VALIDACION E IMPLEMENTACION DE UNA METODOLOGIA …CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA D.C. 10...

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VALIDACION E IMPLEMENTACION DE UNA METODOLOGIA PARA EL ANALISIS

MICROBIOLOGICO DE UN PRODUCTO LÍQUIDO PRESERVADO EL ABORADO EN UNA

INDUSTRIA FARMACEUTICA

AUTOR

DIANA SOFIA ORTIZ GOMEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

BOGOTA D.C. 10 DE ENERO DE 2008

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NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral

católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes

bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

3




AUTOR


APROBADO

________________________ ________________________

Ana Maria González Acero Jannet Arias P

Microbióloga Industrial Bacterióloga MS c

Director Asesor

________________________ ________________________

Cindi C. Fernandez Jasmin Rivera Can tillo

Microbióloga Industrial Química Farmacéutica

Jurado Jurado

4




AUTOR


APROBADO

________________________ ____________________________

Angela Umaña MPh Jannet Arias Palacio s. MSc

Decana Académica Director de Carrera Micr obiología

5

AGRADECIMIENTOS

Agradezco infinitamente a Dios por estar presente en mi vida cada segundo, colocando

siempre las personas mas indicadas para sacar adelante todos mis proyectos.

Gracias a mi familia, a mi mamá sobre todo por la confianza y el eterno amor con que me ha

apoyado SIEMPRE.

A cada una de las personas de Merck S.A. Quienes fueron parte importante para el

cumplimiento de mi trabajo de grado.

6

TABLA DE CONTENIDO

Página

1 INTRODUCCION 1

2 MARCO TEORICO 2

2.1 Calidad en la Industria Farmacéutica 2

2.2 Control de Calidad 4

2.3 Buenas practicas de manufactura (BPM) 4

3 CONCEPTOS DE VALIDACIÓN 5

3.1 VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ALTERNATIVOS 5

3.2 TIPOS DE VALIDACIÓN 5

3.2.1 Validación Prospectiva 5

3.2.2 Validación Concurrente 6

3.2.3 Validación Retrospectiva 6

3.2.4 Revalidación 7

3.3 TIPOS DE PRUEBAS MICROBIÓLOGICAS 7

3.4 PARAMETROS A VALIDAR EN UNA PRUEBAS CUALITATIVA 7

3.4.1 Especificidad 8

3.4.2 Límite de Detección 8

3.4.3 Tolerancia 8

3.4.4 Robustez 8

7

3.5 PARAMETROS A VALIDAR PARA LA ESTIMACIÓN CUANTITATIVA DE MICROORGANISMOS VIABLES EN UNA MUESTRA

8

3.5.1 Exactitud 9

3.5.2 Precisión 9


3.5.4 Límite de Cuantificación 10

3.5.5 Linealidad 10

3.5.6 Límite de Detección 10

3.5.7 Intervalo 10

3.5.8 Tolerancia 10

3.5.9 Robustez 11

3.6 PRESERVANTES 11

3.6.1 PRESERVANTES CONTENIDOS EN EL PRODUCTO A VALIDAR 11

3.6.1.1 Metil-Parabeno 11

3.6.1.2 Descripción 12

3.6.1.3 Propiedades. 12

3.6.1.3.1 Actividad antimicrobiana 12

3.6.1.3.2 Incompatibilidad 13

3.6.1.3.3 Seguridad 13

3.6.2 Propilparabeno 14

3.6.2.1 Descripción 14

3.6.2.2 Propiedades 15

8

3.6.2.2.1 Actividad antimicrobiana 15

3.6.2.2.2 Incompatibilidad 16

3.6.2.2.3 Seguridad 16

4 FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 17

5 OBJETIVOS 18

5.1 Objetivo General 19

5.2 Objetivos Específicos 19

6 MATERIALES Y METODOS 19

6.1.1 Método cuantitativo para Recuento de Bacterias Mesofilos Aerobios y Recuento de Hongos y Levaduras 19

6.1.2 Método cualitativo Ausencia o Presencia de Escherichia coli 19

6.2 MATERIALES Y MÉTODOS CUANTITATIVOS 19

6.2.1 Medios de cultivo y reactivos 19

6.2.2 Estándares 20

6.3 METODOLOGIA 20

6.3.1 Preparación de inóculos Bacterianos 20

6.3.2 Preparación de inóculo Levadura 21

6.3.3 Preparación de inóculos Hongo Filamentoso 21

6.3.4 Preparación del Placebo (Medio Cultivo + Producto) 22

6.3.5 Preparación del Estándar 22

6.3.6 Preparación del Ensayo 22

6.3.7 Siembra 22

9

6.4 METODOLOGIA PARAMETROS CUANTITATIVOS 23

6.4.1 EXACTITUD (USP 30, 2007) 23

6.4.2 PRECISIÓN (USP 30, 2007) 23

6.4.2.1 Precisión del método 23

6.4.2.2 Precisión intermedia (Repetibilidad) 24

6.4.3 SELECTIVIDAD (USP 30, 2007) 24

6.4.4 ROBUSTEZ (USP 30, 2007) 24

6.5 MATERIALES Y MÉTODOS CUALITATIVOS 25

6.5.1 Reactivos y medios de cultivo 25

6.5.2 Estándares 25

6.6 METODOLOGÍA 26

6.6.1 Preparación del inóculo bacteriano 26

6.6.2 Preparación del Placebo (Medio Cultivo + Producto) 26

6.6.3 Robustez 26

6.6.4 Linealidad 27

6.6.5 Límite de detección 27


7 RESULTADOS Y DISCUSION 29

7.1 Verificación de Calibración de equipos utilizados en la Validación 29

7.2 Estandarización 29

7.2.1 Estandarización de curva 29

10

7.2.3 Estandarización de la Metodología 29

7.3 RESULTADOS PARAMETROS CUANTITATIVOS 30

7.3.1 Selectividad 30

7.3.2 Exactitud 34

7.3.2.1 Recuento de Bacterias Mesófilas Aerobias 34

7.3.2.2 Recuento de Mohos y Levaduras 37

7.3.3 Precisión 42

7.3.3.1 Precisión del Sistema 42

7.3.3.2 Precisión del método 43

7.3.3.3 Precisión Intermedia (Entre Analistas y entre días) 46

7.3.3.3.1 Precisión Entre Analistas. Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias

48

7.3.3.3.2 Precisión Entre Días. Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias 48

7.3.3.3.3 Precisión Entre Analistas. Recuento de Mohos y Levaduras 48

7.3.3.3.4 Precisión Entre Días. Recuento de Mohos y Levaduras 48

7.3.4. Robustez 50

7.4. RESULTADOS PARÁMETROS CUALITATIVOS 54

7.4.1 Linealidad 54

7.4.2. Limite de detección y especificidad 57

7.4.3. ROBUSTEZ 61

8. CONCLUSIONES 65

9. RECOMENDACIONES 66

11

10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67

ANEXOS 68

12

INDICE DE TABLAS

Página

1 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Bacillus subtilis ATCC 6633 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 30

2 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Escherichia coli ATCC 8739 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 31

3 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Staphylococcus aureus ATCC 6538 en la prueba Cuantitativa de Selectividad

31

4 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 32

5 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Salmonella enterica ATCC 14028 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 32

6 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Aspergillus niger ATCC 16404 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 33

7 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 33

8 (%) Porcentaje de Recuperación de Bacterias Mesofilas Aerobias 35

9 (%) Porcentaje de Recuperación de Mohos y Levaduras 38

10

Promedios de los Recuentos de los microorganismo estándares: Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Precisión del Sistema.

42

11

Promedios de los Recuentos de los microorganismo estándares: Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Precisión del método.

44

12

Promedios de los Recuentos del microorganismo estándar: Staphylococcus aureus ATCC 6538 en la prueba Cuantitativa de Precisión del Intermedia.

47

13

13 Promedios de los Recuentos del microorganismo estándar: Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Precisión de Intermedia.

49

14 Robustez para el ensayo de Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias con la variación de Incubadora Memmert TV-30.

51

15 Robustez para el ensayo de Recuento de Mohos y Levaduras con la variación del medio de cultivo: Agar PDA 52

16 Concentración Vs UFC/mL para el microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. Parámetro Cualitativo: Linealidad. 54

17 Concentración Vs UFC/mL para el microorganismo Staphylococcus aures ATCC. Parámetro Cualitativo: Linealidad. 55

18 Concentración Vs UFC/mL para el microorganismo Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Parámetro Cualitativo: Linealidad. 56

19 Parámetro Cualitativo: Límite de Detección. Microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. 58

20 Parámetro Cualitativo: Límite de Detección. Microorganismo Staphylococcus aureus ATCC 6538. 58

21 Parámetro Cualitativo: Límite de Detección. Microorganismo Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. 58

22 Parámetro Cualitativo: Especificidad Microbiana. 60

23 Parámetro Cualitativo: Robustez. Para el Microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. 62

14

TABLA DE GRAFICAS

Página

GRAFICA 1 Curva de Regresión para el microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. Parámetro Cualitativo: Linealidad. 54

GRAFICA 2 Curva de Regresión para el microorganismo Sthapylococcus aureus ATCC 6538. Parámetro Cualitativo: Linealidad 55

GRAFICA 3 Curva de Regresión para el microorganismo Pseudomonas aeruginosa ATCC. Parámetro Cualitativo: Linealidad 56

15

RESUMEN

En la presente tesis se desarrollo la validación e implementación de una metodología para el

análisis microbiológico de un producto liquido preservado con parabenos, elaborado en una

industria farmacéutica; basándose en las técnicas de análisis propuestas por la United

States Pharmacopeia versión XXX año 2007.

Para el desarrollo de la presente validación se procedió a trabajar con un producto

farmacéutico líquido preservando con metilparabeno y propilparabenos, preservantes

utilizados en las formulaciones de industrias farmacéuticas.

Para el desarrollo de la validación se trabajo con microorganismos estándares sugeridos por

la USP 30.2007; para los ensayos cuantitativos se trabajo con Staphylococcus aureus

ATCC6538 y Candida albicans ATCC10231.

Para los ensayos cualitativa se trabajó con Escherichia coli ATCC8739, Staphylococcus

aureus ATCC6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027.

Los resultados obtenidos estuvieron conforme a los esperados basándose en la teoría y con

la metodología seguida de la Pharmacopea. The United States Phamacopeia logrando

obtener resultados que dan cumplimiento a los criterios establecidos por la USP 30.2007.

Confiriendo así la aprobación de la validación de la técnica de análisis microbiológico para

el control de calidad de un producto liquido preservado, elaborado en un laboratorio

farmacéutico.

Se obtuvo una metodología exacta con un porcentaje de recuperación mayor del 70%, con la

capacidad de ser específica para los diferentes microorganismos ensayados, evidenciando

así la aptitud de la técnica para detectar un panel de microorganismos.

La metodología descrita en este trabajo presento ser precisa evidenciando coeficientes de

variación menores 35%; comprobando la metodología propuesta presenta un grado de

coincidencia entre los resultados de las pruebas individuales cuando el procedimiento se

aplica repetidamente por un mismo o diferente analista y aun cuando se aplica la

metodología en días diferentes.

16

También se demostró ser robusta al indicar coeficientes de variación menores al 15% siendo

sometida la técnica a variaciones como lo fueron el cambio de incubadora para el recuento

bacteriano y el uso de un agar nutritivo diferente para el recuento de mohos y levaduras

Se constata que la técnica posee la capacidad de detectar el microorganismo patógeno

Escherichia coli ATCC9637 mostrando crecimientos proporcionales a las concentraciones

establecidas en el parámetro de linealidad y también evidenciando el numero mas bajo de

células viables en una muestra bajo condiciones experimentales establecidas como lo

presento en el parámetro de limite de detección.

Por tanto la metodología descrita se considera reproducible y robusta al tener la capacidad

de no ser afectada por variaciones al desarrollar la técnica, generando así resultados

confiables y precisos.

17

ABSTRACT

In the present tesis, the validation and implementation of a methodology for microbiological

analysis of a liquid product preserved with parabenos were developed. The analyzed

product was produced by a pharmaceutical company, based on the analysis methods

proposed by the United States Pharmacopeia, version XXX, year 2007.

A liquid pharmaceutical product, preserved with metilparabeno and propilparabenos used by

pharmaceutical companies, was used for the development of this validation.

Standard microorganisms suggested in the USP 30.2007 were used during the validation

work for carrying out quantitative tests for Staphylococcus aureus and Candida albicans , and

qualitative tests for Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.

The results were in agreement with those expected according to the theory and to the

methodology followed from the United States Pharmacopeia, and therefore the obtained

results were in compliance with the criteria established by the USP 30.2007. An accurate

methodology, specific for each different microorganism, was achieved with recovery

percentages that exceeded 70%.

The methodology showed to be accurate, evidencing variation coefficients lower than 35%. It

also proved to be robust since it showed variation coefficients lower than 15% when it was

subject to different variation tests (individual tests, multiple tests, change of culture media,

change of incubators, retesting performed by different analysts, and application of the

methodology in different dates).

It was proved that the methodology has enough acid properties to detect the patogen

microorganism Escherichia coli, showing growths that were proportional to the etablished

linearity concentrations; It was also evidenced that the lowest number of viable cells in a

sample under pre-established experimental conditions was obtained, such as it was shown in

the parameter of limit of arrest (detection limit).

Consequently, the above described methodology is considered reproducible and robust

because it has proven not to be affected by variations during the method development,

therefore generating accurate and reliable results.

18

INTRODUCCION

En la actualidad se ha generado una gran aceptación e interés por los temas relacionados

con seguridad y calidad de los productos farmacéuticos, teniendo presente que estos son

productos vitales dentro de la asistencia de la salud. Es por esto que día a día se recurre a la

implementación de nuevas tecnologías y fórmulas farmacéuticas con el fin de desarrollar

sistemas rigurosos de calidad que proporcionen y aseguren al consumidor un producto de

alta calidad que cumpla con las especificaciones.

Adicionalmente, la industria farmacéutica debe velar por el total cumplimiento de la

normatividad nacional e internacional en casos de exportación de fármacos, teniendo

presente que los procedimientos deben estar validados para su implementación y

cumplimiento de la legislación, en el caso de la industria farmacéutica colombiana la

normatividad se basa principalmente en BPM, FDA y USP.

La validación de un proceso toma gran relevancia en el mismo, ya que es la demostración

escrita y experimental con un alto grado de confianza que un transcurso específico arrojará

de forma consistente y permanente productos que poseerán las características de calidad

predefinidas.

Para lograr obtener una producción de fármacos que cumpla con los requerimientos del

consumidor se deben evaluar muchos aspectos importantes que intervienen en dicha

producción como lo son la infraestructura, procedimientos, documentación y procesos como

muestreo, fabricación, análisis y evaluación de todos los factores que intervienen en el

proceso productivo, asegurando que sean bajo las condiciones que garantizan que los

materiales y productos son liberados para su uso, venta o suministro con un alto nivel de

calidad que ha sido juzgado como satisfactorio.

La evaluación de calidad microbiológica de materias primas, material de envase y/o un

producto farmacéutico terminado, juega un papel importante dentro de las características

que le confieren la calidad a un fármaco, ya que la valoración de los microorganismos

presentes reflejara la calidad de los mismos y el proceso de producción al cual fueron

sometidos. Es indispensable conocer las especificaciones microbiológicas de cada uno de

los productos farmacéuticos a analizar, ya que el recuento total de microorganismos

presentes, o la ausencia o presencia de determinados microorganismos patógenos en el

19

producto pueden conferirle la conformidad o no al producto final, con el objetivo de liberar

siempre productos de alta calidad que no atenten contra el paciente y/o pueda presentar

carga microbiana que afecte las características fisicoquímicas del producto.

Por lo anterior resulta útil la implementación y la validación de la técnica de análisis

microbiológico para un producto liquido preservado, para así asegurar que el procedimiento

utilizado para el recuento total de microorganismos y la Ausencia/Presencia de Escherichia

coli, es el adecuado en el control de calidad del producto farmacéutico mencionado.

2. MARCO TEORICO

2.1 Calidad en la industria farmacéutica

En la industria farmacéutica, existen aspectos fundamentales como lo son la infraestructura,

procedimientos y procesos, necesarios para garantizar la producción de fármacos que

cumplan con todos los requerimientos del consumidor, están convocadas dentro del sistema

de garantía de calidad, la cual se caracteriza por ser una herramienta administrativa que

apoya las diferentes etapas de producción generando así mismo productos de alta calidad y

reconocimiento ante sus clientes.

Los conceptos de garantía de la calidad, BPM, y control de la calidad constituyen aspectos

de la administración de la calidad que se relacionan entre sí. (WHO, 1999)

El desarrollo de la industria farmacéutica ha determinado que se realicen los mayores

esfuerzos para optimizar los procesos productivos y los sistemas de control con el fin de

garantizar que los productos farmacéuticos obtenidos son confiables y cumplen

satisfactoriamente los requerimientos farmacológicos y terapéuticos. (Montalvo, 1989)

2. 2. Control De Calidad

El control de calidad es una parte de las Buenas Practicas de Manufactura que agrupa las

normas acerca de organización, documentación y procesos como muestreo, fabricación,

análisis y evaluación de todos los factores que intervienen en el proceso productivo,

asegurando que cada proceso es llevado a cabo bajo las condiciones que garantizan que los

materiales y productos son liberados para su uso, venta o suministro con un alto nivel de

calidad que ha sido juzgado como satisfactorio. El control de calidad no esta confinado a

20

operaciones de laboratorio, debe estar involucrado en todas las decisiones concernientes a

la calidad del producto. (WHO, 1999)

Debe existir un departamento de control de calidad independiente del departamento de

producción, que permita realizar evaluaciones objetivas en pro del mejoramiento continuo.

Los requerimientos básicos para el control de calidad son:

a. Instalaciones adecuadas, personal entrenado y procedimientos aprobados. Los

documentos deben encontrarse disponibles para cada etapa del proceso de calidad,

muestreo, inspección y evaluación de materias primas, materiales de empaque, granel y

producto terminado; y donde sea apropiado cuando se realiza monitoreo de condiciones

ambientales para los propósitos de las buenas prácticas de manufactura.

b. Los métodos de ensayo deben ser validados

c. Los registros deben ser hechos demostrando que todos los muestreos, inspecciones

y procedimientos de ensayo requeridos están siendo llevados a cabo y que cualquier

desviación ha sido totalmente registrada e investigada.

d. Los productos terminados deben ser evaluados para asegurar que contienen la

composición cualitativa y cuantitativa de los componentes descritos en su envase de

comercialización; los componentes deben ser de la pureza requerida, adquiridos de

proveedores calificados, en recipientes adecuados y correctamente etiquetados.

e. Los registros deben ser una fiel reproducción de los hechos, de los resultados de la

inspección de producto terminado, granel e intermedio contra las especificaciones. La

evaluación del producto debe incluir una revisión e inspección de la documentación y una

evaluación de las desviaciones de los procedimientos especificados

f. Los lotes de producto no pueden ser liberados para la venta o suministrados sin

antes obtener la certificación del personal autorizado que esta acorde con los requerimientos

de comercialización.

g. Una muestra suficiente de materias primas y productos, deben ser retenidos para

permitir la evaluación futura de estos, si fuera necesario; el producto retenido debe ser

guardado en su empaque final.

21

El departamento de control de calidad como un todo, debe tener otras obligaciones tales

como establecer, validar e implementar todos los procedimientos de control de calidad a

evaluar, mantener y almacenar los estándares de referencia para sustancias; asegurar el

correcto etiquetado de recipientes de materias y productos; asegurar que la estabilidad de

los ingredientes activos y los productos estén monitoreados; participar en quejas

relacionadas con la calidad del producto y participar en el monitoreo ambiental. Todas

estas operaciones deben ser llevadas a cabo en concordancia con los procedimientos y

registros escritos.

La evaluación de producto terminado debe abarcar todos los factores relevantes, incluyendo

las condiciones de producción, los resultados de inspección en proceso, la documentación

de manufactura incluyendo el empaque, el cumplimiento con la especificación para el

producto terminado y una evaluación del empaque final. (WHO, 1999).

De esta forma el control de calidad se puede definir como el sistema que tiene como

finalidad lograr una producción uniforme para colocar en el mercado productos cuyas

especificaciones correspondan a lo ofrecido, siendo el elemento que en las plantas

industriales favorece el incremento de la eficiencia y productividad. (Montalvo, 1989)

2.3. Buenas Prácticas De Manufactura (BPM)

Buenas practicas de manufactura son una herramienta del aseguramiento de calidad

mediante la cual se confirma o asegura que los productos están consistentemente

controlados y producidos con estándares de calidad apropiados para su uso planeado y

como es requerido para su comercialización.

Las BPM son dirigidas primariamente a disminuir riesgos inherentes en cualquier etapa de la

producción farmacéutica, que puedan alterar la calidad del producto final. La principal

finalidad es llegar a la prevención de dos tipos principales de riesgo: Contaminación cruzada

y confusiones causadas por mal etiquetamiento en los contenedores o recipientes. (WHO,

1999)

22

3. CONCEPTOS DE VALIDACION

3.1. VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ALTERNAT IVOS

La validación de un método microbiológico es un proceso importante para la implementación

de una técnica analítica microbiológica, ya que por medio de la validación de dicho método

se logra establecer de forma experimental que las características de desempeño del método

cumplen con los requisitos para la aplicación prevista. (USP XXX, 2007)

Para la recuperación e identificación microbiana, en análisis microbiológicos, son ajustadas

a veces a métodos alternativos a los descritos en la USP por diversas razones, tales como

económicas, de producción y conveniencia. Por tanto estos métodos requieren validación.

(USP XXX, 2007)

En los estudios de validación de métodos microbiológicos alternativos es importante tener

en cuenta un importante grado de variabilidad. Cuando se llevan a cabo pruebas

microbiológicas por conteo en placa convencional, el cual es el método a escogido para el

presente trabajo; se puede llegar a encontrar resultados con porcentajes de desviación

estándar relativa de 15 a 35 ya que muchos métodos microbiológicos convencionales están

sujetos a errores de muestreo, de dilución, de incubación y del operador. (USP XXX, 2007)

La importancia de la validación de las técnicas analíticas en el análisis de un producto es

gran utilidad e importancia ya que ante todo es parte esencial de las BPM´v (Buenas

Practicas de Manufactura Vigentes) ya que es una forma certera y consistente de afirmar

cuando un proceso esta conforme, es exacto y reproducible.

También es un gran aporte a la reducción de costos y la optimización de procesos ya que las

técnicas se desarrollan con eficacia, rapidez y seguridad, disminuyendo el tiempo muerto en

equipos.

3.2. TIPOS DE VALIDACION

3.2.1. Validación Prospectiva

Este tipo de validación se basa en información obtenida antes de implementar los procesos

de validación. Se realiza durante la etapa de desarrollo, mediante un análisis de riesgos del

proceso de producción, que se divide en pasos individuales, estos se evalúan entonces a la

23

luz de la experiencia para determinar si podría concluir a situaciones criticas; se investigan

posibles causas y se determina la probabilidad de que suceda y su magnitud, se trazan los

planes de ensayo y se fijan las prioridades; a continuación se efectúa y se evalúan los

ensayos y se hace una valoración general; si los resultados son aceptables al final, el

procesos es satisfactorio. Los procesos no satisfactorios se deben modificar y mejorar hasta

que una nueva validación demuestre su carácter satisfactorio. Este tipo de validación es

importante para limitar el riesgo de errores que se producen a escala de producción, por

ejemplo, en la preparación de productos inyectables. (Comisión Europea, 2001)

3.2.2. Validación Concurrente

La información requerida en este tipo de validación se obtiene durante la implementación del

mismo. Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de la variable critica que

demuestre que el proceso esta bajo control y el riesgo de datos sobre la marcha de los

procesos en estado productivo. (Comisión Europea, 2001)

Para otros autores la validación concurrente es el establecimiento de evidencia

documentada para demostrar que un proceso cumple con su propósito, basados en

información obtenida durante la implementación del mismo. Se debe tener en cuenta el

monitoreo en proceso de las variables criticas que demuestren que el proceso esta bajo

control y el registro de datos sobre la marcha del proceso en estado productivo. Este es el

tipo de validación aplicado al trabajo en curso. (Rojas.1997)

3.2.3. Validación Retrospectiva

Este tipo de validación se lleva a cabo por medio de la revisión y análisis de la información

histórica del proceso. Se deben tomar como mínimo 20 a 30 lotes que cuenten con reportes

analíticos sólidos y confiables, documentación que muestre condiciones de los procesos y

estudios de reclamos de los productos, entre otros. Dentro de este tipo de validación es

necesario tener en cuenta el control de la materia prima, controles ambientales, controles

microbiológicos, equipos, procedimientos, métodos analíticos y especificaciones; es aplicada

para productos que se encuentran en el mercado y cuyo proceso de manufactura se

considera estable, además cuando por las características del producto, económicamente no

se justifica hacer una validación prospectiva. La validación retrospectiva también puede ser

útil en el establecimiento de las prioridades en un programa de validación (Comisión

Europea, 2001)

24

3.2.4. Revalidación

Es la repetición de un procedimiento de validación o en parte del mismo.

Se aplica cuando se presentan cambios de algunos de los componentes críticos de la

formulación, cambio o reemplazo de una pieza critica en un sistema o equipo, cambio de

instalaciones, cambio del tamaño del lote de fabricación y por unidades producidas fuera de

especificaciones (Comisión Europea, 2001)

3.3. TIPOS DE PRUEBAS MICROBIÓLOGICAS

Existen tres tipos principales de determinaciones propias de las pruebas microbiológicas,

entre las que se incluyen pruebas para determinar si los microorganismos están presentes

en una muestra (Ausencia/ Presencia), pruebas para cuantificar el número de

microorganismos (o Recuento de microorganismos presentes en la muestra) y pruebas

destinadas a identificar microorganismos.

Este trabajo se basara en la determinación de Ausencia o Presencia de un microorganismo

Bacilo Gram. Negativo (Escherichia coli) y la prueba de cuantificación de microorganismos

presentes en la muestra, esto basado en la especificación analítica del producto

farmacéutico. (USP XXX, 2007)

El método de recuento en placa es el método escogido para la estimación del número de

microorganismos viables presentes en una muestra. Teniendo en cuenta que existen otros

métodos también usados como lo son el método de filtración por membrana y el

Método del Numero Más Probable (NMP).

3.4. PARAMETROS A VALIDAR EN UNA PRUEBAS CUALITATIV A

Con el fin de evaluar y demostrar la existencia de microorganismos viables en una muestra

se deben tener en cuenta los parámetros descritos a continuación, aunque es importante

tener presente que no todas las características son aplicables a cada procedimiento analítico

o a cada material. Ello depende en gran medida del propósito al cual se desea aplicar el

procedimiento.

25

3.4.1. Especificidad

La especificidad de un método microbiológico es la capacidad, para detectar una gama de

microorganismos que pueden estar presentes en la muestra. Este problema se enfrenta de

manera adecuada a través de la promoción del crecimiento en los medios para métodos

cualitativos que dependen del crecimiento para demostrar la presencia o ausencia de

microorganismos. (USP XXX, 2007)

3.4.2. Límite de Detección

El limite de detección es el número más bajo de microorganismos en una muestra que

puede detectarse bajo las condiciones experimentales establecidas. (USP XXX, 2007)

3.4.3. Tolerancia

La tolerancia de un método microbiológico cualitativo es el grado de precisión de los

resultados de la prueba obtenidos mediante el análisis de las mismas muestras bajo

diversas condiciones normales de prueba, tales como el empleo de analistas, instrumentos,

lotes de reactivos y laboratorios diferentes. Se puede definir tolerancia como la resistencia

intrínseca a influencias ejercidas por variables operativas y ambientales sobre los resultados

del método microbiológico. (USP XXX, 2007)

3.4.4. Robustez

La robustez de un método microbiológico cualitativo es la medida de su capacidad para no

ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del método,

representa un indicador de su confiabilidad durante uso normal. (USP XXX, 2007)

3.5. PARAMETROS A VALIDAR PARA LA ESTIMACIÓN CUANTI TATIVA DE

MICROORGANISMOS VIABLES EN UNA MUESTRA

Existen dos técnicas disponibles y convenientes para datos microbiológicos. Los datos

crudos de los recuentos pueden transformarse en datos normalmente distribuidos, ya sea

tomando el valor del Log, para ese recuento o calculando la raíz cuadrada del recuento ±1.

Esta última transformación es especialmente útil silos datos contienen recuentos de cero.

(USP XXX, 2007)

26

3.5.1. Exactitud

La exactitud es la proximidad de los resultados de la prueba obtenidos mediante el método

de prueba respecto a los obtenidos por el método tradicional.

Usualmente, la exactitud se expresa como el porcentaje de la recuperación de los

microorganismos mediante el método de valoración. (USP XXX, 2007)

La exactitud de un procedimiento empleado consiste en la proximidad de los resultados

obtenidos al valor real. La exactitud puede determinarse aplicando el procedimiento a las

muestras del material a examinarse, cuando han sido preparadas con exactitud cuantitativa.

Siempre que sea posible, esas muestras deben contener todos los componentes del

material, incluyendo el analito. Deben prepararse también muestras en las que el analito

haya sido incorporado en cantidades de aproximadamente 10% por encima y por debajo de

la gama de valores prevista. También es posible determinar la exactitud comparando los

resultados con los obtenidos empleando otro procedimiento ya comprobado. (OMS, 1996)

3.5.2. Precisión

La precisión de un método microbiológico cuantitativo es el grado de coincidencia entre los

resultados de las pruebas individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente a

muestreos múltiples de suspensiones de microorganismos de laboratorio a lo largo del

intervalo de la prueba. La precisión de un método microbiológico habitualmente se expresa

como la desviación estándar o la desviación estándar relativa (coeficiente de variación).

La desviación estándar relativa esperada en función de UFC/ Placa es la siguiente: (USP

XXX, 2007)

Tabla 1. Desviación Estándar Relativa en función d e la Unidades Formadoras de

Colonia por Placa

UFC/Placa Desviación Estándar Relativa

30-300 <15%

10-30 <25%

<10 <35%

27

3.5.3. Especificidad

La especificidad de un método microbiológico cuantitativo es su capacidad para detectar un

panel de microorganismos aptos para demostrar que el método sirve al objetivo propuesto.

(USP XXX, 2007)

3.5.4. Límite de Cuantificación

El límite de cuantificación es el número más bajo de microorganismos que pueden contarse

con exactitud. (USP XXX, 2007)

3.5.5. Linealidad

La linealidad de una prueba microbiológica cuantitativa es su capacidad para generar

resultados que sean proporcionales a la concentración de microorganismos presentes en la

muestra dentro de un intervalo dado. (USP XXX, 2007)

Linealidad para otros autores es considerado también como un proceso analítico donde

existe la posibilidad de que este produzca resultados que sean directamente proporcionales

a la concentración de analito en la muestra (OMS, 1992)

3.5.6. Límite de Detección

El limite de detección es el número más bajo de microorganismos en una muestra que

puede detectarse bajo las condiciones experimentales establecidas.

3.5.7. Intervalo

El intervalo operativo de un método microbiológico cuantitativo. Es el intervalo que existe

entre los niveles superiores e inferiores de microorganismos que han demostrado poder

determinarse con precisión, exactitud y linealidad.

3.5.8. Tolerancia

La tolerancia de un método microbiológico cualitativo es el grado de precisión de los

resultados de la prueba obtenidos mediante el análisis de las mismas muestras bajo

28

diversas condiciones normales de prueba, tales como el empleo de analistas, instrumentos,

lotes de reactivos y laboratorios diferentes. Se puede definir tolerancia como la resistencia

intrínseca a influencias ejercidas por variables operativas y ambientales sobre los resultados

del método microbiológico.

3.5.9. Robustez

La robustez de un método microbiológico cualitativo es la medida de su capacidad para no

ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del método,

representa un indicador de su confiabilidad durante uso normal.

3.6. PRESERVANTES

Se entiende por preservante las sustancias que se añaden como ingredientes a los

productos cosméticos y/o farmacéuticos principalmente para inhibir el desarrollo de

microorganismos. (Arthur. 2000)

Los parabenos son compuestos no mutagénicos, no teratogénicos y no generan carcinoma.

(Arthur. 2000)

3.6.1. PRESERVANTES CONTENIDOS EN EL PRODUCTO A VALIDAR

3.6.1.1. Metil-Parabeno

El Metilparabeno es comúnmente utilizado en las formulaciones en las industrias

farmacéutica, cosmética, y alimentos como un preservante antimicrobiano.

Este preservante puede ser utilizado de forma individual, en combinación con otros

parabenos u otros agentes antimicrobianos. En la industria cosmética el metilparabeno es el

agente antimicrobiano mas usado.

Los parabenos son efectivos en un rango amplio de pH y tienen un amplio espectro en

cuanto a Hongos y Levaduras, aunque también poseen actividad antimicrobiana. (Arthur.

2000)

29

Es usual la mezcla de diferentes parabenos ya que proporciona mejor efectividad

preservante.

Debido a la baja solubilidad de los parabenos, particularmente son sales de sodio que

frecuentemente son usadas en las formulaciones. (Arthur. 2000)

3.6.1.2. Descripción

El metilparabeno es incoloro cristalino. Este es in saboro o su sabor se hace casi

despreciable.

Fórmula empírica: C8H8O3

Peso molecular: 152,15 g

Estructura molecular:

3.6.1.3. Propiedades.

3.6.1.3.1. Actividad antimicrobiana

El preservante melitparabeno posee actividad antimicrobiana en presencia de pH entre 4-8.

La eficacia del preservante disminuye con incrementos de pH debido a la formación de una

unión fenolito.

Los parabenos poseen mayor actividad en Hongos y Levaduras, aunque también bacteriana,

entre estos son mas efectivos para las bacterias Gram Positivas, aunque también poseen

actividad antimicrobiana para las bacterias Gram Negativas.

30

El metilparabeno es el preservante con menor efectividad de los parabenos.

La actividad antimicrobiana se consigue con la combinación de otros agentes

antimicrobianos. La combinación más usada de parabenos como agentes antimicrobianos

son los metil, etil, propil y butilparabeno (Arthur. 2000)

Tabla 2. Concentración mínima inhibitoria (MICs) de metilparabeno en soluciones

acuosas.

Microorganismos MIC (µg/mL)

Aspergillus níger ATCC 9642 1000


Bacillus subtilis ATCC 6633 2000

Candida albicals ATCC 10231 2000

Escherichia coli ATCC 8739 1000


Pseudomonas aeuroginosas ATCC 9027 4000

Pseudomonas aeuroginosas ATCC 15442 4000

Salmonella typhosa ATCC 6539 1000

Staphylococcus aureus ATCC 6538 2000

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 2000

(Arthur. 2000)

3.6.1.3.2. Incompatibilidad

La actividad antimicrobiana del metilparabeno y otros parabenos es reducida

considerablemente en presencia de surfactantes no nionicos como lo es el polisorbato 80,

debido a una micelizacion. Existe incompatibilidad con otros compuestos como sorbitol,

alginato de sodio, trisilica de magnesio entre otros reportados. (Arthur. 2000)

3.6.1.3.3. Seguridad

El metilparabeno y otros parabenos son usados con frecuencia como preservantes

antimicrobianos en cosméticos y en formulaciones farmacéuticas orales y tópicas. Los

31

parabenos no son usados como preservantes en inyecciones y en preparaciones

oftalmológicas ya que no son apropiados para este tipo de formulaciones debido al potencial

irritante de los parabenos. Estos efectos dependen de la actividad enzimática formada por

los metabolitos de los parabenos en la piel. (Arthur. 2000)

3.6.2. Propilparabeno

El propilparabeno es comúnmente utilizado en las formulaciones en las industrias

farmacéutica, cosmética, y alimentos como un preservante antimicrobiano.

Este preservante puede ser utilizado de forma individual, en combinación con otros

parabenos u otros agentes antimicrobianos. En la industria cosmética el propilparabeno es el

segundo preservante mas usado.

Los parabenos son efectivos en un rango amplio de pH y tienen un amplio espectro en


2000)

Es usual la mezcla de diferentes parabenos ya que proporciona mejor efectividad

preservante.

Debido a la baja solubilidad de los parabenos, estos antimicrobianos son particularmente

sales de sodio que frecuentemente son usadas en las formulaciones. El pH alcalino de

dichas formulaciones se debe a lo anteriormente mencionado. (Arthur. 2000)

3.6.2.1. Descripción

El propilparabeno es un polvo blanco cristalino e inoloro.

Fórmula empirica: C10H12O3

Peso molecular: 180,20 g

32

Estructura molecular:

3.6.2.2. Propiedades.

3.6.2.2.1. Actividad antimicrobiana

El preservante propilparabeno posee actividad antimicrobiana en presencia de pH entre 4-8.

La eficacia del preservante disminuye con incrementos de pH debido a la formación de un

anion fenolito.

Los parabenos poseen mayor actividad en Hongos y Levaduras, aunque también bacteriana,

entre estos son mas efectivos para las bacterias Gram Positivas, aunque también poseen

actividad antimicrobiana para las bacterias Gram Negativas.

El propilparabeno es usado en preparaciones parenterales y es usado en combinación con

otros parabenos en formulaciones tópicas y orales. (Arthur. 2000)

Tabla 3. Concentración mínima inhibitoria (MICs) de propilparabeno en soluciones

acuosas.

Microorganismos MIC (µg/mL)



Bacillus subtilis ATCC 6633 500

Candida albicals ATCC 10231 250



Pseudomonas aeuroginosas ATCC 9027 > 1000

Pseudomonas aeuroginosas ATCC 15442 > 1000

Salmonella typhosa ATCC 6539 500

Staphylococcus aureus ATCC 6538 500

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 500 (Arthur. 2000)

33

3.6.2.2.2. Incompatibilidad

La actividad antimicrobiana del propilparabeno y otros parabenos es reducida

considerablemente en presencia de surfactantes no nionicos, debido a una micelizacion.

Existe incompatibilidad con compuestos como aluminio de magnesio silca, trisilica de

magnesio, oxido de hierro amarillo y azul ultramarino, reportados como agentes reductores

de la eficacia de preservante.

El propilparabeno es incoloro en la presencia de hierro y puede ser débil a una hidrólisis en

presencia alcalina y fuerte en presencia ácida. (Arthur. 2000)

3.6.2.2.3. Seguridad

El propilparabeno y otros parabenos son usados con frecuencia como preservantes

antimicrobianos en cosméticos y en formulaciones farmacéuticas orales y tópicas. Los

parabenos no son usados como preservantes en inyecciones y en preparaciones

oftalmológicas ya que no son apropiados para este tipo de formulaciones debido al potencial

irritante de los parabenos. Estos efectos dependen de la actividad enzimática formada por

los metabolitos de los parabenos en la piel. (Arthur. 2000)

34

4. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

La calidad en un producto farmacéutico debe comprobarse en su totalidad con sistemas

confiables y seguros, con el fin de cumplir con las exigencias farmacopeicas y legislación

farmacéutica vigente y sobre todo por ofrecer a sus clientes un producto eficaz y de alta

calidad. Por tal motivo, la industria farmacéutica ha ido implementando y mejorando

tecnología y metodologías que logren garantizar dicha calidad. Es así, que la validación de

cualquier proceso a realizar toma relevancia y se convierte como indispensable para el

aseguramiento de la calidad de los productos farmacéuticos.

En cualquier tipo de industria el hecho de contar con procesos validados equivale no solo a

producir productos de calidad que le confieran la capacidad de ser efectivos en sus

pacientes, lograr posicionarse en el mercado farmacéutico, sino también obtener procesos

que permitan ahorrar tiempo y dinero ya que se minimizan los riesgos de reproceso por

errores generados durante la ejecución del procesos.

La validación de una técnica analítica microbiológica es de gran importancia en cuanto a la

implementación y desarrollo de la misma, ya que permite la aprobación de su ejecución

teniendo en cuenta que bajo todas las circunstancias analizadas y validadas, arrojará datos

con un alto nivel de confianza ya que en el procesos a validar, permite simular y evaluar

determinadas situaciones posibles.

La validación de una técnica permite generar resultados confiables en futuros análisis,

gracias a un modelo generalizado a partir de datos disponibles de la validación.

Por tal razón se busca validar un técnica analítica para un producto farmacéutico

preservado, que se administra por vía oral; que logre arrojar resultados veraces en cuanto a

sus especificaciones microbiológicas conferidas como lo son: el análisis cuantitativo de

Recuento de Bacterias Aerobias y Recuento de Hongos y Levaduras, y el análisis

cualitativo: Ausencia o Presencia de un microorganismo patógeno como es el caso del bacilo

Gram Negativo; Escherichia coli.

El criterio de escogencia para realizar dicha validación se basa en la exigencia de la USP 30

para realizar recuento de células viables en productos con aditivos preservantes.

35

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general

Implementar y validar una técnica microbiológica para un producto líquido preservado,

elaborado en una industria farmacéutica bajo las recomendaciones de la United States

Pharmacopoeia.

5.2 Objetivos específicos

- Evaluar la veracidad de los resultados obtenidos con la técnica analítica

microbiológica actualmente utilizada para un producto líquido de administración oral,

preservado con parabenos.

- Comprobar la inactivación de los agentes antimicrobianos mediante la recuperación

significativa de los microorganismos utilizados en el ensayo con la metodología propuesta.

- Validar e implementar una técnica analítica microbiológica para un producto liquido

de administración oral preservado con agentes parabenos.

36

6. MATERIALES Y METODOS

Se realizó una validación de tipo concurrente teniendo en cuenta que la validación se baso

en la información recopilada durante el desarrollo de la validación.

6.1.1. Método cuantitativo para Recuento de Bacteri as Mesofilos Aerobios y Recuento

de Hongos Y Levaduras

• Exactitud

• Precisión

• Robustez

• Selectividad

• Linealidad

6.1.2. Método cualitativo Ausencia o Presencia de Escherichia coli

• Linealidad

• Robustez

• Límite de detección

• Especificidad.

6.2. MATERIALES Y METODOS CUANTITATIVOS

6.2.1. Medios de cultivo y reactivos

• BHI (Infusión Cerebro-Corazón)

• Caldo caseína digerida-soya-lecitina Polisorbato 20

• Diluyente MF (Peptona 0,1% + Cloruro de sodio 0,85%)

• Agar CASO

• Agar Glucosa al 4% según Sabouraud

• Agar PDA (Agar Patata Dextrosa)

• Solución TTC (cloruro de trifenil tetrazolio) al 1 %

• Twen 80

37

6.2.2. Estándares

Los microorganismos estándar utilizados para métodos cuantitativos en la validación fueron:

Staphylococcus aureus ATCC 6538, para método de recuento de Mesófilos Aerobios.

Candida albicans ATCC10231 para método de recuento de Mohos y Levaduras.

6.3. METODOLOGIA

6.3.1. Preparación de inóculos Bacterianos

Se realizó aislamientos en Agar Caso, de cada uno de los microorganismos bacterianos

utilizados en el ensayo, obteniendo colonias aisladas de cada uno de estos

microorganismos a partir de Cryobank, (Merck, 2007) en un periodo de incubación de 24

horas en un rango de temperatura entre 30ºC-35ºC.

Posteriormente se transfirió una colonia de las anteriormente aisladas en un frasco schott

estéril de 50mL que contenía 30 mL de caldo BHI (Infusión Cerebro-Corazón) estéril, y se

llevó a incubarlas a temperatura en un rango entre 30ºC - 35ºC en agitación continua por 24

horas.

A partir de cada inóculo obtenido se realizó diluciones decimales seriados y se sembró 1mL

en profundidad por duplicado por cada dilución, adicionando 15-20mL aproximadamente de

Agar Caso.

Para realizar el recuento con mayor facilidad se adicionó al medio nutritivo en su estado

liquido 1mL de solución de trifenil tetrazolium cloruro al 1% (TTC) por cada 100mL de medio

para evidenciar cada una de las colonias crecidas.

El anterior procedimiento se realizó 3 veces en forma individual.

Al final se tuvo en cuenta la dilución que presentó un recuento de >1600UFC/mL como

concentración (Dilución 10-5) y fue la establecida para el desarrollo de cada uno de los

ensayos para el recuento de bacterias mesofilas aerobias.

38

6.3.2. Preparación de inóculo Levadura

Se realizó aislamientos en Agar Sabouraud 4% de la levadura utilizada en el ensayo

(Candida albicans ATCC 10231), y se obtuvo colonias aisladas de dicha levadura a partir de

Cryobank, (Merck, 2007) en un periodo de incubación de 120 horas en un rango de

temperatura entre 20ºC-25ºC.

Posteriormente se transfirió una colonia de las anteriormente mencionadas, a un frasco

schott estéril de 50mL que contenía 30mL de caldo BHI (Infusión Cerebro-Corazón) estéril, y

se llevó a incubar a temperatura en un rango entre 30ºC - 35ºC en agitación continua por 24

horas.

A partir de cada inóculo obtenido se realizó diluciones decimales seriados y se sembró 1mL

en profundidad por duplicado por cada dilución, adicionando 15-20mL aproximadamente de

Agar Sabouraud 4%.



concentración (Dilución 10-2) y fue la establecida para el desarrollo de cada uno de los

ensayos para el recuento de mohos y levaduras.

6.3.3. Preparación de inóculos Hongo Filamentoso

Se realizó siembra masiva en Agar Sabouraud 4% del hongo utilizado en el ensayo

(Aspergillus niger ATCC 16404), obteniendo un crecimiento considerable del hongo

formando un tapete sobre toda la superficie de la caja de petri a partir de Cryobank, (Merck,

2007) en un periodo de incubación de 120 horas en un rango de temperatura entre 20ºC-

25ºC.

Posteriormente se realizó lavado con 15mL de diluyente MF al 0.1% Tween 80 (Anexo) y con

la ayuda de perlas de vidrio estériles; a cada uno de las cajas de petri sembradas.

A partir de cada inóculo obtenido se llevó a un volumen final de 30mL adicionando a cada

uno 15mL mas de diluyente, se realizó diluciones decimales seriados y se sembró 1mL en

profundidad por duplicado por cada dilución, adicionando 15-20mL aproximadamente de

Agar Sabouraud 4%.

39



concentración (Dilución 10-1) y fue la establecida para el desarrollo del ensayo de

selectividad.

6.3.4. Preparación del Placebo (Medio Cultivo+Produ cto)

Se transfirió 10 g de la muestra (producto) en condiciones asépticas a un frasco estéril el

cual contenía 90mL de Caldo caseína digerida-soya-lecitina Polisorbato 20.

6.3.5. Preparación del Estándar

Se tomó un inóculo con su respectiva concentración de microorganismo, del cual se adicionó

1mL a un frasco estéril que contenía 100mL de Caldo caseína digerida-soya-lecitina

Polisorbato 20 estéril.

6.3.6. Preparación del Ensayo

A partir del nivel de concentración apropiado de microorganismos de prueba, se transfirió

1mL a frasco estéril con 90mL de Caldo caseína digerida-soya-lecitina Polisorbato 20, y se

adicionó en condiciones asépticas 10 g de la muestra del producto.

6.3.7. Siembra

A partir deL caldo ensayado con la concentración apropiada para recuento del

microorganismo se transfirió 1mL por triplicado a cajas de petri estéril. Posterior a esto se

agregó un volumen aproximado de 15-20 mL de Agar CASO fundido y Glucosa 4%

Sabouraud para Bacterias y Hongos respectivamente, a una temperatura no mayor de 45ºC.

Se homogenizó la muestra, se dejó solidificar el agar y se llevó a incubar a una temperatura

entre 30°-35ºC por 48 horas para mesófilos aerobios y 20-25ºC por 120 horas para hongos.

Para la siembra del placebo se siguió la misma metodología anteriormente descrita.

40

6.4. METODOLOGIA PARAMETROS CUANTITATIVOS

6.4.1. EXACTITUD (USP 30,2007)

A partir de 10 inóculos preparados cada uno de forma individual y previamente

estandarizado, se procedió a trabajar con la concentración respectivas a cada inoculo, que

se encontraba en el rango establecido.

Se procedió a transferir 1mL de la concentración a trabajar en un frasco schott estéril, con

90mL de Caldo Caseína Digerida-Soya-Lecitina Polisorbato 20, seguido con la adición de

10g de muestra.

Posteriormente a lo anterior se trabajó con un inoculo adicional denominado estándar en el

cual se manejó la misma dilución trabajada en los 10 inóculos anteriormente mencionados.

Al tiempo se realizó la preparación del placebo.

Finalmente se hallaron las medias de cada replica o inóculos en las diferentes

concentraciones, incluyendo a los estándares para la metodología, se realizó análisis de

varianzas ANOVA y posteriormente t Student y se obtuvo el porcentaje de recuperación

según los criterios que exige la USP 30 (2007).

6.4.2. PRECISION (USP 30,2007)

6.4.2.1. Precisión del método

A partir de 10 inóculos preparados cada uno de forma individual y previamente

estandarizado, se procedió a trabajar con la concentración respectivas a cada inoculo, que

se encontraba en el rango establecido.

Se tomó 10 inóculos para realizar 10 réplicas del ensayo, y se determino el recuento.

Posteriormente se procedió a hallar las medias de cada una de las diluciones de las réplicas

del ensayo y determinar el coeficiente de variación de las replicas.

41

6.4.2.2. Precisión intermedia (Repetibilidad)

Se desarrolló la misma metodología de la precisión del método, con la variante de incluir en

los ensayos de precisión entre analistas contando con el desarrollo de la metodología por

parte de un analista No. 2 y entre días de análisis (7 días después del primer análisis) el

cual corresponde al análisis realizado para precisión del método.

Se determinó el recuento y se procedió a hallar las medias de las réplicas de cada uno de

los analistas y entre días y se determinó su coeficiente de variación.

6.4.3. SELECTIVIDAD (USP 30,2007)

Realizar la preparación de inóculo de las cepas de:

• Bacillus subtilis ATCC 6633 (Dilucion 10-1)

• Escherichia coli ATCC 8739 (Dilucion 10-5)

• Staphylococcus aureus ATCC 6538 (Dilucion 10-5)

• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (Dilucion 10-5)

• Salmonella enterica ATCC 14028 (Dilucion 10-6)

• Aspergillus níger ATCC 16404 (Dilucion 10-2)

• Candida albicans ATCC 10231 (Dilucion 10-2)

A partir de cada inóculo se realizó diluciones decimales seriadas hasta obtener un nivel de

concentración establecido como optimo (contable). Se tomó 3 inóculos para realizar la

preparación de los ensayos y simultáneamente se tomó 1 inoculo aparte para la realización

del Estándar (control positivo); también se realizó la preparación del placebo. A partir de los

resultados obtenidos se determino el porcentaje de recuperación como criterio exigido por la

USP 30 (2007).

6.4.4. ROBUSTEZ (USP 30,2007)

Con relación a la evaluación de este parámetro se realizaron las siguientes variables:

• En el ensayo de recuento de bacterias mesofilas aerobias se llevó a incubación las

replicas a dos incubadoras diferentes, ambas incubadoras calibradas en un rango de

temperatura entre 30°C – 35°C.

42

En el ensayo de recuento de hongos y levaduras se realizo la siembra en dos agares

nutritivos diferentes para hongos y levaduras; Agar Sabouraud al 4% y Agar PDA.

Se realizó 3 inóculos para desarrollar la preparación del ensayo y otro inóculo para la

preparación del Estándar.

6.5. MATERIALES Y METODOS CUALITATIVOS

6.5.1. Reactivos y medios de cultivo

• Caldo caseína digerida-soya-lecitina Polisorbato 20

• BHI (Infusión Cerebro-Corazón)

• Diluyente MF (Peptona/Cloruro de sodio)

• Tween 80

• Agar MacConkey

• Agar Baird Parker

• Agar Cetrimide

• Caldo MacConkey

• Agar Citrato

• Prueba bioquímica Urea

• Prueba bioquímica MR-VP

• Prueba bioquímica TSI

• Prueba bioquímica SIM

6.5.2. Estándares

Los microorganismos estándar utilizados para métodos cuantitativos en la validación fueron:

• Escherichia coli ATCC 8739

• Staphylococcus aureus ATCC 6538

• Pseudomonas earuginosa ATCC 9027

43

6.6. METODOLOGIA

6.6.1. Preparación del inóculo bacteriano

Se obtuvo una colonia aislada de cada uno de los microorganismos usados en el ensayo y

se transfirió cada una a un frasco Schott con 30mL de Caldo BHI (Infusión Cerebro-

Corazón), y se llevó a incubación a una temperatura en un rango de 30ºC-35ºC en

agitación continua por 24 horas.

6.6.2. Preparación del Placebo (Medio Cultivo+Produ cto)

Para la preparación del placebo se siguió la misma metodología utilizada en los ensayos de

métodos cuantitativos citada en el numeral 6.3.3.

6.6.3. ROBUSTEZ

Se realizo tres inoculos del microorganismo Escherichia coli. Y se trabajo con la dilución 10-6,

suspensión considerada como la más apropiada por poseer un recuento aproximado entre

50 UFC/mL- 100 UFC/mL.

Para la preparación de los dos ensayos (placebo), del estándar, se siguió la misma

metodología ya explicada en el numeral 6.3.6. (Métodos cuantitativos).

Posterior a esto se llevó 3 frascos con el Caldo del ensayo a incubación por 24 horas, otros

3 frascos a incubación por 17 horas y otros 3 frascos a incubación por 26 horas;

simultáneamente se llevó para cada una de estas horas ensayadas los Caldos definidos

como Estándares.

Para la incubación del placebo se llevó incubación por un periodo de 24 horas.

Todos los ensayos fueron llevados a una temperatura de incubación de 30°C - 35ºC.

Se realizó resiembras en los medios selectivos para el microorganismo ensayado,

Escherichia coli. De tal manera que se tomó 1mL del Caldo de enriquecimiento y se inoculó

en 100mL de Caldo MacConkey el cual se llevó a incubación por 24 horas a temperatura en

un rango de 30°C-35ºC. Posterior a la incubación se realizó un repique en Agar MacConkey

y se llevó a incubación por un periodo de 48 horas a una temperatura de 30°C – 35°C.

44

6.6.4. LINEALIDAD

Se realizó tres preparaciones de inoculo en forma individual de los microorganismos a

ensayar. A partir de cada inoculo se procedió a realizar diluciones decimales seriadas en

base 10 de la dilución 10-1 a 10-10. A partir de cada nivel de concentración por cada inóculo

se sembró 1mL por triplicado y se adiciono entre 15-20 mL de agar CASO con TTC al 1%

fundido a una temperatura no mayor de 45ºC.

Posteriormente se homogenizo el inóculo con el medio de cultivo y se llevó a incubación por

un periodo de 48 horas a 30°C -35ºC.

Para el análisis de datos realizó la curva de crecimiento UFC (unidades formadoras de

colonias) vs. Niveles de concentración y se determino el coeficiente de correlación al

cuadrado de cada uno de los microorganismos ensayados.

Microorganismos a utilizar en el ensayo:

• Escherichia coli ATCC 8533

• Staphylococcus aureus ATCC 6538

• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

6.6.5. LÍMITE DE DETECCIÓN

La preparación del ensayo se realizó a partir del frasco que contenía la concentración más

baja de microorganismos evidenciada por el crecimiento en placa en las tres réplicas del

inóculo y la subsiguiente dilución decimal en la cual no se registró crecimiento en alguna de

las réplicas o en ninguna de estas (descrito en parámetro de linealidad) y se siguió la

metodología de preparación del ensayo, del estándar y placebo como en los métodos

cuantitativos.

Simultáneamente se llevó los frascos del ensayo, del placebo y del estándar a incubación

por un periodo de 24 horas a una temperatura de 30°C - 35ºC. Al completar el periodo de

incubación se realizó la siembra de estos caldos por recuento en placa transfiriendo 1mL por

triplicado y se llevó a incubación por un periodo de 48 horas a temperatura de 30°C - 35ºC.

6.6.6. ESPECIFICIDAD

Al realizar este parámetro se tomó como base los resultados expresados en el parámetro

descrito como límite de detección. Es así como, luego de llevar los caldos del ensayo a

incubación por 24 horas donde se registró crecimiento del microorganismo se realizaron

45

resiembras en medios de cultivo selectivos para cada microorganismo a ensayar con asa

redonda.

Para el microorganismo de interés el cual es Escherichia coli se realizó resiembra tomando

1mL del Caldo de enriquecimiento y se inocula en 100 mL de Caldo MacConkey el cual debe

se llevó a incubación por 24 horas a 30°C - 35ºC. P osterior a la incubación de este último se

hizo una resiembra en Agar MacConkey y se llevó a incubar por un periodo de 48 horas a

30°C -35ºC.

Para la validez de la prueba y evaluación del parámetro además de tomar el microorganismo

prueba o de ensayo que es Escherichia coli, se tomó un microorganismo que posea las

propiedades para ser un control negativo para demostrar que el método es especifico en la

detección de Escherichia coli, por tal motivo se realizaron pruebas con los microorganismos

Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, realizando el mismo procedimiento que

para el microorganismo ensayado (Escherichia coli).

46

7. RESULTADOS Y DISCUSION

7.1. Verificación de Calibración de quipos utilizad os en la Validación

Se revisaron los planes de Verificación, Calificación y Calibración por parte del área de

Metrología para cada uno de los equipos de ensayo y medición del área de Microbiología y

se evidencio respecto a los equipos utilizados en la validación y etapa experimental que su

vigencia con relación a la fecha de calibración, calificación y verificación, se encontraban

vigentes; por consiguiente se puede asegurar que los equipos utilizados funcionan de

acuerdo con sus especificaciones operacionales establecidas.

Cabe también mencionar que el área de Microbiología posee un plan de verificaciones

diarias de calificación y calibración de equipos como estufas de incubación, balanzas

analíticas, cabina de flujo laminar, nevera e indicador de presión diferencial.

7.2. Estandarización

7.2.1. Estandarización de curva

Se realizó estandarización de la curva de cada uno de los microorganismos estándares

utilizados en la validación: Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 8739,

Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella

enterica ATCC 14028, Aspergillus níger ATCC 16404, Candida albicans ATCC 10231; con

el fin de estimar en futuros ensayos las concentraciones aproximadas de cada uno de los

inóculos y determinar la concentración apropiada para el desarrollo de la validación. (Ver

anexo 1)

7.2.2. Estandarización de la Metodología

Previamente a la validación de la técnica para el análisis microbiológico del producto liquido

preservado con parabenos se considero necesario la estandarización de la técnica y la

evaluación de toxicidad, especificidad y tolerancia presentada por parte de los

microorganismos utilizados en los diferentes ensayos frente al caldo utilizado en la

validación (Caldo Lecitina Polisorbato 20). Por tanto se realizaron ensayos previos utilizando

los mismos estándares, medios de cultivo y reactivos empleados en la validación y siguiendo

la metodología necesaria para este fin.

Se determino que:

47

• Los medios de cultivo, reactivos y caldos de dilución con el inactivante (Polisorbato

20) escogidos no presentaron toxicidad alguna para los microorganismos.

• Los medios de cultivo, reactivos y caldos de dilución con el inactivante acogidos,

mostraron la capacidad de recuperar satisfactoria los microorganismos en prueba.

• El inactivantes utilizado en los ensayos (Polisorbato 20), mostró la capacidad de

neutralizar los preservantes parabenos presentes en el producto líquido preservado con

parabenos, el cual fue evidenciado por la recuperación satisfactoria de los microorganismos

de prueba.

• Se evidencio la viabilidad de cada uno de los microorganismos utilizados en los

ensayos gracias a su presencia en recuento en placa.

7.3. RESULTADOS PARÁMETROS CUANTITATIVOS

7.3.1. Selectividad

En este parámetro se busca determinar la capacidad de la técnica para recuperar la cantidad

de microorganismo inoculado inicialmente, siendo evaluado por el porcentaje de

recuperación microbiano, haciendo relación entre el promedio obtenido en cada uno de los

ensayos con el promedio del recuento del estándar multiplicado por 100%. (USP 30.2007)

Tabla No. 1. (%) Porcentaje de Recuperación del mic roorganismo: Bacillus subtilis

ATCC 6633 en la prueba Cuantitativa de Selectividad

Recuentos Obtenidos UFC/mL

Promedio de Recuentos UFC

Porcentaje de Recuperación (%)

739 746 Estándar 744

743

701 689

Placebo Replica No. 1

692 694 93

674 699


691 688 93

671 689


682 681 92

48

Tabla No. 2. (%) Porcentaje de Recuperación del mic roorganismo: Escherichia coli

ATCC 8739 en la prueba Cuantitativa de Selectividad




185

182 Estándar

173

180

203

195 Placebo Replica

No. 1 193

197 109

206

219 Placebo Replica

No. 2 213

213 118

201

196 Placebo Replica

No. 3 193

197 109

Tabla No. 3. (%) Porcentaje de Recuperación del mic roorganismo: Staphylococcus

aureus ATCC 6538 en la prueba Cuantitativa de Selectivida d




459

445 Estándar

451

452

453

452 Placebo Replica

No. 1 452

452 100

451

450 Placebo Replica

No. 2 449

450 100

455

457 Placebo Replica

No. 3 452

455 101

49

Tabla No. 4. (%) Porcentaje de Recuperación del mic roorganismo: Pseudomonas

aeruginosa ATCC 9027 en la prueba Cuantitativa de Selectivida d




349

345 Estándar

353

349

323

329 Placebo Replica

No. 1 336

329 94

319

325 Placebo Replica

No. 2 331

325 93

326

329 Placebo Replica

No. 3 335

330 95

Tabla No. 5. (%) Porcentaje de Recuperación del mic roorganismo: Salmonella enterica

ATCC 14028 en la prueba Cuantitativa de Selectivida d




329

331 Estándar

337

332

324

321 Placebo Replica

No. 1 317

321 96

323

327 Placebo Replica

No. 2 321

324 97

324

319 Placebo Replica

No. 3 316

320 96

50

Tabla No. 6. (%) Porcentaje de Recuperación del mic roorganismo: Aspergillus niger





112

122 Estándar

113

116

101

107 Placebo Replica

No. 1 106

105 90

114

106 Placebo Replica

No. 2 112

111 96

111

103 Placebo Replica

No. 3 109

108 93

Tabla No. 7. (%) Porcentaje de Recuperación del mic roorganismo: Candida albicans





223

211 Estándar

217

217

217

218 Placebo Replica

No. 1 218

218 100

216

217 Placebo Replica

No. 2 217

217 100

219

218 Placebo Replica

No. 3 216

218 100

51

Se puede constatar según el porcentaje de recuperación para cada uno de los

microorganismos obtenidos, que son capaces de crecer y expresarse en presencia del

producto preservado con parabenos gracias a la acción inactivante del Polisorbato presente

en el caldo nutritivo usado en la validación (Caldo Lecitina Polisorbato 20)

Se puede observar en las tablas correspondientes a cada microorganismo de prueba un

porcentaje de recuperación superior al 90%, obteniendo los menores porcentajes de

recuperación, dos de las replicas de Aspergillus níger con un valor de 90% y 93%, aun así

cumpliendo con lo establecido en la USP 30.2007, donde se establece un porcentaje mayor

al 70% para dar cumplimiento a dicho parámetro. Esto se presento muy posiblemente a la

acción de los preservantes parabenos ya que estos presentan con un amplio espectro en


2000)

También se evidencio porcentajes de recuperación bajos para las tres replicas realizadas

para el microorganismo Bacillus subtilis, correspondiendo a los valores 93%, 93% y 92%;

aunque estos valores son aceptados por el criterio de la USP.30.2007, se observa que

presentan una baja recuperación a comparación de los demás microorganismos ensayados

los cuales muestran porcentajes de recuperación mayores al 95%. Por tanto se puede

comprobar que la metodología posee la capacidad de detectar una gama de

microorganismos presentes en la muestras. (USP.30.2007)

7.3.2. Exactitud

7.3.2.1. Recuento de Bacterias Mesófilas Aerobias

Para todos los ensayos realizados en la validación se determinó como estándar cuantitativo:

Staphylococcus aureus ATCC 6538 para ensayos de Recuento de Bacterias Mesofilas

Aerobias.

A continuación se presentan los promedios de porcentajes de recuperación obtenidos para

la prueba de Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias, a partir de 10 réplicas del ensayo y

10 replicas del estándar realizadas.

52

Los porcentajes de recuperación se obtienen a partir de la relación del promedio del

recuento del ensayo respecto al promedio del recuento de los estándares, esto expresado

en porcentaje (USP 30. 2007)

Tabla No. 8. (%) Porcentaje de Recuperación de Bac terias Mesofilas Aerobias

Recuentos Obtenidos UFC/ mL

Promedio de Recuentos UFC/ mL

% Recuperación

Promedios Estándar UFC/mL

Estándar Promedio 461 465 469 Replica No. 1 466

467 101 456

459 463 Replica No. 2 465

462 100 462

466 469 Replica No. 3 471

469 101 469

453 459 Replica No. 4 452

455 98 471

464 454 Replica No. 5 461

460 99 461

444 456 Replica No. 6 451

450 97 459

451 453 Replica No. 7 467

457 98 462

459 468 Replica No. 8 457

461 99 459

467 466 Replica No. 9 463

465 100 461

452 455 Replica No. 10 455

454 98 450

Observando la Tabla No. 8. (%) Porcentaje de Recuperación de Bacterias Mesofilas

Aerobias; se logra evidenciar como la recuperación microbiana es satisfactoria en la prueba

de exactitud para el Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias, utilizando como

microorganismo estándar Staphyloccocus aureus ATCC 6538.

53

Se puede observar como los promedios de los recuentos obtenidos por parte de cada uno

de los diez ensayos realizados (Microorganismo en presencia del producto y caldo nutritivo

con inactivante) y los diez ensayos realizados denominados como estándares

(Microorganismo en presencia del caldo nutritivo con inactivante sin producto); presentan

gran similitud en sus recuentos obteniendo la mayor variación en UFC/mL en la replica No.

4., donde se obtuvo un promedio de recuento de 455 UFC/mL para el ensayo y un recuento

de 471 UFC/mL en el promedio de recuento del estándar, indicando así una diferencia de

tan solo 16 UFC/mL. Es importante resaltar que ambas pruebas realizadas en la Replica No.

4 (Ensayo y Estándar) provienen de un mismo inoculo, por lo cual se esperaría que los

resultados en ambas casos arrojaran resultados iguales o como en este caso muy similares.

Por lo anteriormente mencionado se puede comprobar que el microorganismo en presencia

del producto preservado con parabenos; puede expresar su crecimiento gracias a la

inactivación de los parabenos por la actividad del Polisorbato presente en el caldo nutritivo

utilizado en la prueba (Caldo Lecitina Polisorbato 20) tal como lo señala la USP 30, 2007,

donde indica la inactivación de los preservantes Parabenos por parte del Polisorbato.

(Arthur. 2000; USP 30.2007)

El requerimiento por parte de la USP 30. 2007. indica que el porcentaje de recuperación

bacteriano debe ser mayor al 70%, el cual se cumple en la prueba realizada al obtener

porcentaje de recuperación desde 97% al 101% siendo el menor y el mayor valor

encontrado, los cuales están por encima del estipulado por la USP.30.2007, 70%.

Con el fin de comprobar si los datos obtenidos en la prueba realizada para el recuento de

bacterias mesofilas aerobias podían ser combinados entre sí gracias a su homogeneidad

(varianza), se desarrollo la prueba estadística ANOVA, postulando como hipótesis:

Ho: No existe diferencia estadísticamente significativa entre cada uno de los replicas

obtenidas .

Hi: Si existe diferencia estadísticamente significativa entre cada uno de los replicas

obtenidas.

Luego de realizar la prueba estadística ANOVA para el análisis de varianzas de dos

muestras (Ensayo – Estándar) con un alfa del 0,05, se estableció que las réplicas no son

54

estadísticamente diferentes, teniendo en cuenta que el análisis estadístico arrojó un F

observado igual a 1.00 y un F tabulado igual a 3.17; indicando así que no se rechaza la

hipótesis de existir diferencia estadísticamente significativa entre cada una de las replicas

del ensayo (Ho) (Ver anexo 2.)

También se desarrollo la prueba estadística t Estudent con el propósito de determinar que el

promedio de los porcentajes de resuperación no difieren significativamente del 100%, con un

95% de grado de confianza, por tanto se postuló como hipótesis:

Ho: El promedio de los porcentajes de recuperación no difiere significativamente del

100%.

Hi: El promedio de los porcentajes de recuperación si difiere significativamente del

100%.

Luego de desarrollar la prueba estadística t Estudent, se estableció que el promedio de los

porcentajes de recuperación no difieren significativamente del 100%; indicando a su vez que

las medias y la homogeneidad (Varianza) entre los recuentos obtenidos en el ensayo como

los de los estándares son similares y no existe diferencia aparente.

Lo anterior se estableció teniendo en cuanta que el análisis estadístico arrojó un t observado

igual a -0.37 y un t tabulado igual a 2.10; indicando así que no se rechaza la hipótesis de

obtener un promedio de los porcentajes de recuperación que difieren entre sí

significativamente del 100% (Ho)

7.3.2.2. Recuento de Mohos y Levaduras

Para todos los ensayos realizados en la validación se determinó como estándares Candida

albicans ATCC 10231 para las pruebas de Recuento de Mohos y Levaduras.

A continuación se presentan los promedios de porcentajes de recuperación obtenidos para

la prueba de Recuento de Mohos y Levaduras, a partir de 10 réplicas del ensayo realizadas

y 10 replicas del estándar. Los porcentajes de recuperación se obtienen a partir de la

relación del promedio del recuento del ensayo respecto al promedio del recuento de los

estándares, esto expresado en porcentaje (USP 30. 2007)

55

Tabla No. 9. (%) Porcentaje de Recuperación de Moh os y Levaduras

Recuentos Obtenidos

UFC/mL

Promedio de Recuentos

UFC/mL

% Recuperación

Promedios Estándar UFC/mL

Estándar 215 211 209 Replica No. 1 210

210 98 211

216 213 Replica No. 2 217

215 100 212

222 221 Replica No. 3 225

223 104 219

218 219 Replica No. 4 223

220 102 225

216 216 Replica No. 5 218

217 101 213

214 215 Replica No. 6 217

215 100 219

218 216 Replica No. 7 216

217 101 213

221 219 Replica No. 8 216

219 102 213

219 223 Replica No. 9 219

220 102 212

216 225 Replica No. 10 219

220 102 215

Observando la Tabla No. 9. (%) Porcentaje de Recuperación de Mohos y Levaduras; se

evidencia como la recuperación microbiana es satisfactoria en el ensayo de exactitud para el

Recuento de Mohos y Levaduras, utilizando como microorganismo estándar Candida

albicans ATCC 10231.

Se evidencia como los promedios de los recuentos obtenidos por parte de cada uno de los

diez ensayos realizados (Microorganismo en presencia del producto y caldo nutritivo con

56

inactivante y los diez ensayos realizados denominados como estándares (Microorganismo

en presencia del caldo nutritivo con inactivante sin producto); presentan similitud en sus

recuentos, obteniendo la mayor variación de unidades formadoras de colonia por mililitro en

la replica No. 8., donde se obtuvo un promedio de recuento de 220 UFC/mL para el ensayo y

un recuento de 212 UFC/mL en el promedio de recuento del estándar, indicando así una

diferencia de 8 UFC/mL. Es importante resaltar que ambos ensayos realizados en la

Replica No. 8 (Ensayo y Estándar) provienen de un mismo inoculo, por lo cual se esperaría

que los resultados en ambos ensayos arrojaran resultados iguales o como en este caso

similares.

Por lo anteriormente mencionado se puede comprobar que el microorganismo en presencia

del producto preservado con parabenos; puede expresarse gracias a la inactivación de los

parabenos por la actividad del Polisorbato presente en el caldo utilizado en la prueba (Caldo

Lecitina Polisorbato 20) tal como lo señala la USP 30, 2007, donde indica la inactivación de

los preservantes Parabenos por parte del Polisorbato. (Arthur. 2000; USP 30.2007)

Teniendo en cuanta el valor en porcentaje de recuperación que exige la USP 30.2007 para

otorgar cumplimiento al parámetro de exactitud, 70%, se puede concluir que al igual que en

la prueba para recuento de bacterias mesofilas aerobias se encuentra conforme la prueba

realizada para recuento de Mohos y Levaduras, teniendo presente los valores de porcentaje

de recuperación mas bajo y alto; 98% y 104% respectivamente, los cuales están por encima

del estipulado (70%) por la USP.30.2007.

Con el fin de comprobar si los datos obtenidos en el ensayo realizado para el recuento de

bacterias mesofilas aerobias podían ser combinados entre sí gracias a su homogeneidad

(varianza), se desarrollo la prueba estadística ANOVA, postulando como hipótesis:

Ho: No existe diferencia estadísticamente significa tiva entre cada uno de los replicas

obtenidas.

Hi: si existe diferencia estadísticamente significa tiva entre cada uno de los replicas

obtenidas.

Luego de proceder con la prueba estadística ANOVA para el análisis de varianzas de dos

muestras (Ensayo – Estándar) y con un alfa del 0,05, se estableció que las réplicas no son

estadísticamente diferentes, teniendo en cuenta que el análisis estadístico arrojó un F

57

observado (Valor calculado) igual a 0.44 y un F tabulado (Valor critico) igual a 0.79;

indicando así que no se rechaza la hipótesis de existir diferencia estadísticamente

significativa entre cada una de las replicas del ensayo (Ho.) (Ver anexo 3.)

También se desarrollo la prueba estadística t Estudent con el propósito de determinar que el

promedio de los porcentajes de resuperación no difieren significativamente del 100%, con un

95% de grado de confianza, por tanto se postuló como hipótesis:

Ho: El promedio de los porcentajes de recuperació n no difiere significativamente del

100%.

Hi: El promedio de los porcentajes de recuperación si difiere significativamente del

100%.

Luego de proceder con la prueba estadística t Estudent, se estableció que el promedio de

los porcentajes de recuperación no difieren significativamente del 100%; indicando a su vez

que las medias y la homogeneidad (Varianza) entre los recuentos obtenidos en el ensayo

como los de los estándares son similares y no existe diferencia aparente.

Lo anterior se estableció teniendo en cuanta que el análisis estadístico arrojó un t observado

(t observado) igual a 1.58 y un t tabulado (valor critico) igual a 2.02; indicando así que no se

rechaza la hipótesis de obtener un promedio de los porcentajes de recuperación que difieren

entre si, significativamente del 100% (Ho.) (Ver anexo 3.)

De esta manera se determina que el ensayo de exactitud para el recuento de bacterias

mesofilas aerobias y el ensayo de exactitud para el recuento de mohos y levaduras son

conformes a lo estipulado en la USP 30.2007. al obtenerse una recuperación mayor al 70%,

el cual expresa la proximidad de los resultados del ensayo mediante el método aplicado

respecto al obtenido en el control, y es acorde a lo que se reporta en literatura como

exactitud (USP.30.2007)

También se establece gracias a las pruebas estadísticas aplicadas en ambos ensayos;

recuento de bacterias mesofilas aerobias y recuento de mohos y levaduras, que si existe

homogeneidad entre cada uno de los grupos y entre grupos de ensayo, revelando así

varianzas pequeñas y gran similitud entre los controles y los ensayos realizados

correspondientemente en las réplicas realizadas con y sin presencia del producto

58

preservado con parabenos; evidenciando también la capacidad del inactivante contenido en

el caldo nutritivo utilizado (caldo lecitina Polisorbato 20) de inactivar los parabenos presentes

en le producto.

Aunque los parabenos son efectivos en un rango amplio de pH y tienen un amplio espectro

en cuanto a Hongos y Levaduras, y también poseen actividad antimicrobiana. (Arthur. 2000),

se evidencia el poder inactivante del Tween o Polisorbato frente a los parabenos, hecho que

se puede comprobar en los recuentos obtenidos para ambos ensayos aun cuando los

parabenos poseen mayor acción frente a los hongos y levaduras.

Simultáneamente se realizaron las siembras de los placebos para cada uno de los ensayos;

presentando ausencia microbiana para el recuento de bacterias mesofilas aerobias y

ausencia para el recuento de mohos y levaduras resultados correspondientes a <10 UFC/g.

Esto demostrando que el producto no contiene carga microbiana interferente que pudiese

afectar el resultado final generando falsos recuentos.

El caso de los controles negativos (1mL de Caldo Caseína Lecitina Polisorbato 20 inoculado

en 15-20mL de agar correspondiente: Agar CASO, Agar Sabouraud) presento el mismo

resultado <10 UFC/g. Esto demostró que el caldo nutritivo y los diferentes agares utilizados

en los ensayos no contenían carga microbiana interferente que pudiese afectar el resultado

final generando falsos recuentos.

Los controles ambientales también presentaron los resultados esperados 0 UFC/placa

para bacterias mesofilas aerobias y 0 UFC/placa para mohos y levaduras; controles

implementados por medio de la sedimentación en placas que contenían Agar Sabouraud y

Agar Caso para evidenciar posible contaminación ambiental en el área de trabajo donde se

llevo a cabo cada uno de los ensayos.

La variación de los valores correspondientes al porcentaje de recuperación en cada uno de

los 10 ensayos realizados ya sea en la prueba de exactitud para recuento de bacterias

mesofilas aerobias y/o recuento de mohos y levaduras; se debe a la incorrecta manipulación

del analista en el momento de inocular dichos ensayos, ya que se evidencian recuentos

diferentes entre ensayos que fueron inoculados con un mismo inoculo.

59

7.3.3. Precisión

7.3.3.1. Precisión del Sistema

Este parámetro pretende evaluar la capacidad de los microorganismos de crecer en el caldo

nutritivo escogido para realizar la validación (Caldo Lecitina Polisorbato 20), siendo evaluado

por el crecimiento de los microorganismos estándares en ausencia del producto preservado

con parabenos; con el fin de evidenciar las posibles variaciones del sistema diseñado.

Tabla No.10. Promedios de los Recuentos de los micr oorganismo estándares:

Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Candida albicans ATCC 10231 en la prueba

Cuantitativa de Precisión del Sistema.

PROMEDIO DE REPLICAS ESTANDAR UFC/mL

No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.7 No.8 No.9 No.10

Promedio 461

DE 6.0 Staphylococcus

aureus ATCC 6538

456 462 469 471 461 459 462 459 461 450

CV 1,3

Promedio 215

DE 4 Candida

albicans ATCC 10231

211 212 219 225 213 219 213 213 212 215

CV 2,1

60

Para evaluar la precisión del sistema se determinaron los coeficientes de variación de los

promedios de los recuentos estándares para cada prueba; recuento de bacterias mesofilas

y recuento de mohos y levaduras.

Al observar la tabla No.10. se puede constatar como los recuentos de las replicas para

ambas pruebas de recuento arrojan resultados homogéneos entre sí y reflejan una vez mas

la capacidad del Polisorbato de inactivar los parabenos presentes en el producto, esto

gracias al crecimiento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Candida albicans ATCC

10231 en las diferentes condiciones de siembra e incubación.

También se puede determinar a través de los coeficientes de variación de los promedios de

los recuentos del estándar para la prueba de recuento de bacterias mesofilas aerobias y

recuento de mohos y levaduras; que los dos valores correspondientes son valores pequeños

concluyendo que el método microbiológico cuantitativo ensayado posee un alto grado de

coincidencia y/o concordancia entre sus resultados individuales ya sea al realizar la prueba

para recuento de bacterias mesofilas y/o recuento de mohos y levaduras.

7.3.3.2. Precisión del método

La tabla descrita a continuación evidencian los promedios de las 10 réplicas realizadas del

ensayo (Muestra inoculada con microorganismo) junto con el estándar (Control Positivo).

A partir de los recuentos obtenidos se procedió a determinar la Desviación Relativa Estándar

(%RSD) o Coeficiente de Variación (CV) para las pruebas de recuento de bacterias

mesofilas aerobias y recuento de mohos y levaduras.

61

Tabla No. 11. Promedios de los Recuentos de los mic roorganismo estándares:

Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Candida albicans ATCC 10231 en la prueba

Cuantitativa de Precisión del método.

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Candida albicans ATCC 10231

Recuentos

Obtenidos UFC/mL Promedio de

Recuentos UFC

Recuentos Obtenidos

UFC/mL


UFC 436 286 446 293 Estándar 442

441 276

285

439 268 516 278 Replica No. 1 489

503 269

272

462 257 475 233 Replica No. 2 455

464 246

245

455 245 452 256 Replica No. 3 450

452 255

252

477 231 456 241 Replica No. 4 465

466 236

236

455 255 468 231 Replica No. 5 465

463 259

248

522 214 514 215 Replica No. 6 532

523 217

215

413 218 411 205 Replica No. 7 423

416 202

208

498 221 473 243 Replica No. 8 488

486 245

236

475 256 472 234 Replica No. 9 459

469 217

236

512 256 534 267 Replica No. 10 544

530 243

255

Promedio 476 242 DE 34.2 21.4 CV 7.2% 8.9%

62

Al observar la tabla No.11 se observa como el microorganismo Staphylococcus aureus

ATCC 6538 en la prueba de recuento de bacterias mesofilas aerobias tuvo un promedio de

476 UFC/mL y un promedio de recuento en el estándar de 441 UFC/mL, con una diferencia

de 35 UFC/mL entre dichos promedios, evidenciando una desviación estándar significativa

de 34 UFC/mL y un coeficiente de variación para el ensayo de 7.2%.

En la prueba realizada para el recuento de mohos y levaduras se obtienen resultados al

igual que los anteriores conforme con la literatura, ya que se obtuvieron para el

microorganismos Candida albicans ATCC 10231 un promedio de 242 UFC/mL y un

promedio de recuento en el estándar de 285 UFC/mL, con una diferencia de 43 UFC/mL

entre dichos promedios, evidenciando una desviación estándar significativa de 21 UFC/mL y

un coeficiente de variación para el ensayo de 8.9%.

Es así que se puede determinar en la prueba para ambos recuentos la relación existente

entre la dispersión de la medida alrededor de un valor medio o central evidenciando así la

concordancia entre ensayos individuales cuando el método se aplica repetidas veces de

muestras separadas e idénticas, obtenidas de una misma muestra o lote.

También se logro establecer que la metodología propuesta posee la capacidad de ser una

metodología repetible ya que los valores de coeficiente de variación tan pequeños indican la

precisión del método cuando este se realiza por el mismo analista, el mismo día, mismos

reactivos, mismos instrumentos (precisión dentro del ensayo) (Rojas,1997)

Simultáneamente se denomina como una metodología precisa teniendo en cuenta el criterio

establecido por la USP 30.2007. al obtener coeficiente de variación con valores menores al

15%.

Es posible que los valores de desviaciones estándar altos de los recuentos de bacterias

mesofilas aerobias y recuento de mohos y levaduras se deban a posibles errores de

laboratorio como lo son la incorrecta manipulación del analista en la homogenización de la

muestra inoculada y/o la variación del inoculo sembrado.

63

7.3.3.3. Precisión Intermedia (Entre Analistas y en tre días)

7.3.3.3.1. Precisión Entre Analistas. Recuento de B acterias Mesofilas Aerobias

En la Tabla No.12 se presentan los resultados de las réplicas del ensayo y control positivo

(Estándar) tomando como referencia los promedios de las réplicas del ensayo: Recuento de

bacterias mesofilas simultáneamente se muestran también los valores de desviación

estándar y coeficiente de variación correspondiente a la prueba.

En el recuento de bacterias mesofilas aerobia se obtuvo una mejor concordancia y

homogeneidad en los recuentos obtenidos por parte del Analista No. 1 en los dos días que

realizó el ensayo (día 1 y día 2) ya que presenta un Coeficiente de Variación de 1.5% y 7.2%

respectivamente; siendo estos valores menores que el coeficiente de variación obtenido por

parte del analista No. 2, el cual presento un valor de 12.2%.

Aun cuando el coeficiente de variación obtenido por el analista No.2 es mayor a

comparación de los valores obtenidos por parte del analista No.1, el coeficiente de variación

corresponde a un valor menor al 35% exigido por la USP 30.2007, lo cual indica que los

recuentos obtenidos cumplen con lo establecido por dicho criterio.

Se logra determinar por tanto, que en el ensayo realizado por el analista No.1 se controlaron

mejor las variables que pudieron afectar el ensayo tales como los volúmenes de diluyentes,

inóculos utilizados y la homogenización de la muestra.

64

Tabla No.12. Promedios de los Recuentos del microor ganismo estándar:

Staphylococcus aureus ATCC 6538 en la prueba Cuantitativa de Precisión de l

Intermedia.

Analista No.1 Día No.1

Analista No.1 Día No.2

Analista No.2

Promedio de

Recuentos UFC/mL

% Recuperación

Promedio de

Recuentos UFC/mL

% Recuperación

Promedio de

Recuentos UFC/mL

% Recuperación

Promedio Estándar 462 441 481

Replica No. 1 467 101 503 113,98 440 91

Replica No. 2 462 100 464 105,22 446 99

Replica No. 3 469 101 452 102,57 454 101

Replica No. 4 455 98 466 105,67 466 100

Replica No. 5 460 99 463 104,91 446 96

Replica No. 6 450 97 523 118,52 465 104

Replica No. 7 457 98,92 416 94,26 451 96

Replica No. 8 461 99,86 486 110,28 454 101

Replica No. 9 465 100,72 469 106,27 567 126

Replica No. 10 454 98,27 530 120,18 479 104

Promedio Replicas 460 476 467

DE Replicas 7 34,2 56,8

CV Replicas 1,5% 7,2% 12,2%

65

7.3.3.3.2. Precisión Entre Días. Recuento de Bacter ias Mesofilas Aerobias

En la Tabla No.12 se e presentan los resultados de las réplicas del ensayo y control positivo


bacterias mesofilas simultáneamente se muestran también los valores de desviación


Los recuentos obtenidos por el analista No.1 en el día 1 y en el día 2, muestran gran

similitud entre sus promedios de replicas de los ensayos y el estándar obteniendo promedios

de recuentos para el ensayo de 460 UFC/mL y 476 UFC/mL respectivamente, y recuentos

para el estándar de 462 UFC/mL y 4416 UFC/mL respectivamente; indicando que la

metodología tiene la facultad de arrojar resultados homogéneos y preciso en variaciones

tales como son los días de análisis.

También se pueden observar como los valores obtenidos para el coeficiente de variación

son diferentes para los días No.1. 1.5% y día No.2 7.2%, aun cuando estos difieren entre si

significativamente se encuentran dentro de lo establecido por la USP.30.2007, por tanto se

comprueba que la prueba es precisa también entre días de análisis para la prueba de

recuento de bacterias mesofilas.

7.3.3.3.3. Precisión Entre Analistas. Recuento de M ohos y Levaduras

En la Tabla No.13 se e presentan los resultados de las réplicas del ensayo y control positivo


mohos y levaduras simultáneamente se muestran también los valores de desviación


En el recuento de mohos y levaduras se obtuvo una mejor concordancia y homogeneidad en

los recuentos obtenidos por parte del Analista No. 1 en el día No.1 ya que presenta un

Coeficiente de Variación de 1.8%, siendo este valor menor que el coeficiente de variación

obtenido por parte del mismo analista No.1 en el día No.2 y también comparado con el

analista No.2 los cuales presentaron coeficientes de variación de 8.9% y 7.8%

respectivamente. .

Aun cuando el coeficiente de variación obtenido por el analista No.1 en día No.2 y el analista

No.2 es mayor comparado con el valor obtenido por parte del analista No.1 en el día No.1,

los coeficientes de variación corresponde a valores menores al 35% exigido por la USP

30.2007, lo cual indica que los recuentos obtenidos por ambos analistas cumplen con lo

establecido por dicho criterio.

66

Tabla No.13. Promedios de los Recuentos del microor ganismo estándar: Candida

albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Precisión de Intermedia.

Analista No.1

Dia No.1 Analista No.1

Dia No.7 Analista No.2

Promedio de

Recuentos UFC/mL

% Recuperación

Promedio de

Recuentos UFC/mL

% Recuperación

Promedio de

Recuentos UFC/mL

% Recuperación

Promedio Estándar 215 285 262

Replica No. 1 210 94,59 272 95 242 92,37

Replica No. 2 215 97 245 86 265 101,15

Replica No. 3 223 100,3 252 88 257 98,09

Replica No. 4 220 99,1 236 83 238 90,84

Replica No. 5 217 97,6 248 87 242 92,37

Replica No. 6 215 97 215 76 277 105,73

Replica No. 7 217 97,6 208 73 252 96,18

Replica No. 8 219 98,5 236 83 271 103,44

Replica No. 9 220 99,25 236 83 295 112,6

Replica No. 10 220 99,1 255 90 275 104,96

Promedio Replicas 217 241 261

DE Replicas 3,9 21,5 20,5

CV Replicas 1,8% 8,9% 7,8%

67

7.3.3.3.4. Precisión Entre Días. Recuento de Mohos y Levaduras

Los recuentos obtenidos por el analista No.1 en el día 1 y en el día 2, muestran gran

similitud entre sus promedios de replicas de los ensayos y el estándar obteniendo promedios

de recuentos para el ensayo de 217 UFC/mL y 241 UFC/mL respectivamente, y recuentos

para el estándar de 215 UFC/mL y 285 UFC/mL respectivamente; indicando que la

metodología tiene la facultad de arrojar resultados homogéneos y preciso en variaciones

tales como son los días de análisis.

También se pueden observar como los valores obtenidos para el coeficiente de variación

son diferentes para los días No.1. 1.8% y día No.2 8.9%, aun cuando estos difieren entre si

significativamente se encuentran dentro de lo establecido por la USP.30.2007, por tanto se

comprueba que la prueba es precisa también entre días de análisis para la prueba de

recuento de bacterias mesofilas.

Al obtener los resultados anteriormente vistos para el parámetro de PRECISION, se puede

asegurar que la metodología propuesta es precisa y comprende dos aspectos importantes

como son la Repetibilidad la cual pudo ser comprobada cuando se obtuvieron resultados

conformes realizados por un mismo analista, el mismo día, mismos reactivos, mismos

instrumentos (precisión dentro del ensayo).

La Reproducibilidad fue comprobada cuando los recuentos fueron homogéneos y similares

aun cuando se realizo por diferentes analistas, y diferentes días. (Maroto, 2000)

7.3.4. Robustez

Se realizó este parámetro con la misma metodología utilizada para el recuento de bacterias

mesofilas aerobias y recuento de mohos y levaduras con la variante para el ensayo de

recuento de bacterias mesofilas aerobias la incubadora (Incubadora Lab Line: Usada en

todos los parámetros /Memmert TV-30: Incubadora variación)

En cuanto al recuento de mohos y levaduras la variación se realizó en el agar nutritivo de

siembra (Agar Sabouraud 4% glucosa: Usado en todos los parámetros/ Agar PDA: Medio

variación)

68

Tabla No.14 Robustez para el ensayo de Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias

con la variación de Incubadora Memmert TV-30.

En el ensayo de recuento de bacterias mesofilas aerobias, se puede evidenciar como los

promedios de los estándares están muy cerca y su diferencia radica en tan solo 12 UFC/mL

obteniendo el mayor recuento el estándar incubado en la incubadora Lab-line.

Teniendo presente que el ensayo se realizó con el mismo inoculo para ambos estándares se

puede evidenciar como los recuentos entre ensayos no difieren mas del 10% entre los

porcentajes de recuperación replicas y los dos ensayos.

Esto se verifica con el valor tan bajo y cercano de los coeficientes de variación para el

ensayo en la incubadora Lab-Line y Memmert TV-30; 4.4% y 3.8% respectivamente.

Por tanto se puede inferir que la técnica es robusta al cumplir con un coeficiente de variación

menor al 35% establecido por la USP 30.2007

Estándar: Staphylococcus aureus ATCC 6538

Sin Variación : Incubadora Lab-Line Con Variación: Incubadora Memmert TV-30

Recuentos Obtenidos

UFC/mL

Promedio de

Recuentos UFC

% Recuperación

Recuentos Obtenidos

UFC/mL


UFC

% Recuperación

Estándar 465 423

475 441

467 411 Replica No. 1

452

465 99

419

424 100

432 431


461

446 95

442

443 105

423 466


433

425 91

423

443 100

Promedio 447 Promedio 435

DE 19,7 DE 17,2

CV 4,4% CV 3,9%

69

También es importante mencionar que la metodología propuesta para el recuento de

bacterias mesofilas aerobias es robusta teniendo presente el estudio realizado en el

laboratorio de Microbiología “Implementación de una metodología para el análisis

microbiológico de un producto líquido no estéril fa bricado en una empresa

farmacéutica” donde se evaluó Bacillus subtilis ATTC 6633 como estándar, con el mismo

caldo nutritivo, Caldo Lecitina Polisorbato 20, y con las mismas condiciones anteriormente

mencionadas exceptuando la presencia de cualquier producto; mostrando resultados

óptimos y robustos en la validación del parámetro de Robustez para métodos cuantitativos:

Recuento de bacterias mesofilas aerobias; al obtener porcentajes de recuperación

homogéneos, y realizar las lecturas de recuentos correspondientes a los diferentes tiempos

de incubación; 40, 48 y 76 horas. (Sanchez, J. 2007)

Tabla No.15 Robustez para el ensayo de Recuento de Mohos y Levaduras con la

variación del medio de cultivo: Agar PDA

Candida albicans ATCC 10231

Sin variación Agar Sabouraud Agar PDA

Recuentos Obtenidos

UFC/mL

Promedio de

Recuentos UFC

%Recuperación Recuentos Obtenidos

UFC/mL

Promedio de

Recuentos UFC

%Recuperación

Estándar 129 115

151 123


158

151 117

151

136 118

124 120


130

125 96

104

113 98

135 85


127

130 101

91

90 78

Promedio 126,00 Promedio 113,00

DE 12,3 DE 20,4

CV 9,7% CV 18%

70

En el caso del ensayo de recuento de mohos y levaduras se puede evidenciar como la

recuperación en los estándares difiere en 14 UFC/mL un recuento muy bajo.

Se puede observar en el medio nutritivo Agar Sabouraud como el porcentaje de

recuperación es conforme teniendo en cuenta que se recuperó un poco más del 100% en

dos replicas y en una su valor fue muy cercano al 100%.

De igual forma se presentó en los porcentajes de recuperación obtenidos en los ensayos

donde se utilizó Agar PDA como medio nutritivo, donde se evidencio un alto nivel de

recuperación al igual que el obtenido en el ensayo paralelo.

Los recuentos obtenidos en el ensayo con Agar Sabouraud mostraron un coeficiente de

variación menor que en el ensayo utilizando Agar PDA 7.9% y 18%, respectivamente

indicado que ambos ensayos presentaron homogeneidad en los recuentos aún cuando el

ensayo con Agar PDA revelo un coeficiente de variación de mayor valor.

También es importante mencionar que la metodología propuesta para el recuento de mohos

y levaduras es caracterizada como robusta teniendo presente el estudio realizado en el

laboratorio de Microbiología “Implementación de una metodología para el análisis

microbiológico de un producto líquido no estéril fa bricado en una empresa

farmacéutica” donde fue evaluado un hongo filamentoso como microorganismo estándar de

hongos y levaduras sugerido por la USP.30.2007, Aspergillus niger ATCC 16404 evaluado

con el mismo caldo nutritivo Caldo Lecitina Polisorbato 20 y con las mismas condiciones

anteriormente mencionadas exceptuando la presencia de cualquier producto; mostrando

resultados óptimos y robustos en la validación del parámetro de Robustez para métodos

cuantitativos: Recuento de hongos filamentosos y levaduras; al obtener porcentajes de

recuperación homogéneos en las lecturas correspondientes a los diferentes tiempos de

incubación; 114, 120 y 126 horas. (Sanchez, J. 2007)

Al igual que en el ensayo realizado para el recuento de bacterias mesofilas aerobias se

comprueba la fiabilidad en el método usado, siendo determinado gracias a los valores bajos

obtenidos para los Coeficiente de Variación en cada uno de los ensayos probados y

mostrando a su vez la homogeneidad de los datos entre ensayos

71

7.4. RESULTADOS PARÁMETROS CUALITATIVOS

7.4.1. Linealidad

A continuación se presentan las graficas y tablas con los recuentos obtenidos después de 48

horas de incubación a una temperatura entre 30ºC – 35ºC de los tres microorganismos

patógenos utilizados en dicho ensayo.

Grafica No.1. Curva de Regresión para el microorgan ismo Escherichia coli ATCC

8739. Parámetro Cualitativo: Linealidad.

Tabla No.16. Concentración Vs UFC/mL para el micro organismo Escherichia coli

ATCC 8739. Parámetro Cualitativo: Linealidad.

Concentración Promedio

Replica No.1 UFC/mL

Promedio Replica No.2

UFC/mL


UFC/Ml Promedio

1,00E-01 Incontable Incontable Incontable Incontable 1,00E-02 Incontable Incontable Incontable Incontable 1,00E-03 Incontable Incontable Incontable Incontable 1,00E-04 1572 1552 1536 1553 1,00E-05 163 146 158 156 1,00E-06 22 19 16 19 1,00E-07 4 3 4 4 1,00E-08 1 0 0 0 1,00E-09 0 0 0 0 1,00E-10 0 0 0 0

Curva de Regresión para Escherichia coli ATCC 8739 R 2 = 0,9912

-5

0

5

10

15

20

25

0,0E+00 2,0E-07 4,0E-07 6,0E-07 8,0E-07 1,0E-06

DiluciónUFC/1mL

72

Grafica No.2. Curva de Regresión para el microorgan ismo Staphylococcus aureus

ATCC 6538. Parámetro Cualitativo: Linealidad

Curva de Regresión para Staphylococcus aureus ATCC 6538

R2 = 0,9773

-202468

10121416

0,0E+00 2,0E-07 4,0E-07 6,0E-07 8,0E-07 1,0E-06

Dilución

UF

C/1

mL

Tabla No.17. Concentración Vs UFC/mL para el micro organismo Staphylococcus

aures ATCC. Parámetro Cualitativo: Linealidad.


Replica No.1 UFC/ mL


UFC/ mL


UFC/ mL Promedio

1,00E-01 Incontable Incontable Incontable Incontable



1,00E-04 1239 1257 1299 1265

1,00E-05 136 142 155 144

1,00E-06 10 15 15 13

1,00E-07 3 3 4 3

1,00E-08 0 0 0 0

1,00E-09 0 0 0 0

1,00E-10 0 0 0 0

73

Grafica No.3. Curva de Regresión para el microorgan ismo Pseudomonas aeruginosa

ATCC 9027. Parámetro Cualitativo: Linealidad

Curva de Regresión para Pseudomonas earuginosa ATCC 9027

R2 = 0,9842

-202468

10121416

0,0E+00 2,0E-07 4,0E-07 6,0E-07 8,0E-07 1,0E-06

Dilución

UF

C/1

mL

Tabla No. 18 Concentración Vs UFC/mL para el micro organismo Pseudomonas

aeruginosa ATCC 9027. Parámetro Cualitativo: Linealidad.


Replica No.1 UFC/ mL


UFC/ mL


UFC/ mL Promedio




1,00E-04 1032 1074 1052 1053

1,00E-05 111 119 131 120

1,00E-06 10 15 16 14

1,00E-07 2 2 5 3

1,00E-08 0 0 0 0

1,00E-09 0 0 0 0

1,00E-10 0 0 0 0

74

En este parámetro se trabajó con tres microorganismos caracterizados por ser indicadores

de microorganismos patógenos.

Teniendo en cuenta cada una de las graficas correspondientes a los microorganismos

ensayados, se puede evidenciar como los microorganismos de prueba son capaces de

crecer en forma consistente a la concentración inoculada en presencia del producto.

La forma en la cual se evaluó la relación entre la concentración de microorganismo

inoculado y el recuento obtenido de dichos microorganismos en presencia del producto

preservado, se efectuó teniendo en cuenta el coeficiente de correlación al cuadrado de cada

uno de los microorganismos, realizando promedios de las 3 replicas de cada uno de los

microorganismos ensayados y ejecutando la ecuación de la línea recta para cada uno.

Al realizar la regresión lineal para los recuentos obtenidos de Escherichia coli, presentó un

R2 de 0.99, Staphylococcus aureus R2 0.97 y Pseudomonas aeruginosa R2 0.98, indicando

así la aproximación de los datos a la línea recta.

Se puede concluir entonces que el ensayo realizado para los tres microorganismos

patógenos presentó conformidad para el parámetro evaluado ya que se logro obtener R2

cercanos al valor teórico 1; aun cuando la USP 30.2007 no indica un valor exacto par dicho

R2

También se puede considerar que la prueba ensayada presento linealidad ya que los

resultados microbiológicos cuantitativos (recuentos) mostraron capacidad de generar

resultados proporcionales a la concentración de microorganismos inicialmente inoculados en

la muestra. (USP 30.2007)

7.4.2. Limite de detección y especificidad

Teniendo en cuenta los recuentos presentados por los tres microorganismos patógenos en

el ensayo de linealidad, se determinaron los últimos niveles de concentración donde se

presento un recuento homogéneo y a su vez de tuvo en cuenta el siguiente nivel de

concentración donde no se presento crecimiento y se procedió a realizar siembras en

profundidad siguiendo la metodología de siembra descrita en el numeral 6.3.8. Siembra

75

Posteriormente se llevó a incubación por un periodo de 24 horas a una temperatura entre

30°C – 35°C y se realizaron las correspondientes le cturas. Para confirmar la presencia del

microorganismo patógeno ensayado Escherichia coli ATCC 8739 en el recuento obtenido, se

realizaron una serie de bioquímicas correspondientes al microorganismo en una colonia

característica por ensayo realizado, obteniendo como resultado final PRESENCIA de

Escherichia coli ATCC 8739.

Tabla No. 19. Parámetro Cualitativo: Límite de Dete cción. Microorganismo Escherichia

coli ATCC 8739.

Concentración Replica

No1 UFC/ mL

Replica No2 UFC/

mL

Replica No3 UFC/ mL

Promedios Recuento UFC

/mL 24 h después

1,00E-07 4 4 4 >1600

1,00E-08 0 0 0 No Recuento

Tabla No. 20. Parámetro Cualitativo: Límite de Dete cción. Microorganismo

Staphylococcus aureus ATCC 6538.


No1 UFC/ mL

Replica No2 UFC/

mL

Replica No3 UFC/ mL

Promedios Recuento UFC/

mL 24 h después

1,00E-07 3 3 3 >1600


Tabla No. 21. Parámetro Cualitativo: Límite de Dete cción. Microorganismo

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027.


No1 UFC/ mL

Replica No2 UFC/

mL

Replica No3 UFC/ mL

Promedios Recuento UFC

/mL 24 h después

1,00E-07 2 2 2 >1600


59

Tabla No. 22. Parámetro Cualitativo: Especificidad Microbiana para los microorganismos Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027,

Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8937 Dilución 10 -7

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aures ATCC 6538 Escherichia coli ATCC 8937

Control Negativo Control Positivo Control Negativo Control

Positivo Control Negativo Control Positivo

Agar. Baird

Parker

Caldo Mac

Conkey

Agar Mac Conkey

Agar. Cetrimide

Agar Mac Conkey

Caldo Mac

Conkey

Agar. Cetrimide

Agar. Baird Parker

Agar. Baird

Parker

Agar. Cetrimide

Caldo Mac

Conkey

Agar Mac Conkey

Rep

lica

No.

1

AUSENTE Turbidez Negativa AUSENTE PRESENTE AUSENTE Turbidez

Negativa AUSENTE PRESENTE AUSENTE AUSENTE Turbidez Positivo PRESENTE

Rep

lica

No.

2



Rep

lica

No.

3



60

Tabla No. 23. Parámetro Cualitativo: Especificidad Microbiana para los

microorganismos Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus

ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8937 Dilución 10 -8

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Staphylococcus aureus ATCC 6538 Escherichia coli ATCC 8937

Repique Repique Repique

Agar. Cetrimide Agar. Baird Parker Caldo Mac Conkey

Agar Mac Conkey

Replica No. 1 AUSENTE AUSENTE

Turbidez Positivo PRESENTE

Replica No. 2

AUSENTE AUSENTE Turbidez Positivo

PRESENTE

Replica No. 3

AUSENTE AUSENTE Turbidez Positivo

PRESENTE

Para este ensayo se realizó siembra de las diluciones correspondientes a cada

microorganismo con el nivel mas bajo de concentración evidenciado en el ensayo de

linealidad (Dilución 10-7) y el siguiente nivel de concentración donde no se evidencio

crecimiento (Dilución 10-8) y se procedió a incubar a temperatura entre 30°C – 35°C .

Los datos obtenidos muestran como la recuperación de los microorganismos en la dilución

10-7 presenta un crecimiento satisfactorio teniendo en cuenta la concentración inicial

inoculada. Staphylococcus aureus mostró una recuperación de >1600 UFC/mL (Dilucion10-

7) y 0 UFC/mL (Dilución 10-8) pasadas 24 horas de incubación, teniendo en cuenta la baja

concentración inoculada inicialmente y observando el recuento después de 24 horas de

incubación, se destaca entonces la capacidad del caldo de enriquecimiento para recuperar

el microorganismos de ensayo.

De igual manera se presento la recuperación de Escherichia coli, inoculando inicialmente

un promedio de células de 4 x10-7UFC/mL (Dilucion10-7) obteniendo un recuento final de

>1600 UFC/mL y 0 UFC/mL (Dilución 10-8). En el caso de de Pseudomonas aeruginosa se

inoculó un promedio de 2 x10-7UFC/mL (Dilucion10-7) obteniendo un recuento final de

>1600 UFC/mL y 0 UFC/mL (Dilución 10-8).

61

Teniendo presente los recuentos finales de cada uno de los microorganismos se puede

constatar la capacidad de cada uno de los microorganismos de recuperarse y crecer en

presencia de producto a lo largo de un tiempo de enriquecimiento e incubación,

comprobando una vez más las características inactivantes del polisorbato presente en el

caldo nutritivo.

Para realizar el ensayo de especificidad y determinar el límite de detección se realizó el

enriquecimiento de los microorganismos de prueba correspondientes a cada nivel donde

presentaron en el ensayo de linealidad el recuento mas bajo y homogéneo y los

subsiguientes diluciones que no presentaron crecimiento; con el fin de verificar la pureza de

cada microorganismo presente en el caldo nutritivo.

Se logró confirmar la presencia de los microorganismos evidenciados en el recuento a partir

de la dilución 10-7 ;de forma cualitativa para Escherichia coli, Staphylococcus aureus y

Pseudomonas aeruginosa y la ausencia de lo microorganismos anteriormente mencionados

en la dilución 10-8 de forma también cualitativa, esto hace pensar que en las diluciones

siguientes 10-9 y 10-10 también arrojaran resultados de ausencia para cada uno de los

microorganismos ensayados.

De esta manera se puede dar cumplimiento al parámetro según el criterio establecido por la

USP 30.2007 donde define el límite de detección como el número más bajo de

microorganismos en una muestra que puede detectarse bajo las condiciones experimentales

establecidas.

7.4.3. ROBUSTEZ

En este parámetro se evaluó la capacidad del caldo de cultivo utilizado en la validación

(Caldo Lecitina Polisorbato 20) como fuente nutritiva en los diferentes tiempos de incubación

del microorganismo Escherichia coli ATCC 8739 para su prenriquecimiento, siendo inoculada

cada una de las muestras con una suspensión celular aproximadamente de 100 UFC/mL.

La USP 30.2007 establece como tiempos de prenriquecimiento de 18-24 horas, por lo tanto

se procedió a realizar la modificación horas antes y horas después de las estipuladas por la

USP (17 horas, 24horas, 36 horas).

62

Tabla No.23. Parámetro Cualitativo: Robustez. Para el Microorganismo Escherichia

coli ATCC 8739.

Teniendo presente la variación de tiempos de incubación, se puede observar como el caldo

ensayado posee las capacidad de recuperar desde la hora 17 de incubación el

microorganismo inoculado, siendo confirmado por la turbidez observada en cada uno de los

frascos de ensayo y por la confirmación de la prueba AUSENCIA/PRESENCIA para

Escherichia coli.

De esta manera se demuestra la robustez del método en cuanto a la estimación cualitativa

de microorganismo Eschericha coli.

Teniendo en cuenta que se comprobó la presencia de Escherichia coli en los tres diferentes

tiempos ensayados, se puede dar conformidad al ensayo de robustez para cualitativos,

indicando así que en los tiempos evaluados de incubación en presencia del producto

Replicas Control Negativo

17 Horas Incubaci

ón

24 Horas Incubaci

ón

36 Horas Incubaci

ón Resiembra

Agar. Baird

Parker

Agar. Cetrimide

Caldo Mac Conkey

Caldo Mac Conkey

Caldo Mac Conkey

17 Horas Incubación



1. Replica No. 1

AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE

1. Replica No. 2 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE

1. Replica No. 3 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE

2. Replica No. 1


2. Replica No. 2


2. Replica No. 3


Estándar No.1


Estándar No.2 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE

Esc

heric

hia

coli

AT

CC

873

9

Estándar No.3


63

preservado con parabenos el microorganismo no presenta inhibición siendo comprobada

frente a un estándar (Control Positivo) y en la prueba realizada de AUSENCIA/PRESENCIA.

Cabe recordar que en la actualidad se ha generado una gran aceptación e interés por los

temas relacionados con seguridad y calidad de los productos farmacéuticos, teniendo

presente que estos son productos vitales dentro de la asistencia de la salud. Es por esto que

la industria farmacéutica debe velar por el total cumplimiento de la normatividad nacional e

internacional tanto para sus formulaciones como para el control de calidad que se establece

para cada producto fabricado. Por tanto la validación de un proceso toma gran relevancia en

el mismo, ya que es la demostración escrita y experimental con un alto grado de confianza

que un transcurso específico arrojará de forma consistente y permanente productos que

poseerán las características de calidad predefinidas.

Dentro de las validaciones de técnicas analíticas de productos es importante tener en cuenta

la neutralización de agentes preservantes que contenga el producto farmacéutico ya sea por

el uso de sustancias neutralizantes específicos, por dilución, por combinación de lavado y

dilución o por cualquier combinación de esos métodos. Para asegurar que los resultados de

los ensayos de control microbiológico de producto y límites microbianos sean verídicos, la

neutralización de las propiedades antimicrobianas del ensayo solución es necesariamente

requerida antes de estimar el número de microorganismos viables y esto a su vez requiere la

validación del método de recuperación (USP .30. 2007)

De esta manera se lograra obtener resultados confiables en cuanto a los diferentes

parámetros a tener en cuenta en una validación como los son la exactitud, precisión,

robustez, limite de detección, y especificidad.

En el presente trabajo se evidencia el cumplimiento de todos los parámetros evaluados y

exigidos por la USP.30.2007 para una validación de tipo concurrente, demostrando ser un

método preciso y exacto al obtener siempre recuentos homogéneos y similares en los

diferentes ensayos.

También se logra establecer de acuerdo a los porcentajes de recuperación obtenidos en

los diferentes ensayos, que se encuentran en un rango entre 90 al 127%, que el caldo

nutritivo utilizado es el adecuado ya que presenta la faculta de inactivar los agentes

preservantes presentes en la muestra.

64

De esta forma se determina que la metodología propuesta en este trabajo y una vez

validada, posee la capacidad de arrojar datos confiables en el análisis de control de calidad

microbiana de un producto preservado con parabenos y con las mismas características del

producto con que se desarrollo la validación.

65

8. CONCLUSIONES

• Se demostró de forma documentada que la técnica recomendada por la

USP.30.2007 es reproducible y repetible demostrando plena confiabilidad en el momento de

su realización.

• Todos los parámetros de validación cumplieron la especificación dada por la

USP.30.2007 presentando conformidad en la totalidad de los parámetros evaluados.

• Se elaboró el protocolo de validación y una técnica analítica del análisis

microbiológico para productos con agentes parabenos dentro de su formulación.

• Se realizo una técnica analítica microbiológica com las herramientas necesarias para

el análisis microbiológico de un producto liquido preservado con agentes parabenos,

producido por uma industria farmaceutica.

• De acuerdo a los porcentajes de recuperación obtenidos en los diferentes ensayos,

se observo que la mayoría de ellos se encontraban em um rango entre 90 al 127%

demostrando así la exactitud del método. Por lo tanto se puede asegurar que los futuros

resultados obtendrán una confiabilidad del 90 al 127%

• Confrontando los controles negativos de los médios de cultivo utilizados y el

producto utilizado como muestra, no se observa ningún tipo de contaminación ni diferencia

significativa en cuanto a recuentos teniendo en cuenta el factor del tiempo.

• Se encuentra relevante la utilización de blancos (Médios de cultivo, caldo nutritivo)

en los estúdios para asegurar que no se esta aportando ningún tipo de contaminación por

parte de los analistas ni del médio ambiente donde se desarrollo la metodologia.

66

9. RECOMENDACIONES

• Se recomienda al iniciar una validación de una técnica para un producto que

contenga agentes antimicrobianos o antifungicos realizar como primera instancia una

verificación acerca de la inactivación del agente.

• Al aplicar esta técnica analítica para productos que contengan este mismo agente

preservante se recomienda realizar ensayos previos y revisar demás componentes de la

formulación farmacéutica del producto.

• Evaluar la posibilidad de reducir procedimientos y/o ensayos en la realización de la

validación que puedan disminuir tiempo, costos, recursos.

• Se aconseja validar esta misma técnica para el análisis microbiológico de otros

productos y matérias primas, revisando las posibles variaciones según muestra.

• Se recomienda revisar protocolos periodicamente para verificar los posibles câmbios

com el tiempo.

67

10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• Barragán Blanco Diana Constanza. 2001. Validación De las Pruebas Esterilidad e

Inocuidad de la Vacuna Antiamarìlica. Microbióloga Industrial. Pontificia Universidad

Javeriana. Ciencias. Microbiología. Bogota. Pagina 40

• Comisión Europea. CALIFICACION Y VALIDACION. Septiembre 2001. En:

http://pharmacos.edudra.org/F2//edudralex/vol-4/pdfs-m/v4an15es.pdf

• Kibbe H Arthur. 2000. Handbook of Pharmaceutical Exipients. American

Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. Third Edition. Pág:340-342,

450-452, 510

• Montalvo Aguirre Edmundo. 1989. Introducción a la tecnología farmacéutica. Primera

edición. Editorial universitaria Universidad Central del ecuador. Quito, Ecuador. Pág.;

22-23

• Sánchez Sánchez Joel. 2007. Implementación de una Metodología para el Análisis

Microbiológico de un Producto no Estéril fabricado en una Industria Farmacéutica.

Microbiólogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Ciencias. Microbiología.

Bogota.

• USP XXX. 2007. Pharmacopea. The United States Phamacopeia. The official

compendia of standards. USA: United States Phamacopeia Convention Inc.

Rockville, Md.

• WHO. 1999. Quality assurance of pharmaceuticals. Volume 2. Good manufacturing

practices and inspection. Ginebra, Suiza. p: 27-39

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ANEXO

Prueba estadística ANOVA para Recuento de Mohos y L evaduras

• Prueba F para varianzas de dos muestras

Variable 1 Variable 2

Media 217,5666667 215,2 Varianza 15,70229885 19,73333333 Observaciones 30 10 Grados de libertad 29 9 F 0,449868087 P(F<=f) una cola 0,301301827 Valor crítico para F (una cola) 0,795724604 Prueba estadística t ANOVA para Recuento de Mohos y Levaduras

• Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales

Variable 1 Variable 2

Media 217,5666667 215,2 Varianza 15,70229885 19,73333333 Observaciones 30 10 Varianza agrupada 16,65701754 Diferencia hipotética de las medias 0 Grados de libertad 38 Estadístico t 1,588068034 P(T<=t) una cola 0,060278988 Valor crítico de t (una cola) 1,685954461 P(T<=t) dos colas 0,120557975 Valor crítico de t (dos colas) 2,024394147

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