INTRODUCCIÓN

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados.

RECOMENDACIONES GENERALES DE EMPLEO PARA LOS MEDIOS DE CULTIVO

Preparación de los Medios de Cultivo Deshidratados Por regla general los ingredientes de los medios de cultivo se disuelven por agitación y calentando ligeramente en agua destilada. Los medios que contienen agente gelificante se suelen hervir durante 1 minuto para conseguir su disolución. Aunque en la mayor parte de los medios hay que calentar, hay que evitar sobrecalentamientos innecesarios. Algunos medios presentan turbidez inevitable o precipitados, por ejemplo la Base de Caldo Tetrationato. Al distribuir el medio debe hacerse de forma uniforme, para que el precipitado quede bien repartido. Posteriormente a la disolución se procede a la esterilización del medio. En algunos casos existen componentes lábiles que no pueden añadirse en el medio de cultivo deshidratado y que será necesario su esterilización por separado y una posterior incorporación de forma aséptica para obtener el medio completo. El pH de los medios de cultivo se ajusta durante su fabricación a los valores descritos en cada uno de ellos. Sin embargo, la calidad del agua que se utiliza en su hidratación, la utilización de medios no recientes etc. Pueden modificar este parámetro por lo que es aconsejable verificarlo y reajustarlo si fuera necesario. En algunos casos se puede ajustar el pH después de la esterilización de forma aséptica y utilizando soluciones ácidas (Acido Clorhídrico) o básicas (Sodio Hidróxido) estériles. En los medios sólidos la medida se hace a 45-50ºC (el agar todavía no ha gelificado) mientras que en los líquidos se hace a temperatura ambiente. Los medios ácidos (pH<5) pueden presentar malas gelificaciones debido a la posible hidrólisis del Agar con la temperatura. Son medios que no es aconsejable refundirlos, y si es imprescindible, es aconsejable añadirles agar. El método más comúnmente utilizado para la esterilización es el Autoclavado. Sin embargo, hay ingredientes en algunos medios que no mantienen sus propiedades si se someten a altas temperaturas. Esterilización En la etiqueta del producto se indican las condiciones de esterilización. De todas formas se describen unas pautas de carácter general. Autoclavado: Exposición durante 15 minutos a 121ºC. Con este tratamiento mueren las células vegetativas y las endosporas bacterianas. Sin embargo, los medios que contienen hidratos de carbono, deben esterilizarse a

temperaturas no superiores a los 116-118ºC, para prevenir su descomposición y la posible formación de compuestos tóxicos que inhiban el crecimiento bacteriano. Filtración: Es el medio más habitual cuando existen productos lábiles. Habitualmente el producto a esterilizar se filtra a través de una membrana de acetato de celulosa o nitrocelulosa de un poro de 0,22 μm. Las soluciones de antibióticos, las de carbohidratos, las vitaminas, etc., se suelen esterilizar por este método y añadir al medio de cultivo ya esterilizado, cuando éste está a temperatura no superior a los 45-50ºC. Tindalización: Exposición a 100ºC durante 30 minutos. Con este tratamiento mueren las células vegetativas, pero no las endosporas. Cuando el medio esta frío, se incuba bajo condiciones de germinación de las endosporas, y si ello ocurre, se repite el tratamiento térmico. Precauciones con algunos Ingredientes Algunos medios contienen productos tóxicos. Se deben tomar las medidas de seguridad necesarias al manipular estos productos. Algunos de estos compuestos son la Fucsina básica y ácida, la Pararrosanilina, la Azida Sódica, el Sodio Selenito, etc. Conservación de los medios preparados Lo más recomendable es preparar el medio cuando se va a emplear, aunque en muchos casos por razones obvias una parte del medio preparado se consume y el resto se guarda como medio preparado. El tiempo de vida del medio preparado dependerá de la propia naturaleza del medio, de la hermeticidad de los recipientes que lo contienen, de la temperatura de conservación y de las condiciones medioambientales. Si la hermeticidad es buena y la temperatura baja, 2-8ºC, la vida del medio puede llegar a ser de 4 a 6 semanas. De todas formas la refrigeración favorece la deshidratación y en algunos casos, como por ejemplo, los medios para anaerobios, la conservación es mejor a temperatura ambiente que en frigorífico. Se deben evitar las condensaciones ya que el depósito de gotas de agua podrá ser causa de una alteración casi inmediata del medio. Tampoco deben emplearse medios preparados en los que se observe un efecto de deshidratación. Conservación de los medios deshidratados Como regla general y si no se establecen condiciones particulares los medios deshidratados deben almacenarse en lugar fresco, seco y al abrigo de luz directa del sol.

Existen unos medios en concreto, que requieren un almacenamiento entre 2-8°C, que son: 414703 Selenito Verde Brillante, Caldo 414680 Marino, Agar 413824 Selenito, Base de Caldo 414698 Marino, Caldo 413809 Selenito y Cistina, Caldo 414722 Emulsión Yema de Huevo 414723 Emulsión Yema de Huevo-Telurito 414724 Potasio Telurito solución 3,5% En la manipulación de los frascos se debe procurar que las aperturas y cierres sean los menos posibles y que el tiempo durante el cual el frasco permanece abierto sea el mínimo. De lo contrario el medio se irá rehidratando, con lo que comenzará a compactarse y endurecerse, ya que son generalmente higroscópicos. Incluso podría llegar a tener lugar un crecimiento bacteriano en superficie. En estas condiciones debe desecharse el producto. Conservación de los medios preparados listos para su uso. Los medios preparados listos para usar tienen un tiempo limitado de conservación, que es de varios meses si las condiciones de almacenamiento y transporte son las adecuadas. Se recomienda su almacenamiento por regla general por debajo de los 20ºC y protegidos de la luz. Algunos medios deben conservarse entre 2-8ºC, siendo este requisito especificado en la etiqueta del producto. Los medios de cultivo con Agar no deben guardarse por debajo de 0ºC, ya que se alteraría la estructura del gel. La pérdida de agua puede provocar precipitados o hacer que cristalicen ciertas sustancias del medio de cultivo, así como originar grietas en las placas preparadas. En los medios de cultivo que deben mejorarse y que deben contener aditivos lábiles, se suministra el medio basal preparado y según la necesidad se deben añadir los aditivos de forma estéril. Destrucción y desinfección Una vez realizados los cultivos, el medio debe ser autoclavado a 121ºC durante 30 minutos antes de su desecho definitivo. De igual manera se debe proceder con el material de laboratorio empleado en los cultivos antes de su lavado y nuevo uso.

MEDIOS DE CULTIVOS

LOS MEDIOS DE CULTIVO SE CLASIFICAN BASÁNDOSE SEGÚN SU COMPOSICIÓN QUÍMICA Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas. Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. Que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.

Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); Utilizando maltosa como única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.

Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-). F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.

AGAR NUTRITIVO

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos.

Extracto de carne 3.0

Cloruro de sodio 8.0

Agar

15.0

pH final: 7.3 - 0.2

FUNDAMENTO Es un medio usado para el cultivo de microorganismo poco exigente en los requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores de crecimiento microbiano. La Pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el crecimiento microbiano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes. CARACTERISTICAS DEL MEDIO: Ámbar claro a medio ligeramente opalescente.

AGAR EMB (Eosina Azul de Metileno).

Se emplea como medio diferencial para el aislamiento y diferenciación de bacterias entéricas Gram-negativas, de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45C y distribuir agitando suavemente.

Lactosa 5.0

Sacarosa 5.0 Fosfato dipotasico 2.0

Agar 13.5

Eosina 0.4 Azul de metileno 0.065

pH final: 7.2 -0.2

Fundamento Por la combinación de estos dos colorantes y los dos hidratos de carbono se pueden distinguir algunos géneros. Las bacterias lactosa-negativas y sacarosa negativas (Salmonella y Shigella) dan colonias incoloras, mientras que las lactosa y/o sacarosa-positivas dan colonias púrpura-violetanegruzco con o sin un centro oscuro y quedan rodeadas de una zona incolora. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y sacarosa, ya aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno;

éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. También es posible la identificación de Candida albicans. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un característico brillo metálico.

Modo de empleo Sembrar en la superficie del medio, Incubar entre 35º y 37ºC de 18 a 24 horas.

Resultados

Microorganismos Tipo de Colonia

Escherichia coli Verdosas con brillo metálico y centro negro

azulado

Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa púrpura, confluentes

Proteus mirabilis Incoloras

Enterococcus faecalis Incoloras, pequeñas, puntiformes

Shigella flexneri Incoloras

Salmonella typhimurium Incoloras

Control de Calidad

Control físico-químico

Aspecto: polvo fino. Solubilidad: opalescente con precipitado.

Color: púrpura rosado. pH: 7,2 ±0,2

Características del medio

Standard Plate Count (SPC)

Se utiliza para el examen microbiológico de alimentos, agua y productos lácteos.

Composición Concentración del medio gr/litro

Triptona 5.0

Dextrosa 1.0

Extracto de levadura 2.5

Agar 12.0

pH final: 7.2- 0.2