Marcadores Marcadores

MolecularesMoleculares

Luis Destefano BeltránLuis Destefano Beltrán

Departamento de Ciencias Biológicas y FisiológicasDepartamento de Ciencias Biológicas y FisiológicasUniversidad Peruana Cayetano HerediaUniversidad Peruana Cayetano Heredia

Marcadores MolecularesMarcadores Moleculares

Un gen o secuencia de ADN que se puede usar paraUn gen o secuencia de ADN que se puede usar paraidentificar a un organismo, a una especie, a una cepaidentificar a un organismo, a una especie, a una cepao a una caractero a una característica fenotípica asociada con élística fenotípica asociada con él

Un señal usada en el aislamiento de genes eucarióticos:Un señal usada en el aislamiento de genes eucarióticos:una sonda de RFLP o una sonda de RFLP o un lugar de unión de partidor para amplificaciónun lugar de unión de partidor para amplificación

Secuencias de ADN que pueden ser identificadas Secuencias de ADN que pueden ser identificadas mediante un simple ensayo: mediante un simple ensayo:

tan pequeño como un SNP otan pequeño como un SNP oo un frag. de ADN generado por ER’s.o un frag. de ADN generado por ER’s.

Marcadores moleculares son Marcadores moleculares son segmentos o fragmentos de segmentos o fragmentos de cromosoma que no codifican cromosoma que no codifican necesariamente alguna necesariamente alguna característica, que no están característica, que no están afectados por el ambiente. pero que afectados por el ambiente. pero que son heredados de una manera son heredados de una manera Mendeliana (2006).Mendeliana (2006).

Marcadores MolecularesMarcadores Moleculares

Isozimas yIsozimas y AlozimasAlozimas

• El “abuelo” de los marcadores El “abuelo” de los marcadores molecularesmoleculares

• Lewontin y Hubby, 1966Lewontin y Hubby, 1966 - Substituciones de amino acidos - Substituciones de amino acidos cambian cambian la movilidad de la enzima en el gel: la movilidad de la enzima en el gel:

-plegamiento y/o carga-plegamiento y/o carga

• AAúún en uso en estudios de Genn en uso en estudios de Genéética de tica de Poblaciones que necesitan identificar Poblaciones que necesitan identificar bajos niveles de variacibajos niveles de variacióón genn genéética.tica.

IsozimasIsozimas

• Pros:Pros:Protocolos bien desarrollados con moderado Protocolos bien desarrollados con moderado

grado de grado de dificultad. dificultad. No se necesita informacion genNo se necesita informacion genóómica. mica. Existen dExisten déécadas y dcadas y déécadas de datos acumulados cadas de datos acumulados

(“mining”).(“mining”).

•Cons:Cons:Poca variaciPoca variación.ón.Se necesita abundante tejido fresco.Se necesita abundante tejido fresco.Loci son una muestra no aleatoria del genoma y Loci son una muestra no aleatoria del genoma y

muchos estan bajo fuerte selección. muchos estan bajo fuerte selección.Puede ser considerado un “arte”.Puede ser considerado un “arte”.Muchos reactivos químicos peligrosos.Muchos reactivos químicos peligrosos.

Marcadores MolecularesMarcadores Moleculares

Southern blotsSouthern blots

• Aislamiento del ADN Aislamiento del ADN • Digestión del ADN con enzima de Digestión del ADN con enzima de

restricción restricción • Separación de los fragmentos de Separación de los fragmentos de

ADN de acuerdo a su tamañoADN de acuerdo a su tamaño• Denaturación del ADNDenaturación del ADN• Transferencia de las cadenas Transferencia de las cadenas

simples de ADN a la membranasimples de ADN a la membrana

MetodologíaMetodología

• Preparación de la sondaPreparación de la sonda– Marcación Marcación – DenaturaciónDenaturación

• Hibridación de la sonda a la Hibridación de la sonda a la membranamembrana

• Enjuague de la membranaEnjuague de la membrana• AutoradiografíaAutoradiografía

sondasonda

ubicaciubicación de los sitios de restricciónón de los sitios de restricción

ADNADNAnemiaAnemia

FalciformeFalciforme

ADNADNAnemiaAnemia

FalciformeFalciformeADNADN

NormalNormalADNADN

NormalNormalAA BB

A + BA + B

A + BA + B

AA

BB

1. Cortar 1. Cortar concon

MstIMstI2. Gel2. Gel

1. Cortar 1. Cortar concon

MstIMstI2. Gel2. Gel

ADN ADN ββ-Globina-GlobinaNormalNormal

ADN AnemiaADN AnemiaFalciformeFalciforme

HibrididaciHibrididaciónónSouthernSouthern

ElectroforesisElectroforesisen geles de en geles de

AgarosaAgarosa

SouthernSouthern

BlotBlot

DesventajasDesventajas

•Es tediosa y trabajosa Es tediosa y trabajosa •Puede durar varios días Puede durar varios días •Costosa Costosa •Usa radioisótopos Usa radioisótopos

RRestriction estriction FFragment ragment LLength ength PPolymorphismolymorphism(RFLP)(RFLP)

““PCR is the practice of Biology without a permit”PCR is the practice of Biology without a permit”

““RAPD allows analysis without a clue”RAPD allows analysis without a clue”

Random Amplified Polymorphic DNARandom Amplified Polymorphic DNA(RAPD)(RAPD)

• 1990, Welsh & McCleland and Williams 1990, Welsh & McCleland and Williams et alet al..• Usa partidores muy cortos (10 pb) para amplificar Usa partidores muy cortos (10 pb) para amplificar fragmentos aleatorios de ADN.fragmentos aleatorios de ADN.• No se necesita ninguna informaciNo se necesita ninguna información acerca del ón acerca del genoma en estudiogenoma en estudio• Marcador dominante: presente o ausenteMarcador dominante: presente o ausente• Muy desacreditado, pero probablemente no es tan Muy desacreditado, pero probablemente no es tan malo como algunos podrmalo como algunos podríían pensaran pensar

Random Amplified Polymorphic DNARandom Amplified Polymorphic DNA(RAPD)(RAPD)

Amplified Fragment Amplified Fragment Length PolymorphismLength Polymorphism

AFLPsAFLPs

Pros:Pros:-Muchos loci estudiados al mismo tiempoMuchos loci estudiados al mismo tiempo-No se necesita ninguna informaciNo se necesita ninguna información anteriorón anterior-Alta variabilidadAlta variabilidad

Cons:Cons:-Homoplasia en el tamaño de los frag’s Homoplasia en el tamaño de los frag’s -Problemas con reproducibilidadProblemas con reproducibilidad-Protocolo es muy largoProtocolo es muy largo-Marcador dominante anónimoMarcador dominante anónimo-Demasiados loci…..!!Demasiados loci…..!!

ADN RepetitivoADN Repetitivo

MicrosatMicrosatéélites o Secuencias Simples Repetidaslites o Secuencias Simples Repetidas(Simple Sequence Repeats, SSRs)(Simple Sequence Repeats, SSRs)-- Mono-, di-, tri-, y tetra-nucle Mono-, di-, tri-, y tetra-nucleótidosótidos

MinisatMinisatéélites o Short Tlites o Short Tandem Repeats (STRs)andem Repeats (STRs)- 5-10 bp- 5-10 bp

Variable Number of Tandem RepeatsVariable Number of Tandem Repeats- 14-100 bp- 14-100 bp

MicrosatMicrosatééliteslites

Rearreglos en los tRearreglos en los táándem repetidos ndem repetidos debido debido a un a un crossovercrossover desigual desigual

MicrosatMicrosatééliteslites

•Pros: Pros: -Altamente variable-Altamente variable-Muchos alelos por locus-Muchos alelos por locus-Marcador co-dominante-Marcador co-dominante

•Cons:Cons:--DinDinámica evolutiva desconocidaámica evolutiva desconocida- “Stutter y alelos nulos complican - “Stutter y alelos nulos complican el “scoring”el “scoring”-Alta inversión inicial para desarrollar -Alta inversión inicial para desarrollar lociloci

Single Nucleotide Polymorphism: Single Nucleotide Polymorphism: SNPsSNPs

• Pueden representar hasta 90% de la VariaciPueden representar hasta 90% de la VariacióónnGenGenéética Humanatica Humana

• 1.5 millon de posiciones presentan variabilidad1.5 millon de posiciones presentan variabilidad• Puede ser la base de la susceptibilidad a Puede ser la base de la susceptibilidad a

enfermedades comunes (cenfermedades comunes (cáncer, diabetes, etc)áncer, diabetes, etc)• Farmacogenética: busca identificar la posibleFarmacogenética: busca identificar la posible

respuesta a las terapias con drogas.respuesta a las terapias con drogas.• Metodos para identificar depende si es un SNPMetodos para identificar depende si es un SNP

desconocido o conocido desconocido o conocido

Marcadores No Marcadores No PolimórficosPolimórficos

• STSs (Sequence Tagged Sites)STSs (Sequence Tagged Sites)

Secuencia corta de ADN (200 – 500 bp) Secuencia corta de ADN (200 – 500 bp) con una ubicación cromosómica conocida con una ubicación cromosómica conocida que ocurre una vez en el genoma. que ocurre una vez en el genoma.

• ESTs (Expressed Sequence Tags)ESTs (Expressed Sequence Tags)

STSs derived from ADNc’sSTSs derived from ADNc’s

Conclusiones

• Todos los MM’s no son iguales.• Ninguno de ellos son ideales.• Algunos son mejores para algunos propósitos

que otros.

• Sin embargo, todos son preferibles a los M’s

Morfológicos para propósitos de mapeo