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BIORREMEDIACIÓN

DE

METALES PESADOS

María de la Salud López Gutiérrez

Ana del Peso Blanco

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ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN 4

1.1. Toxicidad de los metales pesados 6

2. TIPOS DE BIORREMEDIACIÓN 11

2.1. Interacciones extracelulares 11

2.1.1. Movilización 12

2.1.1.1. Volatilización 12

2.1.2. Inmovilización 13

2.1.2.1. Bioadsorción 13

2.1.2.2. Polímeros extracelulares 14

2.1.2.3. Sideróforos 15

2.2. Interacciones con la superficie celular 16

2.3. Interacciones intracelulares 18

2.3.1. Bioacumulación 18

2.3.2. Transformaciones mediadas por enzimas 19

2.3.3. Síntesis de metalotioneínas 20

2.3.4. Síntesis de fitoquelatinas 21

3. CONCLUSIONES 24

4. BIBLIOGRAFÍA 24

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1. INTRODUCCIÓN

El crecimiento de la población y el avance de las actividades industriales a partir del siglo XIX trajeron aparejados serios problemas de contaminación ambiental.

En la actualidad se generan enormes cantidades de residuos, de los cuales muchos no son biodegradables o se degradan muy lentamente en la naturaleza, lo que provoca, que en el caso de no contar con un tratamiento o destino adecuado, estos residuos se acumulen en el medio.

Un ejemplo lo constituyen algunas industrias químicas que producen compuestos cuya estructura química difiere de los compuestos naturales (disolventes, plaguicidas, plásticos, detergentes, fármacos, etc.). El problema principal de estos compuestos es que son resistentes a la biodegradación, por lo que si son liberados al medio, se acumulan en él, persistiendo en el ambiente perjudicando a los seres vivos.

Gran parte de esta contaminación es debida a los metales pesados. Pese a que este tipo de contaminación es de carácter global, en países como España, con una climatología muy marcada, la contaminación de los suelos tiene el problema añadido de que muchas de esas zonas contaminadas están en peligro de desertización.

Dado que cuando existen elevadas concentraciones de metales pesados en el suelo, el efecto adverso se aprecia en todos los organismos edáficos y en la alteración de los procesos biológicos del suelo.

Existen diversas estrategias para la recuperación de suelos contaminados por metales pesados, de las cuales, la mayoría suponen la eliminación de los metales, o su estabilización en el suelo. Las técnicas basadas en procesos físico-químicos (lixiviación ácida, electro-ósmosis, vitrificación, eliminación de la capa superficial, etc.), son drásticas, caras y sólo aplicables a pequeñas áreas. Además, eliminan la actividad biológica del suelo tratado, y afectan negativamente a su estructura, con lo que se ven agravados los problemas de erosión del suelo y degradación de la cubierta vegetal.

En las últimas décadas, entre las técnicas empleadas para contrarrestar los efectos de los contaminantes, se comenzó a utilizar una práctica llamada biorremediación. El término biorremediación fue acuñado a principios de la década de los 80, y proviene del concepto de remediación, que hace referencia a la aplicación de estrategias físico-químicas para evitar el daño y la contaminación de suelos. Los investigadores se dieron cuenta que era posible aplicar estrategias de remediación que fuesen biológicas, basadas esencialmente en la observación de la capacidad de los microorganismos para degradar de forma natural compuestos contaminantes.

Por lo tanto, la biorremediación surge como la rama de la biotécnología que busca resolver los problemas de contaminación mediante el uso de seres vivos (microorganismos y plantas), capaces de degradar compuestos que provocan desequilibrios en el medio ambiente.

Se definen como metales pesados a aquellos elementos químicos que presentan una densidad igual o superior a 5 g/cm3 cuando están en forma elemental, o cuyo número atómico es superior a 20 (excluyendo a los metales alcalinos y alcalinotérreos). Su presencia en la corteza terrestre es inferior al 0.1 % y casi siempre menor del 0.01 %.

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Resaltar que el término metales pesados no es del todo preciso, ya que con él se define a aquellos metales, que siendo elementos pesados, son tóxicos para las células. Sin embargo, en realidad cualquier elemento que a priori es beneficioso para la célula, en concentraciones excesivas puede llegar a ser tóxico.

Junto a los metales pesados hay otros elementos que, aunque son metales ligeros o no metales, se suelen englobar por orígenes y comportamientos asociados, como son el As, B, Ba y Se.

Los metales pesados se pueden clasificar en dos grupos:

• Oligoelementos o micronutrientes: Necesarios para los organismos en pequeñas cantidades, pero tóxicos una vez sobrepasado cierto umbral. Algunos de los que se incluyen en este grupo son: As, B, Co, Fe, V Cr, Mo, Mn, Ni, Se y Zn.

Figura 1. Curva característica de la relación existente entre la concentración de oligoelementos y la actividad biológica de los organismos.

• Sin función biológica conocida: Son elementos elevadamente tóxicos, entre los que se incluyen Ba, Cd, Hg, Pb, Sb y Bi.

Cabe resaltar el hecho de que los elementos pertenecientes a estos dos grupos pueden variar según autores. Además, cuando se habla de metales pesados, no se suele especificar el estado del elementos, es decir, no se suele especificar si se trata del elementos puro, o de algunos o la totalidad de sus estados de oxidación. Información que sería de gran relevancia puesto que no presentan las mismas propiedades físicas, químicas, tóxicas ni ecotóxicas.

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Por todo ello, en realidad sería más apropiado hablar de elementos que poseen orbitales atómicos profundos (d o f). Siendo posiblemente, la presencia de estos orbitales el aspecto clave que les confiere un comportamiento químico análogo en el interior de las células, permitiendo así agruparlos mediante la denominación de metales pesados, aunque realmente se agrupen bajo ese nombre elementos diversos.

En ocasiones, las concentraciones anómalas existentes en un determinado ambiente pueden ser debidas a causas naturales, como por ejemplo, la erosión de una roca o suelo rico en este tipo de metales, como pueden ser los suelos desarrollados sobre serpentinas, con altos contenidos en Cr, Ni, Cu y Mn. Los metales pesados son muy estables en el suelo, pero en el proceso de formación de suelos, los metales se tienden a acumular, pero generalmente no rebasan los umbrales de toxicidad. Además los metales pesados que se encuentran en las rocas y minerales, se encuentran bajo formas poco asimilables para los organismos.

El contenido en metales pesados de un suelo, debería ser únicamente función de la composición de la roca madre y de los procesos edafogénicos que dan lugar a la formación del suelo. Así, por citar unos ejemplos, las rocas ígneas ultrabásicas (como las peridotitas, las serpentinas o las augititas) presentan los más altos contenidos en metales pesados, seguidas de las ígneas básicas (como los gabros y basaltos). Por su parte, las menores concentraciones de metales pesados se encuentran en las rocas ígneas ácidas (como el granito, la sienita y la riolita) y las sedimentarias (como las areniscas y las calizas). Los porcentajes más elevados se dan para el Cr, Mn y Ni, mientras que el Co, Cu, Zn y Pb se encuentran de forma natural en menores cantidades, siendo mínimos el As, Cd y Hg, liberados de esta forma.

Es por ello, que algunas zonas pueden presentar una contaminación por metales pesados de manera natural, pero únicamente en contadas ocasiones este tipo de contaminación supera los umbrales de toxicidad. Siendo la principal fuente de estos metales en el medio la contaminación de tipo antrópico. Fuente que emite grandes cantidades de estos metales en un corto periodo de tiempo.

1.1. Toxicidad de los metales pesados

La toxicidad de los metales pesados depende de la concentración, la forma química ya la persistencia. Debe tenerse en cuenta, como se ha comentado antes, que un elemento indispensable para un ser vivo en concentraciones traza puede llegar a ser tóxico en concentraciones elevadas. Por otra parte, la mayoría de los metales pesados, se combinan con otras formas químicas, antes de entrar en los organismos o bien, una vez se encuentran en el interior de los mismos. Por lo tanto antes de determinar la toxicidad de un elemento es necesario conocer la forma química en la que se encuentra.

En cuanto a la persistencia, ésta se define como el tiempo que tarda un contaminante en transformarse en una forma no tóxica.

Los metales pesados están considerados como muy peligrosos para los seres vivos en general, pues poseen una gran toxicidad, en parte debido a su elevada tendencia a bioacumularse. Definiéndose la bioacumulación como: un aumento de la

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concentración de un producto químico en un organismo en un cierto plazo de tiempo, de tal forma que mediante esa acumulación, se llegan en el organismo a registrar valores de contaminación superiores a los encontrados en el ambiente.

La toxicidad esta causada frecuentemente, por la imposibilidad del organismo afectado para mantener los niveles necesarios de excreción de dicho elemento. Ello se ve agravado por el hecho de subir niveles en las cadenas tróficas, dando así lugar a la biomagnificación.

Los riesgos producidos por la contaminación de este tipo son función tanto de la toxicidad que presente el elemento como del carácter acumulativo de éste, destacando aquellos metales que presentan un índice de bioacumulación superior a la unidad (figura 2).

El concepto de bioacumulación hace referencia a la acumulación de contaminantes en los organismos, mientras que el índice de bioacumulación se expresa mediante el cociente entre la cantidad de ese contaminante en el suelo.

Figura 2. Índice y grado de contaminación de diversos metales en hongos y plantas vasculares.

A la vista de la figura 2, cabe destacar el Cd y el Hg como dos de los iones más tóxicos. El primero se encuentra en forma catiónica y sus propiedades se asemejan a las del ión calcio, salvo por su extrema toxicidad y a que su interacción con los constituyentes edáficos es más fuerte que la de éste.

Por su parte el mercurio, se encuentra en un primer momento en el suelo en forma de hidróxido (Hg (OH)2), pero en medios poco oxidantes, el Hg 2+, puede reducirse a Hg+, y después a mercurio metálico, el cual presenta un doble riesgo, debido a que es muy volátil, por que puede pasar a la atmósfera y porque puede difundir por los poros del terreno.

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Como se ha comentado, los metales pesados adicionados a los suelos se redistribuyen y reparten lentamente entre los componentes de la fase sólida. Caracterizándose dicha redistribución por una rápida retención inicial y posteriores reacciones lentas, dependiendo de las especies del metal, propiedades del suelo, nivel de contaminación y tiempo.

La movilidad relativa de los elementos traza en los suelos es de suma importancia en cuando a su disponibilidad y potencial para lixiviarse de los perfiles del suelo y pasar al agua subterránea.

Los factores que influyen en la movilización de metales pesados en el suelo son:

• Características del suelo: pH, potencial redox, composición iónica de la solución del suelo, capacidad de cambio, presencia de carbonatos, fracción de materia orgánica, presencia de óxidos e hidróxidos de Fe y Mn, textura, salinidad, etc.

• Naturaleza de la contaminación: Origen de los metales y forma de deposición.

• Condiciones ambientales: Acidificación, cambios en las condiciones redox, variaciones de temperatura, humedad, etc.

La movilización es relativa a todos estos factores pero especialmente a los que afectan a la transferencia desde fases sólidas a líquidas.

Los mecanismos mediante los cuales los metales pesados pueden movilizarse de los suelos contaminados son:

• Acidificación: Resultado de la oxidación de sulfuros minerales, precipitados y de fertilizantes de amonio, por la fijación biológica de nitrógeno, por precipitación atmosférica ácida sobre los suelos de óxidos de azufre y nitrógeno, por descomposición de materia orgánica, por agotamiento de bases, por lixiviación y por vertidos contaminantes con carácter ácido.

• Cambios en las condiciones redox: condiciones oxidantes que pueden causar la oxidación y disolución de sulfuros insolubles. A la inversa, condiciones reductoras pueden conducir a la disolución de óxidos y a la liberación de sus elementos metálicos de forma que coprecipiten en la solución. Fuertes condiciones reductoras también darán lugar a la precipitación de sulfuros insolubles de metales.

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• Complejación de especies metálicas con ligandos orgánicos: Los ligandos son constituyentes químicos que se combinan con los metales en un complejo químico.

• Cambios en la composición iónica de la solución del suelo: Los cuales pueden tener un marcado efecto en la adsorción de elementos y su incorporación en complejos inorgánicos solubles e insolubles. . Puede ser debido a la aplicación de fertilizantes o incluso cambios en la salinidad pueden conducir a una adsorción reducida y a la desorción de metales de lugares de la superficie.

Hay cuatro tipos de efectos: competición por sitios de adsorción (por ejemplo, Ca2+ y Zn 2+ inhiben la adsorción de Cd 2+); formación de complejos solubles (con aniones como Cl- y SO4

2-); formación de complejos insolubles como Pb5(PO4)Cl; efectos de fuerza iónica, de manera que incrementos en la fuerza iónica de la solución del suelos como resultado de la contaminación

• Metilación: Metales como el As, Hg, Sb, Se y Sn, pueden ser trasformados en metilespecies, como CH3Hg. La mutilación puede afectar al movimiento y pérdida de ciertos elementos y también en su toxicidad. Así las especies metiladas de arsénico son menos tóxicas que las formas inorgánicas, mientras que las especies metil-mercurio son más tóxicas. Además las especies metiladas pueden volatilizarse a la atmósfera o bien, pueden acumularse en la materia orgánica del suelo o en los tejidos ricos en lípidos de flora y fauna del suelo.

Otro aspecto importante a considerar es la presencia simultánea de varios metales pesados, ya que sus efectos pueden ser tanto sinérgicos como antagónicos. Por lo tanto existe cierta dificultad para predecir los efectos reales de los contaminantes presentes en el medio. Dado que los efectos de la mezcla de estos compuestos pueden ser inocuos, dañinos, letales o subletales (no dañan al organismo pero producen graves daños a nivel genético o fisiológico). De hecho, con frecuencia los daños subletales suelen ser más dañinos para el computo de la población como conjunto, ya que afectan al desarrollo o la reproducción.

La causa primaria del elevado nivel de toxicidad a nivel químico de estos elementos es debida a que los metales pesados poseen una gran capacidad para unirse con moléculas orgánicas. Estos efectos tóxicos en sistemas biológicos dependen de las reacciones con ligandos que son esenciales para su asimilación. Estos ligandos, a su vez, están presentes en gran abundancia en las células, ya sea formando parte de moléculas de mayores dimensiones o como moléculas aisladas.

En este sentido cabe destacar la gran afinidad que muestran los metales pesados, como principales ligandos, por grupos sulfhidrilo, radicales amino, fosfato, carboxilo e hidroxilo. Siendo generalmente, el resultado de estas uniones ligando-metal muy perjudicial para la célula.

Entre los principales efectos sobre la célula que provoca la unión del metal al ligando, caben resaltar los siguientes:

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• La acción genérica sobre proteínas por inhibición de la actividad o por cambios en la estructura de la misma.

• El desplazamiento de elementos esenciales del metabolismo estándar, provocando deficiencias de otros elementos.

• Catálisis de reacciones de generación de moléculas reactivas de oxígeno (ROS) o radicales libres que provocan fenómenos de estrés oxidativo.

El estrés oxidativo es un fenómeno que merece ser estudiado aisladamente, dada su complejidad e importancia en el desarrollo de los mecanismos básicos de la célula, entre cuyos daños más relevantes destacan:

• Inactivación de proteínas y enzimas, fundamentalmente por la oxidación de los grupos sulfhidrilo, dando lugar a puentes disulfuro que causan un funcionamiento anómalo en la proteína o enzima, o incluso su inactivación.

• Peroxidación lipídica de membranas, ocasionando rupturas y subproductos de las cadenas hidrocarbonadas.

• Efectos dañinos en el ADN, pudiendo ser éstos de tipo genotóxico: mutaciones, alteraciones en la síntesis y reparación de ácidos nucleicos y transformaciones celulares.

El estudio de los metales es de gran importancia en términos de contaminación ambiental debido a sus efectos tóxicos sobre los organismos. En especial, las bacterias han sido objeto de numerosos estudios por su participación en los ciclos biogeoquímicos de los elementos esenciales para la vida (C, N, P y S), así como por su capacidad para transformar compuestos no esenciales, que eventualmente pueden representar una amenaza en el ambiente.

Las interacciones entre las bacterias y los metales pueden tener lugar intracelularmente, en la superficie bacteriana o bien, en el espacio extracelular.

A nivel extracelular, se ha determinado:

• El papel de los microorganismos en la movilización e inmovilización de metales, así como la secreción de compuesto orgánicos de bajo peso molecular con alta afinidad por estos elementos (sideróforos).

• Por su parte las interacciones con la superficie celular depende del tipo de bacteria, ya que el metal interactúa con los grupos específicos, cargados negativamente, en cada caso.

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• Cuando la interacción bacteria-metal tiene lugar a nivel intracelular, como consecuencia de la acumulación del metal ocurren transformaciones enzimáticas o la síntesis de proteínas específicas conocidas como metalotioninas.

• Cabría resaltar además, la capacidad que tienen algunas bacterias para utilizar metales como fuente de energía o como aceptores finales de electrones del metabolismo.

2. TIPOS DE BIORREMEDIACIÓN

En los procesos de biorremediación generalmente, se emplean mezclas de microorganismos y/o plantas capaces de degradar o acumular en su biomasa sustancias contaminantes tales como compuestos orgánicos derivados del petróleo o metales pesados.

Básicamente los procesos de biorremediación pueden ser de tres tipos atendiendo a la zona donde tienen lugar.

2.1 Interacciones extracelulares

Las principales interacciones extracelulares entre bacterias y metales son la movilización e inmovilización de éstos, la producción de polímeros extracelulares y la liberación de sideróforos.

La movilización e inmovilización de metales es motivo de interés por sus aplicaciones industriales, especialmente en el campo de la minería, siendo numerosos los estudios que se han llevado a cabo con microorganismos ( Thiobacillus, Serratia, Bacilus, Penicillium, Pseudomonas y Aspergillus) que generan ácidos orgánicos e inorgánicos capaces de extraer los metales de los sustratos sólidos.

Así mismo, existe un creciente interés en el empleo de microorganismos (bacterias, levaduras, algas y hongos) como bioabsorbentes para la recuperación de metales y para el tratamiento de efluentes industriales.

Los exudados son compuestos orgánicos liberados por algunas células, como por ejemplo las que se encuentran en las raíces de las plantas, que pueden ser de dos tipos: de bajo peso molecular y de alto peso molecular. Liberándose los primeros a favor de gradiente de concentración, mientras que los segundos son liberados mediante mecanismos de transporte activo o por lisis celular. Entre los de bajo peso molecular encontramos ácidos orgánicos, azúcares, fenoles, aminoácidos y gases como el etileno.

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Por su parte, los exudados de mayor peso molecular son productos de las autolisis celulares de células epidérmicas y corticales, secreciones que conllevan un proceso metabólico de liberación, o bien, son mucílagos.

En general, los exudados facilitan la disponibilidad de los metales. Por ejemplo, se ha observado que los exudados de ciertas plantas favorecen la absorción de hierro en suelos deficitarios de éste.

En el caso concreto de las raíces, los exudados mucilaginosos, forman una capa externa a éstas, que favorece la complejación de algunos metales como el Cd, Cu y Pb.

Además existen ciertas bacterias que producen polímeros extracelulares que son capaces de atrapar los metales, interviniendo así en la movilización e inmovilización de los metales en los suelos. Siendo, debido a su importancia, la producción de sideróforos (compuestos específicos que atrapan al ión hierro, que es clave en el crecimiento microbiano) uno de los casos más estudiados.

2.1.1.Movilización

La movilización puede definirse como la capacidad que presentas ciertas bacterias para liberar metales constitutivos de algunos compuestos químicos.

En general se ha encontrado poca información sobre la movilización de metales en el ambiente. Aunque cabe destacar que uno de los ejemplos más conocidos es el de la bacteria Thiobacillus ferroxidans, responsable de la lixiviación de Fe, Cu y Mo, razón por la que se emplean en la extracción industriales de dichos metales.

En la industria minera se utilizan como materia prima de compuestos sulforados de hierro como la pirita, del cobre como la novelita. Ambos muy insolubles y complicados de explotar. Por lo general, para la explotación de dichos minerales se emplean tratamientos químicos convencionales, pero cuando los rendimientos de estos son bajos debido a la baja concentración, los procesos convencionales dejan de ser rentables por lo que en estos casos se emplea la bacteria acidófila T. ferroxidans, la cual es capaz de catalizar y acelerar la oxidación de los sulfuros minerales. De hecho en algunos estudios se ha comprobado que la presencia de dicha bacteria solubiliza completamente el cobre presente en la covelita (en un tiempo de reacción de 10 días).

Actualmente, en su mayoría las líneas de investigación están enfocadas al estudio de la capacidad de esta bacteria para disociar los compuestos sulfurados de otros metales, aclimatando el microorganismo a altas concentraciones del metal de interés, como por ejemplo el níquel.

2.1.1.1. Volatilización

Una forma especial de movilización de los metales pesados que pueden llevar a cabo tanto las plantas como los microorganismos, es la volatilización. Proceso mediante el cual se lleva a cabo el paso de iones metálicos a fase volátil. De este modo, logran eliminarlo de su medio, y por lo tanto de sufrir sus efectos, al pasarlo a la atmósfera.

Por ejemplo la enzima MerA reduce el Hg (II) a Hg (0), que es volátil. El proceso constan de dos pasos: en el primero se transforma la forma orgánica del metal a la forma

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inorgánica (debido a que generalmente las especies orgánicas son más toxicas), y de inorgánico a volátil.

Figura 3. Ruta, en dos pasos de volatilización de mercurio.

2.1.2. Inmovilización

La inmovilización puede definirse como la capacidad que presenta la biomasa microbiana para retener metales, uniéndolos a sus componentes estructurales. Esta capacidad, que se utiliza para recuperar metales de efluentes industriales, depende de las propiedades físicas, químicas y biológicas de la biomasa microbiana. Sin embargo, se puede mejorar la capacidad de acumulación y absorción de los microorganismos por selección natural, manipulación genética o mediante manipulación fisicoquímica de la célula.

Los procesos de inmovilización son los siguientes:

2.1.2.1. Bioabsorción

La bioabsorción es la propiedad de la biomasa de inmovilizar y concentrar metales en soluciones acuosas.

Los componentes de la superficie celular que actúan como bioabsorbentes son polímeros estructurales y extracelulares con un alto contenido en grupos funcionales (polianiones), que interactúan con los metales, atrapándolos dentro de su estructura.

Hoy en día, la atención está enfocada hacia el uso de residuos industriales de naturaleza agrícola, como pueden ser restos de paja, salvado, pulpa u otras fibras.

El empleo de este tipo de materiales como adsorbentes tiene la ventaja de contar con un coste nulo y cuentan con una amplia distribución, a la par que no presentan dificultades ni en transporte ni en manejo.

Por el contrario, parte de los inconvenientes son que este tipo de adsorbentes carecen de un tamaño de partícula adecuado y generalmente heterogéneo, baja densidad y carecen de resistencia mecánica.

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Debido a los inconvenientes mencionados, gran parte de las investigaciones recientes en este campo tienen como objetivo la extracción de las proteínas de las pulpas para producir geles, con los que se minimizan mucho de los problemas que presenta este tipo de biomasa. Por ejemplo, xerogeles de remolacha procedente de residuos de la industria azucarera han logrado retener con éxito el Cd, Pb y Cu presente en efluentes acuosos, permitiendo su recuperación y reutilización durante 9 ciclos.

Algunas de las ventajas del empleo de la bioabsorción son:

• La recuperación selectiva de metales valiosos en bajas concentraciones.

• La posibilidad de definir si las concentraciones de metales que quedan en los efluentes cumplen con las regulaciones de calidad de las aguas.

• Se puede aplicar de manera continua en un amplio intervalo de temperatura y pH (en función de la biomasa empleada).

• Se trata de una tecnología económica que requiere poco capital de inversión y bajos costes de operación.

• Los metales absorbidos se pueden recuperar de forma eficiente mediante un tratamiento ácido, de manera que se minimicen los residuos.

• Se puede utilizar biomasa residual generada en procesos de fermentación a gran escala.

2.1.2.2. Polímeros extracelulares

Los polímeros extracelulares son componentes principales de la cápsula celular, cuya función es capacitar la adhesión de la bacteria a todo tipo de superficies (desde partículas a otros organismos), a la vez que posibilitan la captura de iones metálicos por parte de la bacteria.

Los polímeros extracelulares están compuestos principalmente por polisacáridos, aunque también pueden contener proteínas, y sus interacciones con los iones metálicos son consecuencia directa de la presencia de grupos funcionales cargados negativamente en su estructura como son por ejemplo, piruvato, fosfato, hidroxilo, succinilo y ácido urónico.

Tras llevarse a cabo la caracterización de los polímeros extracelulares de muchas bacterias, se ha observado que su composición presenta una gran variabilidad de unas especies a otras. Por ejemplo, el exopolímero de una cepa de Pseudomonas está compuesto por hexosa, ácido pirúvico y acetato (en un 75%, 6% y 4% respectivamente); por su parte en una cepa de Zoogloea, el polímero extracelular está compuesto mayoritariamente por glucosa, y galactosa en menor medida; mientras que en la halófila Aphanocapsa halophytia, además de estar compuestos por varios azúcares (ordenados en porcentaje decreciente: ramosa, manosa, galactosa, xilosa y glucosa), contienen un 12% de residuos de sulfato y un 10% de proteínas.

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La interacción entre los polímeros microbianos y los metales pesados tiene implicaciones ecológicas y prácticas muy importantes, ya que pueden mediar la fijación de metales a las partículas de arcilla en el suelo, con las consecuentes alteraciones en los cultivos agrícolas, intervenir en algunos pasos de ciclos biogeoquímicos de los elementos, alterándolos, e inmovilizar los metales tóxicos de los efluentes líquidos, disminuyendo así su biodisponibilidad.

2.1.2.3. Sideróforos

A pesar de ser uno de los elementos más abundantes en la naturaleza, el hierro es limitante para el crecimiento bacteriano debido a que forma complejos insolubles (hidróxidos férricos) en condiciones aerobias a pH neutro, lo que limita su disponibilidad.

Debido a esta limitación de hierro, las bacterias han seleccionado un sistema activo de alta afinidad con el que obtener el metal. Este sistema de transporte involucra la excreción de ligandos de bajo peso molecular (500-1500 D) con alta afinidad por el ión férrico, denominados siderofóros.

La biosíntesis de los sideróforos está regulada por los niveles de hierro, y se reprime en ambientes con elevadas concentraciones de éste. Los niveles intracelulares de hierro son contralados en las bacterias debido a que su carencia ocasiona una disminución del crecimiento, mientras que a elevadas concentraciones puede resultar tóxico.

Actualmente hay más de 500 sideróforos identificados. Este tipo de compuestos normalmente forman complejos con el Fe3+, llevándolo a la zona de la membrana donde lo reducen a Fe2+, forma en la que es llevado al interior celular.

En algunas ocasiones los sideróforos son destruidos en alguno de los pasos comentados, pero en otras ocasiones no es así y el sideróforo se recupera y reutiliza (observándose este último comportamiento tanto en Gram positivas como en Gram negativas).

Los sideróforos se han clasificado en dos grupos principales: los del grupo fenol/catecolato y los hidroxamatos.

En la tabla 1, mostrada a continuación, se muestran algunos de los sideróforos recogidos en la literatura.

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Tabla 1. Ejemplo de sideróforos.

Sideróforo Tipo de compuesto Cepa bacteriana

Enterobactina

Catecol

Escherichia coli

Aerobactina Hidroxamato Escherichia coli

Ácido rodotorúlico Hidroxamato Rhodotorula pilimanae

Desferrioxamina B Hidroxamato Streptomyces sp.

Rhizobactina Ácido poliamino carboxílico

Rhizobium meliloti

Hidroxamato K Hidroxamato Rhizobium leguminosarum

Micobactina ------- Mycobacterium smegmatis

Pioverdina

Pioquelina

Intermedios entre catecolatos e hidroxamatos

Pseudomonas aeruginosa

Anguibactina Catecol Vibrio anguillarum

Bisucabarina Hidroxamato Alteromonas haloplanktis

Alterobactina A

Alterobactina B

Catecol

Alteromonas luteoviolacea

2.2.Interacciones con la superficie celular

La interacción inicial entre los microorganismos y los metales, tiene lugar por atracción electrostática entre los iones cargados en solución y los grupos funcionales de la superficie celular microbiana.

La membrana plasmática es un sistema complejo de funcionamiento sofisticado, siendo la puerta de entrada de cualquier elemento (señal, nutriente, tóxico, etc.) al interior celular.

La membrana plasmática tiene entre sus funciones la de mantener los gradientes iónicos, que a su vez regulan la turgencia y volumen celular. Si se daña la membrana, entran cationes Ca2+ y salen iones K+ (responsables de los fenómenos de polarización y despolarización de la membrana y por lo tanto de la transmisión eléctrica). Además, la salida de los iones potasio favorece la entrada de agua, por lo que la célula ve incrementado su volumen celular.

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Debido a su exposición, independientemente de la agresión tóxica, la membrana plasmática es uno de los componentes celulares que primero responde al daño, siendo el resultado final el mismo, la pérdida de integridad de la membrana.

Los daños que provocan los metales pesados en la membrana son específicos para cada metal, pero de manera general y resumida se pueden enumerar los siguientes:

• Oxidación y entrecruzamiento de proteínas.

• Inhibición de proteínas de membrana esenciales como la H+-ATPasa.

• Cambios en la composición y fluidez de los lípidos de membrana y cambio en la permeabilidad ( Ej: El Cu y el Cd alteran la composición de estos lípidos provocando la fuga de solutos celulares).

En cualquier caso, todos estos mecanismos esencialmente acaban alterando las propiedades eléctricas de la membrana plasmática. Sin embargo, la membrana plasmática puede estar involucrada en la tolerancia a metales pesados reduciendo su captación o bien, estimulando bombas de flujos de metales.

Es conocido que las plantas que presentan tolerancia a los metales pesados protegen de éstos a sus membranas, siendo los siguientes algunos de los mecanismos empleados para ello:

• Mecanismos de reparación de membranas.

• Empleo de mecanismo de protección como proteínas de choque térmico, metaloproteínas, etc.

• Mejora de los mecanismos de homeostasis del metal.

• Promoviendo un influjo reducido a través de la membrana plasmática.

• Promoviendo un eflujo selectivo (lo cual supone un gasto metabólico inferior al que suponen los mecanismos de influjo y restricción).

En el caso de las bacterias Gram-positivas, la pared celular constituye el primer frente de interacción con las moléculas presentes en el ambiente. En los medios de cultivo apropiados para el crecimiento bacteriano, las especies Gram-positivas presentan una pared celular cargada negativamente, aunque también contiene cargas positivas en menor número. Los centros aniónicos son el carboxilato del péptidoglicano y el fosfato del ácido teicoica, mientras que las cargas positivas corresponden a los grupos amonio

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de la D-alanina (ácido teicoico), los grupos amino de los azúcares (glicano) y del ácido diaminopimélico (porción peptídica del peptidoglicano). Estos grupos son las porciones iónicas que sirven de mediadoras entre la pared celular y los iones metálicos.

Los cationes necesarios para las funcione proteicas o la actividad enzimática, deben atravesar deben atravesar la pared celular de las bacterias Gram-positivas para alcanzar sus sitios de unión cerca de la membrana o en el interior del citoplasma. El transporte de iones metálicos al citoplasma bacteriano, presenta diferentes niveles de complejidad. Las estrategias para el transporte de K, Mg y Ca son conocidas, pero en otros casos como el Ni, Mn, Zn y otros metales, no están tan bien definidas y se supone que deben penetrar la pared celular, disociarse de ella y reasociarse con moléculas transportadoras, para ser liberadas en el citoplasma y finalmente incorporarse a las proteínas.

Por su parte, en las bacterias Gram-negativas, la membrana externa es capaz de unir un amplio rango de iones metálicos. Los cationes al parecer son accesorios importantes que estabilizan la arquitectura molecular de la membrana. También se supone que la unión a iones metálicos reduce las cargas repulsivas entre los constituyentes aniónicos de moléculas de lipopolisacáridos y proteínas adyacentes.

Además, algunos investigadores han demostrado que los grupos fosforilo de los lipopolisacáridos, son los constituyentes de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas que primero se unen a los iones metálicos, y en algunos grupos carboxilo también están disponibles para interactuar con los metales. Sin embargo, es el peptidoglicano quien se une fuertemente a los iones metálicos por los grupos carboxilo, al igual que ocurre con las bacterias Gram- positivas, pero en menor escala.

Como conclusión se aprecia que las bacterias Gram-positivas tienen mayor capacidad para unir especies metálicas que las Gram-negativas, debido a las diferencias que presentan en la composición estructural de la superficie celular.

2.3.Interacciones intracelulares

Las interacciones a nivel intracelular entre las bacterias y los metales pesados, se inician con un proceso activo denominado bioacumulación, seguido de transformaciones enzimáticas y/o inducción de la síntesis de proteínas enlazadoras.

2.3.1.Bioacumulación

La absorción de iones metálicos es un proceso rápido que involucra la interacción con la superficie celular, y es el primer paso para la acumulación, que es un proceso mucho más lento, dependiente del metabolismo celular y capaz de retener mayor cantidad de iones.

La presencia de importantes familias de proteínas transportadoras de metales ha sido estudiada en la literatura. Reseñando en algunos casos, la presencia de sistemas en los cuales los metales son incorporados por transportadores que las células utilizan normalmente para la incorporación de elementos de elementos esenciales como el fósforo y el azufre. Por citar un ejemplo, el As3+, es incorporado por el transportador de los grupos fosfato.

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Aunque los niveles de cationes metálicos necesarios para el crecimiento bacteriano son bajos, los mecanismos de acumulación también funcionan a altas concentraciones, pudiendo este hecho incidir en la toxicidad del metal sobre el organismo que los acumula y la comunidad microbiana a la que pertenece.

No resulta sencillo comprender la acumulación de metales tóxicos en los microorganismos, sin embargo parece ser que el almacenamiento intracelular de estos compuestos, confiere resistencia a metales pesados en algunas bacterias.

La mayoría de las especies metálicas que se acumulan en las células bacterianas pueden ser transformadas a compuestos de menor toxicidad por ciertos complejos enzimáticos.

A nivel de microorganismo, hay un límite para la cantidad de metal que se puede acumular, además, generalmente, antes de llegar a concentraciones letales se activan los mecanismos de resistencia y se inducen la síntesis de enzimas transformadoras o de proteínas enlazadoras con los metales.

2.3.2. Transformaciones mediadas por los enzimas

La resistencia bacteriana a los metales pesados ha sido estudiada y se han podido establecer los mecanismos que están codificados en plásmidos involucrados en la resistencia a dichos metales.

Algunos de estos sistemas de resistencia llevan asociadas transformaciones enzimáticas, como es el caso del Hg, As y Te; mientras que otros están mediados por proteínas transportadoras, como es el caso del Cd, Zn, Co y Ni las cuales se encargan de bombear los iones fuera de la célula.

Cabe destacar que la transformación enzimática del mercurio es una de las más estudiadas, debido a dos aspectos: la importancia de este elemento como contaminante ambiental y al papel primordial que juegan los microorganismos en el ciclo biogeoquímico de este metal.

El mercurio se encuentra en la atmósfera en forma elemental (Hg0), que es volátil y se oxida fotoquímicamente al ión mercúrico (Hg2+), siendo esta la forma en la que penetra en los ecosistemas acuáticos.

El ión mercúrico se absorbe en la materia orgánica particulada donde es metabolizado por los microorganismos, produciendo metilmercurio (CH3Hg+). Esta forma orgánica de mercurio es soluble en agua y puede bioacumularse a través de la cadena trófica o metilarse, dando lugar a dimetilmercurio (CH3HgCH3). Debe tenerse en cuenta la elevada peligrosidad de estas formas orgánicas dado que tienen la capacidad de unirse a proteínas, actuando a modo de neurotoxinas (siendo unas 100 veces más tóxicas que las formas inorgánicas) y tienden a acumularse en los tejidos animales, causando especial daño al sistemas nervioso, hígado y riñón, e incluso llegando a producir la muerte del organismo.

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2.3.3. Síntesis de metalotioneínas (MTs)

Las bacterias tolerantes a los metales son capaces de acumularlos en el interior celular, donde la presencia de proteínas enlazantes, denominadas metalotioneínas, que al unirse a ellos, reduce su toxicidad al evitar la interacción de los metales con otras proteínas esenciales para el microorganismo.

Las metalotioneínas son proteínas de bajo peso molecular cuya función es el transporte de metales. Estas metalotioneínas, son polipéptidos de unos 70-75 aminoácidos, con alto contenido en cisteína, que es un aminoácido capaz de formar complejos con cationes mediante el grupo sulfidrilo que posee como radical.

Se cree que las metalotioneínas, son las principales responsables de la quelación de metales pesados en el citoplasma de las células de mamíferos y bacterias, pero que no son proteínas tan decisivas en el proceso de quelación de metales en las plantas.

Tabla 2. Algunas metalotioneínas implicadas en la tolerancia y/o acumulación de metales pesados.

Proteína

Donante

Receptor

Observaciones

MT1

Ratón

Tabaco

Aporta tolerancia al Cd durante la germinación

MT Guisante Arabidopsis Produce acumulación de Cu

CUP1

Levadura

Coliflor

Se incrementa 16 veces la tolerancia al Cd, provocando la acumulación de éste

Las metalotioninas han sido encontradas en un amplio abanico de organismos que abarca desde bacterias y levaduras a plantas y animales.

Por ejemplo, algunas de las bacterias en las que se han encontrado este tipo de proteínas han sido en las cianobacterias del género Synechococcus y en algunas cepas de Pseudomonas.

En el caso particular de las Pseudomonas, al exponer la cepa a sales de Au se observó la inducción de un polipéptido con altos contenidos en cisteína, glutamato y glicina. Composición que sugiere una estructura similar a las fitoquelatinas presentes en algunos organismos autótrofos y levaduras.

La síntesis de metalotioninas en bacterias constituye uno de los posibles mecanismos para explicar los procesos de bioacumulación de metales pesados, a la vez que representa una herramienta potencial para el tratamiento biológico de ambientes contaminados por metales pesados.

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2.3.4. Síntesis de Fitoquelatinas (PCs)

Las fitoquelatinas son ligandos de alta afinidad que complejas metales pesados. Se cree que las fitoquelatinas pueden desempeñar en plantas el papel equivalente al de las metalotioneínas en mamíferos y bacterias. Según estudios, las fitoquelatinas se inducen rápidamente en plantas mediante el tratamiento con metales pesados. Además, se ha observado como un descenso en su concentración provoca una mayor sensibilidad a los metales, por lo que su papel en la tolerancia y acumulación de éstos en las plantas resulta crítico.

Las fitoquelatinas tienen como sustrato el glutatión, el cual está considerado como el péptido más abundante, que además, resulta ser una molécula clave en el balance del estado oxidativo de la célula. Destacar que también participa en procesos de detoxificación de diversas sustancias dañinas, y es capaz de quelar metales pesados por si misma.

El glutatión está constituido por 3 aminoácidos unidos por enlaces peptídicos: glutámico (Glu), cisteína (Cys) y glicina (Gly). Sin embargo, de forma inusual, el glutámico se una a la cisteína por el grupo carboxílico no cercano al amino, como sería habitual, sino por el grupo carboxílico residual. Por ello, en este sentido, el glutatión es un péptido inusual, cuya estructura primara es γ-GluCysGly.

Numerosos estudios indican que el glutatión (GSH) es el sustrato de la biosínteis de las fitoquelatinas, llevándose a cabo este proceso de síntesis a través de los enzimas que se indican en la figura 3, mostrada a continuación.

Figura 3. Esquema del proceso de síntesis de PCs.

Se ha observado que la síntesis de fitoquelatinas se produce por la unión de glutatión, con residuos de Glu y Cys ligados a través de repeticiones de (γ-GluCysGly)n, donde n = 2-11. En lo referente al consumo energético, los dos primeros pasos,

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correspondientes a la síntesis del glutatión, consumen ATP, mientras que el tercero, correspondiente a la síntesis de PCs, no tiene consumo de energía.

Debe resaltarse que el Cd ejerce un efecto positivo en la síntesis de las fitoquelatinas, actuando sobre todos los enzimas que intervienen en la síntesis de PCs. Así mismo, cabe resaltar que dicha síntesis se inhibe a elevadas concentraciones de glutatión, es decir, el producto del paso 2 inhibe el paso 1.

Tabla 3. Ejemplos de fitoquelatinas implicadas en la tolerancia y/o acumulación de metales pesados.

Proteína

Donante

Receptor

Observaciones

RCS1

Arroz

Tabaco

Tolerancia al Cd

TaPCS1 Trigo Nicotiana

glauca Tolerancia a Pb y Cd. Duplica la

acumulación de Pb.

AtPCS1

Arabidopsis

Arabidopsis

Hipersensibilidad al Cd y Zn, que desaparece al incrementar la

concentración de glutatión al medio.

Las PCs se sintetizan en el citosol, donde se unen a compuestos metálicos formando complejos. Estudios llevados a cabo han observado que las mayores concentraciones de metales y de fitoquelatinas se encuentran en el interior vacuolar, por lo que se deduce que el transporte y acumulación de los metales en su interior está relacionado con la tolerancia y la detoxificación de ambientes llevados a cabo por los vegetales.

Figura 4. Transferencia de metales en plantas.

1. Los metales son adsorbidos por las raíces. 2. Los metales atraviesan la membrana celular de las raíces. 3. Una parte de los metales absorbidos son retenidos en las vacuolas. 4. algunos metales cruzan la célula y atraviesan la membrana celular hasta llegar a espacio intercelular de la raíz. 5. Los metales son

llevados desde la raíz a las partes aéreas de la planta.

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De hecho, parece ser que la compartimentación vacuolar actúa a modo de almacén final de los metales que la planta moviliza en el suelo.

Por lo tanto, el eflujo de iones y el transporte al interior de la vacuola constituyen dos maneras diferentes de conseguir reducir la concentración de metales tóxicos en el citoplasma. Radicando la diferencia entre ambos en que en el primero no existe una reducción garantizada del problema de toxicidad.

Tabla Transportadores vacuolares de metales pesados.

Proteína Donante Receptor Observaciones

YCF1 Saccharomyces

cerevisae Arabidopsis

Tolerancia y acumulación de Cd

y Pb

PtdMTP1 Populus tricharpa x Populus deltoides

Arabidopsis Tolerancia al Zn

ShMPT1 Stylosanthes

hamata Saccharomyces

cerevisae Tolerancia al Mn2+

AtATM3 Arabidopsis

thaliana Arabidopsis

Contribuye a la resistencia al Cd

ZRC1 Saccharomyces

cerevisae Saccharomyces

cerevisae

Contribuye al almacenaje de Zn2+

en la vacuola

Figura 5. Interacción de algunos metales pesados con células vegetales.

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Además del conocido proceso de acumulación de los complejos de PCs-Cd en el interior de la vacuola, se han encontrado evidencias de acumulación de otros metales , involucrando diferentes sistemas de transporte desde el tonoplasto, como el Zn, Ni y Mn.

3. CONCLUSIONES

A la vista de la bibliografía consultada se puede decir que la biorremediación de metales pesados se presenta como una opción en desarrollo y cada vez más válida, con gran variedad de procesos, para el tratamiento de suelos contaminados y de corrientes acuosas.

Además, dado que los actuales tratamientos llevados a cabo para este tipo de contaminación o son muy severos con el medio o excesivamente caros para aplicarlos en grandes superficies o en países en vías de desarrollo, las técnicas de biorremediación suponen un tratamiento de efectivo y mucho más respetuoso con el medio ambiente. Pudiendo en algunos casos, como la bioadsorción, constituir una salida útil y de bajo coste, para unos materiales clasificados a priori como residuales.

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