 10000, ezkerraldeko panela) solutuen askapenaren portzentajeak.

Poro eraketaren prozesua aztertu zen ondoren. 2B proteinak PI-z

osoturiko mintzak irazkortzeko ahalmena duela kontutan hartuta (Agirre, A., Barco, A. eta lank., 2002), fosfolipido anioniko bera aukeratu zen TM1 eta TM2-ren ahalmenak aztertzeko (3.18 irudia). TM2-k bigeruza anionikoak, 1:1000 baino baxuagoak ziren peptido:lipido erlazio molarretan, eraginkorki irazkortu zituen bai ANTS-rekiko, baita FD-10-rekiko. Horren aldean, dosi horietan TM1-k eragin eskasa erakutsi zuen. Hots, domeinu litiko modura definitutako sekuentzia anfipatikoak, txertaturik egonda ere, ez zuen mintz anionikoak poratzeko gaitasun handirik erakutsi. Aldiz TM2-a, mintz neutroak poratzeko ahalmen mugatua erakutsi zuena (3.14 eta 3.19 irudiak), sekuentzia eraginkor modura agertu zen fosfolipido anionikoez osoturiko mintzetan. Hala eta guztiz ere, ezberdintasun garrantzitsu bat nabaritu zitekeen bi domeinuen artean: TM2-ak PI mintzetan eragindako irazkortasun prozesuak ez zuen TM1-k PC-n azaldutako solutu tamainarekiko espezifikotasun bera erakutsi.


119

3.19. Irudia: Peptidoen sinergiaren azterketa. A) ANTS/DPX solutu urtsuen

askapen zinetikak adierazten dira. PC eta PI besikulen presentzian eta 1:1000 peptido:lipido erlazio molarrean. B) 30 minututara lortzen diren ANTS/DPX solutuen askapena kontzentrazio ezberdinetan. PC besikulen presentzian, TM1 peptidoa lipidoarekiko 1:3000 erlazioan finkatu zen eta TM2 peptidoa titulatu zen. Kontrara, PI besikulen presentzian, TM2 erlazio berdinean finkatu zen eta TM1-en titulaketa erakusten da. Erabili zen LUV kontzentrazioa kasu guztietan 50 µM izan zen eta saioak 37 ºC-tan burutu ziren. Marra bertikal ez jarraiak, bi peptidoen arteko erlazio ekimolarra adierazten du


120

Behatutakoaren esangura funtzionalaren bila 3.19 irudian

erakutsitako saioak burutu ziren. Bertan, TM domeinuek poro-eraketa sinergizatzeko ahalmena azaltzen da. TM1-ak, nabarmenki areagotu zuen TM2-ak eragindako ANTS askapena PI liposometan (3.19A irudia). Aldiz, TM2-k, sinergia negatibo ahula agertu zuen TM1-ek eragindako PC irazkortasunarekiko (3.19A irudia). Gainera, TM1-aren efektu sinergiko positiboa, TM1:TM2 1:1 erlazio molarrera heltzean saturatu zen (3.19B irudia). Emaitza horrek, 1:1 estekiometriadun TM1:TM2 konplexuaren eraketari eman diezaioke euskarria. Konplexu horrek, negatiboki kargatuta dauden mintzetan eratzen baldin bada, modu eragingarri batean irazkortasuna bultzatuko luke.

3.3.6. PEPTIDOEN AKTIBITATE ANTIMIKROBIANO

ETA HEMOLITIKOA Azkenean, TM1 eta TM2-ek mintz naturalak irazkortzeko zuten

ahalmena neurtu zen saio hemolitiko eta antimikrobianoen (AMP saioa) bidez (3.20 irudia). TM1-ek aktibitate hemolitiko altua ageri zuen. Kalkulatutako IC50 balioa 10 µM izan zen. Erle-pozoiaren osagaia den "melitina", ezagutzen den peptidorik hemolitikoena 0.16 µM-eko IC50-a aurkezten du (Perez-Paya, E., Dufourcq, J. eta lank., 1997). Bestalde, TM1-ek, Rana tagoi igelatik isolaturiko peptidoa (IC50= 8 µM, melitinarekin erlazionaturik dagoena) aurkezten duen IC50 antzekoa dauka (Conlon, J. M., Sonnevend, A. eta lank., 2003) eta zitolitikotzat jo izandako beste hainbat peptido baino IC50 baxuagoa: Magaininak adibidez 80 µM-eko IC50-a aurkezten du (Unger, T., Oren, Z. eta lank., 2001), parabutoporinak, 38 µM-tan %50-eko hemolisi baino gutxiago eragiten du eta opistoporinak 100 µM-tan %30-a baino gutxiagokoa (Moerman, L., Bosteels, S. eta lank., 2002).

TM2-k, aldiz, ez zuen aktibitate hemolitikorik erakutsi saiatutako

kontzentrazioetan. Bion nahasketaren laginean, TM2-k eragindako inhibizioa nahiko nabarmena izan zen.

Ez batak, ez besteak, ez zuten aktibitate antimikrobiano

esanguratsurik erakutsi kontrol moduan erabili zen "zekropina"-ren aldean (MIC=0.2-0.4 µM (Putsep, K., Normark, S. eta lank., 1999)). Halere, TM2 eta TM1+TM2 nahasketaz trataturiko laginek, bakterioen hazkuntza inhibitzeko joera mugatua azaldu zuten kontzentrazio altuenetan.


121

3.20. Irudia: Peptidoen aktibitate hemolitikoa eta antimikrobianoa.

Ezkerraldeko panela: peptidoen aktibitate hemolitikoa aztertzeko mikrodiluzio test bat egin zen, hRBC-en hemoglobina irteera 412 nm-tan neurtuz. Zirkulu urdinekin TM1 peptidoaren aktibitate hemolitikoa adierazi da, karratu berdeekin TM2 peptidoarena eta hiruki beltzekin bi peptidoen nahastura. Eskuinaldeko panela: peptidoen aktibitate antimikrobianoa E. Coli BL21 anduian mikrodiluzio test batekin aztertu zen ere, eta bakterioen hazkuntzaren xurgapena 620 nm-tan neurtuz. Hazkuntzaren inhibizioaren kontrol positibo modura zekropina peptido antimikrobianoa erabili zen. Aurreko panelean erabili diren koloreak eta sinboloak erabili dira, erronbo gorriak zekropina peptido antimikrobianoa aurkezten duen hazkuntzaren inhibizioari dagozkio.

3.4. EZTABAIDA Mintzetan poroak eratzen dituzten proteinak mota ezberdinetako

organismoek betidanik erabili izan duten defentsarako eta erasorako mekanismo bat dira (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Shai, Y., 1999). Oinarrizko motibo batean laburbildu daiteke poroak eratzeko gaitasunaren funtzioa: “hondar polarrak eta apolarrak aurkako aurpegietan banaturik dituzten transmintz helizeak” (Ojcius, D. M. eta


122

Young, J. D., 1991; Epand, R. M. eta Vogel, H. J., 1999; Shai, Y., 1999; Gilbert, R. J., 2002; Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002; Parker, M. W. eta Feil, S. C., 2005; Huang, H. W., 2006). Egitura unitate hauek mintzaren gune hidrokarbonatua eta kanal urtsu baten lumena kontaktuan jartzeko ahalmena daukate.

Eratzen den poroak, normalean lipido bigeruza zeharkatzeko

ahalmenik ez daukaten molekulen difusioa baimentzen du. Animalia zelulen kasuan, mintz plasmatikoaren mailan erregulazio gabeko egitura hauen agerpenak, zelularen homeostasiaren galera eta bere hilketa eragin dezakete.

Zenbait proteina eta peptidoek, toxina mikrobianoak edo pozoien

osagai diren peptido zitolitikoak adibidez, egitura motibo arrunt hau erabiltzen dute eraso estrategia moduan, zelularen irazkortasun hesian kalteak eraginez (Gouaux, E., 1997; Gilbert, R. J., 2002; Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002; Kuhn-Nentwig, L., 2003; Hecht, O., Van Nuland, N. A. eta lank., 2004; Parker, M. W. eta Feil, S. C., 2005).

Poroak eratzeko gaitasuna daukaten proteinak, linfozito eta

“natural killer” zelulek ere sekretatzen dituzte, defentsa erantzun moduan (Trapani, J. A. eta Smyth, M. J., 2002). Perforina, konplementoari atxekituriko azpiunitateak eta granulisina edo NK-lisina moduko polipeptido txikiak, itu zelularen mintz plasmatikotik gertu granulo exozitikoetatik askatzen dira, bertan transmintz poroak eratuz (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Andersson, M., Gunne, H. eta lank., 1995; Liepinsh, E., Andersson, M. eta lank., 1997; Trapani, J. A. eta Smyth, M. J., 2002; Anderson, D. H., Sawaya, M. R. eta lank., 2003; Voskoboinik, I. eta Trapani, J. A., 2006). Perforinaren oinarrizko sekuentziatik eratorriak diren zenbait peptido motz, zein zatiki proteolisatuak, perforinaren aktibitate litikoa gordetzen dute; transmintz domeinu ezberdinak poro eraketan parte hartzen dutelaren adierazle (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Baran, K., Ciccone, A. eta lank., 2006). Honengatik ez da hain arraroa pentsatzea zenbait birusek, beraien efektu zitopatikoa burutu ahal izateko eboluzioan zehar poroak eratzeko motiboak berenganatu izana.

Tesi honetan, birus biluzi baten proteina ez-egitural batek,

poroak eratzeko domeinua azaltzen duenaren lehenengo ebidentzia esperimentala ematen da. Poliobirusaren 2B proteinaren domeinu honek, zelula monogeruzetan, poliobirusaren infekzioaren erdialdera ikusten den irazkortasun fenomenoa adierazten du zelula monogeruzetan, adibidez behatzen den solutu txikien difusioa mintz


123

plasmatikoan zehar (3.5 eta 3.6 irudiak). Peptidoetan oinarriturik erabili den analisia, TM1 sekuentzian aktibitatea kokatzeko balio izan du (3.8 irudia). Bigarren transmintz sekuentziak, TM2, lipido monogeruzetan eta zelulen mintz plasmatikoan txertatzeko gaitasuna aurkezten duen arren, ez da zelulak irazkortzeko gai.

2B-tik eratorriak diren beste sekuentziek, SDS mizeletan egitura

aurkezten dute (3.1 taula), honek iradokitzen du sekuentzia hauek mintzaren alderdi ez polarrean txertatu ahal direla. Sekuentzia hauek funtzio–eginkizun bat izan dezakete, batez ere irazkortasunean egitura-laguntzaile moduan, mintzean ematen den txertaketan edo prozesua erregulatzen.

TM1 sekuentziaren potentzia (aktiboa dena nM

kontzentrazioetan), zelula monogeruzak irazkortzeko behar duen denbora (peptidoa, lipido monogeruzetan txertatzeko behar duenaren antzekoa) eta irazkortasun prozesua, eraginkorki gertatzen dena garraio aktiboaren ezean, sustatzen duten ebidentziek, TM1 sekuentzia honen eraginez, mintz plasmatikoan transmintz poroen agerpena iradokitzen dute. Are gehiago, TM1 mintz-plasmatikoan kokatzen da, eta bere eragina estreptabidina kanpoaldetik botata inhibitu egiten da (3.13 irudia). Peptidoak, lipido besikuletan poroak eratzen ditu dosi baxuetan (3.14 irudia). Hau dena, TM1-ek eragindako zelularen irazkortasuna, sekuentzia honek mintz plasmatikoan zuzenean eraturiko poroengatik dela ondoriozta lezake.

Poro hauek diskretuak eta egitura egonkorrekoak dira, bai

zeluletan, bai lipido besikuletan ere (solutuarentzat tamaina zehatz bat aurkezten dute eta behin poroa eratuta zabalik mantentzen dira).

Agirre eta lankideek lortutako emaitzak kontutan hartuta, TM1

eta TM2-ek eragindako karga elektrikoaren araberako efektu ezberdinek (3.18 eta 3.19 irudiak), 2B-ren txertaketa eta poro-eraketa mekanismoari buruzko informazioa eman dezakete (3.21 irudia). MBP-2B eraikuntzak negatiboki kargatuta dauden mintzak behar ditu txertaketarako. Posiblea liteke eraikuntza horretan TM1 domeinuaren gune hidrofobikoak babestuak egotea. Beraz, agerian dauden karga positiboek bultzatuko lukete elkarrekintza elektrostatikoa negatiboki kargatuta dagoen mintz-azalerarekin. Poro-eraketak, TM2-ren ekintza beharko luke, TM1-ren translokazioa bultzatzeko hain zuzen ere. Negatiboki kargatuta dauden besikuletan beharrezkoa den sinergiak hala iradokitzen du (3.19 irudia). Mekanismo horrek, barneko mintz zelularretan translokoi ezean burutzen den poro-eraketa azalduko luke.


124

3.21. Irudia: 2B mintz-domeinuen txertaketa eta poro eraketa azaltzen

duen prozesuaren modeloa. MBP-2B eraikuntzak fosfolipido anionikoak behar ditu txertaketa bideratzeko. Prozesu honek, poro eraketa mugatzen du. TM1-a kargarekiko independientea den prozesu bat jarraituz txertatzen da. Poroa, aldiz, karga-gabeko mintzetan baino ez da eratzen. TM2-ak eraginkortasun handiarekin irazkortzen ditu fosfolipido anionikoez osoturiko mintzak, baina ez poro bat eratuz. Honek eragiten duen perturbazioa, TM1-ek translokazioa bultzatzeko erabil lezake.


125

Laburbilduz, 2B-ak bere baitan, egitura-motibo bat darama,

zeinak transmintzak diren poro irazkorrak eratzeko ahalmena aurkezten duen. Erregio honek zelula-mintzak irazkortzeko aurkezten duen eraginkortasun altuak, mintzak poratzeko ahalmenaren funtzioa presio hautakor baten eraginez dela iradokitzen du.

2B proteinaren funtzioa poliobirusaren ziklo-infektiboan oraindik

ez dago oso argi. 2B-aren gainespresioak, erretikulu endoplasmikoan eta Golgi aparailuan metatzea eragiten du. Proteinaren metaketa honek mintz plasmatikora ematen den glikoproteinen garraioa eragozten du. Bestalde, zelula barneko mintzen birantolaketa, eta kaltzio eta beste ioi batzuen kontzentrazio aldaketa dakar (Barco, A. eta Carrasco, L., 1995; Aldabe, R., Barco, A. eta lank., 1996; Aldabe, R., Irurzun, A. eta lank., 1997; Sandoval, I. V. eta Carrasco, L., 1997; Van Kuppeveld, F. J., Hoenderop, J. G. eta lank., 1997; de Jong, A. S., Melchers, W. J. eta lank., 2004). Guztiak ez badira, hauetako zenbait efektu proteinak duen mintza irazkortzeko gaitasunagatik direla proposatu da (de Jong, A. S., Visch, H. J. eta lank., 2006). Honengatik, 2B-ak eragindako solutuen desorekak zelularen barneko mintzen artean, organuluen funtzio normala arriskuan jartzen du eta birusaren erreplikaziorako aproposak diren baldintzak ezartzen ditu.


126


127

4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II

128


129

______________________________________________________________________ AITZINSOLASA GIB-aren 2F5 eta 4E10 antigorputz neutralizatzaile, gp41

proteinaren kanpo domeinuaren pretransmintz alderdira batzen dira. Antigorputz hauek mintzaren gainazalean ezagutzen dituzte beraien epitopoak. Orain dela gutxi kardiolipina fosfolipidoarekin erreakzionatzeko ahalmena dutela frogatu da. Tesi honetan, antigorputzak mintzari batuta daudenean edo soluzioan dispertsaturik daudenean mintzean murgildurik dauden epitopoak ezagutzeko aurkezten duten ahalmena ikertzen da.

Egin diren in vitro saioetan, antigorputzak daukaten berezko

ahalmenaren eraginez, mintzari baturik dauden epitopoak ezagutzen dituztela frogatzen da. Mab2F5-aren kasuan, mintzean ematen den ezagumendua afinitate baxukoa da, ostera kardiolipina fosfolipidoa espezifikoki ezagutzen du, epitopoa batzen deneko gunea erabiltzen baitu lipido hau ezagutzeko.

Mintzen gainazalean ematen den ezagumendua, bi mekanismo

mota ezberdinen menpe dagoela iradokitzen da. Hau oso garrantzitsua da, 2F5 eta 4E10-en erantzun humorala sortarazi dezaketen immunogeno berrien diseinu eta garapenerako.


130

4.1. SARRERA 4.1.1. 1 MOTATAKO GIZA IMMUNOESKASIAREN

BIRUSA (GIB-1) XX. mendean zehar hegazti eta ugaztunek pairatzen dituzten

gaixotasun ugarien eragileak erretrobirusak direla egiaztatu da. 1980-an lehenengo erretrobirusa identifikatu zen, Linfozitoen leuzemia eragiten duen birusa (HTLV-1) hain zuzen, gizakietan neoplasia eta neuropatologiak sortarazten dituena. Erretrobirusak azido erribonukleikoz (RNA) osaturiko genoma konplexua duten birus familia bat dira. Birusaren RNA-a azido desoxirribonukleikora (DNA) transkribatzen dute alderantzizko transkriptasa baten laguntzaz (Coffin, J. M., 1996). HIESA, 1981-ean entitate kliniko modura onartu zen. Gaixotasun honen oinarrizko ezaugarria infekzio oportunistekin batera agertzen diren anormaltasun immunologikoak, desorden neurologikoak eta ez-ohiko minbizi motak dira (Levy, J. A., 1994) Gaixotasunaren eragilea 1983-an isolatu zen lehenengo giza erretrobirusa, Giza Immunoeskariaren Birusa (GIB) deitu zen (Gallo, R. C. eta Montagnier, L., 1988) (4.1 A irudia).

GIB birusak, gizakietan erikortasun eta hilkortasun altua

eragiten duen patogenoa bat da. Birus honek eragiten dituen kalteak direla eta, bere biologiaren azterketa zehatza, egitura molekularrean sakontzea eta kontrolerako eta tratamendurako aukera posibleen garapena sakonki ikertzeak eragin du.

4.1.1.1. BIRIOIAREN EGITURA GIB-1 Erretrobiridae familiaren partaidea da eta Lentibirus

moduan sailkatua dago. Lentibirus genero barnean, immunitate sistema eta nerbio-sistema zentralean infekzio kronikoak sortarazten dituzten patogenoak sailkatzen dira (Freed, E. O. eta Martin, M. M., 2001). Lentibirus guztiek morfologia eta morfogenesi komuna aurkezten dute (4.1 irudia); 110 nm-ko diametroa, itxura esferikoa, lipido bigeruza


131

CA gp41

Mintz lipidikoa gp120

NC p6

NC p9 RT (p66 eta p51) IN

(p32) MA (p17)

Proteasa

RNA

Gp41

batez gaineztatuak daudelarik. Lipido bigeruza honen jatorria zelula ostalariaren mintz plasmatikoan dago.

GIB-aren mintzak, espikula kopuru urria dauka, birioi bakoitzeko 8-15 espikula gehienez daudelarik. Espikulak simetria triangeluarra aurkezten dute, gutxi gorabehera 10 nm-tako altuera eta itxura oboidea daukan 14-15 nm-tako mutur distal bat daukate bere luzera ardatzean (Zhu, P., Chertova, E. eta lank., 2003; Yuste, E., Reeves, J. D. eta lank., 2004; Zhu, P., Liu, J. eta lank., 2006). Datu morfologikoak determinazio biokimikoekin bat datoz eta egitura kuaternario gisa, heterodimeroez osoturiko trimero bat iradokitzen dute. Heterodimero bakoitzak, gainazaleko azpiunitate batez osoturik egongo litzateke (MW=120 kDa glikoproteina edo gp120) lotura ez kobalente baten bitartez transmintz azpiunitate batekin elkarregiten egongo zena (MW=41 kDa glikoproteina edo gp41).

4.1. Irudia: Giza immunoeskasiaren birusaren morfologia. A. GIB-1

partikula extrazelulak. 110 nm-tako diametroa aurkezten dituzten birioiak ikus daitezke. Birioietan kono itxura daukan kapsidea bereizi daiteke. Partikula bakoitza lipido bigeruza batez inguraturik aurkitzen da. Bigeruzatik at glikoproteinaren espikulak kanpoalderantz proiektatzen dira. B. Birus-egituraren diagrama. Irudian glikoproteinak monomero moduan adierazten dira eskema errazteko, baina birioietan oligomerizatuta daude trimero moduan. MA: matrizearen proteina; CA: kapsidearen proteina; NC: nukleokapsidearen proteina; gp120: gainazaleko glikoproteinaren azal-azpiunitatea; gp41: gainazaleko glikoproteinaren transmintz azpiunitatea; RT:


132

alderantzizko transkriptasa; PR: proteasa; IN: integrasa. (Carrasco, L., 1996)-

tik egokituta. Birusaren gainazala kono itxura duen kapside bat inguratzen du

(4.1 irudia). Kapsidearen ardatza birioiaren diametro osoa betetzen du eta aldi berean birusaren nukleokapsidea inguratzen du. Kapsidea p24 (CA) proteinaz osaturik dago. Birusaren nukleokapsidea NCp9 eta NCp6 (NC) proteinaz osaturik dago. Bi proteina hauek birusaren RNA-ri asoziaturik daude. Birusaren genoma harizpi bakarreko bi RNA molekulez osaturik dago. Nukleokapsidearen barnean, p66 eta p51 (RT) RNA-ren alderantzizko transkripzioan beharrezkoak diren entzimak eta birusaren genomaren integraziorako beharrezkoa den p32 (IN) entzima daude. Lipido-bigeruza eta nukleokapsidearen artean p17 (MA) matrize-proteina aurkitzen da. Proteina hau miristilatua dago amino muturrean, gantz azido hau lipido-mintzean txertatzeko erabiltzen duelarik (Luciw, P. A., 1996).

4.1.1.2 BIZI ZIKLOA GIB-1-aren bizi-zikloa beste erretrobirusen bizi zikloaren

antzekoa da (Weber, J. N. eta Weiss, R. A., 1988; Fields, G. B. eta Noble, R. L., 1990). Bi etapetan banatzen da, fase goiztiar batean eta fase berantiar batean (Coffin, J. M., 1996). Fase goiztiarra itu zelularen ezagupenarekin hasten da, mintzen fusioarekin jarraitzen du eta birusaren genoma zelula ostalariaren genoman integratzean bukatzen da. Fase honetan zehar ez da birusaren generik adierazten eta ematen diren urratsak birioiak daramatzan proteinekin burutzen dira. Fase hau latentzia aldi batekin osatzen da, kinada batek birusaren adierazpena eta erreplikazioa pizten duenenean bukatzen dena.

Fase berantiarra, zelularen genoman integraturik dagoen

birusaren RNA-ren transkripzio eta prozesamenduarekin hasten da eta zelula ostalaritik birioi berrien askapenarekin bukatzen da. Azken fase honetan birusak erreplikatu ahal izateko zelula ostalariaren tresneria metabolikoa bahitzen du (4.2 irudia).

GIB-aren zoldura, CD4 errezeptorearen ezagumendu eta

batuketarekin hasten da. Errezeptore hau immunoglobulinen superfamiliaren partaidea dena, T linfozito laguntzaileetan eta antigenoak aurkezten dituzten zeluletan (APC) adierazten da (Dalgleish, A. G., Beverley, P. C. eta lank., 1984; Sattentau, Q. J. eta Weiss, R. A.,


133

1988). GIB-1, CD4 errezeptoreak aurkezten ez dituzten zelulak zoltzeko gaitasuna ere daukanez, birusaren sarrera eraginkorra izan dadin, ko-errezeptore moduan funtzionatuko duten giza faktore zelular espezifikoen presentzia beharrezkoa da (Kolchinsky, P., Mirzabekov, T. eta lank., 1999; Alvarez Losada, S., Canto-Nogues, C. eta lank., 2002).

4.2. Irudia: GIB-1-aren ziklo infektiboa. 1. Ezagumendu espezifikoa eta

gp120-aren batuketa CD4 errezeptorera eta ko-errezeptoreetara (CXCR4, CCR5) 2. Birus eta zelula mintzen fusioa. Puntu honetan gp41 proteina paper garrantzitsu bat jokatzen du. 3. Kapsidearen sarrera zelularen zitoplasmara. 4. Dekapsidazioa eta birusaren material genetikoaren askapena. 5. Alderantzizko transkriptasaren eraginez birusaren RNA, harizpi bikoitzeko DNA-ra itzultzen da. 6. Integrasaren eraginez, probirusa sortzen da. 7. Probirusa zelularen genoma izango balitz bezala transkribatzen da, eta birusaren proteinen espresiorako erabiltzen da, birioi berrien sorrerarako beharrezkoak diren osagaiak eratuz. 8. Env proteinaren itzulpena eta garraioa zelula-mintzera. 9. Gag eta Gag-Pol proteinen itzulpena eta mihiztadura zelula mintzean. 10. Oraindik heldugabe dauden birioi berrien gemazio bidezko

1

23

4

56

7

8

9

10

11


134

irteera. 11. Birus proteasen eraginez birioiaren heltze-prozesua. (Freed, E. O.

eta Mouland, A. J., 2006)-etik egokitua. 4.1.1.3. GIB-aren GLIKOPROTEINAREN EGITURA ETA

FUNTZIOA Gainazaleko Env glikoproteina (gp160) 160 kDa-etako aitzindari

moduan sintetizatzen da erretikulu endoplasmatikoan. Proteina hau Golgi aparailuraino garraiatzen da eta bertan glikosilatzen da. Aitzindari hau behin gainazalean dagoela, konbertasa zelular baten eraginez gp120 eta gp41 azpiunitateetan proteolizatzen da. Gainazaleko gp120 azpiunitatea, tropismo zelularra determinatzen duena da (Choe, H., Farzan, M. eta lank., 1996; Trkola, A., Purtscher, M. eta lank., 1996; Wu, L., Gerard, N. P. eta lank., 1996), eta gp41 transmintz azpiunitatea, zelula mintza eta birusaren mintzaren arteko fusioa sustatzen duena da. Bi azpiunitate hauek lotura ez-kobalenteen bitartez elkartzen dira eta heterodimeroen trimero moduan antolatzen dira (Freed, E. O., 2001) (4.3 irudia).

4.3 Irudia: Gainazaleko gp120 eta gp41 proteinen adierazpen grafikoa.

Irudian gp120-gp41 konplexua zehaztasunez adierazten da. Gp41 proteinaren karboxilo terminala birusaren zitoplasman sarturik, eta fusio peptidoa proteinaren

V3 bigizta

CD4 batura lekua

Gp41

Transmintz domeinua

Fusio peptidoa

Gp120

Glikosilazio lekuak

zitoplasma


135

alderdi amino terminalean kokatua adierazten dira. Gp120-ak, CD4

errezeptorea batzen duen tokia adierazten da. V3 bigizta ikusgai aurkitzen da, gp120 proteina ko-errezeptoreekin elkartu ahal izateko.

4.1.1.3.1. gp41: SUBUNITATE INTEGRALA Gp160 proteinaren aktibitate fusogenikoa gp41 transmintz

azpiunitatearen baitan aurkitzen da. Proteina honen sekuentziaren alderdi amino terminala oso hidrofobikoa eta glizinetan aberatsa da, ezinbestekoa delarik fusio prozesua eman dadin (Gallaher, W. R., 1987; Chan, D. C. eta Kim, P. S., 1998). Honengatik “fusio peptidoa” deitua izan da (FP 4.4 irudian).

Gp41 proteinak, bere sekuentzian birritan errepikatzen diren bi

erregio aurkezten ditu. Erregio hauek birritan errepikatzen diren 7 aminoazido zatikiz osaturik daude. Zatiki hauek lehenengo eta laugarren posizioetan hondar apolarrak aurkezten dituzte, helize superbiribilkatuak eratzeko gaitasuna dutelarik (Delwart, E. L., Mosialos, G. eta lank., 1990). Sekuentziaren amino mutur terminaletik gertuen dagoen erregio errepikakorra (HN edo “leuzinen kremailera” ere deitu izan dena), fusio peptidotik hurbil aurkitzen den bitartean, C-terminaletik hurbil dagoena (HC) transmintz domeinuaren aurretik kokatzen da (4.4 irudia). Bi erregioak, bi zisteina dituen bigizta baten bidez konektaturik daude.

Gp41 proteina, birioi askeetan bi konformazioetan existituko

litzateke: zolduriko zelulatik gemazioaz askaturiko birioi askeetan dagoena, natiboa, eta fusioa eman ostean agertuko litzatekeena. Proteina honen konformazio natiboa metaegonkorra izango litzateke eta gp120 errezeptorearekin batu ostean bere konformazioa aldatuko luke, ikuspegi energetikotik egitura faboragarriago bat hartzeko. Fusioa birtolespen prozesuarekin batera eman behar dela postulatzen da. Gp41 kanpo domeinuaren egitura egonkorrena (fusioa eman ostekoa), X izpien bidezko kristalografiarekin zenbait taldek determinatu dute (Chan, D. C., Fass, D. eta lank., 1997; Weissenhorn, W., Dessen, A. eta lank., 1997). Analisi hauek, N peptidoek coiled-coil trimeriko bat eratzen dutenarekin bat datoz. C peptidoek, coiled-coil trimerikoaren kanpoaldetik paketatzen dituzten hiru helize osatzen dituzte. HN eta HC helizeen orientazioa antiparaleloa denez beraien karboxilo eta amino muturrak konplexuaren alde berdinean aurkituko dira. C helizeak eta N helizeak hondar hidrofobikoen bitartez elkarrekiten dute. Hondar


136

hidrofobiko hauek oso kontserbaturik daude eta coiled-coil trimeriko nagusian aurkitzen diren hiru ildasketetan kokatzen dira.

Egitura hau beste birusen gainazaleko proteinen egiturarekin

konparatzen badugu, adibidez Influenza birusaren hemaglutininarekin (Bullough, P. A., Hughson, F. M. eta lank., 1994), Moloney leuzemiaren birusaren gainazaleko proteinarekin (Fass, D., Harrison, S. C. eta lank., 1996) edo Ebola birusaren proteinarekin (Weissenhorn, W., Dessen, A. eta lank., 1997) antzekotasun ugari daudela ikus daiteke. Beraz, gp41 proteinarentzat determinatu den egituran, mintzen fusioarekin zerikusia duen motibo orokor bat dagoela iradokitzen da.

4.4. Irudia: gp41 proteinaren kanpo domeinuaren eskema eta X izpien

difrakzioaren bidez lortu den nukleoaren egitura tridimentsionala. Egitura primarioan fusio peptidoa (FP), urkilaren parte den leuzina eta isoleuzinetan aberatsa den erregioa (HN), bigarren erregio helikoidala agertzen da (HC), pretransmintz erregioa (preTM) eta transmintz domeinuaren (TMD) kokapena adierazi dira. Azpialdeko irudian, X izpien difrakzioaren bidez ebatzia izan den gp41 proteinaren trimeroa. N helizeak coiled-coil batean taldekatzen dira eta C helizeak, antiparaleloki kokatuta, inguratzen dituzte, (Weissenhorn, W., Dessen, A. eta lank., 1997).

4.1.1.3.2. TRANSMINTZ-AURREKO SEKUENTZIA


137

transmintzaren aurreko erregioa (pretransmintza edo preTM) gp41 proteinaren 664-683 hondarren artean kokatua dago. Hasiera batean preTM sekuentzia Wimley eta White-k (1996) garaturiko hidrofobizitate eskalekin mugatu zen (Suarez, T., Nir, S. eta lank., 2000). Geroago esperimentalki frogatu zen: i) Konformazio helikoidala hartzen duela, mintzekin elkarrekiteko eta mintzak desegonkortzeko joera daukalarik (Nieva, J. L. eta Suarez, T., 2000; Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Suarez, T., Nir, S. eta lank., 2000; Schibli, D. J., Montelaro, R. C. eta lank., 2001) ii) Aktibitate hau kolesterola eta esfingomielinaren eraginez modulatua dagoela (Saez-Cirion, A., Nir, S. eta lank., 2002; Epand, R. F., Sayer, B. G. eta lank., 2005) eta iii) Soluzioan eta mintzaren gainazalean oligomerizatzeko ahalmena aurkezten duela.

PreTM alderdirako zenbait funtzio proposatu dira. Zenbait

autorek, lotura bigizta malgu bat bezala ikusten dute, fusio prozesua egoki eman dadin, fusio proteina ondo orientatzeko ahalmena daukana (Dimitrov, A. S., Rawat, S. S. eta lank., 2003). Beste autore batzuk mintzak desengonkortzen eta barreiatzen funtzio aktiboak dituela proposatzen dute, mintzen arteko ainguraleku moduan jokatuz edo zelula-mintzaren eta birus-mintzaren arteko lipidoen elkartrukea baimenduz (Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Suarez, T., Nir, S. eta lank., 2000; Saez-Cirion, A. eta Nieva, J. L., 2002; Saez-Cirion, A., Nir, S. eta lank., 2002; Vincent, N., Genin, C. eta lank., 2002; Epand, R. M., Sayer, B. G. eta lank., 2003; Epand, R. F., Sayer, B. G. eta lank., 2005).

Zenbait taldek SIV-arekin egindako ikasketetatik, preTM-ak

coiled-coil-a luzatuko zuela ondorioztatzen dute, modu honetan helize sorta egonkortuko litzateke eta fusioa emateko beharrezkoa den energi transdukzioa egonkortuko zen ere (Lay, C. S., Wilson, K. A. eta lank., 2004). Salzwedel eta lankideek, Env trimeroen egitura mantentzeko balio duela defendatzen dute, modu honetan trimero kopia egonkor bat mantenduz eta birusaren gainazalaren egonkortasuna mantenduz (Salzwedel, K., West, J. T. eta lank., 1999). Azkenik, zenbait talde bere antigenizitate eta immunogeneizitate baxuek fusioan daukaten paper zuzenaren ebidentzia direla uste dute, hartzen duen antolamenduarekin, antigorputzek erregioa eskuratzeko zail daukate, antigorputz neutralizatzaileen sorrera murrizten delarik (Nyambi, P. N., Mbah, H. A. eta lank., 2000; Zwick, M. B., Labrijn, A. F. eta lank., 2001; Burrer, R., Haessig-Einius, S. eta lank., 2005; Haynes, B. F., Fleming, J. eta lank., 2005; Sanchez-Martinez, S., Lorizate, M. eta lank., 2006). Badirudi preTM sekuentzia heltze prozesuan ez dela beharrezkoa, baina


138

bai derrigorrezkoa, fusioa gertatzeko eta glikoproteina birioiaren gainazalean txertatzeko (Salzwedel, K., West, J. T. eta lank., 1999).

PreTM sekuentziari egin zaizkion RMN azterketak

dodezilfosfokolina mizelen presentzian, sekuentziak egitura α-helikoidala aurkezten duela ondorioztatzen dute (Schibli, D. J., Montelaro, R. C. eta lank., 2001) (4.5 irudia). PreTM sekuentziaren karboxilo terminala transmintz domeinura loturik dagoenez α−helize egitura ere aurkeztu beharko luke, transmintz domeinuetara gertu dauden sekuentziak α-helize moduan egonkorragoak direla ikusi baita (Bechinger, B., 2000).

Zenbait autoreek, bere baitan hartzen duen preTM sekuentziari

eta alboan dagoen eta 2F5 antigorputza ezagutzen duen sekuentzia zatiari MPER (ingelesetik, “membrane-proximal external region”) deritze (4.5 irudia). Azken urteetan antigorputzei baturik luzera ezberdineko MPER sekuentzien egiturak ebatzi dira. Nahiz eta antigorputzek ezagutzen dituzten sekuentzia natiboak ezezagunak izan, antigorputzak molde moduan erabili daitezke, egitura tridimentsional garrantzitsuak hartzen dituzten epitopoei batzen baitira. Pai eta lankideek (2000), 2F5 antigorputza ELDKWAS sekuentziari loturik kristalizatu zuten (Pai, E. F., Klein, M. H. eta lank., 2000). Geroago Ofek eta lankideek (2004) 2F5 konplexua EKNEQELLELDKWASLW 17-meroari loturik kristalizatu zuten (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004). Bi azterketa hauetan ezagutzera ematen da MPER-aren egitura ez dela α-helikoidal, baizik eta egitura luzatua dela, DKW korean mota 1-eko β-bira bat daukana (Pai, E. F., Klein, M. H. eta lank., 2000; Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004); gainera, DKW sekuentzia batura gunean ezkututa aurkitzen da, eta beraz, fusioa gertatu aurreko aldian eskuragarri egongo litzateke. Orain dela oso gutxi 4E10 antigorputza WNWFDITNW peptidoari lotuta kristalizatu da ere. Kasu honetan, sekuentziak bira txiki bat (N671-W672) duen α-helize konformazioa hartzen du (Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005). Kristalizatu zen egituraren arabera W672 hondarra 4E10-ren paratopoaz estalirik aurkitzen da, beraz gp41-ean ezagutzen den egituran eskuragarri egon beharko litzateke. Kontuan izanik hondar hidrofobikoak ingurune urtsu bateri agerian egoteak gastu energetiko altuegia dakarrela, sekuentzia honek env-aren beste alderdiren batekin elkarrekiten egon beharko litzatekeela iradokitzen da.


139

4.5. Irudia: MPER alderdiarekin gainezartzen diren zenbait erregioen

egiturak. GIB-1 birusaren gp41 proteinaren adierazpen eskematikoa. Fusio peptidoa (FP), errepikatzen diren C eta N terminal heptadak (NHR eta CHR), MPER sekuentzia (gp160-ren 660-683 hondarrak), transmintz domeinua (TMD) eta zitoplasma aldeko domeinua adierazten dira. Sekuentzia ezberdinen lerrokadurak adierazten dira, “Los Alamos”-eko data basean agertzen diren moduan (http://www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/CONSENSUS/CONSENSUS_TOOL/consensus.html). Asterisko baten bidez markaturik dauden hondarrak 2F5 eta 4E10 antigorputzen ezagumendurako beharrezkoak dira (Zwick, M. B., Jensen, R. eta lank., 2005). Irudi honetan HC erregioaren egitura aurkezten da (horiz margotuta) eta 2F5 epitopoaren N-terminaleko zenbait hondar baita ere (arrosaz). Beheko aldean, NMR-z eta dodezilfosfokolinaren presentzian ebatzi den, gp160 proteinaren 666-683 hondarrek mugaturiko erregioa azaltzen da (Schibli, D. J., Montelaro, R. C. eta lank., 2001). 2F5 eta 4E10 epitopoen hondarrak arrosaz eta urdinez, hurrenez-hurren, margoturik daude. X izpien


140

difrakzioaren bidez ebatzi diren sekuentziak Fab 2F5 eta 4E10-ei baturik,

(beheko aldean, ezkerraldean eta eskuinaldean, hurrenez-hurren (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004; Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005). (irudia Zwick, M.B., 2005 hartua izan da).

4.1.1.4. GIB-ZELULA FUSIO-MEKANISMOA Chan eta Kim (1998) gp41-ak induzituriko mintz fusiorentzat

modelo bat iradokitzen dute (4.6 irudia), funtsezko aspektuetan gainazaladun beste birusei aplikatu daitekeena (Hughson, F. M., 1997; Tan, K., Liu, J. eta lank., 1997; Weissenhorn, W., Dessen, A. eta lank., 1997). Nagusitzen den dogmarekin ados, gp41 proteinaren konformazio natiboan fusio peptidoa env konplexuaren barnealdean ezkutaturik egongo litzateke (4.6 irudia). Gp41-ren fusio aurreko egitura gp120-rekin elkarrekiterakoan egonkortzen da. Errezeptore eta ko-errezeptorearekin batzerakoan gp120-ak aldaketa konformazional bat pairatzen du, gp120-gp41 konplexuaren arteko elkarrekintzetan eraginak dituena (4.1 irudia). Konplexuan gertatzen diren aldaketa hauek gp41 aktibatzen dute eta prehairpin deritzon bitartekaria eratzen da. Bitartekari honen izatea hipotetikoa da, baina bere existentzia ondorioztatu daiteke, gp41-a HC-tik eratorriak diren peptidoen inhibiziora sentikorra delako. Fusio peptidoaren aurkezpena eta jarraian itu mintzera ematen den txertaketa, bitartekari honen agerpenarekin lotuta gertatzen dela postulatu da. "Pre-hairpin" egoeran HC eta HN domeinuak disoziaturik mantentzen dira. Bi domeinu hauen elkarketa termodinamikoki egonkorra den “hairpin” egitura edo 6 helize sortaren (6-HB) sorrera dakar.

Egitura honen agerpenak zelula-mintza eta birusaren mintzaren

arteko fusioa dakar. Bi mintzen arteko aposizioa nola gertatzen den ez dago oso argi, baina proteinaren trimeroen elkarketak fusio poroaren eraketan zerikusia daukala uste da. Fusio prozesua gertatu denean, fusio peptidoa eta gp41-ren transmintz zatikia mintz berdinean kokatzen dira.


141

4.6. Irudia: GIB-1-ak eragindako fusioaren eskema. Prozesua, zelula mintzeko CD4 errezeptorearen ezagumenduarekin hasten da. Geroago ko-errezeptorearen ezagumendua ematen da eta birusaren gp41 proteinak bere fusio peptidoa mintz zelularrean txertatzen du. Prozesu honek birusak bi mintzak gertu izatea baimentzen du.

4.1.1.5. ANTIGORPUTZ NEUTRALIZATZAILEAK Birioiaren gainazalean dauden espikulak funtzio bikoitza

daukate: alde batetik, itu zelulan sarrera baimentzea eta bestetik, zelula ostalariaren erantzun immunetik ihes egiteko tresna izatea. Antigorputzek, birusaren funtzio-egiturei batzen direnean birusaren sarrera inhibitu dezakete. GIB-1 birusak bere eboluzioan zehar erregio kontserbatuenak eta sentikorrenak ezkutuan bi arrazoiengatik mantendu ditu: lehenengoa, epitopo kontserbatuenak antigorputzen garapena eragin ez dezaten (immunogeneizitate baxua), eta bigarrena, jadanik sorturiko antigorputzek epitopo kontserbatu hauek ezagutu ez ditzaten (antigenizitate baxua). GIB-1 birusak izan ditzazkeen etsairik eraginkorrenak antigorputz neutralizatzaileak dira, sistema immunetik ihes egiteko erregio kontserbatuetan mutazioak eragitea nahiko zaila baita.


142

Gp41-ak hartzen duen egitura fusioa gertatu ostean egonkorra, errepikakorra eta oso immunogenikoa da. Baina azkenengo fase honetan fusio-bitartekariak aurkezten duen egitura ezberdina da, eta beraz eratzen diren antigorputzak ezin dira batu eta ezin dute fusioaren bitartekari hau inhibitu. Gp41 proteina antigeno moduan ezagutzen duten antigorputz neutralizatzaileak preTM-aren sekuentzian aurkitzen diren sekuentzia linealak ezagutzen dituzte (Binley, J. M., Ditzel, H. J. eta lank., 1996; Zwick, M. B., Bonnycastle, L. L. eta lank., 2001; Zwick, M. B., Labrijn, A. F. eta lank., 2001). Nahiz eta ikerketa asko egin diren gai honen inguruan, ez da aurkitu epitopo hauek imitatzen dituzten eta erantzun neutralizatzaile eraginkorra sortarazten duten immunogenorik.

Antza denez, infekzio naturalean zehar edo immunizazio baten

ostean, sortarazten diren antigorputz gehienak ez-neutralizatzaileak dira, neutralizatzaileak direnak oso kantitate baxuetan aurkitzen direlarik (Xu, J. Y., Gorny, M. K. eta lank., 1991; Binley, J. M., Ditzel, H. J. eta lank., 1996; Earl, P. L., Broder, C. C. eta lank., 1997). Gainera birusaren gainazalaren alderdi immunogenikoen kontra sortzen diren antigorputzak oso aldakorrak dira eta gizabanako bakoitzaren seroa blokeatzeko eredua, beste gizabanako batenarekiko oso ezberdina izan daiteke. Patroi komun baten gabeziak, GIB-1-aren kontrako erantzun immunea sortaraziko lituzketen antigorputz neutralizatzaileen bilaketa zailtzen du (Ferrantelli, F., Rasmussen, R. A. eta lank., 2002; Klausner, R. D., Fauci, A. S. eta lank., 2003; Burton, D. R., Desrosiers, R. C. eta lank., 2004). Guztiz kontserbaturik mantentzen diren epitopoen kontra antigorputzak lortzeak, birus espektro oso handia neutralizatu ahal izatea baimenduko luke, aspektu hau txertoen diseinuan lehentasun bat delarik.

Hovanessian eta lankideek (2004), emaitza oso positiboak

publikatu dituzte. Beraien datuetan, gp41-ean kabeolina-1 proteinara (CBD1) batzeko domeinu bat dagoela frogatzen dute (Env-ren 623-631 hondarren artean dagoen WNNMTWMEW sekuentzia). Sekuentzia hau, helize egitura daukaten bi domeinuak batzen dituen bigiztan aurkitzen da, eta bere azkenengo lau aminoazidoak C-terminalaren heptada errepikakorrarekin gainezartzen da. Sekuentzia hau immunogeno gisa erabiliz, untxietan espektro zabaleko antigorputz neutralizatzaileak sortzea lortu dute. Badirudi CBD1 eta kabeolina-1 proteinaren artean,


143

ziklo birala betetzeko ezinbestekoa den elkarrekintza espezifiko bat ematen dela, antigorputz hauek elkarrekintza hori saihestuko lukete eta honen ondorioz infekzio birala (Hovanessian, A. G., Briand, J. P. eta lank., 2004).

Birioi heldu batean, zelularen errezeptoreetara batu baino lehen, gp41 azpiunitatea gp120 proteinagatik ezkutaturik aurkitzen da (Sattentau, Q. J., Zolla-Pazner, S. eta lank., 1995; Zwick, M. B., Komori, H. K. eta lank., 2004). Behin glikoproteina errezeptoreetara eta ko-errezeptoreetara batu denean zihur aski gp41-a zaurgarriagoa izango da; dena den, fusioaren bitartekari hau espazialki mugatua egongo da, bi mintzak oso gertu aurkitzen direlako.

Tesi honetan erabili diren antigorputz monoklonal

neutralizatzaileak 2F5 eta 4E10 izan dira. Katinger eta lankideek antigorputz hauek MPER erregioaren alboan kokatzen diren epitopo linealak ezagutzen dituztenaren ideia ezarri zuten. Epitopo hauen sekuentziak ELDKWA (2F5-erako) eta NWF(D/N)IT (4E10-erako) dira, eta preTM alderdian kokatzen dira. Antigorputz hauek, errezeptore zelularrarekin ematen den elkarrekintzan eragin gabe, fusioa inhibitzeko gai dira (Burton, D. R., Desrosiers, R. C. eta lank., 2004). Epitopoak atzemateko arazo esterikorik ez dagoela ematen du, antigorputz osoek (IgG-a) Fab-ak baino eraginkortasun handiagorekin blokeatzen dutelako fusioa (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004; Zwick, M. B., Komori, H. K. eta lank., 2004).

Antigorputzen ezagumenduaren testuinguruan, “birusaren

mintzari gertu dagoen kanpoko alderdia” (ingelesetik, “membrane-proximal external region”, MPER) terminoa, bi antigorputzen epitopoak daramatzan sekuentziarako proposatu da (Zwick, M. B., Wang, M. eta lank., 2001; Zwick, M. B., Jensen, R. eta lank., 2005).

PreTM sekuentziarekin konparatuz (4.7 irudia), MPER

(2F5preTM) sekuentzia bere amino terminalean luzatuagoa da, bere baitan Mab2F5-rekiko afinitatea indartzeko hondar gehiago daramatzalarik (Parker, C. E., Deterding, L. J. eta lank., 2001; Barbato, G., Bianchi, E. eta lank., 2003).

Birusaren zoldura gainditzen bada antigorputzak MPER alderdira

batzeak hiru gauza inplikatuko lituzke; (i) Gp41-aren aldaketa konformazionala gertatzen denean, bere pretransmintz alderdia partzialki agerian geratu beharko litzateke, (ii) beraz env konplexu natiboan Mab-entzat eskuragarri agertu beharko litzateke (Sattentau, Q. J., Zolla-Pazner, S. eta lank., 1995; Zwick, M. B., Wang, M. eta lank.,


144

2001), eta (iii) mintzen arteko fusioa gertatzeko guztiz beharrezkoa den erregio bat dela (Salzwedel, K., West, J. T. eta lank., 1999; Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Zwick, M. B., Wang, M. eta lank., 2001; Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003).

Gero eta ebidentzia gehiago daude, Mab2F5 eta Mab4E10-ak

ekintza immunologikoa betetzeko, lipidoekin batu behar direla iradokitzen dutenak. Lehenengoa, gp41 errekonbinanteak lipido hutsezko mintzekin inkubatuz gero, Mab2F5 eta 4E10-ren ezagupena areagotzen duela ikusi da (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004). Bigarrena, analisi molekularrak (Kunert, R., Ruker, F. eta lank., 1998; Kunert, R., Wolbank, S. eta lank., 2004), eta Mab 2F5 eta 4E10-en zatikiak (Fabs), epitopoekin loturik, lorturiko kristal egituraren erresoluzioak (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004; Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005) kate astunetan CDR3 bigizta luzeen presentzia adierazten dutela. CDR3 loop luze hauetan hondar aromatikoak eta hidrofobikoak aurkitzen dira, hondar hauek, epitopoekin ez dituzte kontaktu zuzenik ezartzen, beraz, mintzarekin kontaktuak ezarri beharko dituztenaren posibilitatea dago. Dena den, eta behintzat 2F5-aren kasuan, nahiz eta bigizta hauek antigenoarekin elkarrekintza espezifikoak ez izan, antigorputzaren aktibitaterako guztiz beharrezkoak direla ikusi da (Zwick, M. B., Komori, H. K. eta lank., 2004). Mab4E10-ren kasuan aldiz, bigizta honen funtzioa ez da determinatu, baina mutagenesi saioak egiten ari dira bigizta honen garrantzia aztertzeko (Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005). Hirugarrena, Haynes eta lankideek, (Haynes, B. F., Fleming, J. eta lank., 2005) orain dela gutxi ikusi dute Mab2F5 eta 4E10-ak kardiolipina (CL) fosfolipidoa espezifikoki ezagutzen dutela, MPER-eko epitopoak ezagutzeko erabiltzen dituzten gune berdinak erabiliz. Anti-CL antigorputzak gizakietan gaixotasun autoimmuneei lotuta daude, GIB-ak erantzun immuneari ihes egiteko estrategia moduan CL-a emulatzen duten MPER epitopoak garatu dituenaren posibilitatea handitzen delarik.

Antigorputzak, beraien epitopoei baturik, datu konformazional

ugari egon arren, frogatu diren immunogeno gehienak (kristal-egitura imitatzen zutenak ere frogatu direlarik), erantzun neutralizatzaileen sorreran kale egin dute (Muster, T., Guinea, R. eta lank., 1994; Liang, X., Munshi, S. eta lank., 1999; Coeffier, E., Clement, J. M. eta lank., 2000; Marusic, C., Rizza, P. eta lank., 2001; Joyce, J. G., Hurni, W. M. eta lank., 2002; Zhang, M. Y., Xiao, X. eta lank., 2004; Ho, J., Uger, R. A. eta lank., 2005). Kasu gehienetan immunogenoa ezagutzen duten antigorputz ez neutralizatzaileak lortu direlarik. Zwick-en ustez, sortzen


145

diren antigorputz ez-neutralizatzaile hauek, sekuentziak pairatzen dituen aberrazioek eragindakoak dira (Zwick, M. B., Jensen, R. eta lank., 2005).

Tesi honetan, liposometan oinarrituriko ELISA teknika berri bat

erabiliz, MPER erregioa ordezkatzen duen peptidoa (2F5preTM, 2F5 eta 4E10 antigorputzak ezagutzen dituzten epitopoen sekuentziak barne dituena), erregio honen kontrako Mab-ak, guztiak, fosfolipidoez osoturiko mintzen interfaseekin elkartzeko berezko ahalmena daukate. Are gehiago, emaitzek iradokitzen dute, Mab2F5-ak bere epitopoa afinitate gutxiagorekin ezagutzen duela mintzaren interfasean murgildurik dagoenean. Bestalde, Mab4E10-ak bere epitopoa bigeruza lipidikoaren ingurunearekin zerikusirik ez daukalarik batzen du. Mab4E10-ak eraginkorki fosfolipido osaketa ezberdineko bigeruzekin elkarrekiten duen bitartean, Mab2F5-ak CL-rekiko lehentasuna aurkezten du, bai mintzean murgildurik dauden espezieekiko, bai soluzioan dauden espezieekiko.

Emaitza hauek, bi Mab-ak beraien epitopoak mintzaren

interfasean ezagutzeko, bi moldaera mekanismo ezberdin garatu dituztela iradokitzen dute. Mintzak ere paper garrantzitsu bat jokatzen du antigorputz hauen erantzun neutralizatzailean, gp41-aren MPER erregio honen aurka.

4.2. ERABILITAKO MATERIALAK, TEKNIKA

ESPERIMENTALAK ETA PROTOKOLOEN SAILKAPENA

4.2.1. PEPTIDO SEKUENTZIAK ETA

ANTIGORPUTZAK NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK (2F5preTM) sekuentzia,

bere C karboxiamida terminaletik hasita, Fmoc fase solido sintesiaren bidez sintetizatua izan zen eta HPLC-z purifikatua, Pompeu-Fabra-ko Unibertsitatean (ikusi tesiaren 2.1.1 atala). Peptido soluzioak dimetilsulfoxidoan (DMSO, gradu espektroskopikoa) prestatuak izan ziren, eta kontzentrazioak azido bizintzoninikoaren mikrosaioarekin (BCA, Pierce, Rockford, IL, USA) determinatuak izan ziren.


146

Hibridomak espresatzen dituzten Mab2F5 eta Mab4E10 antigorputz neutralizatzaileak, IgG1 birkonbinatu gisa CHO zeluletan ekoiztu ziren (Kunert, R., Steinfellner, W. eta lank., 2000). Beroiek isolatzeko GIB-1-rekin infektaturik dauden, baina sintomarik aurkezten ez dituzten gaixoen odol-zelula mononuklearrak erabili ziren (Buchacher, A., Predl, R. eta lank., 1994).

CHO-Env lerro zelularrak eta HeLaT4+ lerro zelularrak NIH AIDS

Research and Reference Reagent Program-etik (ARRRP) lortu ziren. 4.2.2. ELISA Kapitulu honetan erabili diren ELISA teknika guztiak 2.6 atalean

adierazi den moduan burutu dira. 4.2.2.1. ELISA PROTOKOLO OROKORRA -2F5preTM fosfato tanpoian (PBS) disolbatu zen eta C96 Maxisorp

mikroplaterretan (100 µl/putzuko) (Nunc, Denmark), 1 µM-eko kontzentrazioan landatu zen.

-Antigorputzekin inkubatu baino lehen, mikroplaterrak 2 orduz blokeatu ziren %3 BSA PBS-an disolbaturik.

4.2.2.2. LIPOSOMETAN OINARRITURIKO ELISA

PROTOKOLOA -100 µΜ PC besikulak estreptabidinaz gaineztaturiko

mikroplaterretan (Nunc, Denmark) landatu ziren. -Liposomak eratzeko, lipidoak tanpoian barreiatu ziren, eta

sonikatu egin ziren. Liposomak, %1 biotina-PE-z markatu ziren.

4.2.2.3. LEHIAKETA ELISA PROTOKOLOA -Batura soluzioan eman zedin, antigorputzarekin lehiatu zuten

epitopo edo besikulen bolumen zehatzak plaketara gehitu ziren.


147

-Hiru protokoloetan, “background” balioak, aldiberean egindako

mab gabeko saioekin lortu ziren. -Mab-en batura, fosfatasa alkalinoa konjugatua daukan giza

kontrako ahuntz immunoglobulinarekin (Pierce, Rockford, IL, USA) lortu zen (1:10000 erlazioan).

-P-nitrofenilo fosfatoak (Sigma, St. Louis, MO, USA) erreakzioa kolorea hartzeko erabili zen.

-Xurgapena, 405 nm-tan neurtu zen Synergy HT microplate reader aparailuan (Bio-TEK Instruments Inc., VT, USA).

Itxurazko afinitate konstatea (K) lortzeko, batura balore

maximoen erdira estrapolatu ziren. Batura balore hauek, balio esperimentalak bigarren kapituluan agertzen den (10) ekuaziora doituz lortu ziren.

Abs = Absmax=[MAb]/(K+[MAb]) 4.2.3. FLUORESZENTZIA BIDEZ EGINDAKO

NEURKETAK Kapitulu honetan fluoreszentzia bidez bi saio burutu ziren,

2.5.1.4 eta 2.5.1.3 ataletan adierazi direnak hurrenez-hurren. Triptofanoaren igorpen-fluoreszentziaren aldaketa jarraituz,

peptidoen banaketa mintzetan aztertu zen. Espektro zuzenduak SLM Aminco espektrofluorimetro batean jaso ziren.

-Espektrofluorimetroa irabiagailu magnetikoa eta kubeta berotzeko

bainua darama. -Kitzikatzeko uhin luzera, 280 nm-tan finkatu zen eta igorpen uhin

luzera 350 nm-tan. Slit-en zabalera 5 nm-tan finkatu zen bi kasutarako. -Banaketa-kurbak, lipido kontzentrazioaren titulazio bat eginez

ematen den Trp-ren igorpen fluoreszentziaren aldaketarekin, zenbatetsiak izan ziren.


148

-Seinalea diluzioarekin zuzendua izan zen eta barneko filtroaren zuzenketa NATA Trp-aren analogoarekin egin zen. NATA ez da mintzetara banatzen.

-Mol frakzioaren itxurazko banaketa koefizientea, Kx-a, balio

esperimentalak bigarren kapituluko (4) ekuaziora doituz kalkulatua izan zen.

[(Fmax/F0)-1]x[L]

F/F0 = 1 + -------------------- K+[L] Mintzaren interfasera ematen den barneraketa aztertzeko,

peptidoaren Trp-tik, gainazalean dagoen d-DHPE zundara ematen den energi transferentzia erabili zen (Ruiz-Arguello, M. B., Goni, F. M. eta lank., 1998) erreferentzian egiten den moduan.

-Laburbilduz, %6 d-DHPE mol zunda, besikulen osaketan gehitu

zen eta zundaren igorpen espektroak jaso ziren (igorpen uhin luzera maximoa 510 nm izanik).

-Kitzikatzeko erabili zen uhin-luzera Trp-arena izan zen (280 nm). -Lipido-peptido nahasturak 30 minutuz eta 37 ºC-tan inkubatu

ziren espektroak jaso baino lehen. -Energi transferentziaren eraginkortasuna (E) bigarren kapituluko

(3)-en ekuazioaren bitartez kalkulatu zen. E = 1- (QT / Q0) 4.2.4. SINTZITIO-ERAKETAREN INHIBIZIOA Sintzitioen inhibizio saioa (Muster, T., Steindl, F. eta lank., 1993)

antigorputzen batura gp41 natiboa gainazalean espresatzen dituzten zelulekin egin zen.

-Saioa CHO-Env zelulekin (GIB HXB2 env genea espresatzen

dituzte) eta HeLaT4+ zelulak (zelula hauek CXCR4 espresatzen dituzte gainazalean) egin zen


149

-CHO-Env eta HeLaT4+ zelulak batera erein ziren, mota bakoitzetik 35.000 zelula/putzu 96 putzuetako plaketan.

-MSX gabeko GMEM gehitzen zaie eta 6 orduz inkubatu ziren 37 ºC-tan eta CO2 inkubadore batean.

-Camedia C-5050 kamara digital batez (Olympus-Europe, Hamburg, Germany) ekipatuta dagoen Olympus CKX41 mikroskopio alderantzikatu (Olympus-Europe, Hamburg, Germany) batekin eta fase kontrastea erabiliz sintzitioak zenbatu ziren.

-Sintzitioen inhibizio saioan, Mab-ak CHO-Env zelulekin 90 minutuz

inkubatuz ziren. Inkubazioa CHO-Env zelulak, HeLaT4+ zelulekin nahastu baino lehen egin zen.

-Ondoren, lehen bezala, HeLaT4 zelulak erein ziren eta 6 orduz elkarrekin inkubatu ziren.

-Inhibizio efektuaren itzulpena ikusteko, CHO-Env zelulei Mab-ak

gehitu baino lehen, hauek peptido edo fosfolipidoekin 90 minutuz inkubatu ziren giro tenperaturan.

-Ondoren HelaT4 zelulak gehitu ziren eta CHO-Env zelulekin 6 orduz inkubatu ziren.

4.3. EMAITZAK 4.3.1. IGARPENAK MINTZ-BANAKETARAKO Mintzetan txertatzeko joera aurkezten duten gp41 erregioak

detektatzeko eta mintzaren interfasean ematen den proteinaren tolesduraren karakterizazioa (Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Saez-Cirion, A., Nir, S. eta lank., 2002; Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003) aztertzeko aurreikuspen tresna berriak proposatu dira. Tresna hauek, aminoazido bakoitza, ura-oktanolera eta ura–mintzaren interfasera, transferitzean askatzen den energi askean oinarriturik daude (Wimley, W. C. eta White, S. H., 1996; Hessa, T., Kim, H. eta lank., 2005).

Interfaseko hidrofobizitate-banaketaren analisiek eta mintz-

banaketa esperimentuek, energi baxuko konfigurazioan preTM erregioa mintz-interfasearen mailan murgildurik dagoela iradokitzen dute (Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003). 2F5 eta 4E10 epitopo sekuentziak, preTM


150

erregioaren amino muturrean eta erdialderantz kokaturik daude, hurrenez-hurren (4.7 irudia). Beraz, Mab2F5 eta Mab4E10 antigorputzek mintzaren interfasean murgilduta egon behar diren sekuentziak ezagutzeko ahalmena dutela pentsa liteke.

4.7. Irudia: 2F5 eta 4E10 epitopo sekuentzien afinitatea mintz-

interfaseekiko. GIB-1 birusaren gp41 proteinan, birusaren mintzetik gertu dagoen sekuentziaren eta transmintz sekuentziaren interfaseko hidropatia (Ploteatu diren hondarrak, gp160-aren 656-711 bitartekoak izan dira). Wimley eta White hidrofobizitate eskalaz hamaika aminoazidotako leihoa erabili da (Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005). Azaltzen den sekuentzia MPER sekuentzia errepresentatzen duen 2F5preTM peptidoarena da. 2F5 eta 4E10 epitopoen kokapen erlatiboak eta aminoazido sekuentziak, gorriz eta berdez adierazten dira, hurrenez-hurren. Urdinez azaltzen diren hondarrak Suarez eta


151

lankideek definituriko preTM domeinuari dagozkie (Suarez, T., Gallaher, W.

R. eta lank., 2000).

4.8. Irudia: 2F5 eta 4E10 antigorputz monoklonalen mintz-interfaseekiko

afinitatea. A) Mab2F5 (gorriz) eta Mab4E10 (berdez) kate astunen batez-besteko interfaseko hidropatia (balorea zenbat hondar leihorako kalkulatu den erakusten da). Azalera grisak, CDR-en kokapena erakusteko erabili dira. Kalkuluak 4.7 irudian azaldu bezala burutu dira. B) Agerian eta mintzarekiko elkarrekintza faboragarriak


152

erakusten duten hondarren kokapena (urdinez beteriko atomoen espazioak),

2F5 eta 4E10 antigorputzen Fab-etan (bigizta grisak). Baturiko epitopoen Cα eskeletoak erakutsi dira gorriz (2F5) eta berdez (4E10).

4.8 irudian eta 4.1 taulan erakutsi diren emaitzek, mintzetan

bertan epitopo-ezagumendua burutzeko 4E10 eta 2F5 antigorputzek jaso dituzten adaptazioak sustatzen dituzte. Bertan kate astunak eta arinak konparatu dira berauen mintzarekiko afinitatea kontuan hartuta. Mab-en CDR-H3 bigiztetan mintzaren afinitatea aurkeztu dezaketen sekuentziak somatu daitezke. Mab4E10-aren kasuan mintzarekiko afinitatea Mab2F5-rena baino altuagoa dela ikusten da (4.8A irudia). Horretaz gain, Mab4E10-ren CDR-H1-k afinitate esanguratsua azaltzen du. B panelean, molekularen azalean dauden (hots, ur-soluzioari begira) eta mintzarekiko afinitatea duten aminoazidoen alboko-kateak erakutsi dira. Mab4E10-aren kasuan mintzarekin kontaktuan jartzeko erabilgarri litekeen paratopoaren azala, Mab2F5-arena baino handiagoa dela behatu daiteke halaber (ikusi ere 4.1 taula).

4.1 taula: Mab 2F5 eta Mab 4E10 antigorputzen kate astunen joera mintzetan

txertatzeko. 2F5 4E10

Sekuentzia1 ∆G (Kcal/mol)2 Sekuentzia1 ∆G (Kcal/mol)2

Gly26-Gly35 -1.23 Gly26-Ser35 -1.91 CDR-H1

Leu29-Phe32 -0.33 Phe29-Tyr32 -1.80

Leu48-Lys57 2.86 Gly50-Asn58 -0.53 CDR-H2

Ile51-Asp54 0.11 Pro52-Thr55 -0.51

Pro98-Ala100g -0.57 Gly96-Lys100e -2.95 CDR-H3

Leu100a-Val100d -1.69 Gly99-Trp100b -3.68

1: Sekuentziek 4 eta 10 aminoazido hondarreko luzera dituzte (Goiko eta

beheko baloreak hurrenez-hurren) 2: Sekuentziek fase urtsutik, mintz interfasera banatzeko behar duten energi

askearen balioak adierazten dira (Wimley, W. C. eta White, S. H., 1996; Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000).


153


154

Azkenean, 4.9 irudia, kapitulu honetan buruturiko lan esperimentala erantzuten saiatu diren galderak planteatzeko erabili da: (a) antigorputzak, mintzekin elkar daitezke? (b) mintzetan barreiatutako epitopo-sekuentziak ezagutzeko gai al dira?; eta azkenik, (c) fosfolipidoekin modu espezifikoaz elkarrekiteko gai al dira?

4.9. Irudia: Mintz-elkarrekintza igarpenetatik datozen galderak. (a) 2F5 eta

4E10 epitopoak mintz-interfasean (MI) kokaturik egon daitezke, energi baxuko egoeran; (b) mintzari baturik dauden epitopoek antigorputzengatik ezagutuak izan daitezkeen posibilitatea dago; (c) Mab hauek mintzeko fosfolipidoek espezifikoki ezagutu ahal dituzte. (HC) Gune hidrokarbonatua.


155

4.3.2. Mab-MINTZA BANAKETAREN AZTERKETA

LIPOSOMETAN OINARRITUTAKO ELISA BAT ERABILIZ Aurreikusiriko mintzarekin elkartzeko ahalmena egiaztatzeko

asmoz, lehenik eta behin liposometan oinarritutako ELISA saioa garatu zen (4.10 irudia). Biot-PE-k, estreptabidinaz gaineztaturiko plaka-azalean liposomak itsastea ahalbidetu zuen (A panela). Estreptabidinaz gaineztaturik dauden plaketara gehitu behar zen liposoma kopurua 100 µM zela zehazki jakiteko, %5 Rho-PE zunda fluoreszenteaz markaturiko liposomekin saioa kalibratu zen (4.10A irudia, eskuineko panela). PC besikulei gehitu izan zitzaien biot-PE kopurua 99:1 izan zen.

Kontrol esperimentuetan, liposoma biotinilatuak ez ziren

detektatu plaka arruntetara gehitzen zirenean (estreptabidina gabekoak), eta bestalde, biot-PE-z markaturik ez zeuden liposomak, hots, liposoma zuriak, estreptabidinaz gaineztaturik zeuden plaketara gaineratu zirenean, ez ziren itsatsi. Honen arabera, liposomen batuketa plaketara estreptabidinarekiko batura espezifikoagatik zela ondorioztatu daiteke.

Antigorputza-liposoma elkarketa buruzko emaitzak Mab4E10-ren

afinitate altuagoarekin bat datoz (4.10B irudia eta 4.2 taula). Beraz, emaitza horiek, Wimley-White analisiak aurreikusitakoa baieztatzen dute (4.9 irudia). Mab2F5 eta Mab4E10-en itxurazko disoziazio batura konstanteak baxuagoak dira CL-rekiko, PC-arekiko baino. Honek adieraz lezake bi antigorputzek CL-rekiko afinitate altuagoa aurkezten dutela (4.2. taula). Azpimarratzekoa da, 2F5 eta 4E10-ek epitopoak batzen duten guneen inguruan karga positibodun azalerak egotea, Mab4E10-ren kasuan askoz ere nabarmenagoa delarik (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004; Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005). Analisi kuantitatiboek Mab4E10-ak fosfolipido anionikoez osoturiko bigeruzekiko, fosfolipido neutroez osaturiko bigeruzekiko baino afinitate altuagoa aurkezten duela baieztatu dute. Bestalde, Mab2F5-a fosfolipido anionikoz osaturiko bigeruzetara batzen da, PC bigeruza neutroetara batzen den afinitate berdinarekin edo/eta baxuagorekin. Beraz, Mab4E10-ren kasuan, CL-z osaturiko bigeruzekiko afinitatea, aldeko elkarrekintza elektrostatikoengatik izan badaiteke ere, Mab2F5-aren kasuan derrigorrez beste faktore batzuk hartu beharko dute parte.


156

4.2. Taula: Epitopoen (peptidoa zuzenean batu denean plakara edo

liposometan lotuta) eta fosfolipido bigeruzen batuketarako lortzen diren antigorputz kontzentrazioak (nM) maximoaren erdira.

Mab2F51 Mab4E101

PC (+1/-1)2 113±19 16±3.3

CL (-2) 31±8.0 4.5±0.8

PG (-1) 173±38 2.7±0.4

PS (+1/-2) 327±113 2.5±0.4

PI (-1) 613±110 Ez deter.

2F5preTM3 0.4±0.03 1.47±0.03

2F5preTM-PC4 4.7±2.4 1.67±0.03

1: Batura balioak funtzio hiperbolikoetara doitutako adsortzio-kurbetatik atera dira. Erroreak doipenaren kalitatea adierazteko eman dira.

2: Plakara batuta dagoen lipido kontzentrazioa kasu guztietan 100 µM izan

zen. Buru polarraren karga parentesi artean adierazi da. 3: Peptido-epitopoa (1 µM) ELISA arruntera zuzenean aplikatu zen. 4: Peptido-epitopoa PC liposometara gehitu zen. PC liposomak lehendabizi

estreptabidinaz gaineztaturik zeuden plaketara gehitu ziren. Bolumena 100 µl izan zen. Baldintza esperimentalak erabaki ziren, azkenean peptido:lipido erlazioa besikuletan 1:100 izateko eta erabili zen plakara batuta dagoen lipido kontzentrazioa, 100 µM izateko ere.


157

4.10. Irudia: Mintz-antigorputz elkarketaren azterketa liposometan

oinarrituriko ELISA-ren bitartez. A) Ezkerreko panela: Liposometan oinarrituriko ELISA-ren eskema. Eskuinaldeko panela: Saioaren kalibrazioa. Rho-PE-z markaturiko PC:biot-PE (99:1 mol:mol erlazioa) besikulak estreptabidinaz gaineztaturiko plaketara gaineratuak izan ziren (zirkuluak). Itsatsirik geratu ez zen frakzioa garbitu ostean, plakara baturik geratu ziren besikulak kuantifikatzeko rodaminaren fluoreszentzia neurtu zen, besikulak Triton X-100 ekin (%0.5 vol/vol) solubilizatu eta gero. Laukiak biot-PE gabeko besikulei dagozkie, eta hirukiak biot-PE-z markaturiko besikulei, baina estreptabidina gabeko, hots plaka arruntetara gehituak izan zirenak. B) Mab2F5 (ezkerrean) eta Mab4E10-en (eskuinean) elkarketa PC (zirkuluak), PG (triangeluak) eta CL (laukiak) liposomekin. Batez besteko baloreak erakutsi dira.


158

4.3.3. PEPTIDO-EPITOPOAREN EZAGUMENDUA

MINTZAREN INTERFASEAN Gp41-aren eraginez gertatzen den fusio prozesua ematen denean,

proteina honen pretransmintz erregioa mintzaren interfasean murgiltzen dela iradokitu da. (Munoz-Barroso, I., Salzwedel, K. eta lank., 1999; Salzwedel, K., West, J. T. eta lank., 1999; Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003; Shnaper, S., Sackett, K. eta lank., 2004). Honengatik, gp41-aren erregio hau bi modu ezberdinetan existitu behar da: (1) Fusio aurreko kanpo domeinu globular eta solugarriaren parte bezala. (2) Mintzean murgilduta, fusio prozesua ematen denean. Beraz, aipatu bezala (4.7 eta 4.8 irudiak) Mab2F5 eta Mab4E10 antigorputzek beraien epitopoak, bai soluzioan, bai mintzaren ingurunean ere ezagutzeko ahalmena izateak bidezkoa dirudi.

Aukera hori baieztatzeko, 2F5preTM peptidoa erabili zen. Peptido

hau MPER erregioaren ordezkoa da (4.7 irudia). 2F5 preTM-a mintz-interfaseetara eraginkorki banatzen da (4.11.irudia). Peptido honek Mab2F5 eta Mab4E10-ak ezagutzen dituzten epitopo sekuentziak bere baitan daramatza. Beraz, peptido honen erabilpenak bi epitopoen ezagumendua aztertzea bidera dezake (4.12. irudia).

Peptidoak bigeruzan hartzen duen kokapena Trp-ren espektrotik

ondorioztatu daiteke, dDHPE-ra energi transferentzia saioa erabiliz (Ruiz-Arguello, M. B., Goni, F. M. eta lank., 1998) (4.11. irudia). Trp-aren igorpenaren jaitsiera 333 nm-tan (besikulen presentzian igorpen uhin-luzeraren maximoa) eta dDHPE zundaren emisioaren igoera 520 nm-tan, energi erresonantziaren transferentzia mintzari asoziatuta dagoen indol taldetik zundaren dansilo taldera ematen dela adierazten du. Dansilo taldea besikulen lipido-ur interfasean kokatzen da, dansilo-Trp bikotearen R0 distantzia 17 Å-ekoa da (Vaz, W. L. eta Schoellmann, G., 1976). Beraz, behatzen den Trp-ren indargabetzeak, Trp hondarren gehiengoa, mintzaren interfaseari edo/eta kate azilikoen erregioari asoziatua egon behar dela iradokitzen du. Honengatik 4.7C irudian irudikatuta dagoen topologia 2F5preTM-a uratik mintzera banatzean dagokio.


159

4.11. Irudia: 2F5preTM peptidoaren fluoreszentzia intrintsekoaren

igorpen espektroa. 2F5preTM (kitzikatze uhin-luzera 280 nm), PC (lerro marraduna) eta PC:dDHPE (9.4:0.6) besikulekin inkubatua (lerro solidoa) izan zen. Lipido kontzentrazioa 0.25 mM izan zen, eta gehitutako peptido:lipido erlazioa 1:100. Barnealdeko irudia: 2F5preTM-aren banatze kurba mintzarekin. Kurbak, PC besikulen presentzian Trp-ak jasaten dituen fluoreszentziaren aldaketak PC besikulen kantitatea handituz neurtzen lortu ziren. Marra solidoa, funtzio hiperboliko batera balore esperimentalak doituz lortu da. Banaketa konstantea 2.5.1.4 atalean deskribatzen den modura kalkulatua dago.

Kx (app) ≈ 2.5x106 balorea duen itxurazko batura konstantea lortu zen 2F5preTM peptidoa PC besikulen presentzian titulatzerakoan (4.11. irudian, barnealdeko irudia).

4.11. Irudian agertzen den itxurazko banaketatik, aintzat har

daiteke, 100 µM lipido besikula, 1.2 µM 2F5preTM-rekin inkubatuz gero 100:1 lipido:peptido (mol:mol) erlazioa egongo dela mintzean edo, hobeto esanda, 1 µM peptido egongo dela putzu bakoitzeko. ELISA kontrolean ikus daiteke, emaitza berdinak lortzen direla lipido besikulak peptidoarekin soluzioan pre-inkubatzen direnean eta gero plaketara gehitzen direnean, edo besikulak lehenbizi plaketara batzen direnean eta gero peptidoarekin inkubatzen direnean.


160

4.12 irudian, 2F5preTM peptidoaren ezagumendua 2F5preTM plaketan aplikatutakoan (ELISA arrunta), eta liposomekin gaineztaturik zeuden plaketara aurkeztutakoan (liposometan oinarrituriko ELISA) konparatzen dira. Bi saioen arteko erkaketa egiteko, bi ELISA motetan erabili zen peptido kantitatea berdina izan zen. Beraz, 4.10A irudian dagoen kurbari dagokionez (eskuin aldeko panela) 530 µM lipido gehitu behar zaio plakari, 100 µM lipido batu dadin. Besikula kantitate hau estreptabidina gaineztatzen duen putzuaren azalera guztia estaltzeko modukoa da.

4.12. Irudia: Mintzari baturik dauden epitopoen ezagumendua 2F5 eta

4E10 antigorputzengatik. Mab2F5 (ezkerrean) eta Mab4E10-en (eskuinean) itxurazko afinitateak 2F5preTM-rekiko: hirukiak, peptidoa zuzenean plaketan itsatsirik; zirkuluak, PC-ra baturiko peptidoa; karratuak, CL-ra baturiko peptidoa. Bi kasuetan erabili zen 2F5preTM kontzentrazioa 1 µM-eko izan zen. Balore esperimentalak adsortzio kurbetara doitu ziren (marra solidoak). Plot guztietan balore bikoitzen batez bestekoa azaltzen da.


161

4.12 Irudian eta 4.2. taulan agertzen diren datuek, liposometara

baturik dauden epitopoekiko, bi antigorputzek afinitate altuagoa aurkezten dutela adierazten dute. Izatez, liposometara lotuta dagoen epitopoaren ezagumendua ematen deneko antigorputz kontzentrazioan, besikulekiko elkarrekintza oso mugatua da (4.2 taula). Mab2F5-ren itxurazko afinitatea liposometara batuta dagoen epitopoarekiko baxuagoa da, plakara zuzenean batuta dagoen epitopoarekin konparatzen badugu. Aitzitik, badirudi MAb4E10-ak antzeko afinitateaz ezagutzen duela epitopoa bi modu horietan aurkezten zaionean. Beraz, 2F5preTM lipido bigeruzan murgiltzen denean, Mab2F5-aren ezagumendua eragotzi egiten duela, baina ostera Mab4E10-aren ezagumendua ez, ondorioztatu dezakegu.

4.3.4. FOSFOLIPIDO-Mab ELKARREKINTZAREN

ESPEZIFIZITATEA: FOSFOLIPIDOAREN EZAGUMENDUA SOLUZIOAN ETA MINTZETAN

Liposometan oinarrituriko ELISA sistemak, fosfolipido-Mab arteko

batuketa prozesuaren oinarri estrukturaletan ezagumendu gehiago lortzeko balio izan du. Lehen azaldu den bezala, Mab2F5-ak CL-rekiko erakusten duen afinitate altua, ezin da adierazi elkarrekintza elektrostatikoa kontuan hartuta. Beraz, prozesua ezagumendu espefizifiko batean oinarritzen dela pentsa liteke. Printzipioz, bi egitura-osagai aintzat hartu behar dira fosfolipido-Mab arteko elkarrekintza gertatzeko: CDR H3 bigizta duen interfasearekiko hidrofobizitatea eta antigorputzak epitopoa batzen dueneko gunea (4.8 irudia). Lehenengo osagaiak CDR H3 bigiztaren mintz banaketa inespezifikoa zuzendu dezake (4.8 irudia eta (Wimley, W. C. eta White, S. H., 1996; Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004; Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005; Hessa, T., Kim, H. eta lank., 2005)), bigarrenak, ezagumendu espezifikoagoak ahalbidetu, adibidez Haynes eta kolaboratzaileek deskribatu dituzten modukoak (Haynes, B. F., Fleming, J. eta lank., 2005).


162

CL-a, beraien artean erlazionaturik ez dauden mota askotako

proteinekin espezifikoki elkartzen da, adibidez, arnasa-kateko osagaiekin edo Bax eta cBid apoptosian parte hartzen duten osagaiekin (Lutter, M., Fang, M. eta lank., 2000; Esposti, M. D., Cristea, I. M. eta lank., 2003). Nahiz eta mekanismoa oraindik oso ulertua ez izan, cBid-ek ez du soilik CL-z osaturiko lipido bigeruzekin elkarrekiten, CL-ren lisoeratorri solugarriekin ere elkarrekiten baitu (Esposti, M. D., Cristea, I. M. eta lank., 2003).

Mab eta fosfolipidoen elkarrekintzaren espezifizitatea ikertzeko,

lisoeratorri ezberdinekiko batuketa ere aztertu zen, besteak beste dilisokardiolipinarekiko (4.13-4.15. irudiak).

Mab2F5-ren batuketa mintz bigeruzetan, mihiztaturik edo

soluzioan dispertsaturik dauden fosfolipidoetara, konparatiboki aztertua izan zen inhibizio ELISA arruntekin (4.13A irudia). 2F5preTM ELISA plaka arruntetan landatu zen. Mab2F5-a PC besikulekin inkubatzen denean, 2F5preTM-arekiko elkarrekintza inhibitua ikusten da (4.13A irudia, ezkerreko panelean, marra jarraia). Baldintza berdinak erabiliz, CL-rekin inkubatzerakoan, inhibizioa nabarmenagoa da (erdiko panela, marra jarraia). Bestalde ez zen inhibizio nabarmenik ikusi Mab2F5 lysoPC-rekin inkubatu zenean (ezkerreko panela, marra ez jarraiak). DilysoCL-rekin preinkubatzerakoan ostera, 2F5preTM elkarrekintzarekiko inhibizio bat ikusi zen, baina CL-ak eragiten duena baino txikiagoa (erdiko panela marra ez-jarraiak).

Fosfatidilglizerolaren (PG) izaera kimikoa oso estuki erlazionatua

dago kardiolipinaren izaera kimikoarekin (ikus 4.13B irudia). Mab2F5, PG besikulekin inkubatuz gero, MAb2F5-aren elkarrekintza 2F5preTM-arekiko gutxitu egiten da, baina ez da inhibiziorik ikusten lysoPG-arekin inkubatzerakoan. Honengatik, CL-aren elkarrekintzak Mab2F5-aren epitopo-batuketa gunearekin glizerolak dauzkan bi ester fosfato beharrezkoak dituela ondorioztatzen da (Fig. 4.13B).


163

A B 4.13. Irudia: Fosfolipidoen ezagumendua, soluzioan eta mintzean. A)

Mab2F5-2F5preTM batuketaren inhibizioa, antigorputza lipido bigeruzekin (zirkuluak eta marra jarraiak) eta lisolipido monomerikoekin (karratuak eta marra ez jarraiak), soluzioan pre-inkubatuz eta 2F5preTM ELISA plaka arruntetan itsastean. Azaltzen diren datuetan, PC eta lysoPC (ezkerreko panela), CL eta lysoCL (erdiko panela) eta, PG eta lysoPG (eskuineko panela) lipidoek eragindako inhibizioa konparatzen dira. 2F5preTM eta Mab2F5-a saio hauetan 5 µgr/ml eta 0.1 µgr/ml-tan, hurrenez-hurren, erabili ziren. Agertzen diren baloreak hiru esperimentuetako baloreen batez bestekoei gehi desbiazio estandarra dagokie. B) CL eta dilysoCL (ezkerrean), eta PG eta lysoPG-ari (eskuinean) dagozkien egiturak.


164

CL Mab2F5-aren lotugaia izan daitekeela aztertzeko, ELDKWA

epitopo gune-sekuentzia eta dilisokardiolipina, plaketan batuta dagoen 2F5preTM (4.14 irudia) eta gp41 natiboa gainazalean espresatuta daukaten zelulen ezagumenduarekin saihesteko erabili ziren (4.15 irudia). ELDKWA eta dilisokardiolipinak Mab-ekin inkubatuz gero, 2F5preTM-z gaineztaturik zeuden plaken ezagumendua inhibitzen da eta gainera antzera inhibitzen dute (4.14 irudia). Ikusten dugun inhibizio hau, luzeagoa den 2F5 epitopo lineala (NEQELLELDKWASLWN) erabiliz ikusten dena baino txikiagoa da (Parker, C. E., Deterding, L. J. eta lank., 2001).

4.14. Irudia: Mab2F5-aren afinitatea fosfolipido solugarri eta

peptidoekiko, ELISA plaketan. Mab2F5-2F5preTM batuketaren inhibizioa dilysoCL (zirkuluak), ELDKWA epitopoa (Laukiak) eta NEQELLELDKWASLWN epitopo luzearekin preinkubatuz gero (hirukiak). 2F5preTM 5 µgr/ml ELISA-plaka arruntetan landatu zen. Mab2F5-aren kontzentrazioa kasu guztietan 0.1 µgr/ml izan zen.


165

ELDKWA eta dilysoCL, Mab2F5-ak eragiten duen sintzitio-

eraketaren inhibizioa itzultzen edo blokeatzen dute (4.15A panelean agertzen diren mikrografiak). Inhibizio efektuaren itzulpenaren edo blokeoaren kuantifikazioa kontzentrazioaren funtziopean, bi konposatuetarako inhibizioaren itzulpen ahalmen berdina adierazten digu (B panela). Berriz ere, peptido lineal luzeenak eraginik altuena aurkezten du, batez ere antigorputzarekiko afinitate altuagoa aurkezten duelako. Laburbilduz, emaitza hauek zera iradokitzen dute: ELDKWA eta dilysoCL-aren ezagumendua Mab2F5-aren aldetik, afinitate konparagarriekin gertatzen dela. Datu hauek, peptidoaren sekuentzian epitopo gunearen inguruan kokatzen diren hondarrak (Parker, C. E., Deterding, L. J. eta lank., 2001), antigorputzarekin ere kontaktuan daudenak (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004) oso lagungarriak direla Mab2F5 bere epitopoa ezagutu ahal izateko ideiarekin bat datoz halaber (Barbato, G., Bianchi, E. eta lank., 2003).


166

4.15. Irudia: Mab2F5-ren afinitatea fosfolipido solugarri eta peptidoekiko

saio zelularretan. A) Zelula-fusioaren gp41 aktibitatea. Goiko aldean: Zelulak 96 putzuetako plaketan hazi ziren eta Mab2F5 (5 µgr/putzuko) bakarrik (ezkerreko mikrografia), Mab2F5-a ELDKWA epitopo sekuentziarekin (50 µM) preinkubatuz (erdiko panela) eta Mab2F5-a dilisoCL-rekin (50 µM) preinkubatuz (eskuinaldeko panela). B) Mab2F5-ak (5 µgr/putzuko) eragiten duen sintzitio-eraketaren inhibizioaren blokeoa, dilysoCL-rekin (zirkuluak), ELDKWA-rekin (laukiak) eta NEQELLELDKWASLWN epitopo luzearekin preinkubatuz (hirukiak). Inhibizio balore osoa, eremu bakoitzeko sintzitioetan agertzen direneko nukleo fusionatu kopuruari dagokio (4 edo nukleo gehiago dauzkaten zelula fusionatuak), Mab2F5-aren gabezian. Bi esperimentuen baloreen batez bestekoak ploteatu dira B paneletan, marra ez-jarraiarekin irudikatu dira, erkaketa hobeagoa egiteko eta NEQELLELDKWASLWN-ren balioen doipena saturazio kurbetara adierazteko.


167

4.4. EZTABAIDA Anti-GIB-1 antigorputz monoklonal neutralizatzaile oso gutxi

isolatu dira. Hiru bakarrik dira gp41-aren transmintz azpiunitatearekin erreakzionatzen dutenak: 2F5-a, 4E10-a eta Z13-a (Zwick, M. B., Wang, M. eta lank., 2001; Binley, J. M., Wrin, T. eta lank., 2004; Zwick, M. B., Komori, H. K. eta lank., 2004; Zwick, M. B., Jensen, R. eta lank., 2005). Hiru antigorputz hauek gp41-aren MPER edo aroma domeinuan kokaturik dauden epitopoak ezagutzen dituzte. Beste birusen fusio proteinekin konparatuz GIB-aren gp41-aren preTM erregioa hidrofobizitate oso nabarmena aurkezten du interfaseekiko (Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000). Honengatik, mintzaren interfaseak gp41-aren kanpo domeinuaren birtolestapenaren prozesuan (fusioaren aktibazioa ematen denean gertatzen dena) paper garrantzitsu bat jokatzen duela iradoki da (Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003). Beste aukera bat izan daiteke sekuentziak dauzkan hondar aromatiko anitzek, gp41-ren kanpo domeinuak ezagutzen dituzten antigorputz neutralizatzaileengatik ihes egiteko garaturiko mekanismo adaptatibo bat izatea.

Transmintz-aurreko sekuentzia mintzaren gainazalean murgiltzen

bada, antigorputzari zailagoa izango zaio berarekin elkarrekitea. Kalkulu teorikoetan oinarrituz, gutxi gorabehera -16 kcal/mol behar dira preTM-aren alderdi α-helikoidala mintzaren interfasean txertatzeko (664-DKWASLWNWFNITNWLWYK-683) (Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003). 1 nM antigorputz-peptido disoziazio konstanterako, -15 Kcal/mol-etako energi librekoa da (mol frakzioaren banaketa koefizientean oinarrituta (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1999)). Antigorputzek mintzera banatzeko aurkezten duten tendentzia ezagutzen duten preTM erregioarekin lehiatzen duela sinesgarria izan daiteke beraz. Egoera hipotetiko honen barnean, Mab2F5 eta Mab4E10 mintzaren interfasean murgildurik dauden epitopoak ezagutzeko ahalmena daukaten antigorputz bereziak izan daitezke (4.7 eta 4.8 irudiak).

Liposometan oinarrituriko ELISA teknika, mintz-elkarrekintza

hauek karakterizatzeko tresna moduan erabili da (4.10 irudia). Fosfolipido besikulak lipido bigeruzaren azaleraren ezaugarriak modu homogeneo batean adierazten dituzte; guztiz kontrakoa gertatzen da orain arte erabili den, disolbatzaile organikoetan fosfolipidoaren aplikazioa zuzenki plakara. Besikulek interfasearen erregio konplexua


168

imitatzen dute, alderdi hau ura eta fosfolipidoen talde kimiko hetereogeneoen nahasturaz osatua dago (buru polarra, glizeriloak, fosforiloak, karboniloak eta metilenoak) eta bertan, maila txikian, gertatzen diren polaritatearen aldaketak (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1999; Granseth, E., von Heijne, G. eta lank., 2005). Are gehiago, alderdi honek paper garrantzitsu bat jokatzen du mintzetan proteinak txertatzen direnean gertatzen diren birtolestapen jazoeratan (White, S. H., Ladokhin, A. S. eta lank., 2001). Liposometan oinarrituriko ELISA emaitzetatik esan dezakegu, Mab2F5 eta Mab4E10 mintz ingurunean dauden epitopoak eta fosfolipidoak ezagutzeko aurkezten dituzten ahalmenak, bi adaptazio mekanismo ezberdinetan oinarriturik daudela.

Fab4E10 eta bere epitopo konplexuaren egitura kristalinoren

ebazpenak, antigorputz honek ezagutzen duen egitura helikoidala dela adierazten digu (Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005). Egituran, indol taldeen alboko kateen interdigitazioak, antigorputzera batuta ez dauden bi aurpegien bitartez elkarrekiten dutela aurkezten da ere. Hondar aromatikoetan oso aberatsa den preTM erregioak mintzetan (Suarez, T., Nir, S. eta lank., 2000; Schibli, D. J., Montelaro, R. C. eta lank., 2001; Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003) eta soluzioan (Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003) konformazio helikoidala aurkezten duela frogatu da. Mab4E10, bere epitopoa soluzioan eta mintzetan murgildurik dagoenean, berdin ezagutzearen arrazoi bat, epitopoaren sekuentzia honek bi medio hauetan konformazio eta orientazio berdina aurkeztea izan daiteke (4.11 eta 4.12 irudia). Honengatik Mab4E10-aren moldaera, mintz-interfaseetan txertatzeko, eta bertan murgildurik dauden pretransmintz egitura helikoidalak batzeko ahalmenean oinarriturik egon daiteke (4.12 irudia).

Hala eta guztiz ere, MAb4E10-aren elkarrekintza mintzekin ez-

espezifikoa dela dirudi (4.10 irudia B panela eta 4.2 taula). Zelula-mintzetara modu ez espezifikoan banatzea, birusaren barreiaketa geldiarazteko ahalmenarekin bat etor daiteke.


169

4.16. Irudia: 2F5 (ezkerraldean) eta 4E10 (eskuinaldean), mintz-

interfasean ezagumendurako adaptazio mekanismo ezberdinak. A) 4E10 (Fab berdea) mintzean murgildurik dauden gp41 epitopo sekuentziak ezagutzeko gai da. Kontrara 2F5-a (Fab gorria) mintzean murgildurik dauden sekuentziak afinitate baxuagorekin ezagutzen ditu. Lehenengo kasuan CDR H3 loop-a (oin beltza) txertaketan inplikatua dago, bigarren kasuan aldiz, loop-a antigorputzak baturik duen epitopo natiboa ez askatzen laguntzen du (gorri argia). B) Mab4E10-ren elkarrekintza fosfolipido bigeruzekin (irudian kardiolipina azaltzen da), CDR H3 bigiztaren mintzeko banaketa inespezifikoagatik zuzendua dago. Mab2F5-ren elkarrekintza CL bigeruzekin, bigizta-mintz banaketagatik gertatzen da, epitopoaren batuketa gunea okupatuta geratzen delarik.


170

Hala ere, ezin daiteke aldean utzi, seroko osagaiek domeinu hidrofobikoak egonkortzeko ahalmena dutela, eta honek antigorputz kontzentrazio eraginkor bat mantentzen laguntzea. Lipido bigeruzetan txertatzeko ahalmen baxua aurkezten duten antigorputzek (solugarriagoak diren espezieak) epitopoa mintzean murgilduta dagoenean ezagutzeko ahalmen hori ez dute aurkezten. Zentzu honetan 4E10 antigorputza aparta da, mintzera banaketa ez espezifikoa eta ezagumenduaren artean proportzio ezin hobea lortu baitu.

Fab2F5-ak bere epitopo sekuentziaren β bira +-ko konformazioa

ezagutzen du (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004). 2F5 epitopoan dauden ondoz-ondoko I-motatako β-birak, DKWA eta WASL C-muturreko hondarrak barne dituztenak, konformazio helikoidala eta orientazio ezberdina hartzen dute mintzari batzen direnean (Schibli, D. J., Montelaro, R. C. eta lank., 2001; Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004). Beraz, 2F5-aren epitopoaren kasuan, mintzarekin banatzen denean konformazioa aldatzen du (White, S. H., Ladokhin, A. S. eta lank., 2001). Bere konformazio natiboa aldatzen denez, Mab-peptido afinitatea gutxitu egiten da (4.12 irudia eta 4.16 irudiak). Hala ere, antigorputzaren banaketa mintzera oraindik garrantzitsua da, kasu honetan, epitopoaren disoziazio joera aurre egiteko, pretransmintzak interfasean barneratzen delako. Leu hondarren aldaketak (660, 661 eta 663 posizioak) Ala hondarrengatik (banaketaren energi askeak -0.56 eta +0.17 Kcal/mol, hurrenez-hurren), birusak Mab2F5-gatik sentikorragoak bihurtzen ditu (Zwick, M. B., Jensen, R. eta lank., 2005), beraz mintzarekiko banaketan eta 2F5-aren batuketaren artean lehia bat egon daiteke.

Mab2F5-aren izaera aparta, epitopo sekuentzia heldu eta

mantentzeko ahalmenarekin bat etor daiteke, sekuentziaren joera mintzaren interfasearekin banatzeko den bitartean. CDR H3 loop-aren elkarrekintzak mintz gainazalarekin, efektu honekin zerikusia izan dezake (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004). Epitopoaren amino mutur zatiak antigorputzarekin batzean energi aske nahikoa eman dezake, karboxilo muturraren joera mintzekin banatzea eragingo duena.

4.13-4.15 irudietako emaitzetatik ondorioztatu daiteke,

fosfolipidoen ezagupena Mab2F5-agatik, mekanismo ezberdin baten ondorioz gertatu daitekeela. Mab2F5-ren elkarrekintza PC eta PG-rekin, Mab-bigeruza banaketa inespezifikoan hertsiki oinarrituta dago, lisoeratorriak ez baitira antigorputzaren batuketa gunean batzen. DilysoCL-arekin guztiz kontrakoa gertatzen da, Mab2F5-an, 2F5preTM-aren batuketa gunean batzen dela dirudielako. Are gehiago konposatu


171

lipidiko honek eta ELDKWA epitopoak antzeko afinitatea aurkezten dute MAb2F5-arekiko (4.11. irudia). Datu guzti hauetatik ondorioztatu daiteke 2F5 eta CL-en artean elkarrekintza espezifiko bat dagoela, Mab2F5 eta ELDKWA epitopoaren artean dagoen elkarrekintzaren antzeko izaera kimikoa duena (4.12. irudia behealdean). PreTM proteinan dauden zenbait hondar auto-antigeno moduan jokatu dezakete. Gure sistema immuneak antigorputz auto-immuneak deuseztatzeko programaturik egoteak, azaldu lezake zergatik antigorputz neutralizante hain gutxi sortzen diren, ez neutralizanteekin konparatuz. Gainera baita azalduko luke, zergatik Eritematosoa eta sistemikoa den Lupusa (SLE) daukaten gaixoen artean GIB-1-aren infekzioa hain baxua izatea. Gaixotasun auto-immune honen infekzioan zehar anti-kardiolipina antigorputzak sortarazten dira (Petrovas, C., Vlachoyiannopoulos, P. G. eta lank., 1999; Haynes, B. F., Fleming, J. eta lank., 2005).


172


173

5. kapitulua: Laburpena eta ondorioak

174

______________________________________________________________________

5.1. LABURPENA 5.1.1. ZELULA-MINTZEAN POROAK ERAGITEKO

AHALMENA AURKEZTEN DUEN 2B PROTEINAREN DOMEINUA

Tesi honetan, 2B proteinak zelula mintzean poro ez-selektibo eta

egonkorrak eratzeko daukan berezko ahalmenari buruz ebidentzia sendoak ematen dira.

TMD (transmintz domeinuak, ingelesetik transmembrane

domains) helizeak ordezkatzen dituzten peptido sintetikoek (oinarrizko sekuentzia polipeptidikoak) proteinak mintzetan ioi-kanalak eta poroak eratzeko duen ahalmena mantentzen dutela frogatu da (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Shai, Y., 1995; Gazit, E., La Rocca, P. eta lank., 1998; Stouffer, A. L., Nanda, V. eta lank., 2005). Bi peptido solugarri sintetizatu ziren, TM1-a eta TM2-a, 2B proteinaren bi transmintz domeinuak ordezkatzen dituztenak. Peptido hauek, kultiboan hazten ari diren zelulen mintzak irazkortzeko daukaten ahalmena aztertu da.

TM1 peptidoa solutu txikietarako, aktiboa eta espezifikoa da.

Analisi zehatzago bat eginez, zelula-monogeruza irazkortzeko ahalmena: i) TM1 domeinuan mugatua dago, ii) nM kontzentrazio mailan eraginkorra da, iii) erabat erdietsi egiten du bere aktibitatea 15 minutu baino gutxiagoko denboretan iv) aktiboa da bai 4 ºC bai 37 ºC-tan ere eta v) peptidoaren aktibitatea inhibitzen da estreptabidina molekula kanpoaldetik botaz gero.


175

Mintzetan ematen den poroaren eraketa lipido hutsezko besikulak erabiliz frogatu da. Mikroskopia konfokaleko datuak kontuan hartuz peptidoa zelularen azalean kokatzen dela ondorioztatu daiteke. Datu orok demostratzen dute 2B-ren TM1 domeinua dela zelularen mintz plasmatikoan poroak eratzeko berezko ahalmena daramana.

Beraz, infekzioaren fase berantiarrean zelula barnean

sintetizatzen den 2B proteina, poroak eratzeko gaitasuna duen jatorri biraleko toxinatzat jo dezakegu. Poroak eratzeko gaitasuna daukaten sekuentzia biralek (biroporinak) (Gonzalez, M. E. eta Carrasco, L., 2003), peptido bioaktiboen garapenerako edo/eta konposatu antibiralak isolatzeko itu moduan erabil litezke potentzialki.

5.1.2. GIB-1 BIRUSA NEUTRALIZATZEKO AHALMENA DUTEN ANTI-GP41 2F5 ETA 4E10 ANTIGORPUTZEK BURUTUTAKO FOSFOLIPIDO ETA EPITOPOEN EZAGUMENDUA MINTZ-GAINAZALEAN

Tesi honetan aurkeztu diren emaitzen arabera, 4E10 epitopoa

mintzean murgildurik dagoenean immunogeno modura erabili daiteke, Mab4E10 antigorputz neutralizanteak epitopoa soluzioan zein mintzean txertaturik berdin ezagutzen baitu. Badirudi epitopoaren egitura bi egoeretan berdina dela, hots, bi kasutan α-helikoidala.

Fosfolipido-Mab2F5 elkarrekintza eman dadin bi egitura elementu beharrezkoak dira: alde batetik CDR-bigizta (interfasearekiko hidrofobizitatea aurkezten duena) eta epitopoa batzen deneko gunea (4.16B irudia). CDR-bigiztak mintz-interfaseetarako banaketa zuzenduko luke (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004; Zwick, M. B., 2005) eta epitopoa batzen deneko gunea ezagupen espezifikoarekin erlazionaturik egongo litzateke, azken hau Haynes eta lankideek deskribatzen dutenari dagokiolarik (Haynes, B. F., Fleming, J. eta lank., 2005).

Tesian lortu diren emaitzen arabera, Mab2F5-a interfase

neutroetara eta negatiboki kargaturik dauden interfaseetara ez-espezifikoki batzen da. Bigiztan aurkitzen diren hondar hidrofobikoek batura ez-espezifiko hau zuzendu dezakete fase urtsuan agertzen direnean (4.16 irudia).


176

Bestela gertatzen omen da kardiolipinaren kasuan. Badirudi CL-ak epitopoa batzen deneko gunea betetzen duela, horrela bere batuketa eragotziz. CL-ren ezaugarri bakarra erlazionaturik ez dauden proteinekin espezifikoki elkarrekitea da. Proteina hauen artean adibidez, arnas katearen zenbait proteina daude eta kate-erreakzio apoptotikoan parte hartzen duten BAX eta cBID (Lutter, M., Fang, M. eta lank., 2000; Esposti, M. D., Cristea, I. M. eta lank., 2003; Terrones, O., Antonsson, B. eta lank., 2004). Mekanismo molekularrean sakontzeko garrantzia duelako, ikusi da cBID proteinak ez duela soilik CL-rekin espezifikoki elkarrekiten, beraren lisoeratorriarekin ere elkarrekiten duela (Esposti, M. D., Cristea, I. M. eta lank., 2003). Tesian ematen diren datuek iradokitzen dute Mab2F5 antigorputzak mekanismo espezifiko baten bidez CL batu behar duela. MPER epitopoak, autoantigorputz epitopoak imitatzen dituenaren oinarrian, ebidentzia molekularrak ematen dira (Haynes, B. F., Fleming, J. eta lank., 2005).

Azkenik, GIB-1-erako negatiboak diren baina eritasun

autoimmuneak dituzten gaixoetan antigorputz neutralizanteak deskribatu dira (Douvas, A., Takehana, Y. eta lank., 1996). Bestalde, antikardiolipina antigorputzak zenbait birus infekzio ezberdin, GIB-1 barne, pairatu dituzten gaixoetan aurkitu dira (Guglielmone, H., Vitozzi, S. eta lank., 2001). 2F5 antigorputza GIB-arekin infektaturik zegoen gaixo batetik isolatu zen, eta beraz ezin daiteke jakin gaixo honek beste antigorputz autoimmunerik bazuen. Ondorioz, ere ezin daiteke jakin Mab2F5-a, gp41 ELDKWA epitopoaren eraginaren ondorioz sortu zen edo CL-ren eraginez sortu zen.


177

5.2. ONDORIOAK 1- Biroporina, zelularen mintz plasmatikoan poroak eratzeko

berezko ahalmena daraman toxina biriko eta intrazelularra da. 2- TM1 domeinua 2B-ren bertsio minimoa da, beraz, domeinu

honetan oinarritutako in vitro saioak antibiral berrien isolamenduan erabilgarri suertatu litezke.

3- Mab2F5 eta Mab4E10-ak mintz ingurunean dauden epitopo

eta fosfolipidoak, adaptazio mekanismo ezberdinen bidez ezagutzen dituzte.

3.1- Mab4E10 antigorputza mintzari batuta egoteak,

mintzari jadanik loturik dagoen epitopoaren ezagumenduan laguntzen du.

3.2-Mab2F5 mintzari batuta egoteak, epitopoa bigeruzan

murgiltzea ekiditen du. 3.3- CL fosfolipidoa Mab2F5-ren epitopoaren batura gunean

espezifikoki batzen da, epitopoaren batura eragotziz.


178


179

6. kapitulua: Bibliografia

180

_____________________________________________________________________

Agirre, A., Barco, A., Carrasco, L. eta Nieva, J. L. (2002). "Viroporin-

mediated membrane permeabilization. Pore formation by nonstructural poliovirus 2B protein." J Biol Chem 277(43): 40434-41.

Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H. eta Kinosita, K., Jr. (1996). "Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope." Biophys J 71(6): 3242-50.

Akiyama, S. K., Nagata, K. eta Yamada, K. M. (1990). "Cell surface receptors for extracellular matrix components." Biochim Biophys Acta 1031(1): 91-110.

Aldabe, R. eta Carrasco, L. (1995). "Induction of membrane proliferation by poliovirus proteins 2C and 2BC." Biochem Biophys Res Commun 206(1): 64-76.

Aldabe, R., Barco, A. eta Carrasco, L. (1996). "Membrane permeabilization by poliovirus proteins 2B and 2BC." J Biol Chem 271(38): 23134-7.

Aldabe, R., Irurzun, A. eta Carrasco, L. (1997). "Poliovirus protein 2BC increases cytosolic free calcium concentrations." J Virol 71(8): 6214-7.

Alvarez Losada, S., Canto-Nogues, C. eta Munoz-Fernandez, M. A. (2002). "A new possible mechanism of human immunodeficiency virus type 1 infection of neural cells." Neurobiol Dis 11(3): 469-78.

Anderson, D. H., Sawaya, M. R., Cascio, D., Ernst, W., Modlin, R., Krensky, A. eta Eisenberg, D. (2003). "Granulysin crystal structure and a structure-derived lytic mechanism." J Mol Biol 325(2): 355-65.

Andersson, M., Gunne, H., Agerberth, B., Boman, A., Bergman, T., Sillard, R., Jornvall, H., Mutt, V., Olsson, B., Wigzell, H. eta et al. (1995). "NK-lysin, a novel effector peptide of cytotoxic T and NK cells. Structure and cDNA cloning of the porcine form, induction by interleukin 2, antibacterial and antitumour activity." Embo J 14(8): 1615-25.

Andreu, D., Merrifield, R. B., Steiner, H. eta Boman, H. G. (1983). "Solid-phase synthesis of cecropin A and related peptides." Proc Natl Acad Sci U S A 80(21): 6475-9.

Arroyo, J., Boceta, M., Gonzalez, M. E., Michel, M. eta Carrasco, L. (1995). "Membrane permeabilization by different regions of the human immunodeficiency virus type 1 transmembrane glycoprotein gp41." J Virol 69(7): 4095-102.


181

Baran, K., Ciccone, A., Peters, C., Yagita, H., Bird, P. I., Villadangos, J.

A. eta Trapani, J. A. (2006). "Cytotoxic T lymphocytes from cathepsin B-deficient mice survive normally in vitro and in vivo after encountering and killing target cells." J Biol Chem 281(41): 30485-91.

Barbato, G., Bianchi, E., Ingallinella, P., Hurni, W. H., Miller, M. D., Ciliberto, G., Cortese, R., Bazzo, R., Shiver, J. W. eta Pessi, A. (2003). "Structural analysis of the epitope of the anti-HIV antibody 2F5 sheds light into its mechanism of neutralization and HIV fusion." J Mol Biol 330(5): 1101-15.

Barco, A. eta Carrasco, L. (1995). "A human virus protein, poliovirus protein 2BC, induces membrane proliferation and blocks the exocytic pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae." Embo J 14(14): 3349-64.

Barco, A. eta Carrasco, L. (1998). "Identification of regions of poliovirus 2BC protein that are involved in cytotoxicity." J Virol 72(5): 3560-70.

Bartlett, G. R. (1959). "Phosphorus assay in column chromatography." J Biol Chem 234(3): 466-8.

Bechinger, B. (1997). "Structure and functions of channel-forming peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin." J Membr Biol 156(3): 197-211.

Bechinger, B. (2000). "Understanding peptide interactions with the lipid bilayer: a guide to membrane protein engineering." Curr Opin Chem Biol 4(6): 639-44.

Belmonte, G., Cescatti, L., Ferrari, B., Nicolussi, T., Ropele, M. eta Menestrina, G. (1987). "Pore formation by Staphylococcus aureus alpha-toxin in lipid bilayers. Dependence upon temperature and toxin concentration." Eur Biophys J 14(6): 349-58.

Bennett, V. (1985). "The membrane skeleton of human erythrocytes and its implications for more complex cells." Annu Rev Biochem 54: 273-304.

Bernheimer, A. W. eta Rudy, B. (1986). "Interactions between membranes and cytolytic peptides." Biochim Biophys Acta 864(1): 123-41.

Berridge, M. J. (1987). "Inositol trisphosphate and diacylglycerol: two interacting second messengers." Annu Rev Biochem 56: 159-93.

Berridge, M. J. (1993). "Inositol trisphosphate and calcium signalling." Nature 361(6410): 315-25.

Bhakdi, S. eta Tranum-Jensen, J. (1991). "Alpha-toxin of Staphylococcus aureus." Microbiol Rev 55(4): 733-51.

Bienz, K., Egger, D. eta Pasamontes, L. (1987). "Association of polioviral proteins of the P2 genomic region with the viral replication complex and virus-induced membrane synthesis as visualized by electron microscopic immunocytochemistry and autoradiography." Virology 160(1): 220-6.


182

Bienz, K., Egger, D., Pfister, T. eta Troxler, M. (1992). "Structural and functional characterization of the poliovirus replication complex." J Virol 66(5): 2740-7.

Binley, J. M., Ditzel, H. J., Barbas, C. F., 3rd, Sullivan, N., Sodroski, J., Parren, P. W. eta Burton, D. R. (1996). "Human antibody responses to HIV type 1 glycoprotein 41 cloned in phage display libraries suggest three major epitopes are recognized and give evidence for conserved antibody motifs in antigen binding." AIDS Res Hum Retroviruses 12(10): 911-24.

Binley, J. M., Wrin, T., Korber, B., Zwick, M. B., Wang, M., Chappey, C., Stiegler, G., Kunert, R., Zolla-Pazner, S., Katinger, H., Petropoulos, C. J. eta Burton, D. R. (2004). "Comprehensive cross-clade neutralization analysis of a panel of anti-human immunodeficiency virus type 1 monoclonal antibodies." J Virol 78(23): 13232-52.

Blanco, R., Carrasco, L. eta Ventoso, I. (2003). "Cell killing by HIV-1 protease." J Biol Chem 278(2): 1086-93.

Bloom, M., Evans, E. eta Mouritsen, O. G. (1991). "Physical properties of the fluid lipid-bilayer component of cell membranes: a perspective." Q Rev Biophys 24(3): 293-397.

Boon, J. M. eta Smith, B. D. (2002). "Chemical control of phospholipid distribution across bilayer membranes." Med Res Rev 22(3): 251-81.

Bottcher, G. J. F., Van Gent, C. M. eta Pries, C. (1961). "A rapid and sensitive submicro

phosphorus determination." Anal. Chim. Acta 24: 203-204. Buchacher, A., Predl, R., Strutzenberger, K., Steinfellner, W., Trkola, A.,

Purtscher, M., Gruber, G., Tauer, C., Steindl, F., Jungbauer, A. eta et al. (1994). "Generation of human monoclonal antibodies against HIV-1 proteins; electrofusion and Epstein-Barr virus transformation for peripheral blood lymphocyte immortalization." AIDS Res Hum Retroviruses 10(4): 359-69.

Bullough, P. A., Hughson, F. M., Skehel, J. J. eta Wiley, D. C. (1994). "Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion." Nature 371(6492): 37-43.

Burrer, R., Haessig-Einius, S., Aubertin, A. M. eta Moog, C. (2005). "Neutralizing as well as non-neutralizing polyclonal immunoglobulin (Ig)G from infected patients capture HIV-1 via antibodies directed against the principal immunodominant domain of gp41." Virology 333(1): 102-13.

Burton, D. R., Desrosiers, R. C., Doms, R. W., Koff, W. C., Kwong, P. D., Moore, J. P., Nabel, G. J., Sodroski, J., Wilson, I. A. eta Wyatt, R. T. (2004). "HIV vaccine design and the neutralizing antibody problem." Nat Immunol 5(3): 233-6.

Buser, C. A., Kim, J., McLaughlin, S. eta Peitzsch, R. M. (1995). "Does the binding of clusters of basic residues to acidic lipids induce domain formation in membranes?" Mol Membr Biol 12(1): 69-75.

Cafiso, D. S. (1991). "Lipid bilayers: Membrane-protein electrostatic interactions." Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 185-190.


183

Cafiso, D. S. (1994). "Alamethicin: a peptide model for voltage gating

and protein-membrane interactions." Annu Rev Biophys Biomol Struct 23: 141-65.

Cajal, Y., Boggs, J. M. eta Jain, M. K. (1997). "Salt-triggered intermembrane exchange of phospholipids and hemifusion by myelin basic protein." Biochemistry 36(9): 2566-76.

Campanella, M., de Jong, A. S., Lanke, K. W., Melchers, W. J., Willems, P. H., Pinton, P., Rizzuto, R. eta van Kuppeveld, F. J. (2004). "The coxsackievirus 2B protein suppresses apoptotic host cell responses by manipulating intracellular Ca2+ homeostasis." J Biol Chem 279(18): 18440-50.

Cardoso, R. M., Zwick, M. B., Stanfield, R. L., Kunert, R., Binley, J. M., Katinger, H., Burton, D. R. eta Wilson, I. A. (2005). "Broadly neutralizing anti-HIV antibody 4E10 recognizes a helical conformation of a highly conserved fusion-associated motif in gp41." Immunity 22(2): 163-73.

Carrasco, L. (1978). "Membrane leakiness after viral infection and a new approach to the development of antiviral agents." Nature 272(5655): 694-9.

Carrasco, L. (1981). "Modification of membrane permeability induced by animal viruses early in infection." Virology 113(2): 623-9.

Carrasco, L. (1994). "Entry of animal viruses and macromolecules into cells." FEBS Lett 350(2-3): 151-4.

Carrasco, L. (1995). "Modification of membrane permeability by animal viruses." Adv Virus Res 45: 61-112.

Carrasco, L. (1996). El virus de la inmunodeficiencia humana. El virus del SIDA, Un desafío pendiente. E. Hélice: 91-111.

Carrasco, L. eta Smith, A. E. (1976). "Sodium ions and the shut-off of host cell protein synthesis by picornaviruses." Nature 264(5588): 807-9.

Carrasco, L., Guinea, R., Irurzun, A. eta Barco, A. (2002). Effects of viral replication on cellular membrane metabolism and function. Molecular biology of picornavirus. B. L. Semler and E. Wimmer. Washington, ASM Press: 337-354.

Carrasco, L., Guinea, R., Irurzun, A. eta Barco, A. (2002). Effects of viral replication on cellular membrane metabolism and function. Molecular biology of picornavirus. B. L. Semler and E. Wimmer. Washington, ASM Press: 337-354.

Carrasco, L., Guinea, R., Irurzun, A. y Barco, A. (2002). Molecular Biology of Picornavirus. B. L. Semler, y Wimmer, E. Washington, DC., ASM Press: 337-354.

Castrillo, J. L. eta Carrasco, L. (1985). "Increased inhibition of cellular RNA synthesis by α-amanitin during entry of viruses into animal cells." FEMS Microbiol. Lett. 26: 221-225.

Castrillo, J. L., Vanden Berghe, D. eta Carrasco, L. (1986). "3-Methylquercetin is a potent and selective inhibitor of poliovirus RNA synthesis." Virology 152(1): 219-27.


184

Ciccaglione, A. R., Marcantonio, C., Costantino, A., Equestre, M., Geraci, A. eta Rapicetta, M. (1998). "Hepatitis C virus E1 protein induces modification of membrane permeability in E. coli cells." Virology 250(1): 1-8.

Ciccaglione, A. R., Costantino, A., Marcantonio, C., Equestre, M., Geraci, A. eta Rapicetta, M. (2001). "Mutagenesis of hepatitis C virus E1 protein affects its membrane-permeabilizing activity." J Gen Virol 82(Pt 9): 2243-50.

Coeffier, E., Clement, J. M., Cussac, V., Khodaei-Boorane, N., Jehanno, M., Rojas, M., Dridi, A., Latour, M., El Habib, R., Barre-Sinoussi, F., Hofnung, M. eta Leclerc, C. (2000). "Antigenicity and immunogenicity of the HIV-1 gp41 epitope ELDKWA inserted into permissive sites of the MalE protein." Vaccine 19(7-8): 684-93.

Coffin, J. M. (1996). Retroviridae: the virus and their replication. Fundamental Virology. P. M. H. D.M. Knipe. Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers: 763-843.

Conlon, J. M., Sonnevend, A., Patel, M., Camasamudram, V., Nowotny, N., Zilahi, E., Iwamuro, S., Nielsen, P. F. eta Pal, T. (2003). "A melittin-related peptide from the skin of the Japanese frog, Rana tagoi, with antimicrobial and cytolytic properties." Biochem Biophys Res Commun 306(2): 496-500.

Connor, J., Pak, C. C. eta Schroit, A. J. (1994). "Exposure of phosphatidylserine in the outer leaflet of human red blood cells. Relationship to cell density, cell age, and clearance by mononuclear cells." J Biol Chem 269(4): 2399-404.

Cramer, W. A., Heymann, J. B., Schendel, S. L., Deriy, B. N., Cohen, F. S., Elkins, P. A. eta Stauffacher, C. V. (1995). "Structure-function of the channel-forming colicins." Annu Rev Biophys Biomol Struct 24: 611-41.

Cross, G. A. (1987). "Eukaryotic protein modification and membrane attachment via phosphatidylinositol." Cell 48(2): 179-81.

Chan, D. C. eta Kim, P. S. (1998). "HIV entry and its inhibition." Cell 93(5): 681-4.

Chan, D. C., Fass, D., Berger, J. M. eta Kim, P. S. (1997). "Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein." Cell 89(2): 263-73.

Chang, Y. S., Liao, C. L., Tsao, C. H., Chen, M. C., Liu, C. I., Chen, L. K. eta Lin, Y. L. (1999). "Membrane permeabilization by small hydrophobic nonstructural proteins of Japanese encephalitis virus." J Virol 73(8): 6257-64.

Chapman, D. (1984). Physicochemical properties of phospholipids and lipid-water systems. liposome technology. G. Gregoriadis, Boca Raton, CRC Press.: 1-18.

Charpilienne, A., Abad, M. J., Michelangeli, F., Alvarado, F., Vasseur, M., Cohen, J. eta Ruiz, M. C. (1997). "Solubilized and cleaved VP7, the outer glycoprotein of rotavirus, induces permeabilization of cell membrane vesicles." J Gen Virol 78 (Pt 6): 1367-71.


185

Chen, H. M., Clayton, A. H., Wang, W. eta Sawyer, W. H. (2001). "Kinetics of membrane lysis by custom lytic peptides and peptide orientations in membrane." Eur J Biochem 268(6): 1659-69.

Cho, M. W., Teterina, N., Egger, D., Bienz, K. eta Ehrenfeld, E. (1994). "Membrane rearrangement and vesicle induction by recombinant poliovirus 2C and 2BC in human cells." Virology 202(1): 129-45.

Choe, H., Farzan, M., Sun, Y., Sullivan, N., Rollins, B., Ponath, P. D., Wu, L., Mackay, C. R., LaRosa, G., Newman, W., Gerard, N., Gerard, C. eta Sodroski, J. (1996). "The beta-chemokine receptors CCR3 and CCR5 facilitate infection by primary HIV-1 isolates." Cell 85(7): 1135-48.

Dalgleish, A. G., Beverley, P. C., Clapham, P. R., Crawford, D. H., Greaves, M. F. eta Weiss, R. A. (1984). "The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus." Nature 312(5996): 763-7.

Davies, J. T. eta Rideal, E. K. (1963). Interfacial phenomena. Londres, Academic Press.

de Jong, A. S., Melchers, W. J., Glaudemans, D. H., Willems, P. H. eta van Kuppeveld, F. J. (2004). "Mutational analysis of different regions in the coxsackievirus 2B protein: requirements for homo-multimerization, membrane permeabilization, subcellular localization, and virus replication." J Biol Chem 279(19): 19924-35.

de Jong, A. S., Wessels, E., Dijkman, H. B., Galama, J. M., Melchers, W. J., Willems, P. H. eta van Kuppeveld, F. J. (2003). "Determinants for membrane association and permeabilization of the coxsackievirus 2B protein and the identification of the Golgi complex as the target organelle." J Biol Chem 278(2): 1012-21.

de Jong, A. S., Visch, H. J., de Mattia, F., van Dommelen, M. M., Swarts, H. G., Luyten, T., Callewaert, G., Melchers, W. J., Willems, P. H. eta van Kuppeveld, F. J. (2006). "The coxsackievirus 2B protein increases efflux of ions from the endoplasmic reticulum and Golgi, thereby inhibiting protein trafficking through the Golgi." J Biol Chem 281(20): 14144-50.

Delwart, E. L., Mosialos, G. eta Gilmore, T. (1990). "Retroviral envelope glycoproteins contain a "leucine zipper"-like repeat." AIDS Res Hum Retroviruses 6(6): 703-6.

Diaz, C. eta Schroit, A. J. (1996). "Role of translocases in the generation of phosphatidylserine asymmetry." J Membr Biol 151(1): 1-9.

Dimitrov, A. S., Rawat, S. S., Jiang, S. eta Blumenthal, R. (2003). "Role of the fusion peptide and membrane-proximal domain in HIV-1 envelope glycoprotein-mediated membrane fusion." Biochemistry 42(48): 14150-8.

Doedens, J., Maynell, L. A., Klymkowsky, M. W. eta Kirkegaard, K. (1994). "Secretory pathway function, but not cytoskeletal integrity, is required in poliovirus infection." Arch Virol Suppl 9: 159-72.


186

Doedens, J., Maynell, L. A., Klymkowsky, M. W. eta Kirkegaard, K.

(1994). "Secretory pathway function, but not cytoskeletal integrity, is required in poliovirus infection." Arch. Virol 136: 159-172.

Doedens, J. R. eta Kirkegaard, K. (1995). "Inhibition of cellular protein secretion by poliovirus proteins 2B and 3A." Embo J 14(5): 894-907.

Doedens, J. R., Giddings, T. H., Jr. eta Kirkegaard, K. (1997). "Inhibition of endoplasmic reticulum-to-Golgi traffic by poliovirus protein 3A: genetic and ultrastructural analysis." J Virol 71(12): 9054-64.

Doms, R. W. eta Moore, J. P. (2000). "HIV-1 membrane fusion: targets of opportunity." J Cell Biol 151(2): F9-14.

Dong, Y., Zeng, C. Q., Ball, J. M., Estes, M. K. eta Morris, A. P. (1997). "The rotavirus enterotoxin NSP4 mobilizes intracellular calcium in human intestinal cells by stimulating phospholipase C-mediated inositol 1,4,5-trisphosphate production." Proc Natl Acad Sci U S A 94(8): 3960-5.

Douvas, A., Takehana, Y., Ehresmann, G., Chernyovskiy, T. eta Daar, E. S. (1996). "Neutralization of HIV type 1 infectivity by serum antibodies from a subset of autoimmune patients with mixed connective tissue disease." AIDS Res Hum Retroviruses 12(16): 1509-17.

Dowhan, W. (1997). "Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?" Annu Rev Biochem 66: 199-232.

Dulbecco, R. eta Freeman, G. (1959). "Plaque production by the polyoma virus." Virology 8(3): 396-7.

Earl, P. L., Broder, C. C., Doms, R. W. eta Moss, B. (1997). "Epitope map of human immunodeficiency virus type 1 gp41 derived from 47 monoclonal antibodies produced by immunization with oligomeric envelope protein." J Virol 71(4): 2674-84.

Eckert, D. M. eta Kim, P. S. (2001). "Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition." Annu Rev Biochem 70: 777-810.

Egger, D., Gosert, R. y Bienz, K. (2002). Molecular Biology of Picornavirus. B. L. y. W. Semler, E. Washington, DC, ASM Press: 247-253.

Eisenberg, D., Schwarz, E., Komaromy, M. eta Wall, R. (1984). "Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot." J Mol Biol 179(1): 125-42.

Eisenberg, M., Hall, J. E. eta Mead, C. A. (1973). "The nature of the voltage-dependent conductance induced by alamethicin in black lipid membranes." J Membr Biol 14(2): 143-76.

Eklund, K. K., Vuorinen, J., Mikkola, J., Virtanen, J. A. eta Kinnunen, P. K. (1988). "Ca2+-induced lateral phase separation in phosphatidic acid/phosphatidylcholine monolayers as revealed by fluorescence microscopy." Biochemistry 27(9): 3433-7.


187

Ellens, H., Bentz, J. eta Szoka, F. C. (1985). "H+- and Ca2+-induced

fusion and destabilization of liposomes." Biochemistry 24(13): 3099-106.

Engelman, D. M. (1996). "Crossing the hydrophobic barrier: insertion of membrane proteins." Science 274(5294): 1850-1.

Engelman, D. M. (2005). "Membranes are more mosaic than fluid." Nature 438(7068): 578-80.

Epand, R. F., Sayer, B. G. eta Epand, R. M. (2005). "The tryptophan-rich region of HIV gp41 and the promotion of cholesterol-rich domains." Biochemistry 44(14): 5525-31.

Epand, R. M. eta Vogel, H. J. (1999). "Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action." Biochim Biophys Acta 1462(1-2): 11-28.

Epand, R. M., Sayer, B. G. eta Epand, R. F. (2003). "Peptide-induced formation of cholesterol-rich domains." Biochemistry 42(49): 14677-89.

Esposti, M. D., Cristea, I. M., Gaskell, S. J., Nakao, Y. eta Dive, C. (2003). "Proapoptotic Bid binds to monolysocardiolipin, a new molecular connection between mitochondrial membranes and cell death." Cell Death Differ 10(12): 1300-9.

Evans, W. H. (1989). Membrane structure and function., Oxford, IRL Press at Oxford University Press.

Fass, D., Harrison, S. C. eta Kim, P. S. (1996). "Retrovirus envelope domain at 1.7 angstrom resolution." Nat Struct Biol 3(5): 465-9.

Fernandez-Puentes, C. eta Carrasco, L. (1980). "Viral infection permeabilizes mammalian cells to protein toxins." Cell 20(3): 769-75.

Ferrantelli, F., Rasmussen, R. A., Hofmann-Lehmann, R., Xu, W., McClure, H. M. eta Ruprecht, R. M. (2002). "Do not underestimate the power of antibodies--lessons from adoptive transfer of antibodies against HIV." Vaccine 20 Suppl 4: A61-5.

Fidelio, G. D., Maggio, B. eta Cumar, F. A. (1986). "Stability and penetration of soluble and membrane proteins in interfaces." An. Asoc. Quim. Argent. 74: 801-813.

Fields, G. B. eta Noble, R. L. (1990). "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids." Int J Pept Protein Res 35(3): 161-214.

Freed, E. O. (2001). "HIV-1 replication." Somat Cell Mol Genet 26(1-6): 13-33.

Freed, E. O. eta Martin, M. M. (2001). HIVs and their replication. Fields Virology. K. e. Holley. Philadelphia, Lippincott and Wilkins: 1971-2041.

Freed, E. O. eta Mouland, A. J. (2006). "The cell biology of HIV-1 and other retroviruses." Retrovirology 3: 77.

Gallaher, W. R. (1987). "Detection of a fusion peptide sequence in the transmembrane protein of human immunodeficiency virus." Cell 50(3): 327-8.


188

Gallo, R. C. eta Montagnier, L. (1988). "AIDS in 1988." Sci Am 259(4): 41-8.

Ganz, T. eta Lehrer, R. I. (1995). "Defensins." Pharmacol Ther 66(2): 191-205.

Garidel, P., Johann, C. eta Blume, A. (1997). "Nonideal mixing and phase separation in phosphatidylcholine-phosphatidic acid mixtures as a function of acyl chain length and pH." Biophys J 72(5): 2196-210.

Garry, R. F. eta Dash, S. (2003). "Proteomics computational analyses suggest that hepatitis C virus E1 and pestivirus E2 envelope glycoproteins are truncated class II fusion proteins." Virology 307(2): 255-65.

Gawrisch, K., Ruston, D., Zimmerberg, J., Parsegian, V. A., Rand, R. P. eta Fuller, N. (1992). "Membrane dipole potentials, hydration forces, and the ordering of water at membrane surfaces." Biophys J 61(5): 1213-23.

Gazit, E., La Rocca, P., Sansom, M. S. eta Shai, Y. (1998). "The structure and organization within the membrane of the helices composing the pore-forming domain of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin are consistent with an "umbrella-like" structure of the pore." Proc Natl Acad Sci U S A 95(21): 12289-94.

Gennis, R. B. (1989). Biomembranes. Molecular structure and function., New York, Springer-Verlag.

Gilbert, R. J. (2002). "Pore-forming toxins." Cell Mol Life Sci 59(5): 832-44.

Gonzalez, M. E. eta Carrasco, L. (2003). "Viroporins." FEBS Lett 552(1): 28-34.

Gouaux, E. (1997). "Channel-forming toxins: tales of transformation." Curr Opin Struct Biol 7(4): 566-73.

Gouaux, E. (1998). "alpha-Hemolysin from Staphylococcus aureus: an archetype of beta-barrel, channel-forming toxins." J Struct Biol 121(2): 110-22.

Granseth, E., von Heijne, G. eta Elofsson, A. (2005). "A study of the membrane-water interface region of membrane proteins." J Mol Biol 346(1): 377-85.

Grice, A. L., Kerr, I. D. eta Sansom, M. S. (1997). "Ion channels formed by HIV-1 Vpu: a modelling and simulation study." FEBS Lett 405(3): 299-304.

Guglielmone, H., Vitozzi, S., Elbarcha, O. eta Fernandez, E. (2001). "Cofactor dependence and isotype distribution of anticardiolipin antibodies in viral infections." Ann Rheum Dis 60(5): 500-4.

Guinea, R. eta Carrasco, L. (1990). "Phospholipid biosynthesis and poliovirus genome replication, two coupled phenomena." Embo J 9(6): 2011-6.

Hakomori, S. eta Igarashi, Y. (1993). "Gangliosides and glycosphingolipids as modulators of cell growth, adhesion, and transmembrane signaling." Adv Lipid Res 25: 147-62.


189

Hakomori, S. eta Igarashi, Y. (1995). "Functional role of glycosphingolipids in cell recognition and signaling." J Biochem (Tokyo) 118(6): 1091-103.

Hall, J. E., Vodyanoy, I., Balasubramanian, T. M. eta Marshall, G. R. (1984). "Alamethicin. A rich model for channel behavior." Biophys J 45(1): 233-47.

Han, Z. eta Harty, R. N. (2004). "The NS3 protein of bluetongue virus exhibits viroporin-like properties." J Biol Chem 279(41): 43092-7.

Hansen, J. C., Skalak, R., Chien, S. eta Hoger, A. (1997). "Influence of network topology on the elasticity of the red blood cell membrane skeleton." Biophys J 72(5): 2369-81.

Harada, T., Tautz, N. eta Thiel, H. J. (2000). "E2-p7 region of the bovine viral diarrhea virus polyprotein: processing and functional studies." J Virol 74(20): 9498-506.

Hatta, M. eta Kawaoka, Y. (2003). "The NB protein of influenza B virus is not necessary for virus replication in vitro." J Virol 77(10): 6050-4.

Haynes, B. F., Fleming, J., St Clair, E. W., Katinger, H., Stiegler, G., Kunert, R., Robinson, J., Scearce, R. M., Plonk, K., Staats, H. F., Ortel, T. L., Liao, H. X. eta Alam, S. M. (2005). "Cardiolipin polyspecific autoreactivity in two broadly neutralizing HIV-1 antibodies." Science 308(5730): 1906-8.

He, K., Ludtke, S. J., Heller, W. T. eta Huang, H. W. (1996). "Mechanism of alamethicin insertion into lipid bilayers." Biophys J 71(5): 2669-79.

Hecht, O., Van Nuland, N. A., Schleinkofer, K., Dingley, A. J., Bruhn, H., Leippe, M. eta Grotzinger, J. (2004). "Solution structure of the pore-forming protein of Entamoeba histolytica." J Biol Chem 279(17): 17834-41.

Heimburg, T. eta Marsh, D. (1995). "Protein surface-distribution and protein-protein interactions in the binding of peripheral proteins to charged lipid membranes." Biophys J 68(2): 536-46.

Hessa, T., Kim, H., Bihlmaier, K., Lundin, C., Boekel, J., Andersson, H., Nilsson, I., White, S. H. eta von Heijne, G. (2005). "Recognition of transmembrane helices by the endoplasmic reticulum translocon." Nature 433(7024): 377-81.

Heymann, J. B., Zakharov, S. D., Zhang, Y. L. eta Cramer, W. A. (1996). "Characterization of electrostatic and nonelectrostatic components of protein--membrane binding interactions." Biochemistry 35(8): 2717-25.

Ho, J., Uger, R. A., Zwick, M. B., Luscher, M. A., Barber, B. H. eta MacDonald, K. S. (2005). "Conformational constraints imposed on a pan-neutralizing HIV-1 antibody epitope result in increased antigenicity but not neutralizing response." Vaccine 23(13): 1559-73.


190

Holak, T. A., Engstrom, A., Kraulis, P. J., Lindeberg, G., Bennich, H.,

Jones, T. A., Gronenborn, A. M. eta Clore, G. M. (1988). "The solution conformation of the antibacterial peptide cecropin A: a nuclear magnetic resonance and dynamical simulated annealing study." Biochemistry 27(20): 7620-9.

Honig, B. H., Hubbell, W. L. eta Flewelling, R. F. (1986). "Electrostatic interactions in membranes and proteins." Annu Rev Biophys Biophys Chem 15: 163-93.

Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G. eta Cullis, P. R. (1985). "Production of large unilamellar

vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution,

trapped volume and ability to maintain a membrane potential." Biochim. Biophys. Acta 812: 55-65.

Hormaeche, I., Iloro, I., Arrondo, J. L., Goni, F. M., de la Cruz, F. eta Alkorta, I. (2004). "Role of the transmembrane domain in the stability of TrwB, an integral protein involved in bacterial conjugation." J Biol Chem 279(12): 10955-61.

Hovanessian, A. G., Briand, J. P., Said, E. A., Svab, J., Ferris, S., Dali, H., Muller, S., Desgranges, C. eta Krust, B. (2004). "The caveolin-1 binding domain of HIV-1 glycoprotein gp41 is an efficient B cell epitope vaccine candidate against virus infection." Immunity 21(5): 617-27.

Huang, H. W. (2006). "Molecular mechanism of antimicrobial peptides: The origin of cooperativity." Biochim Biophys Acta 1758(9): 1292-302.

Huang, J., Swanson, J. E., Dibble, A. R., Hinderliter, A. K. eta Feigenson, G. W. (1993). "Nonideal mixing of phosphatidylserine and phosphatidylcholine in the fluid lamellar phase." Biophys J 64(2): 413-25.

Hughson, F. M. (1997). "Enveloped viruses: a common mode of membrane fusion?" Curr Biol 7(9): R565-9.

Hultmark, D., Steiner, H., Rasmuson, T. eta Boman, H. G. (1980). "Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia." Eur J Biochem 106(1): 7-16.

Hultmark, D., Engstrom, A., Bennich, H., Kapur, R. eta Boman, H. G. (1982). "Insect immunity: isolation and structure of cecropin D and four minor antibacterial components from Cecropia pupae." Eur J Biochem 127(1): 207-17.

Hunter, D. G. eta Frisken, B. J. (1998). "Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles." Biophys J 74(6): 2996-3002.

Jain, M. K. (1988). Introduction to biological membranes., New York, John Wiley & Sons.

Joyce, J. G., Hurni, W. M., Bogusky, M. J., Garsky, V. M., Liang, X., Citron, M. P., Danzeisen, R. C., Miller, M. D., Shiver, J. W. eta Keller, P. M. (2002). "Enhancement of alpha -helicity in the HIV-1


191

inhibitory peptide DP178 leads to an increased affinity for human monoclonal antibody 2F5 but does not elicit neutralizing responses in vitro. Implications for vaccine design." J Biol Chem 277(48): 45811-20.

Kaiser, E. T. eta Kezdy, F. J. (1987). "Peptides with affinity for membranes." Annu Rev Biophys Biophys Chem 16: 561-81.

Keenan, T. W. eta Morre, D. J. (1970). "Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions." Biochemistry 9(1): 19-25.

Kim, Y., Valentine, K., Opella, S. J., Schendel, S. L. eta Cramer, W. A. (1998). "Solid-state NMR studies of the membrane-bound closed state of the colicin E1 channel domain in lipid bilayers." Protein Sci 7(2): 342-8.

Klausner, R. D., Fauci, A. S., Corey, L., Nabel, G. J., Gayle, H., Berkley, S., Haynes, B. F., Baltimore, D., Collins, C., Douglas, R. G., Esparza, J., Francis, D. P., Ganguly, N. K., Gerberding, J. L., Johnston, M. I., Kazatchkine, M. D., McMichael, A. J., Makgoba, M. W., Pantaleo, G., Piot, P., Shao, Y., Tramont, E., Varmus, H. eta Wasserheit, J. N. (2003). "Medicine. The need for a global HIV vaccine enterprise." Science 300(5628): 2036-9.

Klimkait, T., Strebel, K., Hoggan, M. D., Martin, M. A. eta Orenstein, J. M. (1990). "The human immunodeficiency virus type 1-specific protein vpu is required for efficient virus maturation and release." J Virol 64(2): 621-9.

Koch, F. eta Koch, G. (1985). Morphological alterations of the host cell as an essential

basis for poliovirus replication. The Molecular Biology of Poliovirus. Viena, Springer Verlag: 227-266.

Kolchinsky, P., Mirzabekov, T., Farzan, M., Kiprilov, E., Cayabyab, M., Mooney, L. J., Choe, H. eta Sodroski, J. (1999). "Adaptation of a CCR5-using, primary human immunodeficiency virus type 1 isolate for CD4-independent replication." J Virol 73(10): 8120-6.

Kuhn-Nentwig, L. (2003). "Antimicrobial and cytolytic peptides of venomous arthropods." Cell Mol Life Sci 60(12): 2651-68.

Kunert, R., Ruker, F. eta Katinger, H. (1998). "Molecular characterization of five neutralizing anti-HIV type 1 antibodies: identification of nonconventional D segments in the human monoclonal antibodies 2G12 and 2F5." AIDS Res Hum Retroviruses 14(13): 1115-28.

Kunert, R., Steinfellner, W., Purtscher, M., Assadian, A. eta Katinger, H. (2000). "Stable recombinant expression of the anti HIV-1 monoclonal antibody 2F5 after IgG3/IgG1 subclass switch in CHO cells." Biotechnol Bioeng 67(1): 97-103.

Kunert, R., Wolbank, S., Stiegler, G., Weik, R. eta Katinger, H. (2004). "Characterization of molecular features, antigen-binding, and in vitro properties of IgG and IgM variants of 4E10, an anti-HIV type 1 neutralizing monoclonal antibody." AIDS Res Hum Retroviruses 20(7): 755-62.


192

Kuo, L. eta Masters, P. S. (2003). "The small envelope protein E is not essential for murine coronavirus replication." J Virol 77(8): 4597-608.

Kyte, J. eta Doolittle, R. F. (1982). "A simple method for displaying the hydropathic character of a protein." J Mol Biol 157(1): 105-32.

Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S. eta White, S. H. (2000). "How to measure and analyze

tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?" Analytical

Biochemistry 285: 235-245. Lakey, J. H., Parker, M. W., Gonzalez-Manas, J. M., Duche, D., Vriend,

G., Baty, D. eta Pattus, F. (1994). "The role of electrostatic charge in the membrane insertion of colicin A. Calculation and mutation." Eur J Biochem 220(1): 155-63.

Lakowicz, J. R. (1983). Principles of fluorescence spectroscopy. New York, Plenum Press.

Lama, J. eta Carrasco, L. (1992). "Expression of poliovirus nonstructural proteins in Escherichia coli cells. Modification of membrane permeability induced by 2B and 3A." J Biol Chem 267(22): 15932-7.

Lay, C. S., Wilson, K. A., Kobe, B., Kemp, B. E., Drummer, H. E. eta Poumbourios, P. (2004). "Expression and biochemical analysis of the entire HIV-2 gp41 ectodomain: determinants of stability map to N- and C-terminal sequences outside the 6-helix bundle core." FEBS Lett 567(2-3): 183-8.

Lee, J. Y., Boman, A., Sun, C. X., Andersson, M., Jornvall, H., Mutt, V. eta Boman, H. G. (1989). "Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin." Proc Natl Acad Sci U S A 86(23): 9159-62.

Leenhouts, J. M., van den Wijngaard, P. W., de Kroon, A. I. eta de Kruijff, B. (1995). "Anionic phospholipids can mediate membrane insertion of the anionic part of a bound peptide." FEBS Lett 370(3): 189-92.

Leontiadou, H., Mark, A. E. eta Marrink, S. J. (2006). "Antimicrobial peptides in action." J Am Chem Soc 128(37): 12156-61.

Lesieur, C., Vecsey-Semjen, B., Abrami, L., Fivaz, M. eta Gisou van der Goot, F. (1997). "Membrane insertion: The strategies of toxins (review)." Mol Membr Biol 14(2): 45-64.

Levy, J. A. (1994). HIV and AIDS pathogenesis. Washington,DC, ASM Press.

Liang, X., Munshi, S., Shendure, J., Mark, G., 3rd, Davies, M. E., Freed, D. C., Montefiori, D. C. eta Shiver, J. W. (1999). "Epitope insertion into variable loops of HIV-1 gp120 as a potential means to improve immunogenicity of viral envelope protein." Vaccine 17(22): 2862-72.

Liepinsh, E., Andersson, M., Ruysschaert, J. M. eta Otting, G. (1997). "Saposin fold revealed by the NMR structure of NK-lysin." Nat Struct Biol 4(10): 793-5.


193

Liljestrom, P. eta Garoff, H. (1991). "Internally located cleavable signal sequences direct the formation of Semliki Forest virus membrane proteins from a polyprotein precursor." J Virol 65(1): 147-54.

Loewy, A., Smyth, J., von Bonsdorff, C. H., Liljestrom, P. eta Schlesinger, M. J. (1995). "The 6-kilodalton membrane protein of Semliki Forest virus is involved in the budding process." J Virol 69(1): 469-75.

Low, M. G. (1987). "Biochemistry of the glycosyl-phosphatidylinositol membrane protein anchors." Biochem J 244(1): 1-13.

Luciw, P. A. (1996). Human immunodeficiency viruses and their replication. Fundamental Virology. P. M. H. D.M. Knipe. Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers: 845-916.

Lutter, M., Fang, M., Luo, X., Nishijima, M., Xie, X. eta Wang, X. (2000). "Cardiolipin provides specificity for targeting of tBid to mitochondria." Nat Cell Biol 2(10): 754-61.

Madan, V., Garcia Mde, J., Sanz, M. A. eta Carrasco, L. (2005). "Viroporin activity of murine hepatitis virus E protein." FEBS Lett 579(17): 3607-12.

Maget-Dana, R. (1999). "The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes." Biochim Biophys Acta 1462(1-2): 109-40.

Maidji, E., Tugizov, S., Jones, T., Zheng, Z. eta Pereira, L. (1996). "Accessory human cytomegalovirus glycoprotein US9 in the unique short component of the viral genome promotes cell-to-cell transmission of virus in polarized epithelial cells." J Virol 70(12): 8402-10.

Maloy, W. L. eta Kari, U. P. (1995). "Structure-activity studies on magainins and other host defense peptides." Biopolymers 37(2): 105-22.

Marusic, C., Rizza, P., Lattanzi, L., Mancini, C., Spada, M., Belardelli, F., Benvenuto, E. eta Capone, I. (2001). "Chimeric plant virus particles as immunogens for inducing murine and human immune responses against human immunodeficiency virus type 1." J Virol 75(18): 8434-9.

Matsuzaki, K. (1998). "Magainins as paradigm for the mode of action of pore forming polypeptides." Biochim Biophys Acta 1376(3): 391-400.

Mayer, L. D., Hope, M. J. eta Cullis, P. R. (1986). "Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure." Biochim Biophys Acta 858(1): 161-8.

McInerney, G. M., Smit, J. M., Liljestrom, P. eta Wilschut, J. (2004). "Semliki Forest virus produced in the absence of the 6K protein has an altered spike structure as revealed by decreased membrane fusion capacity." Virology 325(2): 200-6.

McIntosh, T. J., Magid, A. D. eta Simon, S. A. (1989). "Repulsive interactions between uncharged bilayers. Hydration and


194

fluctuation pressures for monoglycerides." Biophys J 55(5): 897-904.

McIntyre, J. C. eta Sleight, R. G. (1991). "Fluorescence assay for phospholipid membrane asymmetry." Biochemistry 30(51): 11819-27.

Melnyk, R. A., Partridge, A. W., Yip, J., Wu, Y., Goto, N. K. eta Deber, C. M. (2003). "Polar residue tagging of transmembrane peptides." Biopolymers 71(6): 675-85.

Melton, J. V., Ewart, G. D., Weir, R. C., Board, P. G., Lee, E. eta Gage, P. W. (2002). "Alphavirus 6K proteins form ion channels." J Biol Chem 277(49): 46923-31.

Menestrina, G. (1986). "Ionic channels formed by Staphylococcus aureus alpha-toxin: voltage-dependent inhibition by divalent and trivalent cations." J Membr Biol 90(2): 177-90.

Meyer, P. eta Reusser, F. (1967). "A polypeptide antibacterial agent isolated from Trichoderma viride." Experientia 23: 85-86.

Micol, V., Sanchez-Pinera, P., Villalain, J., de Godos, A. eta Gomez-Fernandez, J. C. (1999). "Correlation between protein kinase C alpha activity and membrane phase behavior." Biophys J 76(2): 916-27.

Moerman, L., Bosteels, S., Noppe, W., Willems, J., Clynen, E., Schoofs, L., Thevissen, K., Tytgat, J., Van Eldere, J., Van Der Walt, J. eta Verdonck, F. (2002). "Antibacterial and antifungal properties of alpha-helical, cationic peptides in the venom of scorpions from southern Africa." Eur J Biochem 269(19): 4799-810.

Moll, G. N., Clark, J., Chan, W. C., Bycroft, B. W., Roberts, G. C., Konings, W. N. eta Driessen, A. J. (1997). "Role of transmembrane pH gradient and membrane binding in nisin pore formation." J Bacteriol 179(1): 135-40.

Montoya, M. eta Gouaux, E. (2003). "Beta-barrel membrane protein folding and structure viewed through the lens of alpha-hemolysin." Biochim Biophys Acta 1609(1): 19-27.

Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P. eta Zare, R. N. (1996). "Rapid preparation of giant unilamellar vesicles." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21): 11443-7.

Mosior, M. eta McLaughlin, S. (1992). "Electrostatics and reduction of dimensionality produce apparent cooperativity when basic peptides bind to acidic lipids in membranes." Biochim Biophys Acta 1105(1): 185-7.

Munoz-Barroso, I., Salzwedel, K., Hunter, E. eta Blumenthal, R. (1999). "Role of the membrane-proximal domain in the initial stages of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein-mediated membrane fusion." J Virol 73(7): 6089-92.

Muster, T., Steindl, F., Purtscher, M., Trkola, A., Klima, A., Himmler, G., Ruker, F. eta Katinger, H. (1993). "A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1." J Virol 67(11): 6642-7.

Muster, T., Guinea, R., Trkola, A., Purtscher, M., Klima, A., Steindl, F., Palese, P. eta Katinger, H. (1994). "Cross-neutralizing activity


195

against divergent human immunodeficiency virus type 1 isolates induced by the gp41 sequence ELDKWAS." J Virol 68(6): 4031-4.

Nelson, D. L. eta Cox, M. M. (2005). Lehninger Principles of Biochemistry, W. Freeman.

New, R. R. C. (1990). Liposomes, a practical approach. Oxford, IRL Press.

Newton, K., Meyer, J. C., Bellamy, A. R. eta Taylor, J. A. (1997). "Rotavirus nonstructural glycoprotein NSP4 alters plasma membrane permeability in mammalian cells." J Virol 71(12): 9458-65.

Nicholls, D. G. (1982). Bioenergetics, Academic Press, New York. Nieva, J. L. eta Suarez, T. (2000). "Hydrophobic-at-interface regions in

viral fusion protein ectodomains." Biosci Rep 20(6): 519-33. Nieva, J. L., Sanz, M. A. eta Carrasco, L. (2004). "Membrane-

permeabilizing motif in Semliki forest virus E1 glycoprotein." FEBS Lett 576(3): 417-22.

Nieva, J. L., Agirre, A., Nir, S. eta Carrasco, L. (2003). "Mechanisms of membrane permeabilization by picornavirus 2B viroporin." FEBS Lett 552(1): 68-73.

Nishizuka, Y. (1992). "Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C." Science 258(5082): 607-14.

Nyambi, P. N., Mbah, H. A., Burda, S., Williams, C., Gorny, M. K., Nadas, A. eta Zolla-Pazner, S. (2000). "Conserved and exposed epitopes on intact, native, primary human immunodeficiency virus type 1 virions of group M." J Virol 74(15): 7096-107.

Nyfeler, S., Senn, K. eta Kempf, C. (2001). "Expression of Semliki Forest virus E1 protein in Escherichia coli. Low pH-induced pore formation." J Biol Chem 276(18): 15453-7.

Ofek, G., Tang, M., Sambor, A., Katinger, H., Mascola, J. R., Wyatt, R. eta Kwong, P. D. (2004). "Structure and mechanistic analysis of the anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody 2F5 in complex with its gp41 epitope." J Virol 78(19): 10724-37.

Ojcius, D. M. eta Young, J. D. (1991). "Cytolytic pore-forming proteins and peptides: is there a common structural motif?" Trends Biochem Sci 16(6): 225-9.

Oren, Z., Hong, J. eta Shai, Y. (1999). "A comparative study on the structure and function of a cytolytic alpha-helical peptide and its antimicrobial beta-sheet diastereomer." Eur J Biochem 259(1-2): 360-9.

Oren, Z., Lerman, J. C., Gudmundsson, G. H., Agerberth, B. eta Shai, Y. (1999). "Structure and organization of the human antimicrobial peptide LL-37 in phospholipid membranes: relevance to the molecular basis for its non-cell-selective activity." Biochem J 341 (Pt 3): 501-13.

Ovchinnikov, Y. A. (1979). "Physico-chemical basis of ion transport through biological membranes: ionophores and ion channels." Eur J Biochem 94(2): 321-36.


196

Pai, E. F., Klein, M. H., Chong, P. eta Pedyczak, A. (2000). W. I. P. O. Patent. WO-00/61618.

Panchal, R. G., Smart, M. L., Bowser, D. N., Williams, D. A. eta Petrou, S. (2002). "Pore-forming proteins and their application in biotechnology." Curr Pharm Biotechnol 3(2): 99-115.

Parker, C. E., Deterding, L. J., Hager-Braun, C., Binley, J. M., Schulke, N., Katinger, H., Moore, J. P. eta Tomer, K. B. (2001). "Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5." J Virol 75(22): 10906-11.

Parker, M. W. eta Feil, S. C. (2005). "Pore-forming protein toxins: from structure to function." Prog Biophys Mol Biol 88(1): 91-142.

Parker, M. W., Pattus, F., Tucker, A. D. eta Tsernoglou, D. (1989). "Structure of the membrane-pore-forming fragment of colicin A." Nature 337(6202): 93-6.

Partridge, A. W., Melnyk, R. A., Yang, D., Bowie, J. U. eta Deber, C. M. (2003). "A transmembrane segment mimic derived from Escherichia coli diacylglycerol kinase inhibits protein activity." J Biol Chem 278(24): 22056-60.

Pedersen, P. L. eta Carafoli, E. (1987). "Ion motive ATPases. I. Ubiquity, properties and significance to cell function." Trends Biol. Sci. 12: 146-150.

Penman, S. (1965). "Stimulation Of The Incorporation Of Choline In Poliovirus-Infected Cells." Virology 25: 149-52.

Penman, S. (1965). "Stimulation of the incorporation of choline in poliovirus-infected cells." Virology 25(148-152).

Penman, S. eta Summers, D. (1965). "Effects on host cell metabolism following synchronous infection with poliovirus." Virology 27(4): 614-20.

Perczel, A. eta Hollósi, M. (1996). Turns. Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules. G. D. Fasman. New York, Plenum Press.

Perez-Paya, E., Dufourcq, J., Braco, L. eta Abad, C. (1997). "Structural characterisation of the natural membrane-bound state of melittin: a fluorescence study of a dansylated analogue." Biochim Biophys Acta 1329(2): 223-36.

Petrovas, C., Vlachoyiannopoulos, P. G., Kordossis, T. eta Moutsopoulos, H. M. (1999). "Anti-phospholipid antibodies in HIV infection and SLE with or without anti-phospholipid syndrome: comparisons of phospholipid specificity, avidity and reactivity with beta2-GPI." J Autoimmun 13(3): 347-55.

Pinto, L. H., Dieckmann, G. R., Gandhi, C. S., Papworth, C. G., Braman, J., Shaughnessy, M. A., Lear, J. D., Lamb, R. A. eta DeGrado, W. F. (1997). "A functionally defined model for the M2 proton channel of influenza A virus suggests a mechanism for its ion selectivity." Proc Natl Acad Sci U S A 94(21): 11301-6.

Porter, A. G. (1993). "Picornavirus nonstructural proteins: emerging roles in virus replication and inhibition of host cell functions." J Virol 67(12): 6917-21.


197

Putsep, K., Normark, S. eta Boman, H. G. (1999). "The origin of cecropins; implications from synthetic peptides derived from ribosomal protein L1." FEBS Lett 451(3): 249-52.

Rapaport, D. eta Shai, Y. (1991). "Interaction of fluorescently labeled pardaxin and its analogues with lipid bilayers." J Biol Chem 266(35): 23769-75.

Resh, M. D. (1994). "Myristylation and palmitylation of Src family members: the fats of the matter." Cell 76(3): 411-3.

Ruiz-Arguello, M. B., Goni, F. M., Pereira, F. B. eta Nieva, J. L. (1998). "Phosphatidylinositol-dependent membrane fusion induced by a putative fusogenic sequence of Ebola virus." J Virol 72(3): 1775-81.

Rust, R. C., Landmann, L., Gosert, R., Tang, B. L., Hong, W., Hauri, H. P., Egger, D. eta Bienz, K. (2001). "Cellular COPII proteins are involved in production of the vesicles that form the poliovirus replication complex." J Virol 75(20): 9808-18.

Saez-Cirion, A. eta Nieva, J. L. (2002). "Conformational transitions of membrane-bound HIV-1 fusion peptide." Biochim Biophys Acta 1564(1): 57-65.

Saez-Cirion, A., Gomara, M. J., Agirre, A. eta Nieva, J. L. (2003). "Pre-transmembrane sequence of Ebola glycoprotein. Interfacial hydrophobicity distribution and interaction with membranes." FEBS Lett 533(1-3): 47-53.

Saez-Cirion, A., Nir, S., Lorizate, M., Agirre, A., Cruz, A., Perez-Gil, J. eta Nieva, J. L. (2002). "Sphingomyelin and cholesterol promote HIV-1 gp41 pretransmembrane sequence surface aggregation and membrane restructuring." J Biol Chem 277(24): 21776-85.

Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L., Gomara, M. J., Lorizate, M., Iloro, I., Melikyan, G. eta Nieva, J. L. (2003). "Structural and functional roles of HIV-1 gp41 pretransmembrane sequence segmentation." Biophys J 85(6): 3769-80.

Salzwedel, K., West, J. T. eta Hunter, E. (1999). "A conserved tryptophan-rich motif in the membrane-proximal region of the human immunodeficiency virus type 1 gp41 ectodomain is important for Env-mediated fusion and virus infectivity." J Virol 73(3): 2469-80.

Sambrook, J., Fritsch, E. R. eta Maniatis, T. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sanchez-Magraner, L., Cortajarena, A. L., Goni, F. M. eta Ostolaza, H. (2006). "Membrane insertion of Escherichia coli alpha-hemolysin is independent from membrane lysis." J Biol Chem 281(9): 5461-7.

Sanchez-Martinez, S., Lorizate, M., Hermann, K., Kunert, R., Basanez, G. eta Nieva, J. L. (2006). "Specific phospholipid recognition by human immunodeficiency virus type-1 neutralizing anti-gp41 2F5 antibody." FEBS Lett 580(9): 2395-99.


198

Sanderson, C. M., Parkinson, J. E., Hollinshead, M. eta Smith, G. L.

(1996). "Overexpression of the vaccinia virus A38L integral membrane protein promotes Ca2+ influx into infected cells." J Virol 70(2): 905-14.

Sandoval, I. V. eta Carrasco, L. (1997). "Poliovirus infection and expression of the poliovirus protein 2B provoke the disassembly of the Golgi complex, the organelle target for the antipoliovirus drug Ro-090179." J Virol 71(6): 4679-93.

Sankaram, M. B., Marsh, D., Gierasch, L. M. eta Thompson, T. E. (1994). "Reorganization of lipid domain structure in membranes by a transmembrane peptide: an ESR spin label study on the effect of the Escherichia coli outer membrane protein A signal peptide on the fluid lipid domain connectivity in binary mixtures of dimyristoyl phosphatidylcholine and distearoyl phosphatidylcholine." Biophys J 66(6): 1959-68.

Sanz, M. A., Madan, V., Carrasco, L. eta Nieva, J. L. (2003). "Interfacial domains in Sindbis virus 6K protein. Detection and functional characterization." J Biol Chem 278(3): 2051-7.

Saslowsky, D. E., Lawrence, J., Ren, X., Brown, D. A., Henderson, R. M. eta Edwardson, J. M. (2002). "Placental alkaline phosphatase is efficiently targeted to rafts in supported lipid bilayers." J Biol Chem 277(30): 26966-70.

Sato, H. eta Feix, J. B. (2006). "Peptide-membrane interactions and mechanisms of membrane destruction by amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides." Biochim Biophys Acta 1758(9): 1245-56.

Sattentau, Q. J. eta Weiss, R. A. (1988). "The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor." Cell 52(5): 631-3.

Sattentau, Q. J., Zolla-Pazner, S. eta Poignard, P. (1995). "Epitope exposure on functional, oligomeric HIV-1 gp41 molecules." Virology 206(1): 713-7.

Schibli, D. J., Montelaro, R. C. eta Vogel, H. J. (2001). "The membrane-proximal tryptophan-rich region of the HIV glycoprotein, gp41, forms a well-defined helix in dodecylphosphocholine micelles." Biochemistry 40(32): 9570-8.

Schlegel, A., Giddings, T. H., Jr., Ladinsky, M. S. eta Kirkegaard, K. (1996). "Cellular origin and ultrastructure of membranes induced during poliovirus infection." J Virol 70(10): 6576-88.

Shai, Y. (1995). "Molecular recognition between membrane-spanning polypeptides." Trends Biochem Sci 20(11): 460-4.

Shai, Y. (1999). "Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides." Biochim Biophys Acta 1462(1-2): 55-70.

Shatursky, O., Heuck, A. P., Shepard, L. A., Rossjohn, J., Parker, M. W., Johnson, A. E. eta Tweten, R. K. (1999). "The mechanism of membrane insertion for a cholesterol-dependent cytolysin: a novel paradigm for pore-forming toxins." Cell 99(3): 293-9.


199

Shnaper, S., Sackett, K., Gallo, S. A., Blumenthal, R. eta Shai, Y. (2004). "The C- and the N-terminal regions of glycoprotein 41 ectodomain fuse membranes enriched and not enriched with cholesterol, respectively." J Biol Chem 279(18): 18526-34.

Silvestro, L., Weiser, J. N. eta Axelsen, P. H. (2000). "Antibacterial and antimembrane activities of cecropin A in Escherichia coli." Antimicrob Agents Chemother 44(3): 602-7.

Simon, S. A. eta McIntosh, T. J. (1989). "Magnitude of the solvation pressure depends on dipole potential." Proc Natl Acad Sci U S A 86(23): 9263-7.

Simons, K. eta Ikonen, E. (1997). "Functional rafts in cell membranes." Nature 387(6633): 569-72.

Singer, S. J. eta Nicolson, G. L. (1972). "The fluid mosaic model of the structure of cell membranes." Science 175(23): 720-31.

Sipos, D., Andersson, M. eta Ehrenberg, A. (1992). "The structure of the mammalian antibacterial peptide cecropin P1 in solution, determined by proton-NMR." Eur J Biochem 209(1): 163-9.

Slatin, S. L., Qiu, X. Q., Jakes, K. S. eta Finkelstein, A. (1994). "Identification of a translocated protein segment in a voltage-dependent channel." Nature 371(6493): 158-61.

Song, L., Hobaugh, M. R., Shustak, C., Cheley, S., Bayley, H. eta Gouaux, J. E. (1996). "Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore." Science 274(5294): 1859-66.

Steiner, H., Hultmark, D., Engstrom, A., Bennich, H. eta Boman, H. G. (1981). "Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity." Nature 292(5820): 246-8.

Stouffer, A. L., Nanda, V., Lear, J. D. eta DeGrado, W. F. (2005). "Sequence determinants of a transmembrane proton channel: an inverse relationship between stability and function." J Mol Biol 347(1): 169-79.

Stroud, R. (1995). "Ion channel forming colicins." Curr Opin Struct Biol 5(4): 514-20.

Struck, D. K., Hoekstra, D. eta Pagano, R. E. (1981). "Use of resonance energy transfer to monitor membrane fusion." Biochemistry 20(14): 4093-9.

Stryer, L. (1978). "Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler." Annu Rev Biochem 47: 819-46.

Suarez, T., Gallaher, W. R., Agirre, A., Goni, F. M. eta Nieva, J. L. (2000). "Membrane interface-interacting sequences within the ectodomain of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein: putative role during viral fusion." J Virol 74(17): 8038-47.

Suarez, T., Nir, S., Goni, F. M., Saez-Cirion, A. eta Nieva, J. L. (2000). "The pre-transmembrane region of the human immunodeficiency virus type-1 glycoprotein: a novel fusogenic sequence." FEBS Lett 477(1-2): 145-9.


200

Suhy, D. A., Giddings, T. H., Jr. eta Kirkegaard, K. (2000). "Remodeling the endoplasmic reticulum by poliovirus infection and by individual viral proteins: an autophagy-like origin for virus-induced vesicles." J Virol 74(19): 8953-65.

Takagaki, Y., Radhakrishnan, R., Wirtz, K. W. eta Khorana, H. G. (1983). "The membrane-embedded segment of cytochrome b5 as studied by cross-linking with photoactivatable phospholipids. II. The nontransferable form." J Biol Chem 258(15): 9136-42.

Takeda, M., Pekosz, A., Shuck, K., Pinto, L. H. eta Lamb, R. A. (2002). "Influenza a virus M2 ion channel activity is essential for efficient replication in tissue culture." J Virol 76(3): 1391-9.

Tan, K., Liu, J., Wang, J., Shen, S. eta Lu, M. (1997). "Atomic structure of a thermostable subdomain of HIV-1 gp41." Proc Natl Acad Sci U S A 94(23): 12303-8.

Tanner, M. J. A. "Isolation of integral membrane proteins and criteria for identifying carrier proteins." Curr. Topics Memb. Transp. 12: 1-51.

Terrones, O., Antonsson, B., Yamaguchi, H., Wang, H. G., Liu, J., Lee, R. M., Herrmann, A. eta Basanez, G. (2004). "Lipidic pore formation by the concerted action of proapoptotic BAX and tBID." J Biol Chem 279(29): 30081-91.

Tian, P., Ball, J. M., Zeng, C. Q. eta Estes, M. K. (1996). "The rotavirus nonstructural glycoprotein NSP4 possesses membrane destabilization activity." J Virol 70(10): 6973-81.

Tian, P., Estes, M. K., Hu, Y., Ball, J. M., Zeng, C. Q. eta Schilling, W. P. (1995). "The rotavirus nonstructural glycoprotein NSP4 mobilizes Ca2+ from the endoplasmic reticulum." J Virol 69(9): 5763-72.

Tieleman, D. P., Sansom, M. S. eta Berendsen, H. J. (1999). "Alamethicin helices in a bilayer and in solution: molecular dynamics simulations." Biophys J 76(1 Pt 1): 40-9.

Tilley, S. J. eta Saibil, H. R. (2006). "The mechanism of pore formation by bacterial toxins." Curr Opin Struct Biol 16(2): 230-6.

Trapani, J. A. eta Smyth, M. J. (2002). "Functional significance of the perforin/granzyme cell death pathway." Nat Rev Immunol 2(10): 735-47.

Trkola, A., Purtscher, M., Muster, T., Ballaun, C., Buchacher, A., Sullivan, N., Srinivasan, K., Sodroski, J., Moore, J. P. eta Katinger, H. (1996). "Human monoclonal antibody 2G12 defines a distinctive neutralization epitope on the gp120 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1." J Virol 70(2): 1100-8.

Unger, T., Oren, Z. eta Shai, Y. (2001). "The effect of cyclization of magainin 2 and melittin analogues on structure, function, and model membrane interactions: implication to their mode of action." Biochemistry 40(21): 6388-97.

Van der Goot, F. G., Gonzalez-Manas, J. M., Lakey, J. H. eta Pattus, F. (1991). "A 'molten-globule' membrane-insertion intermediate of the pore-forming domain of colicin A." Nature 354(6352): 408-10.


201

Van der Goot, F. G., Didat, N., Pattus, F., Dowhan, W. eta Letellier, L. (1993). "Role of acidic lipids in the translocation and channel activity of colicins A and N in Escherichia coli cells." Eur J Biochem 213(1): 217-21.

Van Kuppeveld, F. J., Melchers, W. J., Kirkegaard, K. eta Doedens, J. R. (1997). "Structure-function analysis of coxsackie B3 virus protein 2B." Virology 227(1): 111-8.

Van Kuppeveld, F. J., de Jong, A. S., Melchers, W. J. eta Willems, P. H. (2005). "Enterovirus protein 2B po(u)res out the calcium: a viral strategy to survive?" Trends Microbiol 13(2): 41-4.

Van Kuppeveld, F. J., Galama, J. M., Zoll, J., van den Hurk, P. J. eta Melchers, W. J. (1996). "Coxsackie B3 virus protein 2B contains cationic amphipathic helix that is required for viral RNA replication." J Virol 70(6): 3876-86.

Van Kuppeveld, F. J., Hoenderop, J. G., Smeets, R. L., Willems, P. H., Dijkman, H. B., Galama, J. M. eta Melchers, W. J. (1997). "Coxsackievirus protein 2B modifies endoplasmic reticulum membrane and plasma membrane permeability and facilitates virus release." Embo J 16(12): 3519-32.

Van Meer, G. (1989). "Lipid traffic in animal cells." Annu Rev Cell Biol 5: 247-75.

Vaz, W. L. eta Schoellmann, G. (1976). "Specific fluorescent derivatives of macromolecules. A fluorescence study of some specifically modified derivatives of chymotrypsin, trypsin and subtilisin." Biochim Biophys Acta 439(1): 206-18.

Vincent, N., Genin, C. eta Malvoisin, E. (2002). "Identification of a conserved domain of the HIV-1 transmembrane protein gp41 which interacts with cholesteryl groups." Biochim Biophys Acta 1567(1-2): 157-64.

Voet, D. eta Voet, J. G. (1992). En "Bioquímica", Omega, Barcelona. Voskoboinik, I. eta Trapani, J. A. (2006). "Addressing the mysteries of

perforin function." Immunol Cell Biol 84(1): 66-71. Wallace, B. A. (1998). "Recent Advances in the High Resolution

Structures of Bacterial Channels: Gramicidin A." J Struct Biol 121(2): 123-41.

Watanabe, T., Watanabe, S., Ito, H., Kida, H. eta Kawaoka, Y. (2001). "Influenza A virus can undergo multiple cycles of replication without M2 ion channel activity." J Virol 75(12): 5656-62.

Weber, J. N. eta Weiss, R. A. (1988). "HIV infection: the cellular picture." Sci Am 259(4): 100-9.

Weissenhorn, W., Dessen, A., Harrison, S. C., Skehel, J. J. eta Wiley, D. C. (1997). "Atomic structure of the ectodomain from HIV-1 gp41." Nature 387(6631): 426-30.

White, S. H. eta Wimley, W. C. (1998). "Hydrophobic interactions of peptides with membrane interfaces." Biochim Biophys Acta 1376(3): 339-52.

White, S. H. eta Wimley, W. C. (1999). "Membrane protein folding and stability: physical principles." Annu Rev Biophys Biomol Struct 28: 319-65.


202

White, S. H., Wimley, W. C. eta Selsted, M. E. (1995). "Structure, function, and membrane integration of defensins." Curr Opin Struct Biol 5(4): 521-7.

White, S. H., Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S. eta Hristova, K. (2001). "How membranes shape protein structure." J Biol Chem 276(35): 32395-8.

Wiener, M. C. eta White, S. H. (1991). "Fluid bilayer structure determination by the combined use of x-ray and neutron diffraction. II. "Composition-space" refinement method." Biophys J 59(1): 174-85.

Wiener, M. C. eta White, S. H. (1991). "Fluid bilayer structure determination by the combined use of x-ray and neutron diffraction. I. Fluid bilayer models and the limits of resolution." Biophys J 59(1): 162-73.

Wiener, M. C. eta White, S. H. (1992). "Structure of a fluid dioleoylphosphatidylcholine bilayer determined by joint refinement of x-ray and neutron diffraction data. III. Complete structure." Biophys J 61(2): 434-47.

Wilschut, J. (1991). Membrane fusion., New York, Marcel Dekker. Wilson, L., McKinlay, C., Gage, P. eta Ewart, G. (2004). "SARS

coronavirus E protein forms cation-selective ion channels." Virology 330(1): 322-31.

Wimley, W. C. eta White, S. H. (1996). "Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces." Nat Struct Biol 3(10): 842-8.

Wimley, W. C., Creamer, T. P. eta White, S. H. (1996). "Solvation energies of amino acid side chains and backbone in a family of host-guest pentapeptides." Biochemistry 35(16): 5109-24.

Wimmer, E. eta Nomoto, A. (1993). "Molecular biology and cell-free synthesis of poliovirus." Biologicals 21(4): 349-56.

Wu, L., Gerard, N. P., Wyatt, R., Choe, H., Parolin, C., Ruffing, N., Borsetti, A., Cardoso, A. A., Desjardin, E., Newman, W., Gerard, C. eta Sodroski, J. (1996). "CD4-induced interaction of primary HIV-1 gp120 glycoproteins with the chemokine receptor CCR-5." Nature 384(6605): 179-83.

Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J. eta Huang, H. W. (1995). "X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations." Biophys J 68(6): 2361-9.

Xu, J. Y., Gorny, M. K., Palker, T., Karwowska, S. eta Zolla-Pazner, S. (1991). "Epitope mapping of two immunodominant domains of gp41, the transmembrane protein of human immunodeficiency virus type 1, using ten human monoclonal antibodies." J Virol 65(9): 4832-8.

Yang, Z. Y., Duckers, H. J., Sullivan, N. J., Sanchez, A., Nabel, E. G. eta Nabel, G. J. (2000). "Identification of the Ebola virus glycoprotein as the main viral determinant of vascular cell cytotoxicity and injury." Nat Med 6(8): 886-9.


203

Young, R. (1992). "Bacteriophage lysis: mechanism and regulation." Microbiol Rev 56(3): 430-81.

Yuste, E., Reeves, J. D., Doms, R. W. eta Desrosiers, R. C. (2004). "Modulation of Env content in virions of simian immunodeficiency virus: correlation with cell surface expression and virion infectivity." J Virol 78(13): 6775-85.

Zachowski, A. (1993). "Phospholipids in animal eukaryotic membranes: transverse asymmetry and movement." Biochem J 294 (Pt 1): 1-14.

Zelezetsky, I., Pacor, S., Pag, U., Papo, N., Shai, Y., Sahl, H. G. eta Tossi, A. (2005). "Controlled alteration of the shape and conformational stability of alpha-helical cell-lytic peptides: effect on mode of action and cell specificity." Biochem J 390(Pt 1): 177-88.

Zhang, M. Y., Xiao, X., Sidorov, I. A., Choudhry, V., Cham, F., Zhang, P. F., Bouma, P., Zwick, M., Choudhary, A., Montefiori, D. C., Broder, C. C., Burton, D. R., Quinnan, G. V., Jr. eta Dimitrov, D. S. (2004). "Identification and characterization of a new cross-reactive human immunodeficiency virus type 1-neutralizing human monoclonal antibody." J Virol 78(17): 9233-42.

Zhu, P., Chertova, E., Bess, J., Jr., Lifson, J. D., Arthur, L. O., Liu, J., Taylor, K. A. eta Roux, K. H. (2003). "Electron tomography analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian immunodeficiency virus virions." Proc Natl Acad Sci U S A 100(26): 15812-7.

Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Jr., Chertova, E., Lifson, J. D., Grise, H., Ofek, G. A., Taylor, K. A. eta Roux, K. H. (2006). "Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes." Nature 441(7095): 847-52.

Zwick, M. B. (2005). "The membrane-proximal external region of HIV-1 gp41: a vaccine target worth exploring." Aids 19(16): 1725-37.

Zwick, M. B., Wang, M., Poignard, P., Stiegler, G., Katinger, H., Burton, D. R. eta Parren, P. W. (2001). "Neutralization synergy of human immunodeficiency virus type 1 primary isolates by cocktails of broadly neutralizing antibodies." J Virol 75(24): 12198-208.

Zwick, M. B., Bonnycastle, L. L., Menendez, A., Irving, M. B., Barbas, C. F., 3rd, Parren, P. W., Burton, D. R. eta Scott, J. K. (2001). "Identification and characterization of a peptide that specifically binds the human, broadly neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody b12." J Virol 75(14): 6692-9.

Zwick, M. B., Jensen, R., Church, S., Wang, M., Stiegler, G., Kunert, R., Katinger, H. eta Burton, D. R. (2005). "Anti-human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) antibodies 2F5 and 4E10 require surprisingly few crucial residues in the membrane-proximal external region of glycoprotein gp41 to neutralize HIV-1." J Virol 79(2): 1252-61.


204

Zwick, M. B., Komori, H. K., Stanfield, R. L., Church, S., Wang, M.,

Parren, P. W., Kunert, R., Katinger, H., Wilson, I. A. eta Burton, D. R. (2004). "The long third complementarity-determining region of the heavy chain is important in the activity of the broadly neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody 2F5." J Virol 78(6): 3155-61.

Zwick, M. B., Labrijn, A. F., Wang, M., Spenlehauer, C., Saphire, E. O., Binley, J. M., Moore, J. P., Stiegler, G., Katinger, H., Burton, D. R. eta Parren, P. W. (2001). "Broadly neutralizing antibodies targeted to the membrane-proximal external region of human immunodeficiency virus type 1 glycoprotein gp41." J Virol 75(22): 10892-905.


205


206


207

AUTOREAREN ARGITALPENAK ______________________________________________________________________ Sanchez-Martinez, S., Lorizate, M., Hermann, K., Kunert, R., Basanez, G.

eta Nieva, J. L. (2006). "Specific phospholipid recognition by human immunodeficiency virus type-1 neutralizing anti-gp41 2F5 antibody." FEBS Lett 580(9): 2395-99.

Sanchez-Martinez, S., Lorizate, M., Katinger, H., Kunert, R. eta Nieva, J.

L. (2006). "Membrane association and epitope recognition by HIV-1 neutralizing anti-gp41 2F5 and 4E10 antibodies." AIDS Res Hum Retroviruses 22(10): 998-1006.

Lorizate, M., de la Arada, I., Huarte, N., Sanchez-Martinez, S., de la

Torre, B. G., Andreu, D., Arrondo, J. L. eta Nieva, J. L. (2006). "Structural analysis and assembly of the HIV-1 Gp41 amino-terminal fusion peptide and the pretransmembrane amphipathic-at-interface sequence." Biochemistry 45(48): 14337-46.

Madan, V., Sanchez-Martinez, S., Vedovato, N., Rispoli, G., Carrasco, L.,

eta Nieva, J.L. (2007). "Plasma cell membrane-porating domain in non-structural 2B viral protein." (PNAS-ra bidalia)


208

Mintzetan txertaketa bideratzen duten sekuentziak · Mintzetan txertaketa bideratzen duten...

Documents

Transcript of Mintzetan txertaketa bideratzen duten sekuentziak · Mintzetan txertaketa bideratzen duten...