I.INTRODUCCIN

La microbiologa ha ido dando nuevos resultados, los primeros se debieron mucho a las tcnicas de aislamiento de cultivos que fueron precedidos por el hallazgo de un adecuado medio de cultivo, el Agar. Koch encontr que este era un alimento universal de los microorganismos, un polisacrido derivado de las algas pardas.Un material preparado para el crecimiento de microorganismos en un laboratorio se denomina medio de cultivo. Algunas bacterias pueden crecer bien en casi cualquier medio de cultivo; otras requieren de medios especiales y otras no pueden crecer en ninguno de los medios inertes existentes hasta ahora. Los microbios que se introducen en un medio de cultivo para que comiencen a crecer se denominan inoculo. Los microbio que crecen y se multiplican se denomina cultivo.Los medios de agar suelen utilizarse en tubos de ensayo o placas Petri, los tubos se denominan tubos en pico de flauta o inclinados cuando el medio se solidifica manteniendo el tubo en un angulo adecuado para lograr una gran superficie para el crecimiento. Cuando el Agar se solidifica en un tubo en posicin vertical se denomina profundo. Los cultivos en placas Petri, denominados asi en honor a su inventor, asistente de Koch, se realizan en placas poco profundas con una tapa que cubre perfectamente la base para evitar la contaminacin.Existe una clasificacin para los tipos de medio. Un medio qumicamente definido es aquel donde su composicin qumica exacta es conocida, este tipo de medio suele reservarse para el trabajo experimental del laboratorio o para el crecimiento de bacterias auttrofas. Un medio complejo es aquel donde su composicin exacta vara de un lote a otro, ya que este medio esta hecho de nutrientes como extractos de levaduras, carne, partes de plantas o protenas digeridas. Hay medios especficos para crecer anaerbicos, es estos se utiliza un ingrediente reductor como tioglicolato de sodio, que se combina con el oxgeno molecular disuelto para eliminarlo del medio. Tambin hay medios selectivos, stos medios en particular proveen nutrientes que ayudan al crecimiento y predominancia de un tipo particular de bacterias, y a su vez inhibe que otros tipos de microorganismos estn presentes, un ejemplo de estos es el medio para crecer la bacteria Neisseria gonorrhoeae. El Medio diferencial nos permite diferenciar entre varios tipos de bacterias al incorporar a ste ciertas substancias como sangre, sal, tintes y otros. Si inoculamos el medio con bacterias que destruyen las clulas rojas mientras que otras bacterias no destruyen este tipo de clulas, podemos diferenciar unas de otras en el mismo medio.En esta prctica nuestro objetivo fue preparar y esterilizar medios de cultivo de diferentes caractersticas para el cultivo de microorganismos.

Materiales:

1. Medios de cultivo o ingredientes deshidratados1. Agua destilada1. Algodn, gasa1. Balanza1. Erlenmeyers de 250 y 500 ml1. Pipetas graduadas1. Probetas de 100 ml1. Tubos de Ensayo1. Esptulas1. Lpiz marcador de vidrio1. Papel indicador de pH1. Papel Aluminio y papel corriente no absorbente

Metodologa:1. Cada mesa de trabajo se encarg de la preparacin de una cantidad suficiente de un determinado medio de cultivo, para ser utilizado, en su momento, por todos los alumnos del grupo de prcticas.1. Disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos se parte de un preparado comercial con todos los componentes deshidratados. Siguiendo las instrucciones del fabricante o del profesor, aadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentracin deseada de los mismos. 1. Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la ebullicin del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una completa disolucin del agar (medios slidos y semislidos); para medios lquidos no es necesario calentar, nicamente se agita la mezcla hasta la completa disolucin de la misma.1. En el caso del Agar Gelatina y el Agar Almidn se debe tomar en cuenta el orden: primero sales, segundo azcares y finalmente los dems.1. Esterilizar la disolucin.- Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el procedimiento ser diferente:

1. Medios slidos en placa.- Tapar el matraz con tapn de algodn y cubrir con papel de aluminio. Llevar a esterilizar(121C) durante 15-20 minutos. Una vez estril repartir en placas de Petri estriles y dejar en reposo para que solidifique.1. Medios lquidos.- Una vez disueltos los componentes repartir en tubos a razn de unos 2-4 ml por tubo, tapar con tapn de aluminio y llevar a esterilizar.

RESULTADOS:

Caldo NutritivoExtracto de Carne 0.3%Peptona 0.5%El caldo nutritivo es un medio lquido que contiene 0.5% de peptona que es un digerido enzimtico de carne, 0.3% de extracto de carne que es un concentrado de los componentes hidrosolubles de la carne Fue el resultado de los experimentos de Koch. Es uno de los medios de cultivo ms utilizados en el trabajo de bacteriologa desde que Koch lo utilizara en uno de sus experimentos. Y aunque este es un medio complejo y comn, lo que significa que posee todos los nutrientes necesarios para el crecimiento indiscriminado de todo tipo de microorganismos, textos sealan que esto no es del todo cierto, ya que con el avance del conocimiento de la Microbiologa se conoce que las bacterias varan enormemente sus requerimientos alimenticios y no existe ningn medio capaz de permitir el crecimiento de ms de una pequea fraccin de las bacterias que existen en la naturaleza (INGRAHAM, 1992).

DISCUSIONES:

Segn Tortora (2002), para favorecer el crecimiento microbiano un medio debe proporcionar una fuente de energa as como fuentes de carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y cualquier otro factor de crecimiento que el organismo no pueda sintetizar. Un medio qumicamente definido es uno del que se conoce la composicin qumica exacta.

Los medios qumicamente definidos suelen reservarse para el trabajo experimental del laboratorio o para el crecimiento de bacterias auttrofas. Casi todas las bacterias hetertrofas y los hongos, se cultivan de modo sistemtico en medios complejos, compuestos por nutrientes como extractos de levaduras, carne o plantas, digeridos de protenas de estas y otras fuentes. Los extractos de levadura tienen contenidos particularmente elevados de vitaminas del complejo B. Si un medio complejo se halla en una forma lquida se denomina caldo nutritivo, cuando se agrega agar se convierte en agar nutritivo.

Segn Stryer (2008), algunas enzimas tienen un pH ptimo y fuera de un rango de de pH determinado, estas decrecen su velocidad de reaccin hasta inactivarse. Es por eso que en algunos medios de cultivo se necesita ajustar el pH para evitar la inactivacin de algunas enzimas de las que dependen algunos microorganismos para subsistir. Ejemplo: amilasa a ph7.

Segn Madigan (2003), existen algunos factores que pueden inhibir agentes microbianos por ejemplo la temperatura, el pH, la salinidad, etc. Es por esto que algunos medios de cultivo son esterilizados antes y luego se les somete a condiciones extremas donde solo pueden proliferar ciertos microorganismos.

CONCLUSIONES:

Para el desarrollo de poblaciones bacterianas en medio de cultivo se debe contar con los nutrientes esenciales tales como protenas (peptona), carbohidratos, lpidos, vitaminas (complejo B), H2O y minerales. Adems debe estar exento de cualquier microorganismo contaminante.

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo agar, ya que muy pocos microorganismos pueden degradar este polisacrido, con lo que obtendramos medios en estado slido.

Los medios de cultivo son variados, lo que permite caracterizarlos de acuerdo a su composicin qumica, estado fsico y caractersticas en el medio; debiendo ser escogidos de acuerdo al propsito de lo que se quiere hacer: probar reacciones metablicas, requerimientos del medio, etc. Siempre deben presentar fuentes de los macroelementos, as como fuentes de energa.

No siempre se utilizaran medios de cultivos hechos a base a sustancias puras (medios definidos) debido al alto costo de estos a nivel industrial; se podr remplazar con materias primas llamadas medios complejos, debido al bajo valor de estos en comparacin de las puras.

Para la preparacin de los medios de cultivo es necesario una estricta esterificacin, puesto que si no lo est no se podr llevar a cabo correctamente la identificacin de los organismos. Existen diferentes medios de esterilizar, uno de los ms conocidos es el Autoclave donde es necesario altas temperaturas y presin.

CUESTIONARIO:1. Cules son las ventajas de los medios complejos para el cultivo de microorganismos?

Segn Hernandez, A (2003), los medios complejos se preparan a partir de ingredientes de origen natural cuya composicin qumica no est del todo definida. Generalmente, los componentes de los medios complejos son subproductos de alguna industria, por lo que son mucho ms baratos que los medios definidos y se utilizan en la mayora de los procesos industriales. En el Anexo 1, se desglosa la composicin de un medio complejo, utilizado para la produccin de penicilina.La concentracin final de algunos microorganismos depende del tipo de medio de cultivo empleado. Se seala el caso de la levadura Saccharomyces cerevisiae: en un medio definido que contiene glucosa, se obtiene un rendimiento de 10 a 20 g/l de biomasa, mientras que en un medio complejo con melazas de caa o remolacha, el rendimiento es de 60 a 100 g/l de biomasa; el aumento en el rendimiento as como el bajo precio de las melazas son factores muy atractivos para utilizarlo.

2. Por qu no es necesario ajustar el ph en el caldo nutritivo y si lo es en agar almidn?

la mayora de los microorganismos (con algunas excepciones) se desarrollan en medios neutros (pH 7) o ligeramente alcalinos, mientras que algunas levaduras lo hacen en medios cidos, es por eso que es necesario ajustar el pH de los medios segn los requerimientos de los microorganismos a estudiar.para ello se utiliza NaOH (hidrxido de sodio) para aumentar el pH y HCl (cido clorhdrico) para bajar el pH.En el agar almidon, la molcula del almidn es muy compleja y para su asimilacin por las bacterias, estas deben descomponerla (hidrolizarla) en sustancias ms simples y facilmnte asimilables. un gran nmero de bacterias son capaces de elaborar una enzima amilasa que hidroliza el almidn con formacin de maltosa. la maltosa puede ingresar a la clula para ser utilizada. la enzima amilasa es tambin una enzima extracelular, por lo tanto la demostracin de la hidrlisis del almidn puede hacerse tanto en medio lquido como en medio slido.En el medio slido( sobre las placas) al agregar la solucin de lugol ,se formar un color azul si no hubo hidrlisis; la aparicin de una zona clara alrededor de las colonias significa la hidrlisis del almidn. Cuando la bacteria no hidroliza el almidn todo el medio permanece azul. para evidenciar la formacin cido ser necesario agregar un indicador apropiado al medio de cultivo. la hidrlisis del almidn puede ser evidenciada en ausencia de bacterias, ya que la amilasa es una enzima extracelular. para el efecto un filtro libre de grmenes se agrega una solucin del almidn al 0.2%, se incuba por 24 horas a 37c. adicionar la solucin de lugol y comprobar los resultados anteriores.3. Determine la naturaleza qumica y la funcin nutritiva de cada uno de los ingredientes que contienen los medios que se ha utilizado.Extracto de carneEl extracto de carne comercial se obtiene de carne de vaca, la cual es hervida durante un periodo de tiempo, obtenindose un extracto acuoso que normalmente es suplementado con digestos e protenas para incrementar el contenido de nitrgeno amino. Por ello este extracto constituye una solucin acuosa de pptidos, aminocidos, fracciones de cidos nucleicos, cidos orgnicos, minerales, vitaminas, sales y otros nutrientesEl extracto de carne concentrado es rico en hidratos de carbono y fosfatos con lo cual puede interaccionar y sufrir reacciones de Maillard, su contenido en tiamina es bajo y tiene una alta proporcin de cidos orgnicos lo que le hace que sea una adecuada fuente de carbono para organismos quimoorganotrficos (CAMACHO, E. 2005).Extracto de levadurasEl extracto de levadura consiste en una solucin concentrada de hidrolizado proteico de clulas de Saccharomyces cerevisias, producido por una reaccin autolitica o plasmtica de dichas clulas. Es una buena fuente de aminocidos, carbohidratos y vitaminas especialmente del complejo hidrosoluble C y tiene un bajo contenido en sales.El crecimiento microbiano se ve influenciado del origen el extracto de levadura, pues el obtenido de levaduras de cerveza tiene un efecto inhibidor en el crecimiento de algunos microorganismos (CAMACHO, E. 2005).PeptonasSe define una peptona como el producto soluble en agua de una digestin enzimtica e cualquier fuente proteica cuya composicin es una mezcla de polipptidos, oligopptidos y aminocidos junto con otros compuestos solubles que vara segn la materia prima de partida.Para este medio existen muy pocas bacterias que son capaces de asimilar protenas desnaturalizadas con fuente de nitrgeno ya que este proceso depende de la presencia de enzimas proteolticas, extracelulares, y no todos los microorganismos las poseen (CAMACHO, E. 2005).

4. Describa el autoclave y su forma de usoUn autoclave es un dispositivo que sirve para esterilizar material de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presin y temperatura para ello. El fundamento del autoclave es que coagula las protenas de los microorganismos debido a la presin y temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunos microorganismos, as como los priones, que pueden soportar las temperaturas de autoclave.Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generacin de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presin interna de 103 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centgrados. Un tiempo tpico de esterilizacin a esta temperatura y presin es de 15 minutos.5. Que otro mtodos de utilizacin se emplean para medios de cultivo? Qu ventajas otorgan?Mtodos QumicosEstos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.

Con xido de etileno: Es un agente que se une a compuestos con hidrgenos lbiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.Destruye todos los microorganismos incluso virus. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable (goma, plstico, papel, etc.), equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, metal, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y adems cancergeno.

Con aldehdos: Son agentes alquilantes que actan sobre las protenas, provocando una modificacin irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimtica. Estos compuestos destruyen las esporas.

Glutaraldehdo: Consiste en preparar una solucin alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos. Este mtodo tiene la ventaja de ser rpido y ser el nico esterilizante efectivo fro. Puede esterilizar plstico, goma, vidrio, metal, etc.

Formaldehido: Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las cuales pueden disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodn, que despus pueden ser expuestos al calor para una rpida esterilizacin (accin del gas formaldehido). Tambin pueden ser usadas en Estufas de Formol, que son cajas de doble fondo, en donde se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60 C y pueden esterilizar materiales de ltex, goma, plsticos, etc. Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs.

Esterilizacin por gas-plasma de Perxido de Hidrgeno Es proceso de esterilizacin a baja temperatura la cual consta en la transmisin de perxido de hidrgeno en fase plasma (estado entre lquido y gas), que ejerce la accin biocida. Posee como ventajas: No deja ningn residuo txico. , Se convierte en agua y oxgeno al final del proceso. , El material no precisa aireacin. Y El ciclo de esterilizacin dura entre 54 y 75 minutos.

BIBLIOGRAFA:

CAMACHO, E. 2005. Importancia de la proteasa peptona N3 en la produccin de pigmentos por Streptococcus agalactiae en el medio granada. Tesis UNIVERSIDAD DE GRANADA. MADIGAN, MARTINKO & PARKER. 2003. Brock Microbiologia de los microorganismos. Editorial Prentice Hall. Dcima Edicion. Impreso en Espaa, pag 107 STRYER, BERG, TYMOCZKO. 2008. Bioqumica. Editorial Revert. Impreso en Espaa.