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MICROBIOLOGÍA E

INMUNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BIOLÓGICA

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

2013

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TP N°1 A) MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE (OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA) OBJETIVOS - Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente (laboratorio de T.P.), determinando las diferentes morfologías de colonias que se obtienen. - Poner de manifiesto la necesidad de trabajar en estricta esterilidad en microbiología debido a la gran facilidad con que se puede contaminar el material de trabajo. DESARROLLO DEL PRÁCTICO 1- Exponer placas con agar nutritivo al medio ambiente durante distintos tiempos. 2- Estriar con un hisopo previamente pasado por la mesada de trabajo sobre una placa con agar nutritivo. 3- Incubar las placas a temperatura ambiente hasta la clase siguiente. 4- Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes características: .Forma: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa. .Tamaño: grande (más de 3 mm), mediana (2-3 mm), pequeña (1-2 mm) .Color .Borde: entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado .Elevación: plano, elevado, convexo, pulvinado, umbonado .Superficie: suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta

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B) EVALUACIÓN DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA EN UNA MUESTRA NATURAL Columna de Winogradsky Introducción A diferencia de los estudios realizados por Luis Pasteur y Roberto Koch sobre cultivos puros, dos famosos microbiólogos: Sergei N. Winogradsky (1856-1953) y Martinus Willem Beijerinck (1851-1931), fueron los primeros en estudiar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos que conviven en un mismo habitat y cuyas poblaciones se mezclan. Una demostración simple de laboratorio - la columna de Winogradsky- ilustra cómo diferentes microorganismos interactúan entre sí, de forma tal que la actividad metabólica de un microorganismo posibilita el crecimiento de otros y viceversa. Estas columnas, que llevan el nombre del microbiólogo ruso que las utilizó por primera vez, son sistemas completos autoreciclables, puestos en marcha solamente por energía lumínica. Inicialmente, todos los microorganismos están presentes en muy baja proporción, pero cuando la columna se incuba por 2 o 3 meses, los distintos tipos de microorganismos proliferan y ocupan distintas zonas en donde las condiciones ambientales favorecen sus actividades específicas. La columna de Winogradsky es una demostración clásica de cómo los microorganismos ocupan micrositios altamente específicos de acuerdo a sus tolerancias ambientales y sus requerimientos de carbono y energía. Además, la columna permite ver cómo los elementos minerales son reciclados tal como ocurre en los ambientes naturales. En este trabajo práctico, se enfoca principalmente la utilización del azufre por los distintos microorganismos, pero realizando pequeñas modificaciones se pueden estudiar ciclos equivalentes para el nitrógeno, carbono y otros elementos. OBJETIVOS Los alumnos deberán: 1- Armar una columna de Winogradsky. 2- Observar y describir la sucesión temporal de microorganismos en la columna. Material de laboratorio • Muestra de barro de un arroyo, lago, pantano o costa de mar o río (aproximadamente

100–150 gr de sedimento superficial o subsuperficial). • Recipiente alto de paredes trasparentes y rectas (botellas plásticas o probetas de vidrio. • Tapón de goma o cobertura plástica. • Pipetas de vidrio, portaobjetos, cubreobjetos, cajas de Petri. • Medios de cultivo de enriquecimiento, selectivos y diferenciales, colorantes, reactivos

para realizar pruebas bioquímicas. • Papel de filtro o en su defecto papel de diario finamente cortado. • 6 gr de cada una de las siguientes sales: CaCO3 , CaSO4 , CaHPO4. Procedimiento 1- Colectar una cantidad de tierra o barro para llenar el recipiente hasta una altura

aproximada de 10 cm. Remover las piedras, ramas o partículas grandes del material en estudio. Mezclarlo con las sales y el papel finamente cortado.

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2- Colocar la mezcla en un recipiente adecuado (en nuestro caso una probeta de vidrio de 500 ml) y añadir suficiente agua destilada hasta aproximadamente 3 – 5 cm del borde. Revolver la mezcla para eliminar burbujas de aire.

3- Marcar el nivel de agua y cubrir la boca de la probeta con una envoltura plástica para reducir la evaporación. Puede ser necesario reponer agua para mantener el nivel original.

4- Incubar a temperatura ambiente cerca de una ventana para que reciba una adecuada cantidad de luz, pero no excesiva.

5- Observar la columna semanalmente, anotando cualquier cambio de aspecto (color, crecimiento microbiano, etc.). Guía para la interpretación de la columna de Winogradsky Una columna ideal de Winogradsky se podría representar con el siguiente esquema:

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Apéndice Medios de enriquecimiento y condiciones de cultivo para aislar las especies representativas de uno o más grupos fotosintéticos.

Organismos a ser enriquecidos

Fuente de C orgánica

Sales inorgánicas

Atmósfera pH

Bacterias verde azuladas

ninguna ninguna aerobia o aerobia + 5%CO2

6,0 - 8,0

Bacterias verdes del azufre

ninguna NH4Cl: 1,0 Na2S.9H2O: 2,0

NaHCO3: 5,0

ninguna 7,5

Bacterias púrpuras del

azufre

ninguna NH4Cl: 1,0 Na2S.9H2O: 1,0

NaHCO3: 5,0

ninguna 8,0 - 8,5

Bacterias púrpuras

malato de sodio: 5,0

extracto de levadura: 0,5

NH4Cl: 1,0 ninguna 7,0 - 7,5

El medio basal contiene: MgSO4.7H2O................................... 0,2 K2HPO4........................................... 1,0 FeSO4.7H2O.................................... 0,01 CaCl2................................................ 0,02 MnCl2.4H2O.................................... 0,002 NaMoO4.2H2O................................ 0,001 NaCl................................................. 0,5 La concentración de los componentes de los medios se expresa en gr/l. Medio ambiente: iluminación constante y 25 - 30 °C. Las técnicas de coloración y las pruebas bioquímicas están detalladas en las guías correspondientes a esos temas. Bibliografia Brock, T. D., Madigan, M. T. Microbiología. Sexta edición. Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 1993. Seeley, H. W. Jr., VanDemark, P. J., Lee, J. J.: Microbes in action. A Laboratory Manual of Microbiology. W. H. Freeman and Company New York. Fourth Edition. 1991. Tortora, G. J., Funke, B. R., Case, C. L.: Introducción a la Microbiología. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. 1993. Vullo, D., Wachsman, M., Alche, L. Microbiología en Práctica. Manual de técnicas de laboratorio para la enseñanza de Microbiología básica y aplicada. Primera edición Editorial Atlante S.R.L., Buenos Aires, 2000.

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C) TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS BÁSICAS OBJETIVOS - Adquirir experiencia en el manejo de los materiales y técnicas básicas que se utilizarán a lo largo del curso de trabajos prácticos. - Reforzar los conocimientos previos sobre el trabajo de laboratorio en condiciones de esterilidad. Coordinar la operativa de trabajo en el laboratorio y las normas de seguridad. DESARROLLO DEL PRÁCTICO - En todos los prácticos que se realicen en condiciones de esterilidad se debe, en primer lugar, limpiar el área de trabajo de la mesada con alguna sustancia desinfectante y encender el mechero. - Preparar placas de Petri con agar nutritivo fundido y mantenido a 45 °C. - Esperar que el medio solidifique y luego secar las placas invertidas en estufa a 37 °C. -Preparar y rotular tubos de hemólisis para realizar diluciones seriadas al décimo desde 10-1 hasta 10-3. - Colocar en cada tubo 1,8 ml de solución fisiológica estéril siguiendo las instrucciones del docente en cuanto al trabajo en esterilidad. - Agregar al tubo rotulado 10-1 0,2 ml de una solución estéril. Descartar la pipeta. Homogeneizar en agitador. Con una nueva pipeta tomar 0,3 ml del tubo anterior y descargar 0,2 ml de esta dilución (10-1) en el tubo rotulado 10-2. Continuar haciendo las diluciones hasta 10-3. - A partir de la dilución 10-3 sembrar: a) con ansa por estriado sobre agar nutritivo b) con pipeta (0,1 ml) y posterior rastrillado sobre agar nutritivo - Incubar las placas INVERTIDAS en cuarto estufa a 37ºC hasta la clase siguiente.

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Procedimiento para preparar una placa por volcado (aislamiento en profundidad). A) Fundir el medio contenido en un tubo y luego enfriarlo hasta que se lo pueda tomar con la mano sin quemarse. B) Flamear el ansa C) y D) Transferir microorganismos al medio con el ansa. E) Agitar rotando el tubo entre las manos para que se homogeinice bien. F) Volcar en una placa de Petri estéril. G) Agitar con un movimiento rotatorio hasta asegurar una buena distribución. H) Incubar boca abajo. Un método alternativo muy usado es volcar en la placa vacía una suspensión bacteriana y luego con el medio fundido y enfriado según A) volcarlo y efectuar los pasos G) y H).

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Procedimiento para obtener colonias aisladas estriando en placa:

A) Flamear el ansa B) Obtener un inóculo con ella (en forma estéril) C) Estriar con el ansa en medio estéril contenido en una placa de Petri siguiendo uno de los modelos mostrados en D.

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Siembra en agar inclinado (pico de flauta) por estría.

A) Flamear el ansa B) Obtener material a sembrar C) Apoyar el ansa sobre la superficie del agar y estriar con el diseño mostrado en D)

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Inoculación por punción A) Flamear un ansa recta B) Sumergirla una vez fría, en una suspensión bacteriana C) Punzar cuidadosamente en el centro del tubo hasta el fondo y retirar el ansa cuidadosamente tratando de recorrer el mismo camino que para la inoculación. D) Flamear el ansa E) Incubar el tubo

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TP N°2°2°2°2 MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN OBJETIVO Adquirir experiencia en el manejo de equipos de esterilización y aplicar métodos de desinfección y esterilización empleando distintos agentes físicos o químicos. Agentes físicos Calor húmedo (autoclave) El alumno se familiarizará con el uso del autoclave que incluye: 1- Preparación del material a autoclavar. 2- Carga del autoclave con el material a esterilizar o decontaminar. 3- Cierre del autoclave y encendido. 4- Eliminación del aire contenido en su interior (hasta emisión de chorro continuo de vapor por la espita o válvula de descarga). 5- Cierre de la válvula de descarga y control hasta llegar a la presión de esterilización deseada. 6- Control del tiempo de esterilización requerido. 7- Apagado del autoclave. 8- Apertura de la válvula para igualar presiones. 9- Retirado y secado del material autoclavado. Se esterilizarán distintos materiales de vidrio y otros que resistan la temperatura, como así también soluciones y medios de cultivo. También se decontaminará material que contenga cultivos bacterianos (en especial cultivos de microorganismos que forman esporas). Se harán controles de esterilidad después del autoclavado para verificar que el proceso fue eficiente. Calor seco (horno) 1- Preparación del material a hornear. 2- Carga del horno. 3- Control hasta llegar a la temperatura de esterilización. 4- Control del tiempo de esterilización. 5- Apagado, enfriado y apertura del horno. Se esterilizarán materiales que no puedan ser autoclavados y/o que resistan altas temperaturas. Incineración por llama El alumno adquirirá práctica en el flameado de la boca de botellas, frascos y tubos y en la esterilización y decontaminación del ansa que se emplea para transferir cultivos bacterianos. Radiación ultravioleta Se empleará la radiación ultravioleta como agente desinfectante o esterilizante. Se pondrán debajo de la luz U.V. objetos que no puedan autoclavarse ni hornearse ( Ej: tapas plásticas, membranas filtrantes, etc.). Filtración

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Se procederá a esterilizar líquidos que contienen componentes sensibles al calor como proteínas, vitaminas, antibióticos y soluciones salinas definidas. Se emplearán filtros de celulosa utilizando vacío o presión positiva. Agentes químicos Se emplearán distintos agentes germicidas y desinfectantes (soluciones de hipoclorito de sodio, cloroxilenol, formaldehído, etc.) para desinfectar superficies. Se analizará la reducción de la cantidad de microorganismos presentes en una mesada de trabajo, pasando un hisopo con el que se sembrarán placas conteniendo agar nutritivo, antes y después de haber sido tratada con el desinfectante en cuestión. Bibliografía: Seeley, H.W.Jr.; Vandermark, P.J., Lee, J.J., ¨Microbes in action. A laboratory manual of microbiology¨. Editores W. H. Freeman and Company, Cuarta Edición, Capítulo 5, 1991. Tortora G.J., Funke B.R., Case C.L. Introducción a la Microbiología. Editorial Acribia SA, Zaragoza España, 1993. Vullo D.L., Wachsman M.B., Alché L.E. Microbiología en Práctica. Editorial Atlante S.R.L. Buenos Aires, 2000.

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TP N°°°°3333 A) AISLAMIENTO DE DISTINTAS ESPECIES BACTERIANAS Para aislar un microorganismo de la naturaleza, se debe conocer previamente los requerimientos nutricionales y las condiciones ambientales óptimas para su crecimiento. Los alumnos deberán buscar en la bibliografía, las características metabólicas y el hábitat de los microorganismos que se van a utilizar. OBJETIVO: Aislamiento y posterior identificación de especies bacterianas a partir de distintas muestras. METODOLOGÍA: Para el aislamiento de las distintas especies se va a seguir el siguiente esquema: - Inocular la muestra en un caldo de enriquecimiento (que puede o no ser selectivo al mismo tiempo), para favorecer el crecimiento del microorganismo de interés. - Incubar a temperatura y tiempo adecuados. - Tomar una muestra del caldo ya crecido y estriar con un ansa en un medio sólido que sea selectivo, para inhibir la flora acompañante del microorganismo que quiero aislar, y obtener colonias del mismo. Este medio puede a la vez ser diferencial (se diferencian cepas o especies bacterianas en base a alguna característica de las colonias). - Incubar a temperatura y tiempo adecuados. - Observar crecimiento de colonias aisladas. Luego del aislamiento se hará un repique de alguna de las colonias obtenidas a un agar nutritivo para hacer una coloración de Gram. Posteriormente se identificarán los microorganismos en base a las pruebas bioquímicas y a las otras técnicas de coloración. Aislamiento de Enterobacterias 1- Tomar 1ml de muestra de agua y sembrar en caldo Mac Conkey 1X en tubos con campanita de Durham. 2- Incubar durante 48 hs. a 37°C. 3-Observar crecimiento (la formación de gas y viraje del indicador Azul de Bromocresol a amarillo indica probable presencia de E. coli). 4- Tomar una muestra con el ansa y estriar sobre placas con agar EMB. 5- Incubar durante 24 hs. a 37 °C. 6- Observar colonias con distinta morfología y color. Aislamiento de Pseudomonas sp. 1- Sembrar 1 ml. de agua en caldo M9. 2- Incubar 48 hs. a 37 °C. 3- Si se observa crecimiento, tomar una muestra con el ansa y estriar sobre una placa con agar Cetrimida. 4-Incubar 48 hs a 42°C. 5- Observar crecimiento de colonias con pigmento verde

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Aislamiento de Bacillus sp. 1- Agregar 10 g. de arroz (una cucharada) a 30 ml de solución fisiológica estéril. 2- Agitar durante 15 minutos. 3- Calentar a 80 °C durante 5 minutos. 4- Tomar 1 ml. del sobrenadante y pasarlo a un tubo con caldo nutritivo. 5- Incubar 48 hs. a 37 °C. 6- Estriar en agar Mossel (selectivo y diferencial) 7- Incubar 48 hs. a 37 °C 8- Observar el crecimiento de colonias con un halo rosa y precipitado de lecitina (B. cereus,

manitol -, lecitinasa +) y colonias con halo amarillo sin precipitado (B. subtilis, manitol +, lecitinasa -). Aislamiento de Lactobacillus sp 1- Realizar diluciones de yogur en solución fisiológica y sembrar 0,1 ml de cada dilución en agar MRS 2-Incubar 48 horas a 37 °C en anaerobiosis. 3- Calcular el recuento de bacterias lácticas del yogur y observar los distintos fenotipos de colonia crecidos en el agar MRS. 4- Seleccionar 2 fenotipos de colonias diferentes y a partir de ellas sembrar por estría con ansa en agar Rogosa. 5- Incubar en condiciones de anaerobiosis a 37 °C. Aislamiento de Streptomyces 1) Preparar 3 placas de Petri con AS. Dejar solidificar y secar bien en estufa a 37 ºC. 2) Mezclar 1 gr. de tierra en 100 ml de agua destilada en un frasco estéril (un frasco por cada

4 alumnos). Agitar vigorosamente durante 5 min.. Tomar 0,2 ml de dicha suspensión y diluirla en 1,8 ml de solución fisiológica estéril en un tubo de hemólisis. Homogeneizar en agitador de tubos. Repetir la dilución

3) Sembrar 0,2 ml con rastrillo de cada dilución en placas de Petri con un inóculo proveniente de la suspensión original y con otros dos inóculos proveniente de la suspensión diluida.

4) Incubar a temperatura ambiente durante 5 días. Bibliografía Brock, T.D.; Smith, D.W. & Madigan, M.T. ¨Microbiologia¨ Prentice Hall Hispanoamericana S.A., Sexta Edición, 1993 B) IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DE LOS MICROORGANISMOS. i. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA 1-Preparación de extendidos y coloración por el método de Gram. a-Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos. b-Preparar extendidos de los microorganismos indicados por el docente.

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Tomar material de la colonia elegida, con un ansa previamente esterilizada a la llama y suspender este material en una gota de agua colocada en la mitad del portaobjetos. Extender el material sobre toda la superficie del portaobjeto. c-Dejar secar al aire junto a la llama del mechero. d-Fijar con calor pasando el preparado por sobre la llama SIN QUEMARLO. e-Cubrir el extendido con una solución del colorante cristal violeta. Dejar en contacto 60 segundos. f-Volcar el colorante. Cubrir con solución de lugol. Dejar en contacto durante 60 segundos. g-Decolorar con alcohol-acetona (exhaustivamente). Lavar con agua. h-Cubrir con safranina (colorante de contraste). Dejar en contacto 20 segundos. Lavar con agua. i-Secar j-Observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión. Se deberán reconocer las características morfológicas y tintoriales de las distintas bacterias. El alumno deberá informar el agrupamiento, forma, coloración, pudiendo utilizar como guía para dicha descripción la siguiente clasificación: Forma: esférica (COCOS) alargada (BACILOS) bacilos cortos (COCOBACILOS) Agrupamiento: aislado(individual) diplos tetradas cadenas racimos en empalizada Comparar con las cepas patrones: Escherichia coli Klebsiella oxytoca Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Micrococcus luteus

2-Coloración de esporas. 1-Prepare un extendido del microorganismo. 2-Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solución de verde de Malaquita. 3-Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.) 4-Lavar con agua y cubrir con solución de Safranina. Dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersión. 5-Informar: morfología, color y tipo de espora. Comparar con las cepas patrones: Bacillus subtilis Bacillus cereus Bacillus sphaericus

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Solución de Verde de Malaquita: Verde de Malaquita al 5 % en agua destilada. Solución de Safranina: Safranina 0.5 g en agua destilada. ACLARACIÓN: Los tiempos que aparecen en los protocolos de las tinciones en la guía de T.P. son los que figuran en los kits comerciales. Si se utilizan los colorantes en otra concentración, puede ser que dichos tiempos se modifiquen. BIBLIOGRAFÍA Brock, T.D.; Smith, D.W. & Madigan, M.T. ¨Microbiologia¨, Prentice Hall Hispanoamericana S.A., Sexta Edición, 1993 ii. PRUEBAS BIOQUIMICAS Se trata de un conjunto de reacciones basadas en el metabolismo de los microorganismos. Entre otros aspectos, se analiza la acción de la bacteria sobre los hidratos de carbono (qué fuente de carbono utiliza, en qué condiciones, cómo la utiliza, qué productos se obtienen), la liberación de exoenzimas, metabolitos y toxinas al medio de cultivo, la motilidad, etc. A partir del conocimiento del metabolismo, las pruebas bioquímicas nos permiten determinar el género y la especie de la bacteria en estudio. Esta identificación debe hacerse a partir de un cultivo puro y fresco (18-24 horas). Hay que tener en cuenta, además, que las características metabólicas de los microorganismos pueden variar en función de distintos factores de manera que para realizar una caracterización confiable es necesario realizar las pruebas en condiciones estandarizadas (en cuanto al inóculo, los reactivos, las condiciones de incubación y el tiempo de lectura) y utilizar más de una prueba en cada caso. La elección de las mismas se hará en base a la familia en estudio, lo cual se irá determinando en el curso del aislamiento. Las pruebas más comunmente utilizadas son: 1) Prueba de oxidasa Esta prueba sirve para la determinación de la presencia de la enzima citocromo oxidasa en preparaciones de microorganismos. Permite diferenciar enterobacterias, distintas especies de Streptococcus, Staphylococcus y Micrococcus (-) de algunas especies de Pseudomonas u Aeromonas (+). Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tiras de papel de filtro impregnadas en reactivo de Kovacs (1 naftol + dimetilparafenilendiamina). - ansa. - Procedimiento: 1.- Levantar con el ansa una colonia del cultivo puro.

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2.- Aplicar dicha colonia sobre la tira de papel de filtro embebida con el reactivo de Kovacs, asegurándose de extender bien el material. 3.- Esperar 5-10 segundos y observar la coloración. Interpretación de resultados: * Prueba positiva: la tira de papel de filtro embebida en reactivo de Kovacs vira al color azul por oxidación de dicho compuesto a azul de indofenol. * Prueba negativa: el color de la tira de papel de filtro embebida en reactivo de Kovacs no se modifica. 2) Prueba de catalasa Esta prueba sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en preparaciones de microorganismos. Permite diferenciar: A) géneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+); Bacillus (+) de Clostridium (-) y Corynebacterium (+) de Erysipelothrix (-), siendo excepciones en este último caso, Corynebacterium pyogenes (-) y Corynebacterium haemolyticum (-). B) especies: Moraxella bovis (variable) y Moraxella kingii (-) de otras especies de Moraxella

(+). Materiales: - Cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - ansa. - portaobjetos limpios. - agua estéril. - agua oxigenada fresca. Procedimiento: 1.- Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio. 2.- Colocar dos ansadas del cultivo a probar sobre la gota de agua y hacer una suspensión espesa (no dejar secar). 3.- Agregar 2 o 3 gotas de agua oxigenada fresca. 4.- Observar los resultados. 3) Prueba del agar hierro de Kligler Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono específico incorporado a un medio de crecimiento básico así como la de producir gas y ácido sulfhídrico. Se utiliza para identificar diferentes especies bacterianas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos en pico de flauta con agar hierro de Kligler, pH=7,4. - ansa. Procedimineto:

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1.- Inocular cada uno de los microorganismos aislados por punción y por estría en el mismo tubo de medio agar hierro de Kligler. 2.- Incubar a 37 oC durante 18-24 horas. 3.- Observar entre las 18 horas y las 24 horas de cultivo (ni antes ni después). Interpretación de resultados: La utilización de un hidrato de carbono implica la liberación al medio de productos ácidos capaces de ser detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo es incapaz de utilizar el hidrato de carbono, consume las peptonas del medio liberando productos que alcalinizan el medio. Cuando se interpretan los resultados de esta prueba deben analizarse los siguientes aspectos: A) Utilización del hidrato de carbono: * Si el microrganismo en estudio sólo fermenta la glucosa: a) en superficie: reacción alcalina, color rojo. b) en profundidad: reacción ácida, color amarillo. * Si el microorganismo en estudio es capaz de fermentar tanto la glucosa como la lactosa: a) en superficie: reacción ácida, color amarillo. b) en profundidad: reacción ácida, color amarillo. * Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa ni la lactosa (no entérico): a) en superficie: reacción alcalina, color rojo. b) en profundidad: si el microorganismo es aerobio no se observa crecimiento ni cambio de color; si el microorganismo es facultativo, reacción alcalina, color rojo. * Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa pero si de oxidarla: a) en superficie: reacción ácida a tiempos cortos y luego alcalina, color rojo. b) en profundidad: no se observa crecimiento ni cambio de color. B) Producción de gas: * Si el microorganismo en estudio es aerogénico, la producción de H2 y CO2 se manifiesta mediante la formación de una o varias burbujas o el desprendimiento del medio del fondo del tubo dejando un área clara. * Si el microorganismo en estudio es anaerogénico, no hay producción de gases. C) Producción de ácido sulfhídrico (SH2): * Si el microorganismo en estudio produce este ácido, se manifestará por la presencia de un precipitado negro de sulfuro de hierro en la parte profunda del tubo. * Si el microorganismo en estudio no produce este ácido, se manifestará por la ausencia de dicho precipitado. 4) Prueba de extracción de pigmento con cloroformo Esta prueba bioquímica permite investigar los pigmentos producido por cepas de Pseudomonas. Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos con caldo nutritivo. - ansa. - cloroformo Procedimiento: 1.- Sembrar el microorganismo en estudio en caldo nutritivo. 2.- Incubar a 37 oC.

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3.- Agregar 1 ml de cloroformo al contenido del tubo y agitar. 4.- Observar los resultados. Interpretación de resultados: * Prueba positiva: la fase clorofórmica toma color azul verdoso por extracción de piocianina. * Prueba negativa: la fase clorofórmica permanece amarilla (no se extrajo pigmento). 5) IMViC Son cuatro pruebas que se utilizan para distinguir bacterias coliformes entre si. Las pruebas son: Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato. Investigación de la producción de Indol. Con esta prueba bioquímica se mide la capacidad del microorganismo de producir indol a partir de la molécula de triptofano. Sirve para diferenciar Escherichia coli y distintas especies del género Edwarsiella (+) de especies de los géneros Salmonella, Klebsiella y Enterobacter (-). Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos con caldo triptona. - ansa. - reactivo de Kovacs: alcohol amílico + paradimetilbenzal- dehído en medio ácido. Procedimiento: 1.- Inocular tubos conteniendo caldo triptona. Dejar un tubo sin inocular como control. 2.- Incubar a 37 oC durante 48 horas. 3.- Determinar la presencia de indol utilizando el reactivo de Kovacs. Para ello, colocar en un tubo de ensayo 1 ml de medio, agregar 0,1 ml de reactivo y dejar reposar hasta la formación de un anillo. 6.- Observar coloración. Interpretación de los resultados * Prueba positiva: un anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohólica (corresponde a la formación de un compuesto quinónico coloreado derivado del indol). * Prueba negativa: anillo amarillo en la superficie del medio en la capa alcohólica (ausencia de indol en medio de cultivo). Investigación de la producción de acetil metil carbinol (Voges Proskahuer) y ácidos (rojo de metilo). Con estas dos pruebas se estudia qué tipo de fermentación (butilenglicólica o ácido mixta) realiza el microorganismo en estudio. La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, el acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la fermentación (butilenglicólica) de la glucosa. Esta prueba permite diferenciar Klebsiella pneumoniae y Enterobacter (+) de Escherichia coli y otras especies de Klebsiella (-). La prueba del rojo de metilo sirve para comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación (ácido mixta) de la

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glucosa. Esta prueba permite diferenciar Escherichia coli (+) de distintas especies pertenecientes a los géneros Enterobacter y Klebsiella (-). Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos con caldo glucosa fosfato. - ansa. - reactivos para la determinación de acetil-metil-carbinol (solución alcohólica de naftol al 5% y KOH al 40%). - reactivos para la determinación de ácido (solución de rojo de metilo 0,1%). Procedimiento: 1.- Inocular tubos conteniendo caldo glucosa fosfato. Dejar un tubo sin inocular como control. 2.- Incubar a 37oC durante 48 horas. 3.- Dividir el contenido de cada uno de los tubos en dos partes iguales. En una mitad, investigar la presencia de acetil-metil-carbinol y en la otra la presencia de ácidos. - Para determinar acetil-metil-Carbinol: a) Agregar 0.6 ml de solución alcohólica de naftol al 5%. b) Agregar 0,2 ml de solución de KOH al 40%. c) Agitar y dejar en reposo 5-10 minutos. d) Observar la coloración resultado. - Para determinar ácidos: a) Agregar al cultivo 10 gotas de solución de rojo de metilo 0,1%. b) Observar la coloración. Interpretación de resultados: Voges-Proskauer * Prueba positiva: color rojo rosado en la superficie del medio (presencia de acetoína). * Prueba negativa: sin cambio de color (color amarillo) en la superficie del medio. Rojo de Metilo * Prueba positiva: el cultivo es lo suficientemente ácido como para permitir que el reactivo rojo de metilo mantenga un color rojo definido (pH= 4,4) en la superficie del medio. * Prueba negativa: color amarillo (pH= 6) en la superficie del medio. Investigación del aprovechamiento de citrato Se usa para determinar la capacidad del microorganismo para utilizar citrato como única fuente de carbono. Permite diferenciar especies de Salmonella, Klebsiella y Enterobacter (+) de Escherichia coli y especies de Edwarsiella, Yersinia, Actinobacillus (-). Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos con caldo citrato de Koser. - ansa. - Procedimiento: 1.- Inocular tubos conteniendo caldo citrato de Koser. Dejar un tubo sin inocular como control.

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2.- Incubar a 37oC durante 48 horas. 3.- Observar la presencia o ausencia de crecimiento. Interpretación del resultado: * Prueba positiva: hay crecimiento (turbidez). * Prueba negativa: ausencia de crecimiento. Bibliografia Mac Faddin, J. F., Pruebas Bioquímicas para la identificacióm de bacterias. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina, 1980.

SISTEMAS MULTIPRUEBAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

SISTEMA API 20E PARA ENTEROBACTERIAS Descripción general: Es un sistema miniaturizado de las pruebas convencionales que se emplean para la identificación de enterobacterias y otras bacterias Gram negativas. Se trata de microtubos con sustratos deshidratados a los que se les agrega una suspensión bacteriana y se incuban durante 18 a 24 hs. a 37 ºC. En cada microtubo se halla incorporado un sistema indicador. Al cabo del tiempo de incubación ese sistema es afectado por metabolitos de la bacteria o por reactivos agregados. Se registran los resultados obtenidos en cada microtubo y en base a ellos se identifica la bacteria en cuestión. Instrucciones para el uso del sistema: a)- Agregar 5 ml. de agua en la base de la caja antes de sacar la tira. Esto sirve para mantener una atmósfera húmeda durante la incubación. b)- Picar con el ansa una colonia y resuspender en un tubo con solución fisiológica estéril. Agitar con vortex. c)- Ubicar la tira en la bandeja con agua. d)- Sembrar muy suavemente la suspensión bacteriana con pipeta Pasteur. Para ello se debe tener en cuenta lo siguiente: cada microtubo está compuesto por un tubo y una cúpula y la cantidad de inóculo a agregar a cada uno depende del tipo de prueba. Para el llenado se inclina la bandeja y se apoya la punta de la pipeta contra un costado de la cúpula. Cada uno de los 20 microtubos se llenan hasta el volumen del tubo. Los microtubos correspondientes a las pruebas CIT, VP y GEL se llenan completamente (tubo + cúpula). Aquellos correspondientes a las pruebas cuyos nombres están subrayados se llenan hasta el volumen del tubo y luego se completa el volumen de la cúpula con aceite mineral. e)- Incubar entre 18 y 24 hs. a 37 ºC. f)- Luego de la incubación, se anotan los resultados obtenidos en todas las pruebas que no requieran el agregado de reactivos. Si el microtubo de glucosa es negativo (azul o verde), se debe contar el total de ensayos positivos. Pueden entonces presentarse las siguientes alternativas: 1)- Si dicho número es menor o igual a 2, se reincuba 18-24 hs. a 37 ºC. 2)- Si el número es mayor que 2 se agregan los reactivos a las pruebas que correspondan, se realiza la prueba de oxidasa (ver más adelante) y se anotan todos los resultados obtenidos. Si el ensayo de glucosa es positivo (amarillo) al cabo de las primeras 18-24 hs. de incubación, se procede de la misma forma que en el caso de la alternativa 2) del párrafo anterior.

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g)- Identificación de la bacteria por comparación de los resultados obtenidos con una tabla. Características de las pruebas e interpretación de resultados. ONPG: determina la actividad de la enzima β-galactosidasa. β-galactosidasa ONPG---------------------------------------------ortonitrofenol (Orto-nitrofenil- (amarillo) β-D-galactopiranósido) Reacción positiva: amarillo. Reacción negativa: incoloro. ADH: determina actividad de la enzima arginina dehidrolasa. ADH arginina---------------------------ornitina + NH4 + CO2

El amonio produce un cambio en el pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo. Reacción positiva: rojo. Reacción negativa: amarillo. LDC: determina actividad de la enzima lisina decarboxilasa. LDC lisina------------------------------cadaverina (amina) La amina produce un cambio de pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo. Reacción positiva: rojo. Reacción negativa: amarillo. ODC: determina actividad de la enzima ornitina decarboxilasa. ODC ornitina---------------------------putrescina (amina) La amina produce un cambio de pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo. Reacción positiva: rojo. Reacción negativa: amarillo. CIT: determina la capacidad de la bacteria de usar el citrato como única fuente de carbono. El consumo del citrato produce un aumento de pH y un viraje del indicador de verde a azul. Reacción positiva: azul. Reacción negativa: verde. H2S: determina la capacidad de la bacteria de reducir el tiosulfato a H2S para reducir la tensión de oxígeno.

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El H2S se combina con sales de hierro y forma un precipitado negro. Reacción positiva: precipitado negro. Reacción negativa: ausencia de precipitado. URE: determina la actividad de la enzima ureasa. ureasa urea---------------------------NH4 El amonio produce un cambio de pH y un viraje del indicador de amarillo a rojo si se observa entre las 18 hs. y las 24 hs., o de naranja a rojo si se observa entre las 36 y 48 hs. Reacción positiva: rojo o naranja. Reacción negativa: amarillo. TDA: determina la actividad de la enzima triptofano deaminasa. TDA triptofano-----------------------indolpirúvico + NH4 Al final de la incubación se agrega una gota de cloruro férrico al 10%. El ácido indolpirúvico produce un color rojo-amarronado en presencia del mismo. Reacción positiva: rojo-amarronado. Reacción negativa: amarillo. IND: determina la capacidad de la bacteria de metabolizar el triptofano. triptofanasa triptofano------------------------indol Al final de la incubación se agrega una gota del reactivo de Kovacs. La reacción debe ser leída dentro de los dos minutos de agregado el mismo. El indol se combina con el p-dimetilamino benzaldehído presente en el reactivo y se forma una quinona de color rojo violáceo. Reacción positiva: color rojo. Reacción negativa: amarillo. VP: Determina la presencia de acetoína como intermediario en el metabolismo de la glucosa. Al final de la incubación se agrega una gota de KOH al 40% y luego una gota de alfa-naftol. Se esperan 10 minutos antes de observar el resultado. Reacción positiva: rojo Reacción negativa: incoloro Reducción de nitratos: Esta prueba permite determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrógeno libre.

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Sirve para identificar miembros de la familia Enterobacteriaceae (por lo general +) y diferenciar: 1.- Haemophilus ducreyi (-) y Haemophilus vaginalis (-) de otras especies de Haemophilus (+). 2.- Branhanella catarrhalis (+) y Neisseria mucosa (+) de otras especies de Neisseria(-) La prueba se lleva a cabo en el mismo microtubo que la de glucosa. Además de anotar el resultado de dicha prueba, se observa si hay burbujas, lo cual indica que se redujeron los nitratos a nitrógeno gaseoso. Se agregan dos gotas de ácido sulfanílico al 0.8% y dos gotas de N,N- dimetil-α naftilamina. Se espran de 2-3 minutos. Si hay nitritos en el medio, los mismos forman un complejo de color rojo con los reactivos. Los resultados negativos se confirman agregando zinc al microtubo. Los nitratos son reducidos por el zinc dando un color rosa anaranjado. Si no hay un cambio de color, es porque los nitratos fueron reducidos primeramente a nitritos y posteriormente a N2 o a alguna amina aerogénica. GEL: Esta prueba sirve para determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas) que licuan la gelatina. Permite diferenciar especies: Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (lento y +) y especies de Micrococcus (variables y lentas); Listeria monocytogenes (-) de Corynebacterium ulcerans (+), Corynebacterium haemolyticum (+) y Corynebacterium pyogenes (variable). También ayuda a identificar: Serratia liquefaciens (+), Serratia marcescens (+), Pseudomona aeruginosa (+, rápida) y especies de Flavobacterium (+). Reacción positiva: difusión del pigmento negro Reacción negativa: no hay difusión. GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA: Determinan la capacidad de un organismo anaeróbico de fermentar el carbohidrato o la de un organismo aeróbico de oxidarlo. GLU: glucosa, MAN: manitol, INO: inositol, SOR: sorbitol, RHA: ramnosa, SAC: sacarosa, MEL: melibiosa, AMY: amigdalina, ARA: arabinosa. Como consecuencia de la utilización del carbohidrato, se forman productos ácidos. El descenso de pH produce un viraje del indicador de azul a amarillo. MAN; INO; SOR: determina la actividad de la enzima catalasa. 2 H2O2 2 H2O + O2 (gas) La reacción se lleva a cabo en los mismos microtubos utilizados para MAN; INO y SOR. Después de leer los resultados de dichas reacciones, se agrega una gota de H2O2 al 1.5% a cada tubo. Se espera de 1-2 minutos y se observa si hay formación de burbujas. Reacción positiva: formación de burbujas Reacción negativa: no se forman burbujas Prueba de oxidasa: Se embebe un papel de filtro con una suspensión bacteriana similar a la utilizada para inocular los microtubos. Se agrega una gota de clorhidrato de tetrametil-p-fenildiamina al 1%. Si la reacción es positiva, el área del papel que contiene la suspensión de

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bacterias toma un color púrpura dentro de los 30 segundos. Si la reacción es negativa no se registra ningún cambio de color. iii. CARACTERIZACION DE LAS CEPAS POR RASTREO DE ENZIMAS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO Objetivos: Determinar la capacidad de los microorganismos aislados en el TP anterior de producir enzimas de interés industrial utilizando ensayos en placa y verificar actividad a distintas temperaturas de incubación. Introducción: En el siguiente trabajo práctico se estudiará la capacidad de los microorganismos aislados de diversas fuentes de producir enzimas y compuestos químicos que se utilizan en la industria en general. Principalmente se seleccionarán aquellos que tengan una mayor actividad con respecto a los controles empleados y a distintas temperaturas de incubación. Además cuando sea posible se utilizará dicha característica para la identificación de los mismos. Las enzimas se producen comercialmente desde fines del siglo pasado y a partir de la década del 60 comienza la producción masiva con microorganismos. Los microorganismos ofrecen grandes ventajas como sistemas de producción de enzimas, dada su alta velocidad de síntesis, alto rendimiento de conversión de sustrato en proteína enzimática, gran versatilidad y mayor simplicidad en la manipulación ambiental y genética de su capacidad productiva. Las enzimas de uso industrial, son mayoritariamente hidrolasas extracelulares de estructura simple, estables y sin requerimientos de cofactores disociables para su actividad. Estas enzimas son producidas por las bacterias como respuestas adaptativas de fase estacionaria que le sirven para la provisión de nutrientes en condiciones de hambreado extremo como lo es la situación en su hábitat natural. Mientras que para las bacterias Gram positivas la exportación al extracelular esta facilitada por carecer de membrana externa, las Gram negativas presentan complejos sistemas de secreción para atravesar la capa externa de LPS. Además existen diferentes niveles de control genético de la expresión de estas actividades, que han sido ampliamente estudiados. Uno de los problemas de las enzimas es su inestabilidad, siendo particularmente sensibles a la temperatura; de manera que la vida media puede llegar a ser muy corta o su actividad baja en temperaturas ambiente. En la siguiente tabla se muestra las enzimas de producción microbiana que serán rastreadas y su campo de aplicación industrial:

Nombre de la enzima y reacción catalizada

Origen microbiano Campo de aplicación industrial

α-Amilasa Hidrólisis de almidón

Bacillus, Aspergillus, otros hongos

Obtención de jarabe de glucosa; eliminación del apresto del almidón

Proteasa Hidrólisis de proteínas

Bacillus y otras bacterias, también hongos

Aditivos de productos de lavado; curtidos

Lipasa Hidrólisis de lípidos

Pseudomonas y

Hongos

Curtidos, aditivos de productos de lavado

Metodología: Para todas las actividades que se evaluaran se empleara el sistema de detección en placa de halos de degradación. Esto se realiza en forma directa por inspección de la placa o por

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revelado especifico que produce diferencias en la coloración en las zonas degradadas respecto del fondo no hidrolizado. En todos los casos se comparara la actividad con respecto a los controles empleados. Estas comparaciones requieren que exista un desarrollo microbiano similar para evaluar cuantitativamente los resultados a distintas temperaturas de incubación.

1) Producción de amilasas. El almidón es un polisacárido de reserva complejo. Almidón es un polímero de glucosa en enlace glucosidico lineal (amilasa) α-1,4 o ramificado (amilopectina) α-1,6. Un test cualitativo para determinar su presencia es la aparición de un color azul luego de la adición de una solución de ioduro de potasio/ I2. Luego de la hidrólisis del almidón, los productos de clivaje (dextrinas, maltosa y glucosa) no dan este color. Este principio será utilizado para testear la hidrólisis del almidón en este trabajo. La capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidón esta asociada a la enzima alfa-amilasa extracelular. Esta sirve como criterio de identificación de aislamientos desconocidos.

1. Sembrar el microorganismo en estudio por estría en una placa de Agar Almidón. Inocular dos placas con microorganismos control, Escherichia coli y Bacillus subtillis.

2. Incubar a 22, 30 y 42 oC durante 48 hs o hasta observar desarrollo. 3. Testear la hidrólisis del almidón por acción del microorganismo cubriendo la

superficie de la placa con una solución de ioduro de potasio/ I2 (lugol) 4. Dejar actuar 10 minutos. 5. Observar la coloración: halos de degradación (marrones o transparentes) alrededor de

las colonias sobre fondo azul. Comparar con los controles ensayados y en cada temperatura.

2) Producción de proteasas Muchas bacterias pueden degradar diversas proteínas y utilizar los péptidos y aminoácidos resultantes como fuente de energía y para sintetizar sus propias proteínas. Un ejemplo es la hidrólisis de la caseína. La caseína existe en la leche como una suspensión coloidal que da a la leche su aspecto opaco. Muchas bacterias producen enzimas que hidrolizan esta proteína dando derivados solubles y transparentes. La ruptura de proteínas a veces llamada peptonización, es útil en la identificación de especies microbianas.

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1. Sembrar el microorganismo en estudio por estría en una placa de Agar Leche Inocular dos placas control con Escherichia coli y Bacillus subtillis.

2. Incubar a 22, 30 y 42 oC durante 48 hs o hasta observar desarrollo. 3. Colocar las placas sobre una superficie negra y analizar la presencia o ausencia de

zonas claras (halos de degradación) alrededor del área de crecimiento de los microorganismos testeados. Comparar con los controles ensayados y en cada temperatura.

3) Producción de lipasas Las lipasas tienen la capacidad de hidrolizar fosfolípidos, como los presentes en las lecitinas de la yema del huevo. El clivaje de las uniones fosfoester por acción de la Fosfolipasa C forma un diglicérido insoluble en agua. Esta actividad enzimática puede ser detectada por una zona de opalescencia en el medio alrededor de la masa celular. Otra posible acción enzimática es la de la Fosfolipasa A, dando un producto soluble en agua (lisolecitina), que en cambio se observa como una zona transparente alrededor de la masa celular. Los fosfolípidos son componentes mayoritarios y funcionales de las membranas celulares. La capacidad de hidrólisis de fosfolípidos de células huéspedes es un factor importante de virulencia de las bacterias que la poseen y por lo tanto su determinación es una herramienta utilizada para caracterizar e identificar miembros de los géneros Pseudomonas, Staphylococcus, Bacillus y Clostridium. 1. Sembrar el microorganismo en estudio por estría en una placa de Agar Yema de huevo.

Inocular placas control con Bacillus cereus, Streptomyces sp, Pseudomonas aeruginosa y

Escherichia coli. 2. Incubar a 22, 30 y 42 oC durante 48 hs. o hasta observar desarrollo. 3. Observar la presencia o ausencia de halos de precipitado insoluble o traslúcido alrededor

del área de crecimiento de los microorganismos testeados. 5) Producción de antibióticos La búsqueda de microorganismos productores de nuevos antibióticos utilizados en diversos ámbitos (agricultura, veterinaria y la industria farmacéutica) ha sido y continúa siendo intensa debido, principalmente, al fenómeno de resistencia a los antibióticos. Una gran cantidad de bacterias pertenecientes al Phylum Actinobacteria (actinomycetes) tienen la capacidad de sintetizar diferentes metabolitos secundarios biológicamente activos: antibióticos, herbicidas, pesticidas, antiparasitarios y enzimas que son utilizadas para el tratamiento de desechos. En particular, los antibióticos resultan de gran importancia terapéutica y comercial. Los actinomycetes constituyen un grupo ampliamente distribuido en la naturaleza. Semejantes a los hongos en su estructura filamentosa ramificada, estas bacterias son Gram positivas, aeróbicas, mesófilas, morfológicamente irregulares. Alrededor del 80% de los aislamientos del suelo pertenecen al Género Streptomyces; se encuentran en concentraciones viables de 106-107 por gramo de tierra. Diversas especies de Streptomyces producen geosminas responsables del olor característico de la tierra fértil. Su aislamiento es relativamente sencillo pues son nutricionalmente muy versátiles: utilizan almidón, asparragina o malato cálcico como fuente de carbono y caseína no digerida o nitrato potásico como fuente de nitrógeno. Producen esporas, denominadas conidios, por tabicación. Se han obtenido más de 50 antibióticos diferentes a partir de especies de Streptomyces, incluyendo la estreptomicina, la neomicina, el cloranfenicol y las tetraciclinas.

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Desarrollo experimental

1er. día 1) Observar el desarrollo de colonias en las placas de agar S estriadas y describir su aspecto

macroscópico. Las colonias de Streptomyces son pequeñas, de consistencia firme y adheridas fuertemente al sustrato solidificado, de aspecto granuloso y pulverulento, generalmente pigmentadas (blanco, amarillo, rojo). Identificar una colonia aislada, realizar una tinción de Gram y observar al microscopio.

2) Preparar una suspensión de un microoganismo sensible (E.coli) colocando varias colonias en un tubo de hemólisis conteniendo 1 ml de solución fisiológica estéril. Homogeneizar en agitador de tubos. Agregar 4.ml de agar AS blando. Conservar a 40ºC.

3) Volcar con cuidado la suspensión de agar blando con las bacterias sensibles sobre las placas de Petri que tienen las colonias provenientes de las muestras de tierra, y las que tienen colonias de S. aureofaciens y/o S. venezuelae.

4) Dejar secar las placas durante 5 min. e incubar durante 24 hs. a a 37 ºC . 2do. día Observar los halos de inhibición del crecimiento de B. subtilis y E. coli en las placas con AN controles debidos a la producción de antibióticos de S. aureofaciens y/o S. venezuelae, y compararlos con los obtenidos a partir de los aislamientos de tierra.

Bibliografía

Madigan M.T., Martinko J.M. and Parker J. “Biología de los microorganismos”, 10ª Edición, pp 415, 721-722, 2004. Seeley H.W., Vandemark P.J. and Lee J.J. “Microbes in action” (A laboratory manual of microbiology) 4th edition, pp. 173-176, 1991. http://www.accessexcelence.org/AE/AEC/AEF/1995/goudie_soil.html http://www-micro.msb.le.ac.uk/video/Streptomyces.html “Purification and structure elucidation of antifungal and antibacterial activities of a newly isolated Streptomyces sp. Strain US80”. Fourati-Ben Fguira L., Fotso S., Ben Ameur-Mehdi R., Mellouli L and Laatsch H. Research in Microbiology 156: 341-347, 2005. “Plasticity of the Streptomyces genome-evolution and engineering of new antibiotics”. Hranueli D., Cullum J., Basrak B., Goldstein P. and Long P.F. Current Nedical Chemistry 12: 1697-1704, 2005. B) DETERMINACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS INTRODUCCIÓN El uso y abuso de los antibióticos en las terapias contra infecciones de origen bacteriano, conlleva a la selección de cepas bacterianas resistente. La diseminación de estas resistencias a otras cepas de la misma o diferente especie se ve facilitada cuando los marcadores de resistencia (genes) se encuentran en elementos genéticos móviles como son plásmidos y/o transposones La susceptibilidad de los microorganismos a los antibióticos se determina mediante técnicas basadas en la dilución o difusión del antibiótico en un medio de cultivo donde desarrolla el microorganismo en estudio. Las técnicas de dilución en caldo y agar son utilizadas para medir la actividad de un agente antimicrobiano frente a una cepa bacteriana y permiten determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) que es la menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento bacteriano.

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La CIM indica la concentración de antimicrobiano que se necesita para matar o inhibir el crecimiento del microorganismo analizado y permite valorar comparativamente la potencia de los antimicrobianos. La reproducibilidad de estas pruebas es de ± 1 dilución y para evitar una gran variabilidad éstas deben ser estandarizadas y controladas muy cuidadosamente. Los métodos estandarizados se detallan ampliamente en el NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) Para el caso de las técnicas que se basan en la difusión del antibiótico, el método universalmente utilizado es el de Bauer y Kirby comúnmente llamado antibiograma. Este método consiste básicamente en un disco de papel embebido en el antibiótico que es colocado sobre un medio de cultivo sólido inoculado con el microorganismo a ensayar; luego de 18 a 24 horas de incubación se mide el halo de inhibición del crecimiento bacteriano que produce el antibiótico al difundir desde el disco de papel que lo contiene, radialmente hacia el medio de cultivo donde esta creciendo el microorganismo. El diámetro del halo de inhibición del crecimiento en un antibiograma y el valor de la CIM para un determinado antibiótico son un criterio de referencia experimental para determinar si un microorganismo es resistente o sensible a ese antibiótico. Otro novedoso método es el EtestTM , que permite la determinación de la (CIM) . El EtestTM es una tira plástica que contiene un gradiente continuo de un antibiótico, la técnica combina el fenómeno de difusión con el de dilución del antibiótico para determinar la CIM para un dado microorganismo. Este método, como veremos en el trabajo práctico, es mucho más certero que el antibiograma y más rápido y preciso que la técnica de dilución para obtener la CIM, que usualmente se realiza en varios pasos de dilución y cultivo lo cual requiere disponer de mucho material estéril para una sola determinación. Desarrollo del trabajo práctico Determinación de la CIM por dilución en caldo 1. Se realizan diluciones al medio decrecientes del o los antibióticos en tubos conteniendo 1 ml de caldo Mueller-Hinton 2. Se siembra 1ml de una suspensión bacteriana de aproximadamente 10 5 bacterias por ml que equivale a una dilución 1/500 del tubo 1 de la escala de Mc Farland. 3. Se realiza un control de crecimiento inoculando un caldo sin antibiótico y un control negativo con caldo sin inocular. 4. Se incuban todos los tubos a 37 °C durante 24 horas. Luego se observa turbidez indicativa del desarrollo bacteriano. 5. Se determina la CIM como aquella concentración del antibiótico contenida en el tubo que posee la mayor dilución del mismo en la que se detecta falta de turbidez. La mínima concentración que inhibe el crecimiento bacteriano. Antibiograma 1. Preparar placas de Petri con agar Müller Hinton de aproximadamente 4 mm de alto. Dejar solidificar y secar bien. 2. Preparar con el cultivo de la cepa a analizar, una suspensión bacteriana con solución fisiológica estéril, ajustarla a 0,5 de la escala de McFarland. 3. Sumergir un hisopo estéril en la suspensión recién preparada, escurrir el excedente de líquido en las paredes del tubo y sembrar la placa de Petri con medio de cultivo anteriormente preparada. Distribuir uniformemente el inóculo en toda la superficie del agar. 4. Cuando la superficie del agar este completamente seca, apoyar los discos de antibiograma utilizando el aplicador o una pinza estéril. Asegurarse que toda la superficie de los discos esté en contacto con el agar, una vez colocados no deberán ser movidos, dado que el antibiótico es liberado instantáneamente cuando entra en contacto con el agar. 5. Incubar en estufa a 37 °C durante 24 horas.

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6. Observar y medir para cada disco el halo de inhibición del crecimiento. 7. Analizar si las cepas bacterianas utilizadas son resistentes o sensibles a los antibióticos probados, según los datos que figuran en tablas de sensibilidad a antibióticos. Bibliografía Bauer, A., Kirby, W., Sherris, J., Turk, M. American Journal of Clinical Pathology, 45: 493-496, 1986. Davis, D. B., Dulbecco, R., Eisen, H., Ginsberg, H., Tratado de Microbiología. capítulo 7 Salvat Editores, Tercera edición, 1984. C) FORMACIÓN DE BIOFILMS BACTERIANOS INTRODUCCIÓN

En los últimos años se ha demostrado que muchas bacterias en ambientes naturales,

clínicos e industriales no se encuentran como células planctónicas estudiadas típicamente el laboratorio, sino que se unen a superficies formando estructuras denominadas biofilms. Los biofilms se definen como poblaciones o comunidades microbianas unidas a una superficie que puede ser biótica o abiótica. La formación de los mismos depende de muchos factores de la superficie y ambientales tales como las características de sustrato, el inóculo y la disponibilidad de nutrientes. Los microorganismos que habitan estas estructuras poseen una alta resistencia a diversos factores, incluyendo los bactericidas, por lo que algunos problemas derivados de los biofilms, en muchos casos, son difíciles de solucionar.

Entre las ventajas que representa este modo de vida para los microorganismos se encuentran la mayor disponibilidad de nutrientes cerca del soporte o superficie, la capacidad de promover el intercambio genético y, en el caso de los patógenos, el incremento de la protección frente a las defensas del hospedador. Además de las ventajas mencionadas, este modo de vida constituye una defensa frente a la predación en ambientes naturales y en el caso de suelos también frente a la desecación.

El conocimiento de las características de los biofilms resulta de utilidad en estudios aplicados de biorremediación y en algunos procesos como la biocatálisis. Por otra parte, los microorganismos formadores de biofilms provocan problemas en redes de distribución de agua y otras cañerías como las del transporte de petróleo o combustibles, tienen importancia en fenómenos de biocorrosión y desde el punto de vista clínico son frecuentemente responsables de las inflamaciones asociadas a los catéteres, etc.

OBJETIVO Analizar la capacidad de formación de biofilms de las Pseudomonas aisladas. Existe una gran variedad de sistemas disponibles para evaluar la formación de biofilms bacterianos. Como un primer paso para estudiar la capacidad de formación de los mismos se utilizarán microplacas de 96 pocillos fondo en U estériles para evaluar la unión de las bacterias a una superficie abiótica. Está técnica se emplea para analizar biofilms estáticos. PROCEDIMIENTO Inocular 3-5 ml de caldo de cultivo con las bacterias de interés e incubar hasta fase estacionaria. Medir la densidad óptica (DO). Diluir los cultivos en caldo nutritivo fresco hasta DO600nm=0,025 e inocular 5 pocillos con 150 µl de cada cultivo. Llenar 5 pocillos con el medio de cultivo utilizado. Tapar la microplaca.

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Incubar durante 24-48 h a 30°C. Observar el crecimiento en los pocillos sembrados y ausencia en los controles. Retirar con pipeta cuidadosamente (sin tocar las paredes ni el fondo) el medio de cultivo para eliminar las células planctónicas. Lavar los pocillos con agua. Teñir con 150 µl de cristal violeta (0,1%), dejar en contacto con el colorante 20 min. Retirar el colorante que no se haya unido a las células y observar el patrón de unión. Lavar el exceso de colorante con agua. Solubilizar el colorante con 200 µl de etanol (95%) a temperatura ambiente durante 10-15 min. Transvasar el contenido de los pocillos a una placa de 96 pocillos fondo plano y cuantificar midiendo la DO a 500-600 nm utilizando un lector de ELISA. Con esta metodología se comparará la capacidad de formación de biofilms en Pseudomonas

fluorescens y en las Pseudomonas aisladas. BIBLIOGRAFÍA O`Toole, G.A. and R. Kolter. (1998). Initiation of biofilm formation in Pseudomonas

fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Molecular microbiology, 28:449-461. Palmer J, Flint, S and J. Brooks, (2007) Bacterial cell attachment, the beginning of a biofilm. J Ind Microbiol Biotechnol (2007) 34:577–588 D) SUSCEPTIBILIDAD A LA INFECCION CON FAGOS El fago se fija o adsorbe a componentes de la superficie bacteriana que actúan como receptores específicos. La zona de adsorción del fago es complementaria al receptor bacteriano, por lo tanto un determinado fago sólo puede infectar un número limitado de cepas bacterianas que contengan a un determinado receptor. Debido a esto, los fagos pueden ser utilizados como herramientas en el proceso de identificación de especies, evaluando la susceptibilidad de una cepa bacteriana a la infección con un determinado fago. Protocolo -Sobre placas de agar MRS realizar estrías con los distintos aislamientos de bacterias lácticas. -Colocar una gota de 10 µl del fago en el centro de la estría. -Incubar boca arriba a 30 °C - Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3

10µl de fago

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PREPARACIÓN DE STOCKS DE BACTERIÓFAGOS OBJETIVOS - Preparación y determinación del título de stocks de bacteriófagos a través de la formación de placas de lisis. Microorganismos a utilizar: - Bacteriófagos T4 - Escherichia coli Desarrollo experimental: Preparación de stocks de los bacteriófagos T4

- Inocular dos cultivos en fase exponencial de Escherichia coli ccda uno con una suspensión del bacteriófago T4 a una multiplicidad de infección de 0,1. - Incubar a 37 °C con agitación durante dos a cuatro horas. - Centrífugar a 10.000 rpm durante aproximadamente 15 minutos a 4 °C, para eliminar en el pellet los restos celulares y cosechar el sobrenadante en otro tubo. - Filtrar el sobrenadante por una membrana de nitrocelulosa de 0,45 µ de tamaño de poro. - Controlar la ausencia total de bacterias en los stocks mediante plaqueo de una alícuota en agar LB. Bibliografía Adams, M. H. Bacteriophages. Editorial Interscience N Y, 1959

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TP N°4 RECUENTO DE CÉLULAS VIABLES

A) RECUENTO DE VIABLES EN PLACA OBJETIVO: Determinar las unidades formadoras de colonias de una muestra de bacterias por el método de recuento en placa. INTRODUCCIÓN TEÓRICA El método de recuento en placa se utiliza a menudo para contar sólo las células vivas (capaces de dividirse). En el método de placa extendida, una muestra pequeña (generalmente 0.1 ml) se extiende en esterilidad sobre la superficie de una caja de cultivo con agar que contiene medio adecuado y se incuba hasta que las colonias sean visibles a simple vista. Se infiere que cada colonia se originó de una sola célula, entonces contando el número de colonias se puede calcular la cantidad de células viables de la muestra. Para minimizar errores al calcular el tamaño de la población se ha determinado prácticamente que debe haber entre 30 y 300 colonias por caja de cultivo, por eso para suspensiones densas es necesario realizar diluciones del cultivo. El tamaño de la población se calcula usando la siguiente fórmula:

ufc/ml = N / vol x dil donde: ufc:unidades formadoras de colonias N: número promedio de colonias obtenidas para una dilución dada. vol: volumen de inóculo dil: dilución MATERIALES -cultivo bacteriano -solución fisiológica -agar nutritivo -material de vidrio estéril (tubos, pipetas, placas de Petri) MÉTODO 1- Hacer diluciones seriadas al décimo de las muestras a titular: dil.(-1) 0.1 ml muestra + 0.9 ml solución fisiológica dil.(-2) 0.1 ml dil(-1) + 0.9 ml solución fisiológica dil.(N) 0.1 ml dil.(N-1) + 0.9 ml dilución fisiológica 2- Sembrar por rastrillado 0.1 ml de cada dilución en placas de Petri con agar nutritivo (cada dilución se siembra por duplicado). 3- Las placas se incuban 24 - 48 horas en estufa a 37 °C.

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4- Contar las colonias obtenidas en cada placa. 5- Elegir la dilución en la cual se hayan obtenido entre 30 y 300 colonias y calcular las unidades formadoras de colonias (ufc) según la fórmula: 6- Tomar 1 ml de la muestra original (a partir de la cual se hicieron las diluciones) y medir la densidad óptica en un espectrofotómetro a 600 nm. 7- Comparar los resultados obtenidos de ufc/ml y D.O., entre los distintos microorganismos utilizados. Bibliografía 1- Seeley, H.W.Jr.; Vandermark, P.J. , Lee, J.J., ¨Microbes in action. A laboratory manual of microbiology¨. Editores W. H. Freeman and Company, Cuarta Edición, Capítulo 5, 1991. 2- Brock, T.D.; Smith, D.W. & Madigan, M.T. ¨Microbiologia¨ Prentice Hall Hispanoamericana S.A., Sexta Edición, 1993 B) NUMERO MÁS PROBABLE INTRODUCCIÓN

El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes. Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contendrán tan sólo un microorganismo y otros tubos no contendrán ninguno. Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna célula, se puede estimar el número más probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadística. La precisión del método del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan.

OBJETIVO - Determinación de la presencia de bacterias coliformes totales en agua. MATERIALES Y MÉTODOS - Caldo Brila Fluorocult (Merck) (ver al final) de simple y doble concentración - Tubos de ensayo con campanitas de Durham - Baños o estufas a 37 °C . - Luz U.V. Fundamentos del método

Se busca detectar la presencia de bacterias coliformes totales, basándose en la capacidad de dichos organismos de fermentar lactosa con la producción de ácido y gas. Se

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considera indicador positivo la producción de gas, dado que otros microorganismos (no coliformes) son capaces de producir acidez y no gas.

Finalmente, la cuantificación se hace por el método del número más probable, que es un método estadístico basado en la teoría de las probabilidades de Poisson. Para ello se tiene en cuenta el número de porciones de la muestra que se siembra en el medio original de crecimiento y el número de dichas porciones que contienen coliformes. El volumen de las porciones a sembrar y el número de diluciones consecutivas a realizar, depende del conocimiento que se tenga del grado de contaminación del agua. De cualquier forma, los volúmenes deberán ser tales que: 1) Todos o la mayoría de los tubos de la mayor dilución hayan dado negativos a la producción de gas en el Caldo Brila a 37 °C. 2) Todos o la mayoría de los tubos de la menor dilución hayan dado positivos a dicho ensayo Práctica: Determinación de coliformes totales: 1) Se siembran por triplicado en tubos de fermentación que contienen 10 ml de Caldo Brila fluorocult, 10, 1 y 0.1 ml de la muestra de agua. Las siembras que se hagan con un volumen de 10 ml, se harán en un volumen igual de caldo de cultivo de doble concentración. Las siembras que se hagan con un volumen igual o menor a 1 ml, se harán directamente en 5 ml de caldo de cultivo de simple concentración. 2) Se incuban los tubos sembrados a 37 °C durante 48 hrs. 3) Se observan los tubos a las 48 horas. Se considera resultado positivo la producción de gas (debido a la fermentación de la lactosa) que ocupe más de 1/3 del volumen de la campanita de Durham. 4) Se anota la cantidad de tubos positivos de cada dilución. Medio de cultivo para la demostración rápida de E. coli mediante fluorescencia. Fundamento Al margen de ciertas especies de Salmonella y Shigella, la bacteria Escherichia coli, es la única especie perteneciente al grupo de las Enterobacterias que posee la enzima β-D-glucuronidasa. Esta enzima es capaz de escindir el sustrato 4-metilumbeliferil-β-D-glucurónido (MUG), formando 4-metilumbeliferona. Esta sustancia se caracteriza por ser fluorescente al iluminarse con luz U.V., lo que permite su detección fácilmente. Este hecho es, al mismo tiempo, un indicador de la presencia de E. coli. Caldo Brila Fluorocult Composición (g/litro) Peptona ......................................................10,0 Lactosa........................................................10,0 Verde Brillante.............................................0,0133 L-Triptofano................................................1,0 Bilis de buey desecada..................................20,0 MUG............................................................0,1 Bibliografía: 1) Brock. T.D., Smith D.W. & Madigan M.T. " Microbiología" 4ta. edición . pp 637-647. 1984 2) Seeley H.W., Vandemark P.J & Lee J.J. " Microbes in action (A laboratory manual of microbiology)" 4th. edition chapter 12. 1991 3) Ferramola R." Examen bacteriológico de aguas". Editorial el Ateneo. 1947.

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TP N° 5 INMUNOLOGÍA Mecanismos Inmunológicos en el control de la invasión microbiana a vertebrados INTRODUCCIÓN El sistema inmune surgió durante la evolución al combatir más eficientemente las infecciones causadas por virus, bacterias, protozoos, hongos y helmintos. Estos patógenos pueden ser responsables de infecciones intracelulares o extracelulares, para las cuales la respuesta inmune debe ser diferente. De hecho, el sistema inmune ha desarrollado una variedad de respuestas apropiadas para combatir cada tipo de patógeno, al mismo tiempo que mantiene la tolerancia a los componentes del propio organismo, de la dieta y de los embriones (en mamíferos). Existen en el sistema inmune dos tipos de mecanismos, innatos y adaptativos, cuya diferencia principal reside en las estructuras de reconocimiento de los patógenos, ya que los mecanismos efectores de destrucción son esencialmente similares. La primera y más primitiva línea de defensa contra la invasión de patógenos, una vez superadas las barreras externas (cubierta, proteinas tóxicas, agentes lubricantes, etc.) es la ingestión de dichos microorganismos por una célula especializada. Dentro de la célula, el patógeno queda atrapado dentro de un fagosoma, y será eliminado por digestión dentro de organelas especializadas llamadas fagolisosomas. Este mecanismo – fagocitosis- es muy rápido, y es efectivo en el intervalo de 5 a 30 minutos. Se halla conservado evolutivamente en todos los eucariotes, y es paralelo a su uso para la ingestión normal de alimento.

En organismos pluricelulares primitivos, las células especializadas en esta función son los fagocitos, pero en los mamíferos las tareas se diversifican: los leucocitos polimorfonucleares del torrente sanguíneo pueden rápidamente extravasarse para fagocitar microorganismos en los tejidos, hasta que -desplazándose más lentamente- los macrófagos tisulares también llegan a la zona invadida, realizando fagocitosis y secreción de citoquinas pro-inflamatorias.

Ambas células se mueven siguiendo un gradiente de sustancias específicas (quimioatractantes) liberadas por los tejidos en respuesta a la presencia de productos de los microorganismonos (pared, ácidos nucleicos, proteinas extrañas).

El objetivo de defensa se cumple cuando, sin daño al citoplasma del fagocito, los microorganismos fagocitados son destruidas (ya no pueden multiplicarse) debido a sustancias tóxicas diversas que se encuentran en el fagolisosoma. Sin embargo, si la cantidad de microorganismos ingeridos es muy abundante, los mecanismos líticos desencadenados pueden ser tan intensos que el fagocito mismo se lisa. Las células muertas acumuladas constituyen el pus. La infección queda limitada a los tejidos de entrada.

La defensa no es exitosa cuando la especie de microorganismo ingerida posee mecanismos capaces de evadir esta reacción de defensa celular, pudiendo incluso vivir dentro del citoplasma de los fagocitos, y diseminarse por el organismo viajando dentro de ellos. Salmonella, Listeria, Mycobacterium son ejemplos de géneros bacterianos que se propagan de esta manera. Son bacterias intracelulares facultativas.

La comprobación de la muerte bacteriana puede realizarse lisando al fagocito y plaqueando

las bacterias liberadas. Las unidades formadoras de colonias (ufc) producidas permitirán comprobar la efectividad del mecanismo lítico intra- fagolisosomal.

Simultáneamente con la fagocitosis y/o la destrucción del microorganismo invasor, se ponen

en marcha mecanismos de respuesta inmune (pesentación antigénica, activación T y B, expansión clonal) más lentos, que a más largo plazo (mínimo 3 días) producen anticuerpos específicos, que son capaces de inmovilizar a todo microorganismo que se encuentre en circulación ( por aglutinación), eventualmente lisarlo (mediante la activación del sistema Complemento) y lo preparan para su ulterior

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fagocitosis (opsonización por anticuerpo y Complemento), y muerte intracelular (activación de los mecanismos proteolíticos y oxidativos intra-fagolisosomales).

Asimismo, se produce la diferenciación de linfocitos T y B a células específicas de memoria

inmunológica, que se activarán ante una nueva invasión con el mismo microorganismo. En esta segunda oportunidad, habiendo más clones (como células de memoria) capaces de responder al antígeno, la respuesta final alcanza actividad protectora en menos tiempo, haciendo más eficiente la limitación de la re-infección. En la Figura 1 se muestra un esquema- resumen de los conceptos introducidos arriba.

Fig: 1

BARRERAS NATURALES: su función es evitar la penetración de los patógenos. Se constituyen sobre los epitelios corporales, mediante mecanismos antimicrobianos fisicos (mucus, movimientos ciliares), quimicos (pH, ácidos grasos, sustancias bactericidas: lisozima) y biologicos (microbiota normal) asociados. RESPUESTA INMUNE INNATA: Funciona conteniendo la diseminación y proliferación de los patógenos en los tejidos, una vez superadas las barreras naturales. Se desarrolla en respuesta a la presencia de patrones estructurales de patógenos (sus factores de virulencia), reconocidos la primera vez por las células dendríticas (presentadoras de antígeno). Las respuestas efectoras se manifiestan ordenadas en el tiempo, en relación con las capacidades invasoras de los patógenos: 1º- Mediada por sustancias en circulación (respuesta humoral), que llegan hasta los tejidos Proteinas séricas de Fase Aguda Sistema Complemento activado Citoquinas pro-inflamatorias 2º- Mediada por células que entran en los tejidos. No se generan células de memoria.

Fagocitos (polimorfonucleares, monocitos / macrófagos) Natural Killer (células NK) RESPUESTA INMUNE ADAPTATIVA : es específica para un antígeno determinado. 1º- Mediada por células efectoras T específicas, con formación de células de memoria. 2º- Mediada por moléculas específicas en circulación : Anticuerpos producidos por Plasmocitos (linfocitos B diferenciados)

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3º- Eliminación de los complejos inmunes circulantes y células infectadas mediante fagocitosis o lisis por Tc respectivamente. Todos estos mecanismos están activos en los vertebrados superiores. En los animales más primitivos suelen faltar algunos mecanismos adaptativos . Los organismos unicelulares y los no vertebrados poseen solo los mecanismos de barrera y la fagocitosis. TRABAJO PRACTICO Mecanismos humorales y celulares en el control inmunológico de la invasión microbiana Este trabajo práctico consiste de dos partes, en el que se estudian in vitro mecanismos que in

vivo resultan en la eliminación de microorganismos: opsonización y fagocitosis.

I. Determinación de la capacidad aglutinante bacteriana de un suero de conejo inmune, anti – Salmonella enterica serovar newport. * Titulación de los anticuerpos anti - antígeno somático O frente al antígeno homólogo y heterólogo (antígeno O de Salmonella enterica serovar oranienburg) : concepto de tipificación serológica.

* Titulación por aglutinación de los anticuerpos - anti antígeno flagelar H de Salmonella enterica serovar newport (homólogo) y heterólogo (antígeno H de Salmonella enterica serovar oranienburg) .

II. A) Fagocitosis por macrófagos de la línea murina Raw 264.7 de levaduras

(Saccharomyces cerevisiae) opsonizadas con suero normal , o con suero normal inactivado por calor (56º/30 min). Se informará el porcentaje de fagocitosis y del indice fagocítico por observación al microscopio óptico. B) Fagocitosis por macrófagos peritoneales de ratón (reclutados con tioglicolato) de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) o bacterias ( S.e. newport) marcados con Fluoresceina. Análisis por citometría de flujo de las células que han fagocitado microorganismos, registrando la intensidad de su fluorescencia verde. Cálculo del porcentaje de fagocitosis.

Trabajo Práctico I REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN (Titulación de sueros a punto final) Cuando un anticuerpo específico es puesto en contacto con un antígeno, si éste es particulado (por ejemplo un glóbulo rojo, una bacteria o cualquier otra célula), las partículas se aglutinan formando una malla visible. Esta reacción se conoce con el nombre de aglutinación. Los principios que regulan la aglutinación son los mismos que regulan la precipitación. La ocurrencia de uno u otro fenómeno depende del tipo de antígeno involucrado (particulado o soluble ). In vitro, la reacción de aglutinación se usa para identificar un antígeno particulado, el cual va a reaccionar con un inmunosuero específico, o para determinar el título aglutinante de un suero inmune. In vivo, el complejo Anticuerpo-Microorganismo formado facilita la ingestión

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del mismo por células especializadas (fagocitos). Se dice que el microorganismo está opsonizado, siendo el Anticuerpo la “opsonina” Para titular un antisuero se mezcla una cantidad constante de la suspensión antigénica con diluciones crecientes del suero a examinar y se determina su título como la inversa de la máxima dilución capaz de dar una aglutinación positiva. El título depende de la técnica utilizada y deben estandarizarse distintos factores tales como concentración de la suspensión antigénica, temperatura, concentración salina en el medio y tiempo de reacción, para que los resultados sean comparables. Objetivo: Titular anticuerpos en suero utilizando la técnica de aglutinación directa Materiales: - Solución salina buffereada con fosfatos (PBS) pH 7,2 - Microplacas de 96 pocillos con fondo en "U". - Micropipetas y tips. - Suspensiones homogéneas de Salmonella enterica sv newport y Salmonella enterica sv oranienburg crecidas en caldo nutritivo y diluidas hasta ajustar la concentración tomando como referencia el tubo 1 de la escala de Mac Farland (3 x 108 bacterias / ml aproximadamente). Estas suspensiones bacterianas representan el antígeno flagelar llamado antígeno H, de naturaleza proteica (Suspensión H). - Suspensiones homogéneas de S. e newport y S. e. oranienburg crecidas en agar nutritivo y diluidas de igual forma que las crecidas en medio líquido. Estas suspensiones bacterianas representan el antígeno somático llamado antígeno O o endotoxina, de naturaleza glucolipídica (Suspensión O).

S.e. sv oranienburg (estructura antigénica: 6,7:m,t) S.e. sv newport (estructura antigénica: 6,8:e.h:1,2)

- Antisuero anti-O preparado en conejo, inmunizándolo con antígeno O purificado de S.e. sv newport (reconoce los antígenos O: 6,8). - Antisuero anti-H preparado en conejo, inmunizándolo con una suspensión de S.e. sv newport crecida en medio líquido (reconoce a los antígenos flagelares H: m,t ). En menor medida, también reconoce los Ag O correspondientes. Procedimiento: (Ver grilla adjunta) 1.- Se colocan 50 µl de PBS en cada uno de los 12 pocillos de una fila (A) de una microplaca de 96 pocillos con fondo en "U". 2.- Se colocan 50 µl del suero anti H a titular en el primer pocillo de la fila. 3.- Se realizan diluciones seriadas al medio de dicho antisuero. Para ello se homogeniza el contenido del primer pocillo y se trasvasan 50 µl de la mezcla al segundo pocillo de la misma fila. Se repite el procedimiento a lo largo de toda la fila. Se descartan los últimos 50 µl. 4.- Se trasvasan 25 µl de cada pocillo al pocillo correspondiente de la siguiente fila (B). 5.- A cada pocillo de la primera fila, se agregan 75 µl de la suspensión antigénica H de S.

newport .

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6.- A cada pocillo de la segunda fila, se agregan 75 µl de la suspensión antigénica H de S.

oranienburg.

7.- Se repite idéntico procedimiento descripto en los puntos 1 a 6 pero empleando el suero anti O y enfrentándolo con los antígenos O de S. newport y de S. oranienburg en otra microplaca. 8.- En todos los casos se homogeniza y se incuba a 37 °C durante 2-3 hs. 9.- Se realiza una primera lectura de los resultados, anotando la mayor dilución del antisuero que produce aglutinación. Observar atentamente también los primeros pocillos. 10.- Se incuba durante toda la noche a 4 ºC y luego se realiza una segunda lectura, verificando el título definitivo. 11.- Como controles negativos se utilizan sueros normales (preinmunes) de conejos obtenidos con anterioridad a la inoculación de los distintos antígenos, diluyéndolos de igual manera y enfrentándolos con los antígenos correspondientes. Aglutinación Bacteriana Directa: Esquema de siembra en microplaca de 96 pocillos, fondo en U Dilución antisuero o suero normal 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/ 4096

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

75 µl del correspondiente antígeno

Discusión:

1- ¿Se podría obtener un antisuero específico contra antígenos H únicamente, a partir de un suero obtenido por inmunización con S.e sv newport crecida en caldo nutritivo? 2- ¿Serviría el aglutinado del pocillo del título (de la aglutinación directa del TP I) como antígeno para dar a fagocitar a un macrófago?

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Trabajo Práctico II FAGOCITOSIS Parte A OBJETIVO: Demostrar la actividad innata de fagocitosis de levaduras (Saccharomyces cervisiae) por células RAW 264.7 (línea de macrófagos murinos) crecidas en monocapa sobre cubreobjetos colocados en una microplaca de 24 pocillos . Se analizará la cinética de ingestión de partículas por incubación a distintos tiempos y se determinará el porcentaje de fagocitosis y el índice fagocítico por observación al microscopio mediante coloración con Giemsa. PROCEDIMIENTO: Preparación de las levaduras: Se utiliza “Levadura de Cerveza” desecada para repostería. Se lava unos miligramos dos veces con SF. Se lleva a una concentración aproximada de 1 x 106 partículas/ ml en PBS conteniendo 0,6 % de formol (contar en cámara de Neubauer con líquido de Turk: las levaduras se ven azules.) Atención: Antes de usar la suspensión en el ensayo sobre células, centrifugarlas, descartar el sobrenadante y resuspenderlas en igual volumen de medio de cultivo completo. Fagocitosis: A los 0.5 ml de medio de cultivo sin suero que ya cubre la monocapa de células establecida en los pocillos, se agrega 0.1 ml de la suspensión de levaduras. Para probar la influencia del Complemento, se agregan además 50 µl de suero fresco de ratón (queda al 10% en el pocillo), o inactivado a 56ºC/30 min. Cinética: Trabajando en el cuarto-estufa a 37 °C, se agregan las levaduras según el siguiente esquema. Células Opsonina (Suero ratón) Tiempo de incubación (minutos)

Fresco 5 RAW + Lev

Inactivado 5 Fresco 15

RAW + Lev Inactivado 15

Fresco 30 RAW + Lev

Inactivado 30 Se incuban las placas durante 5, 15 y 30 minutos y luego se retira el sobrenadante, terminándose la reacción. Se procede al paso de tinción. Tinción: La monocapa se lava (con turbulencia) una vez con solución fisiológica, para eliminar las levaduras no fagocitadas o que puedan haber quedado adheridas al exterior de las células. Se descarta rápidamente y se lava otra vez con solución fisiológica, dejando secar al aire. La monocapa se fija con 1 ml de metanol durante 5 min. y se colorea con Giemsa (15 gotas/10ml de agua pH=7 ) durante 2-3 min. Los cubreobjetos se extraen de los pocillos de la microplaca y se dejan secar al aire. Se montan colocando la cara que tiene las células sobre una gota de aceite de inmersión depositada sobre un portaobjetos.

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Observación y Recuento Los preparados se examinan a 400 aumentos. 1-Se determina el Porcentaje de Fagocitosis contando el número de células que contienen 3 o más partículas en su citoplasma (célula fagocítica positiva) por cada 100 células contadas . 2- Se calcula el Indice Fagocítico promediando el número de microorganismos fagocitados en células positivas sobre el número total de células positivas analizadas 3- En las muestras extraidas a los 30 minutos, buscar levaduras decoloradas. Serán las levaduras que murieron intracelularmente como consecuencia de los fenómenos desencadenados por su ingestión. Informe - % DE FAGOCITOSIS :(n° células fagocíticas/ nº total células contado) x 100 - INDICE FAGOCITICO : nº levaduras fagocitadas promedio / n° célula fagocítica - ACTIVIDAD CITOCIDA: (nº levaduras intracelulares muertas / nº levaduras intracelulares totales)x100 Discusión: 1- ¿Cuáles serían las opsoninas que está evaluando en la fagocitosis de Salmonella? 2- ¿Cuáles serían las opsoninas evaluadas en la fagocitosis de Levaduras? Parte B OBJETIVO: Demostrar la actividad innata de fagocitosis de microorganismos inactivados con formol 0,6% (Saccharomyces cervisiae y Salmonella newport) acoplados con FITC (Isotiocianato de fluoresceína) por macrófagos peritoneales de ratón mantenidos en suspensión. Procedimiento Obtención de Macrófagos Peritoneales de Ratón: Los animales reciben una inyección intraperitoneal de 2 ml de caldo tioglicolato estéril. Cuatro días después se sacrifican por anestesia, se abre la piel del abdomen sin lastimar el peritoneo, y se inyectan, mediante jeringa y aguja estériles, 5 ml de medio de cultivo RPMI suplementado con 10 % de suero fetal bovino que contiene 5 UI/ml de heparina. Sin retirar la aguja, se masajea el abdomen y luego se ubica la aguja cerca de la base del bazo, en el flanco izquierdo. Se aspira el líquido inyectado, obteniéndose así una suspensión de macrófagos “reclutados”, en condiciones para ser cultivados in vitro. Protocolo

1- Resuspender las células a una concentración de 2.5 x 107 células/ml. 2- Agregar 0.1 ml de la suspensión de macrófagos (2.5 x 106 células) a los tubos de

cultivo. 3- Vortexear el cultivo microbiano y diluirlo 1/10 en PBS. Atención: Para eliminar el

formol, antes de usar la suspensión en el ensayo sobre células, centrifugarlas, descartar el sobrenadante y resuspenderlas en igual volumen de medio de cultivo completo

4- Vortexearlo nuevamente y transferir 0.1 ml de microorganismos (2.5 x 107

microorganismos) al tubo de cultivo. Es importante el vortexeo para que se dispersen los microorganismos agregados que pueda

haber. Para este ensayo se usa una relación de 10 microorganismos a 1 fagocito. Sin

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embargo, los microorganismos se fagocitan bien, y se puede detectar el fenómeno aún usando

una relación microorganismo : fagocito 1:1.

5- Agregar 50 µl de suero normal fresco. Agregar PBS hasta 1 ml. Asegurarse de tapar el

tubo herméticamente. 6- Colocar los tubos en un agitador cabeza-cola y agitarlos entre 20-30 min a baja

velocidad (aprox 8 rpm) en estufa a 37 ºC. No deberían usarse tiempos mayores a 30 minutos, ya que puede producirse una significativa

muerte de los microorganismos en ese período, y se degradarán rápidamente a 37º, por lo

cual disminuirá la intensidad de su fluorescencia, y desaparecerán del recuento.

7- Para eliminar las células que han quedado adheridas al fagocito por afuera, lavar las células con PBS, centrifugando 8 min a 250 xg (aprox 1000 rpm en centrífuga standard). Descartar el sobrenadante, agregar 1 ml de PBS helado, y resuspender las células suavemente usando una pipeta Pasteur plástica. Repetir 2 veces.

8- Resuspender el pellet de células con 1 ml de formol 0.6% en PBS. 9- Dejar en la heladera en oscuridad hasta poder leer en el citómetro. 10- Antes de pasar por el citometro, volver a centrifugar para eliminar el formol,

reemplazándolo por igual volumen de PBS.

Expresar el resultado como porcentaje de células (+), cuya intensidad de fluorescencia es mayor que el control sin fagocitosis (autofluorescencia), leido de un diagrama bidimensional de Side Scatter (complejidad citoplasmática) vs Fluorescencia (FITC, verde)

Materiales necesarios: Solución salina buffereada con fosfatos (PBS) Macrófagos/ línea celular RAW 264.7 Cultivo microbiano de 12-16 hs., muerto por calor o en formol al 0,6%. Suero Normal (preferentemente de la especie dadora de fagocitos) Tubos de polipropileno o poliestireno de 10 x 75 mm con tapa a presión Eppendorf x 1,5 ml Agitador cabeza-cola Microplacas de 96 pocillos fondo en U y de 24 pocillos fondo plano.

Cubreobjetos y portaobjetos Formol 0,6 % en PBS Medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10 % de suero fetal bovino Heparina Coloración: Metanol-Giemsa Bandeja para coloración Centrífuga de rotor pivotante Microscopio, líquido de Turk Cámara de Neubauer. Citómetro de flujo.

Discusión: 1- Comparar los resultados de la fagocitosis determinados por frotis y por citometría. ¿Miden las mismas propiedades? Por qué? 2-¿Cuál método sería más confiable para detectar una fagocitosis más lenta que lo normal? ¿Cuál método usaría para determinar un bajo porcentaje de fagocitosis? Por qué? 3- Esquematice mediante histogramas de intensidad de fluorescencia los casos anteriores posibles .

Bibliografía general Techniques in Clinical Immunology Ed: Thompson, RA, Blackwell Scientific Publications. Handbook of Experimental Immunology. Weir, DM, Volume 1 Immunochemistry. Blackwell Scientific Publications. Fourth Edition. 1986. Inmunología e Inmunoquímica. Margni, RA, Editorial Médica Panamericana. Quinta Edición. 1996. Bibliografía específica 1. Alvarez-Barrientos, A.; Arroyo, J.; Canton, R.; Nombela, C., and Sanchez-Perez, M. Applications of flow

cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 2000 Apr; 13(2):167-195; ISSN: 0893-8512 (Print). 0893-8512 (Linking).

2. Bassoe, C. F. Processing of staphylococcus aureus and zymosan particles by human leukocytes measured by flow cytometry. Cytometry. 1984 Jan; 5(1):86-91; ISSN: 0196-4763 (Print). 0196-4763 (Linking).

3. Bjerknes, R. Flow cytometric assay for combined measurement of phagocytosis and intracellular killing of Candida albicans. J Immunol Methods. 1984 Aug 3; 72(1):229-41; ISSN: 0022-1759 (Print). 0022-1759 (Linking).

4. Brenner FW; Villar RG; Angulo; TauxeR, and Swaminathan . Salmonella nomenclature. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 2000; 38(7):2465–2467.

5. Kuusi, N.; Nurminen, M., and Sarvas, M. Immunochemical characterization of major outer membrane components from Salmonella typhimurium. Infect Immun. 1981 Sep; 33(3):750-7; ISSN: 0019-9567 (Print). 0019-9567 (Linking).

6. McClelland, R. G. and Pinder, A. C. Detection of Salmonella typhimurium in dairy products with flow cytometry and monoclonal antibodies. Appl Environ Microbiol. 1994 Dec; 60(12):4255-4262; ISSN: 0099-2240 (Print). 0099-2240 (Linking).

7. Veal, D. A.; Deere, D.; Ferrari, B.; Piper, J., and Attfield, P. V. Fluorescence staining and flow cytometry for monitoring microbial cells. J Immunol Methods. 2000 Sep 21; 243(1-2):191-210; ISSN: 0022-1759 (Print). 0022-1759 (Linking).

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Guía para la confección de informe

TURNO TP: ........ GRUPO Nº: .......... INTEGRANTES:................................

.................................

.................................

INFORME TRABAJO PRACTICO Nº ....

TITULO: .................................................................................................. OBJETIVOS:..................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... RESULTADOS OBTENIDOS: (se pueden utilizar tablas y/o gráficos que expresen los resultados en forma concreta, sin detalles de los métodos utilizados que figuran en la guía de TP). .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. CONCLUSIONES: (comente brevemente las conclusiones obtenidas a partir del análisis de los resultados) ..................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

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APÉNDICE

MEDIOS DE CULTIVO CALDO NUTRITIVO Extracto de carne..................................... 3,0 g. Peptona de carne...................................... 5,0 g. Agua destilada c.s.p. .................................. 1 lt. pH = 7,0 ± 0,2 CALDO MAC CONKEY Peptona de caseína................................ 20,0 g. Lactosa................................................. 10,0 g. Bilis de Buey desecada............................ 5,0 g. Púrpura de Bromocresol....................... 0,01 g. Agua destilada c.s.p. ................................. 1 lt. pH = 7,1 ± 0,1 CALDO CEREBRO-CORAZÓN Infusión de cerebro............................... 12,5 g. Infusion de corazón................................ 5,0 g. Proteosa-peptona.................................. 10,0 g. D(+) glucosa........................................... 2,0 g. Cloruro de sodio..................................... 5,0 g. Di-sodio hidrógeno fosfato..................... 2,5 g. Agua destilada c.s.p. ................................. 1 lt. pH = 7,4 ± 0,2 CALDO TIOGLICOLATO Peptona de caseína............................... 15,0 g. Extracto de levadura.............................. 5,0 g. D (+) glucosa......................................... 5,5 g. L (+) cisteína.......................................... 0,5 g. Cloruro de sodio.................................... 2,5 g. Sodio tioglicolato................................... 0,5 g. Resazurina sódica............................... 0,001 g. Agua destilada c.s.p. ................................. 1 lt. pH = 7,1 ± 0,1

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CALDO M9 (2X) NH4Cl.................................................... 1,0 g. Na2 HPO4.............................................. 6,0 g. KH2PO4................................................. 3,0 g. Cloruro de sodio.................................... 0,5 g. Glicerol o asparragina............................ 5,0 g. Agua destilada c.s.p. ................................ 1 lt. Agregar en frío Sulfato de magnesio 1N.......................... 1 ml. Cloruro de Calcio 0,01 M...................... 10 ml (autoclavados aparte) CALDO MRS (según DE MAN, ROGOSA Y SHARPE) Peptona universal....................................... 10,0 g. Extracto de carne......................................... 5,0 g. Extracto de Levadura................................... 5,0 g. D (+) glucosa............................................. 20,0 g. Di-potasio hidrógeno fosfato........................ 2,0 g. Tween 80..................................................... 1,0 g. Di-amonio hidrógeno citrato........................ 2,0 g. Acetato de sodio.......................................... 5,0 g. Sulfato de magnesio..................................... 0,1 g. Sulfato de Manganeso................................ 0,05 g. Agua destilada c.s.p. .......................................1 lt. pH = 6,5 ± 0,1 CALDO LB Triptona de soya..........................................10,0 g. Extracto de levadura......................................5,0 g. Cloruro de sodio..........................................10,0 g. Agua destilada c.s.p. ........................................1 lt. pH = 7,5 ± 0,1 CALDO CITRATO DE KOSER Sodio y amonio hidrogenofosfato.................. 1,5 g. Sulfato de magnesio...................................... 0,2 g. Potasio hidrógenofosfato............................... 1,0 g. Citrato de Sodio............................................ 3,0 g. Agua destilada c.s.p. ....................................... 1 lt. pH = 6,7 ± 0,1

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AGAR NUTRITIVO Extracto de carne..................................... 3,0 g. Peptona de carne...................................... 5,0 g. Agar....................................................... 15,0 g. Agua destilada c.s.p. .................................. 1 lt. AGAR CETRIMIDA Peptona de gelatina....................................................... 20,0 g. Cloruro de Magnesio...................................................... 1,4 g. Sulfato de potasio......................................................... 10,0 g. N-cetil-N,N,N-trimetilamoniobromuro (cetrimida).......... 0,3 g. Agar............................................................................. 13,6 g. Agua destilada c.s.p. ..........................................................1 lt. pH = 7,2 ± 0,2 Aditivo: glicerina 10 ml AGAR MOSSEL Peptona de carne.............................................. 10,0 g. Extracto de carne............................................... 1,0 g. D (-) manita.................................................... 10,0 g. Cloruro de sodio.............................................. 10,0 g. Rojo de fenol................................................. 0,025 g. Agar................................................................ 12,0 g. Agua destilada c.s.p. ......................................... 0,9 lt. ADITIVOS: Luego de autoclavar, agregar 100 ml. de una emulsión de yema de huevo al 50 % y 0,1/0,01 g. de Polimixina B. EMULSIÓN DE YEMA DE HUEVO: Huevos de gallina frescos se lavan durante varias horas en etanol al 70 %. Luego se flamean y se abren asépticamente. Bajo condiciones de esterilidad, se separan las yemas de las claras. Se mezclan homogeneamente 50 ml. de yema de huevo con 50 ml. de solución fisiológica estéril, utilizando un homogeneizador de pequeña velocidad de rotación (para evitar formación de espuma). POLIMIXINA B: Solución estéril (por filtración). AGAR EMB (LEVINE) Peptona de carne............................................ 10,0 g. Di-potasio hidrógeno fosfato............................ 2,0 g. Lactosa.......................................................... 10,0 g. Eosina yellow................................................... 0,4 g. Azul de metileno........................................... 0,065 g. Agar............................................................... 15,0 g. Agua destilada c.s.p. .......................................... 1 lt. pH = 7,0 ± 0,2

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AGAR MAC CONKEY Peptona de caseína.......................................... 17,0 g. Peptona de carne............................................... 3,0 g. Cloruro de sodio............................................... 5,0 g. Lactosa........................................................... 10,0 g. Sales biliares..................................................... 1,5 g. Rojo neutro.................................................... 0,03 g. Cristal violeta............................................... 0,001 g. Agar.............................................................. 13,5 g. Agua destilada c.s.p. .......................................... 1 lt. pH = 7,1 ± 0,1 AGAR MANITA SAL COMÚN ROJO DE FENOL Peptona de carne........................................... 10,0 g. Extracto de carne............................................ 1,0 g. Cloruro de sodio........................................... 75,0 g. D (-) manita.................................................. 10,0 g. Rojo de fenol.............................................. 0,025 g. Agar............................................................. 12,0 g. Agua destilada c.s.p. ......................................... 1 lt. pH = 7,4 ± 0,1 AGAR ALMIDON Extracto de carne.......................................... 3,0 g. Peptona......................................................... 5,0 g. Almidón soluble............................................ 2,0 g. Agar........................................................... 25,0 g. Agua destilada c.s.p. ....................................... 1 lt. pH = 7,2 ± 0,1 AGAR LECHE Triptona…………………………………5 g Extracto de levadura………………….. 2,5g Glucosa …………………………………1g Agar……………………………………. 15g Leche descremada 10%........................... 20 ml Agua destilada……………………… …..980 ml AGAR YEMA DE HUEVO Triptona………………………… 5 g Extracto de levadura……………. 2,5 g Glucosa…….…………………… 1 g Agar………………………………..15 g Solución de yema de huevo 5% …..100 ml Agua destilada …………………….900 ml

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Solución de yema de huevo 5%: Lavar huevos de gallina frescos durante 30 minutos en etanol 70%. Luego se abren asépticamente. Bajo condiciones de esterilidad se separan las claras de las yemas. Se mezclan homogéneamente 5 ml de yemas de huevo con 95 ml de sc. fisiológica estéril. AGAR HIERRO DE KLIGLER Extracto de carne.......................................... 3,0 g. Extracto de levadura..................................... 3,0 g. Peptona....................................................... 15,0 g. Proteosa peptona........................................... 5,0 g. Lactosa....................................................... 10,0 g. Dextrosa(glucosa)......................................... 1,0 g. Sulfato ferroso.............................................. 0,2 g. Cloruro de sodio........................................... 5,0 g. Tiosulfato de sodio....................................... 0,3 g. Rojo fenol..................................................0,024 g. Agar...............................................................12 g. Agua destilada c.s.p. ....................................... 1 lt. pH = 7,4 AGAR ROGOSA Peptona de caseína...................................... 10,0 g. Extracto de levadura..................................... 5,0 g. D (+) glucosa.............................................. 20,0 g. Potasio di-hidrógeno fosfato......................... 6,0 g. Citrato de amonio......................................... 2,0 g. Polioxietilen sorbitan monoleato................... 1,0 g. Acetato de sodio......................................... 15,0 g. Sulfato de magnesio.................................. 0,575 g. Hierro II sulfato........................................ 0,034 g. Sulfato de manganeso................................. 0,12 g. Agar........................................................... 15,0 g. Agua destilada c.s.p. ....................................... 1 lt. pH = 5,5 ± 0,1 AGAR SELECTIVO PARA ACTINOMYCETES (AS) Caseinato de Na 2 g/l Almidón 5 g/l K2HPO4 0,5 g/l MgSO4 0,2 g/l FeCl3 0,01 g/l Agar-agar 15 g/l Agua destilada 1000 ml pH 7 Preparar 1000 ml y fraccionar en frascos de a 150 ml cada uno.

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AGAR MUELLER-HINTON Infusión de carne..........................................5,0 g. Caseina hidrolizada.....................................17,5 g. Almidón........................................................1,5 g. Agar............................................................12,5 g. pH = 7,4 ± 0,2

COLORANTE ESCALA de pH

COLOR Ácido - Alcalino

ROJO DE METILO

4,4 – 6,0

Rojo - Amarillo

ROJO NEUTRO

6,8 – 8,0

Rojo - Amarillo

ROJO FENOL

6,8 – 8,4

Amarillo - Rojo

ROJO CRESOL

7,2 – 8,8

Amarillo - Rojo

AZUL CON BROMO TIMOL

6,0 – 7,6

Amarillo - Azul

PÚRPURA CON BROMO CRESOL

5,2 – 6,8

Amarillo - Púrpura

FENOLFTALEINA

8,3 - 10,0

Incoloro - Rojo

VERDE CON BROMO CRESOL

3,8 - 5,4

Amarillo - Azul