MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

TÉCNICAS DE LABORATORIO

FROTIS

Extensión de una mínima cantidad de una muestra biológica sobre una lámina portaobjetos de vidrio, para someterla a un proceso de tinción y su posterior examen microscópico.

Métodos para la preparación del Frotis

1.- En forma directa:

2.- Frotis indirecto:

MÉTODOS DE TINCIÓN BACTERIANA Los métodos de Tinción o Coloraciones

se basan en el uso de colorantes biológicos que tienen propiedades químicas de ciertos grupos ionizables.

Se da un proceso de intercambio iónico en la reacción de la tinción o coloración bacteriana

Método de tinción simple:

Es el método más fácil de realizarlo, se efectúa aplicando un solo colorante básico en solución sobre la extensión o frotis de la muestra que ha sido ya fijado y enfriado.

Método de tinción diferencial:El método de tinción diferencial se usa para poder distinguir las partes constitutivas de la estructura bacteriana, mediante la aplicación de dos o más colorantes y de otros reactivos complementarios.

Coloración GramReactivos: Reactivos de la coloración Gram:

VIOLETA CRISTAL, 30-60 “

SOLUCIÓN DE YODO- 60”

MEZCLA DE ALCOHOL-ACETONA 30 %, 10”

FUCSINA o SAFRANINA: 15-30”

AGUA DESTILADA O AGUA CORRIENTE para el lavado del frotis después de cada paso de la coloración.

Las bacterias Gram Positivas no se decoloran, debido a la constitución de la pared celular, que es mas gruesa y menos permeable a las moléculas pequeñas y no pueden atravesar la pared, el alcohol cierra también los poros de la membrana celular, y no deja escapar al exterior el complejo violeta de cristal - yodo, dando el color violeta a la célula.

En cambio las bacterias Gram negativas se

decoloran ya que la constitución de la pared es diferente, pues, contiene un alto porcentaje de LIPIDOS o substancias grasas, hasta un 20 por ciento, que son disueltas y extraídas por la acción de alcohol. El alcohol aumenta también la porosidad de la membrana celular y penetra en la bacteria para extraer el complejo violeta cristal-yodo que se elimina fácilmente hacia el exterior.

BACTERIAS ALCOHOL ACIDO RESISTENTES

BACILOSCOPÍA

COLORACIÓN ZIELH-NEELSEN• Identificación de M. tuberculosis, y M. leprae.

• Hay también otras pocas bacterias que se consideran acidorresistentes leves, como los Actinomicetos (Nocardia), y ciertas especies de Corynebacterium, como el C. equi, que infecta los animales

El bacilo de la Tuberculosis puede identificarse en:

Esputo, lavado bronquial y gástrico. En el sedimento de la orina, en heces; en el

líquido cefalorraquídeo, Otros fluidos corporales como: pleural,

pericárdico, peritoneal, pus, etc.

PROCEDIMIENTO: Frotis

La SOLUCIÓN DE ZIELH-NEELSEN está constituida por fucsina fenicada o fenolada o carbofucsina, que se aplica sobre el frotis por 3-5 minutos, sometiéndola a la acción suave del calor por debajo del portaobjetos, hasta que salgan ligeros vapores, sin dejar secar la solución ni que burbujee.

Lavar el portaobjetivos que contiene el frotis hasta que se elimine la mayor cantidad del colorante de fuscina.

Aplicar el alcohol ácido, que contiene 3% de ácido clorhídrico, y se deja actuar durante 3—5 minutos, para tratar de eliminar casi todo el colorante de fucsina. Lavar.

Aplicar el colorante de azul de metileno, por un minuto que es la tinción de contraste y da un fondo azul.

El bacilo de la Tuberculosis y el de la Lepra, NO SON GRAMNEGATIVOS, sino ACIDO RESISTENTES, fundamentalmente porque "retienen en su pared celular la fucsina fenolada, la cual NO SE ELIMINA AL EXTERIOR de la célula por la acción del alcohol ácido, y los bacilos quedan teñidos de rojo.

La reacción de coloración se explica porque los bacilos acidorresistentes contienen en su pared celular gran cantidad de LIPIDOS, hasta el 40% de peso seco de la célula.

Estos lípidos están compuestos por FOSFOLIPIDOS Y CERA. Una parte importante de esta cera soluble es el ACIDO MICOLICO, que guarda relación con la propiedad de acidorresistencia, y que puede considerarse como el substrato en esta reacción de tinción.

REGISTRO / INFORME Nº DE BAAR

(-) Negativo No se encuentran BAAR en 100 campos microscópicos

Nº de BAAR encontrados 1 – 9 BAAR en 100 microscópicos

(+) Positivo 10 – 99 BAAR en 100 campos microscópicos

(++) Positivo 1 – 10 BAAR por campo en 50 campos microscópicos

(+++) Positivo Más de 10 BAAR por campo en 20 campos microscópicos.

BACILOSCOPIA

Para que se puedan observar bacilos de la tuberculosis en el esputo, es necesario que éste contenga por lo menos 100.000 bacilos por ml. En este caso se considera al paciente como altamente infeccioso.

Con un golpe de tos, un paciente tuberculoso puede lanzar al aire un núcleo de expectoración que contiene hasta 100.000 bacilos.

MEDIOS DE CULTIVO BACTERIANOS

COMPOSICIÓN BÁSICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deben cubrir todas las necesidades nutricionales de los microorganismos.

Los medios de cultivo son líquidos cuando los nutrientes están en solución acuosa. Si a un medio liquido se añade una sustancia gelificante como agar, se obtiene un medio sólido.

Agua

Peptonas.- Se obtienen por hidrólisis acida o enzimático de proteínas. Constituyen una fuente de nitrógeno, de carbono y azufre.

Glúcidos.- Mediante su degradación enzimática, suponen una fuente de energía y de carbono para las bacterias. El mas utilizado es la glucosa, aunque también se emplea la fructosa, disacáridos como la sacarosa y lactosa, polisacáridos como el almidón.

Extracto de carne.- Es un concentrado de productos hidrosolubles de la carne de composición indefinida pero rico en xantina e hipoxantina, glucógeno, acido láctico, grasas, vitamina B y oligoelementos. La carne puede ser como por ejemplo: corazón, músculos, hígado bovino o cerebro.

Extracto de levadura.- Procede de la hidrólisis ácida o enzimática de la levadura que ha sido previamente lisada por el calor (levadura de pan o cerveza). Aporta nitrógeno y otras sustancias que son factores de crecimiento.

Suero o sangre de caballo o carnero, vitamina.- Constituyen elementos importantes para las bacterias exigentes en factores nutritivos.

Cloruro sódico.- Se emplea para equilibrar la presión osmótica del medio.

Sales minerales u otras sustancias que los microorganismos sean incapaces de sintetizar

Agentes solidificantes.- Se incorporan a los medios líquidos para preparar medios sólidos. El agar es un polisacárido obtenido a partir de algas rojas como Gelidium corneum. Es insoluble en agua fría y soluble en agua caliente, funde entre 80 y 100 ºC y se mantiene en este estado enfriando hasta 45 ºC. Por debajo de esa temperatura, solidifica dando lugar a un gel muy transparente y resistente a la hidrólisis bacteriana.

Agentes selectivos.- Sustancias químicas, colorantes, antimicrobianos etc. agregados al medio lo pueden convertir en selectivos para determinados organismos ejm. cristal violeta, sales biliares, telurito de potasio, antibióticos.

Sistemas amortiguadores.- Consisten en sales como fosfatos que son incorporados a los medios de cultivos para mantener un ph adecuado en el cultivo.

Indicadores de ph.- Se incorporan a los medios de cultivo para dar prueba visual de las variaciones del ph , estas concentraciones no deben ser tóxicas.

CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO

SEGÚN SU CONTENIDO: Definidos o sintéticos.- Son los medios cuya

composición química exacta se conoce porque se han elaborado añadiendo los productos químicos puros e individualizados.

Empíricos, indefinidos o no sintéticos.- En éstos, su composición exacta es desconocida, y su empleo se basa en la experiencia. Es el caso de los medios preparados con peptonas, extractos de carne y de levadura.

SEGÚN SU ESTADO FÍSICO

Líquidos.- Tienen los nutrientes disueltos en agua y poseen consistencia líquida. Permiten evaluar el tipo de crecimiento, que será característico del microorganismo. En estos medios. Es donde se estudian las curvas de crecimiento bacteriano.

Sólido.- En general, son los mismos medios líquidos a los que se ha añadido una sustancia inerte solidificante como es el agar. Cuando se vierten en placas Petri, aparece una superficie plana y lisa para la siembra. En el lugar donde se deposita una bacteria, su multiplicación se traduce en la formación de una masa, macroscópicamente visible, denominada colonia, que es un clon procedente de una misma bacteria.

Semisólidos.- Contienen sólo pequeñas cantidades de agar y se pueden emplear para estudiar diferentes comportamientos de las bacterias, tales como su movilidad, o para realizar determinadas pruebas bioquímicas.

SEGÚN SU UTILIDAD Usuales o básicos.- Contienen las sustancias nutritivas mínimas

para el crecimiento de las bacterias metabólicamente no exigentes.

Enriquecidos.- Además de los componentes básicos, se han añadido ciertas sustancias imprescindibles para el desarrollo de microorganismos exigentes en requerimientos nutritivos.En ellos, crecerán prácticamente todas las bacterias. Tienen en su composición sustancias como sangre, albúmina o suero.

Diferenciales.- Incorporan elementos que facilitan la diferenciación de las colonias formadas por uno u otro tipo de bacterias, generalmente por variaciones de color de las colonias, consecuencia de la manifestación de algunas propiedades bioquímicas de estos microorganismos. Así, por ejemplo, el agar-sangre diferencia a las bacterias que producen hemólisis de las que no la producen, y el agar Mac Conkey, que en su composición incorpora lactosa y un indicador de pH.

SEGÚN SELECCIÓN Selectivos.- Generalmente son sólidos e inhiben el

crecimiento de unas bacterias, permitiendo el crecimiento de otras. Contienen sustancias inhibidoras tales como: bilis, cristal violeta, antibióticos, o sustancias que modifican el pH hasta valores en los que solo se puedan desarrollar determinadas bacterias.

De enriquecimiento.- Normalmente son líquidos y dificultan el crecimiento de bacterias permitiendo crecer fundamentalmente a la que interesa aislar. Por ejemplo, el caldo selinito, impide el crecimiento de Escherichia Coli, permitiendo la multiplicación de Salmonella, el agua de peptona alcalina tiene un pH de 8.4 y se utiliza como enriquecimiento para detectar Vibrio Cholerae.

De conservación.- Sirven para mantener la viabilidad de los microorganismos que en ellos se colocan durante mucho tiempo en condiciones de baja temperatura; suelen llevar leche o glicerol, entre otros componentes. Sin embargo, la mejor forma de conservar los microorganismos es recurriendo a la liofilización.

De identificación.- Se utiliza para detectar diferentes productos catabólicos microbianos.

TIPOS DE CULTIVO SEGÚN LA CAPACIDAD DE UTILIZACIÓN DE OXÍGENO

Existen 2 tipos de cultivos, dependiendo del microorganismo a aislar según la capacidad de utilización de oxígeno:

Aerobios.- La mayoría de los medios de cultivo permiten la utilización de oxígeno atmosférico por las bacterias.

El medio de transporte para estudio de bacterias aerobias de todo tipo de muestras es el Stuart o Amies, que está constituido por agar agar, un buffer y agua.

En medio líquido, el microorganismo crece en la disolución, donde la concentración de oxígeno es menor, y disminuye en función del crecimiento del microorganismo. Para evitar esa disminución de oxígeno, utilizamos dos recursos:

○ Agitación○ Adición de aire u O2 estéril mediante burbujeo

Anaerobios.- Se modifica el contenido del oxígeno por el uso de tapones de parafina o por aceite en la superficie de tubos de cultivo. Permite el crecimiento de bacterias anaerobias estrictas o de otras que lo utilizan en mínimas proporciones. Ejemplo: Medio de Tioglicolato con indicador, para clostridios.El caldo de cultivo para bacterias anaeróbicas es el tioglicolato de sodio, que contiene sustancias reductoras del potencial de óxido reducción y está contenido en un tubo hermético (tapón de goma o tapa rosca).

SELECCIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO La selección se hace según el propósito de la investigación y el

siguiente esquema:

Por la procedencia de la muestra: cavidad oral, nasal, de ojos, nariz, secreción, del tracto urogenital, piel, heridas, etc.

De acuerdo al resultado de la tinción del frotis de la muestra, y la presencia de bacterias, ya sean grampositivos o gramnegativos.

Los grampositivos, en su mayoría, crecen mejor en el medio deAGAR SANGRE. Aquí se observan las reacciones de hemólisis. Se puede adicionar CO2 a este medio, para bacterias anaerobias.

Los gramnegativos, crecen más abundantemente en los medios de cultivo que contienen AZÚCARES. Como la lactosa, glucosa, dextrosa, etc.