Medios de Cultivo y Toma de MuestraProf: Katia Fernndez M.

Cultivo Proceso de laboratorio donde se induce el crecimiento in vitro de los microorganismos. Para conseguir la multiplicacin de agentes patgenos en sistemas artificiales es necesario aportar los elementos nutritivos mnimos suficientes, as como las condiciones fisicoqumicas ptimas para su desarrollo. Para ello se utilizan los medios de cultivo.

RequerimientosAbsolutos- Fuente de Energa - Fuente de Carbono - Fuente de Nitrgeno - Sales - Agua

Adicionales- Vitaminas - Factores de crecimiento - A esenciales

Ambientales- Temperatura - Atmsfera - Humedad - Salinidad - pH

Compuestos y reactivos qumico usados en medios de cultivo Hidrolizados de protenas: peptonas, infusin de carne, triptonas y casena. La protenas son divididas en a y pptidos utilizados como fuente de C y N. Carbohidratos: una variedad de disacridos (lactosa, sacarosa,y maltosa), hexosas (dextrosa) y pentosas (xilosa) son incluidas. Proporcionar una fuente de C para energa y servir como sustrato para reacciones bioqumicas para la identificacin de MO desconocidos.

Tampones: Se utilizan fosfatos de Na o K. Proporcionan un pH estable para el ptimo crecimiento de MO y un pH de referencia estndar para aquellos medios en los que las reacciones cidas o alcalinas son usadas para identificar MO. Enriquecedores: sangre, suero, suplementos vitamnicos y extracto de levadura. Los suplementos son agregados al medio para recuperar MO fastidiosos.

Inhibidores: diferentes compuestos se pueden usar para inhibir el desarrollo de MO no deseados (medio secletivo). Colorantes de anilina (verde brillante, eosina). Metales pesados (bismuto). Compuestos qumicos (azida, selenito, fenil-etil-alcohol). Agentes antimicrobianos (neomicina, colistn, ampicilina, vancomicina, cloranfenicol).

Indicadores de pH: Los ms usados fucsina, azul de metileno, rojo neutro, rojo fenol y prpura de bromocresol. Para medir cambios de pH en el medio resultante del metabolismo bacteriano de los sustratos dados. Indicadores miscelneos: pueden incluirse otros indicadores para detectar productos especficos (iones frricos y ferrosos para la deteccin de sulfuro de hidrgeno)

Indicadores de pH

Compuestos qumicos miscelneos: El agar, un extracto gelatinoso de las algas rojas es adicionado al medio en concentraciones variables como un agente gelificante.

Ejemplosmedio Agar MacConkey tipo S,D Inhibidor o indicador Sales biliares, cristal violeta, lactosa, rojo neutro proposito Selecciona entrobacteria y otros bacilos Gram -. Inhiben la mayora de los Gram +. Diferencian los bacilos Gram fermentadores de los no fermentadores. Enriquecimiento para Salmonella spp

Caldo selenito F

E

Sales de selenio

Agar sangre

E, D

Glbulos rojos de cordero

Permite el desarrollo de una amplia gama de bacterias y evidenciar el tipo de hemlisis que estas producen.

S: selectivo; D: diferencial; E: enriquecido

Medios de cultivo Uso Clasificacin

Uso Objetivo es aislar y cultivar los microorganismos (MO) (bacterias) causantes de una infeccin, para llegar a un diagnstico certero y un tratamiento adecuado

Clasificacin Fsico Componentes Funcin

Fsico Slidos Semi slidos Lquidos 1,5 2,0 % agar 0,5 % agar sin agar

Medios slidos

Medios lquidos

Componentes Naturales compuestos de origen natural (protenas, suero) sales

Sintticos

Clasificacin - Funcin Medios nutritivos Medios enriquecidos Medios selectivos Medios diferenciales

Medios nutritivos Contienen nutrientes que permiten que la mayora de los MO no fastidiosos crezcan en la misma proporcin en que se encuentran en la muestra, sin permitir que otro MO crezca de forma exagerada. Ej: Agar corazn. nutritivo, agar cerebro

Agar nutritivo: sembrado con E. coli

Medios enriquecidos Favorecen el sobrecrecimiento de un determinado MO a partir de una muestra que lo tiene en escasa cantidad, con predominio de la flora habitual. Agregando sustancias altamente nutritivas (sangre, suero etc) Ej: agar sangre, caldo selenito

Agar sangre (5% de GR sangre de cordero)

Medios selectivos Contienen uno o mas agentes inhibitorios (antibiticos, colorantes) que inhiben los MO excepto al que se desea recuperar. Ej: agar Mac Conkey, agar nutritivo con ampicilina, agar Skirrow.

Medio Kanamicina Esculina Azida aislamiento de Enterococcus

Medio Hektoen aislamiento de Salmonella enteritidis

Medios diferenciales Emplean metabolitos que permiten que los MO expresen caractersticas metablicas que hacen posible distinguirlos de otros con caractersticas diferentes. Ej: agar Mc Conkey, agar sangre, agar urea

Estos medios contienen nutrientes bsicos, la caracterstica bioqumica que se quiere determinar (lactosa, para determinar su fermentacin) mas indicadores de pH, lo cuales al haber metabolismo de la bacteria estudio hay modificacin del pH del medio de cultivo evidencindose por el cambio de color.

Agar XLD

Agar Mc Conkey

Agar TSI

Agar LIA

Agar MacConkey Es un medio selectivo y diferencial Frmula (g/L): Peptona Proteasa peptona Lactosa Sales biliares Cloruro de sodio Rojo neutro Cristal violeta Agar pH 17,0 3,0 10,0 1,5 5,0 0,03 0,001 13,5 7,1 0,2

Agar MacConkey Selectivo: inhiben D de Gram + y Selectivo permite la seleccin y recuperacin de las enterobacterias. Diferencial: rojo fenol como indicador de pH, al haber fermentacin de la lactosa por parte de la bacteria el medio de cultivo vira de color a fucsia.

L (-)

L (+)

Agar MacConkey

Agar SS A. Klebsiella pneumoniae; B. Escherichia coli C: Salmonella sp. ; D: Proteus mirabilis E: Pseudomona aeruginosa

Agares cromognicos Son medios de cultivo selectivos y diferenciales. Contiene en su composicin metabolitos e indicadores que permiten el crecimiento y clasificacin simultanea o diagnstico de un MO en particular.

Cromocoli Agar selectivo y diferencial para la deteccin simultnea de Escherichia coli y recuento total de coliformes mesfilos en agua y alimentos. Las cepas Gram + y algunas Gram se inhiben por la presencia de tergitol 7. La E. coli se presenta de color azul-violeta por los componentes del medio de cultivo.

E. coli de color azul-violeta

Cromoaureus Es un medio de cultivo selectivo y diagnstico para el cultivo, aislamiento , diferenciacin y diagnstico de Staphylococcus aureus. Los colores son producidos especficamente por reacciones enzimticas del St. aureus que combinadas con las substancias cromgenas contenidas en el medio producen el viraje de las colonias al color malva-violeta.

Agar CromoAureus mostrando desarrollo mixto y colonias de Staphylococcus aureus.

Cromocandida Es un medio selectivo para levaduras y hongos. Para la diferenciacin de estas especies en base a los diferentes colores de sus colonias producidos por reacciones enzimticas de especie especficas con un sustrato cromgeno contenido en el medio.

MEDIO CROMOCANDIDA mostrando desarrollo de: Candida tropicalis colonias azules violceas Candida albicans colonias verdes Candida glabrata colonias rosa-rojizas Candida krusei colonias rosa plido

Medios de transporte Son un sistema de obtencin y transporte de muestras microbiolgicas para su cultivo y posterior identificacin. Consiste en una trula estril y un tubo con el medio de transporte correspondiente en el cual se introduce la trula con la muestra, lo que permite que los MO permanezcan viables hasta el momento del cultivo.

Medio de transporte (trula estril y medio)

Medio Stuart Medio de transporte eficaz para la recuperacin y viabilidad de microorganismos como Streptococcus pneumoniae, Str. pyogenes , N. gonnorrhoeae, Haemophilus sp. y otros microorganismos lbiles. Se utiliza tambin para el transporte de muestras de secreciones oculares, ticas, heridas y abscesos. Los microorganismos permanecen viables de 6 das a 8 semanas. Se recomienda para la toma de muestras en sitios estriles.

Medio Amies /c carbn Es una modificacin del medio Stuart, se reemplaz el glicerofosfato por un buffer inorgnico superior, la adicin de carbn permite la absorcin de toxinas y de bactericidas del medio, lo que permite el desarrollo de patgenos an en presencia de antibacterianos. Se le omiti el Azul de Metileno lo que permite el crecimiento de patgenos entricos adems de la flora de fastidiosos que se desarrollan en el Stuart. Este medio permiti una recuperacin mayor de patgenos que en el Medio Stuart. Se recomienda para la toma de muestras en sitios no estriles , como faringe, vagina y uretra.

Medio Cary Blair Se utiliza para el transporte de muestras fecales o raspados rectales para Coprocultivo. Se recomienda este medio, ya que permite el desarrollo de Salmonellas y Shigellas an despus de 49 das a 28C, Vibriones y Campylobacter permanecen viables hasta por 22 das a 28C.

Medio gel fisiolgico Se utiliza para el examen directo de secreciones vaginales y uretrales en las cuales se debe investigar la presencia de Trichomonas vaginalis. La concentracin apropiada de sales , el pH ptimo del medio , la inclusin de agarosa en ste, lo hace el medio de preferencia para la observacin directa de secreciones. Si la trula se mantiene a 37C despus de obtenida la muestra, las Trichomonas vaginalis pueden permanecer vivos hasta por 6 horas.

Recoleccin y transporte de muestras En la recuperacin del o los MO causantes de una infeccin lo mas importante es la correcta recoleccin de una muestra.

La recoleccin comprende 4 pasos: Seleccin del sitio anatmico mas adecuado. Usar la tcnica ms apropiada Poner la muestra recolectada en un envase que favorezca la viabilidad de los MO en forma segura. Enviar la muestra en forma rpida y expedita al laboratorio.

Recoleccin Preparacin del sitio: muestra obtenida con aguja o aspiracin, se debe desinfectar la piel. Alcohol 70%, seguido por yodforo, durante 1 min. En reas muy contaminadas repetir procedimiento. Volumen: esto depende de el tipo de muestra, consultar en el laboratorio. Se encuentran estandarizadas la toma de muestra para hemocultivo, LCR para cultivo de hongos y orina para cultivo.

Envase y aparato recolector: La trula debe ser de un material que no inhiba el crecimiento bacteriano. Una vez tomada la muestra se introduce en un frasco estril o medio de transporte. Muestras lquidas envases estriles con tapa rosca. Nmero de muestras: Solo las muestras de hemocultivo, coprocultivo, baciloscopas, y cultivo de Koch se encuentran normadas. En el resto tomar mas de una muestra en innecesario y caro.

Tcnicas de recoleccin: Para la obtencin de una correcta toma de muestra, se debe seguir un manual de toma de muestra. En general las muestras menos satisfactorias son las obtenidas con trula, las ptimas con jeringa. Medio de transporte: No deben usarse trulas sin medio de transporte (excepto para tcnicas especficas) porque esto lleva a la desecacin de la muestra.

En el caso de secreciones se recomienda medio tipo tampn como Stuart o Amies. Como no tienen nutrientes ayudan a preservar los MO de la muestra evitando el sobrecrecimiento. Para coprocultivos se utiliza el medio Cary Blair, que permite una mejor recuperacin de enteropatgenos. Muestras de aspirado o lquidos que se solicite cultivo anaerobio, deben colocarse en frascos o recipientes con medio de transporte y atmsfera sin O2 (medio de transporte anaerobio). Sobreviven app 24 horas a RT.

Transporte de muestras: Aun usando medio de transporte, las muestras deben llevarse lo ms rpido posible, antes de las dos horas. Algunas muestras se pueden refrigerar hasta 12 horas (expectoracin y orina). Las muestras de Neisseria o anaerobios deben mantenerse a RT.