Manual Nidacon 2012

Manual deProductos

Nidación 1. La construcción de un nido, Nidus, como las aves.

2. Implantación de un óvulo fertilizado (Zigoto) y la construcción de un nido en el endometrio, la placenta.

Concepción1. La unión de los gametos masculinos yfemeninos, del esperma y el huevo.

2. Una impresión o idea.

Contenido

Contenido

Introducción • Calidad .......................................................................................................................................... 4

Aseguramiento de la calidad.......................................................................................................................... 5

Vida útil .................................................................................................................................................................................. 6

Empaque ............................................................................................................................................................................... 6

Composición del producto............................................................................................................................... 7

Productos • Información pedidos ............................................................................................................ 8

Productos................................................................................................................................................................... 9 -12

Bases científicas........................................................................................................................................................ 13

Preparación de gradiente de densidad ................................................................................. 14-15

SpeediKit........................................................................................................................................................................... 16

ProInsert ........................................................................................................................................................................... 17

Swim-up............................................................................................................................................................................. 18

Congelación de semen ............................................................................................................................ 19-21

ICSI .......................................................................................................................................................................................... 22

NidOil................................................................................................................................................................................... 23

Vitrificación y calentamiento de blastocistos.............................................................. 24-27

Tinción para vitalidad........................................................................................................................................ 28

Tinción para morfología ................................................................................................................................. 29

Referencias ..................................................................................................................................................................... 30

Contactos.......................................................................................................................................................................... 31

Introducción • Calidad

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Nidacon International AB fabrica y vende productos médicos principalmente para Técnicas de ReproducciónAsistida (ART); IVF, ICSI e inseminación intrauterina (IUI).La compañía fue fundada en 1996 por el Profesor Assoc.Paul V. Holmes MSc, PhD, DrMedSc, embriólogo y endo-crinólogo del departamento de ginecología y obstetricia de la Universidad Hospital Sahlgrenska en GotemburgoSuecia.

Nidacon considera muchos factores cuando diseña susproductos. Nos concentramos en los pequeños detalles quenos ayuden a crear productos para obtener mejores resul-tados. Nuestro objetivo es trabajar en estrecha relación connuestros clientes, ellos son la piedra angular de nuestro departamento de investigación.

Nos enorgullecemos con el desarrollo de nuestros productos y aseguramos que respondan a las necesidadesde nuestros clientes y colegas de investigación. Todos nuestros productos son desarrollados en estrecha coope-ración con profesionales en los diferentes campos.

Uno de los primeros productos originado por nuestrodepartamento de investigación y desarrollo, PureSperm®,fue lanzado al mercado en Noviembre de 1996. Ha venidoganando rápida aceptación y se ha convertido en el líderdel mercado global para el aislamiento y preparación de esperma, en técnicas de reproducción humana asistida.Fue el primer producto de su categoría en alcanzar tantola acreditación 510(k) por parte de US FDA como la marcaCE con las autoridades europeas.

Introducción

Nidacon está certificada de acuerdo a SS-EN ISO 9001 (Implementado 2000-12-15) y SS-EN ISO 13485 (Implemen-tado 2003-08-15). El sistema de gestión de calidad nos asegura un continuo desarrollo de la organización.

Registramos nuestros productos de acu-erdo a las normas vigentes y las necesidadesen los distintos países del mundo. Esto también garantiza nuestra alta calidad en elmercado y seguirá siendo nuestra guía.

La intención siempre de Nidacon es mantener una alta calidad de nuestros productos y, para lograr este cometido,todos nuestros lotes son probados en Nidacon antes de saliral mercado.

Controles de esterilidad son realizados en cada uno de loslotes fabricados, los niveles de endotoxinas son medidos ypruebas de eficacia biológica son llevadas a cabo.

Los lotes son liberados para la venta, únicamente si cumplen ciertos criterios específicos.

En cada lote se adjunta un certificado de control de calidadcon los registros de las pruebas efectuados. Solamente usandoeste riguroso control nos aseguramos que cada lote cumplacon los estándares correctos. Por consiguiente, los clientes estarán seguros que nuestros productos son fiables y daránbuenos resultados cuando se utilizan correctamente.

Calidad

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Aseguramiento de la calidad

Análisis físicospH – probado en todos los lotes durante la producción ydespués de ser embotellado el producto a temperatura ambiente en aire.

La osmolarida – probada encada lotes durante la produc-ción y luego que el producto esembotellado.

Esterilidad y análisis detoxinas Control de crecimiento microbio-lógico – Se realiza después dela producción de un lote paraver crecimiento de bacteriasy hongos. Los ensayos se rea-lizan en un período de 2-3semanas con el fin de detec-tar cualquier crecimiento.Estos controles son llevadosa cabo por el LaboratorioBacteriológico acreditadodel Hospital UniversitarioSahlgrenska, Gotemburgo,Suecia.

Detección de endotoxinas –Este análisis se realiza por medio de un test FDAaprobado, Limulus Am-oebocyte Lisado (LAL)utilizando un método espectrofotométrico cu-antitativo con el fin deobtener valores reales con unidades de UE / ml, de acuerdo conla U.S. farmacopea. Laprueba se realiza por elacreditado laboratoriode la microbiología del HospitalUniversitario Sahlgrenska de Gotemburgo, Suecia.

Análisis biológicoPrueba de esperma humano – El ensayo de eficacia biológicaimplica evaluación de, rendimiento de la motilidad y via-bilidad medido tanto subjetivamente como mediante elanálisis de esperma asistido por computadora (HamiltonThorne, IVOS). Cada lote se prueba biológicamente conmuestras de semen humano. Las muestras se separan endos partes, una parte se utiliza como control y el segundaparte se utiliza para la preparación de los espermatozoidescon los lotes nuevos. Los resultados se comparan con losresultados del control. El análisis proporciona un recuentode los espermatozoides por ml, la actividad de los esper-matozoides se clasifica como la actividad que es expresadacomo un porcentaje del total de esperma. Todos los datos

Aseguramiento de la calidad

se registran antes y después de la separación y purificación,y se comparan con el control, es decir, utilizando un loterecientemente aprobado.

Esperma humano prueba de superviven-cia para aceite – Los espermatozoides sonpreparados cubiertocon aceite y se incubandurante la noche a 37°C, CO2 5.6%. Por-centaje de espermato-zoides móviles en el día 2.

Ensayo de embriones deratón (MEA) para las botellas, etc. – se utilizapara evaluación In vitrode crecimiento y desar-rollo pre-implantación deembriones expuestos aelementos de prueba. Elensayo predice la toxici-dad del embrión en losmedios, dispositivos mé-dicos o productos relacio-nados para ser utilizados en la tecnología de repro-ducción asistida (ART).

Ensayo de fertilización invitro de embriones de ratónpara medios de IVF – Unaprueba sensible con la imi-tación de un procedimientode IVF. Este ensayo es la téc-nica preferida para analizarlas técnicas de reproducciónasistida, suministrandodatos de toxicidad en cuantoa la capacidad fecundante delgameto masculino y feme-nino y la capacidad de desar-rollo embrionario.

Análisis de Peróxido – el nivel de peróxido se mide utilizandoun QuantiChrom ™ ensayo de peróxido. Es un método mejorado que utiliza el cromógeno Fe3 +-xilenol reacciónnaranja. Se forma un complejo de color púrpura cuando el Fe2 + incluido en el reactivo se oxida a Fe3 + por la peroxidasa presentes en el muestra.

El análisis funcional / Prueba de eficacia – se utiliza para probar la eficacia y la función de los productos.

Control visual – Control visual constante durante la produc-ción, llenado, etiquetado y control final de los empaqueslistos elegidos.

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Vida útil • Empaque

Nidacon es consciente de las necesidades de nuestros clientes y siempre trata de ofrecer productos que son convenientes. Estas conveniencias incluyen, fácil trans-porte y una larga vida útil. Es por eso que los productos tienen una vida útil entre uno y dos años a temperaturaambiente.

Todos los ingredientes son escogidos por su toleranciaa la temperatura y su estabilidad en solución acuosa. Pruebas rigurosas de vida útil se llevan a cabo en el labo-ratorio de Nidacon para garantizar que la estabilidad teórica de las formulaciones de sal concuerde con la esta-bilidad actual cuando se combina con el producto

Vida útil

El empaque de los productos de Nidacon, recibe el mismocuidado y atención en detalles como cuando se diseña elproducto.

Botella; Para la mayoría de nuestros productos hemoselegido vidrio de borosilicato en lugar de vidrio de silicatode sodio para evitar la filtración de sodio desde las botellasen el contenido durante la larga vida útil. La investigaciónen nuestro laboratorio ha demostrado que suficientes ionesde sodio se pueden filtrar desde una botella de silicato de sodio y tener un efecto negativo en el desarrollo de embriones de ratón de dos células. Por lo tanto evitamosla exposición de todas las células a niveles elevados de ionesde sodio en el producto utilizando empaque de vidrio deborosilicato.

Tapones; Basándose en las pruebas de embrio-toxici-dad de tres diferentes tapones de goma disponibles hoy comercialmente y aprobados para uso farmacéutico, Nidacon eligió tapones de goma de silicona como materialpara los tapones. Encontramos que tanto los de goma delátex natural y los de caucho butílico son tóxicos para embriones, obstaculizando el desarrollo y provocando talvez muerte embrionaria. Los de caucho de silicona no tienen ningún efecto perjudicial, lo que permite el desar-rollo embrionario y el hatching de forma normal. Por lotanto los tapones para uso farmacéutico hechos de cauchode silicona fueron elegidos para nuestros productos.

Empaque

Esta conveniencia incluye la facilidad en el transportey la larga vida útil.

Composición del producto

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Bajo circunstancias fisiológicas normales, los espermato-zoides sufren una serie de cambios en la maduración después de la eyaculación que les permite negociar las diferentes secciones de tracto reproductor femenino yeventualmente localizar y fertilizar el óvulo. Si los esper-matozoides se van a utilizar para ART, es esencial que cualquier producto que se use para la capacitación delsemen, coincida con los requerimientos fisiológicos del semen lo más fielmente posible. Si los espermatozoidesson estimulados en exceso, sobre todo iónicamente, se vuelven “hiperactivos”, un proceso que da lugar a que losespermatozoides utilicen sus recursos energéticos y mueran antes que la fertilización ocurra.

Por lo tanto, el pH y la osmolaridad de las soluciones deespermatozoides deben ajustarse muy específicamentepara evitar el shock iónico y posteriores hiperactivaciones.

Fundamentos

Las sales que componen los productos de Nidacon se equi-libran poniendo especial atención a la composición iónicatanto del eyaculado como del tracto reproductor femenino.Este equilibrio garantiza una transición sin problemasdesde la eyaculación al medio de fertilización a través delgradiente y el lavado.

Composición del Producto

El buffer zwitterion, HEPES, se incluye para mantener elph de PureSperm® Gradiente y PureSperm®Wash mientrasse trabaja con el semen en la mesa de trabajo. Los fluidosdiseñados para mantener el pH en ambiente de CO2 esdecir en la incubadora, no son adecuados para su uso fuerade la incubadora ya que no poseen la suficiente capacidadde buffer para mantener el pH.

Las fluctuaciones en el pH y la temperatura son perju-diciales para la supervivencia de los espermatozoides en elárea de trabajo. Además el HEPES tiene un efecto anti-ox-idante, reduciendo las especies reactivas de oxígeno (ROS),que pueden ser perjudiciales en la capacitación esper-mática.

Buffer

La glucosa es un componente de los productosPureSperm®. Glucosa es el sustrato de energía primaria disponible para los espermatozoides enel tracto reproductor femenino.

Glucosa

Los antibióticos no están incluidos en nuestros productospor varias razones. La penicilina G es el antibiótico másusado en los medios de cultivo pero solo dura unos 10 díasen solución acuosa, siendo inactivada después de esetiempo y los productos de degradación son tóxicos celula-res. Además este antibiótico no es eficaz contra algunas delas bacterias más comúnmente encontradas en el semen.La estreptomicina y la gentamicina son citotóxicas. La gentamicina en particular, se ha demostrado que es tóxicapara los embriones.

Es prudente no incluir componentes espermaticidas en las preparaciones de esperma. Por otro parte la conta-minación bacteriana en el eyaculado es eliminada por la preparación de gradientes de densidad. Por lo tanto la ausencia de antibióticos en el gradiente no será perjudicialen la capacitación espermática y si evita exponer a los espermatozoides a compuestos potencialmente tóxicos.

Antibióticos

No conservantes ni ingredientes inestables se añaden a losproductos de Nidacon. Además hemos decidido no usar elrojo de fenol en nuestro medio, ya que se ha demostradoque tiene efectos estrogénicos. Los gametos tienen recep-tores para estrógenos y pueden ser afectados por su presencia. Por ejemplo, se ha demostrado que el estrógenoinhibe la motilidad del espermatozoide y la reacción del acrosoma.

Aditivos y Rojo de Fenol

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Productos • Información sobre pedidos

Información sobre pedidos

Cat. No. Descripción Tamaño

PSK-020 PureSperm® 40/80 2 × 20 mL

PS40-100 PureSperm® 40 100 mL




PS100-1000 PureSperm® 100 1000 mL

PSB-100 PureSperm® Buffer 100 mL

PSW-100 PureSperm® Wash 100 mL

PSW-020 PureSperm® Wash 2 × 20 mL

PSSK-070 PureSperm® SpeediKit 5 patient preps

10 artículos o más en una sola orden tendrán un 5% de descuento adicional.Tenemos distribuidores en la mayoría de los países, para una lista completa por favor visite nuestra página www.nidacon.com

Cat. No. Descripción Tamaño

SC-100 SpermCatch™ 6 × 100 µL

SCP-020 Sperm CryoProtec™II 2 × 20 mL

NO-100 NidOil™ 100 mL

NO-300 NidOil™ 300 mL

SVS-010 Sperm VitalStain™ 2 × 10 mL

SMS-250 Sperm MorfoStain™ 250 mL

VBK-010 VitriBlast™Kit 3 × 10 mL

TBK-010 ThermoBlast™Kit 4 × 10 mL

PI15-5 ProInsert™ 5 kits

Preparación semen

Productos de Cultivo

Preparación gradiente Swim-up Capa única

Productos de diagnostico Sperm VitalStain™– Un paso tinción Vital

PureSperm® 100– Solución Stock Gradiente

PureSperm® 40/80– Gradiente listo para su uso

PureSperm® Wash– Medio de lavado optimizado

PureSperm® SpeediKit– Kit de preparación de

semen para IUI

ProInsert™– Fácil manejo gradiente

PureSperm® Buffer– Diluyente optimizado

PureSperm

PureSperm® Wash– Medio de lavado optimizado

Sperm CryoProtec™II– Congelación de Semen

optimizado

Sperm CryoFloater™– Dispositivo para congelación

de semen por vapor

SpermCatch™– Desaceleración espermatozoides

antes de ICSI

NidOil™– Superposición durante

el cultivo de embriones

VitriBlast™– Vitrificación de blastocistos

ThermoBlast™– Descongelación de blastocistos

vitrificados

Sperm MorfoStain™– Un paso tinción Morfología

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PureSperm® 100

Es un coloide de sílice estéril (auto clavadoSAL-10-3), recubierto de silano en una solu-ción salina isotónica. Esta optimizado para la preparación de gradientes de densidad discontinuos en la separación y purificaciónde los espermatozoides humanos.

Periodo de validez 2 años.

QA Esterilidad – Osmolaridad – EndotoxinaspH – Supervivencia

PureSperm® 40 PureSperm® 80

Solución de gradiente de densidad listo parasu uso, de 40 y 80%. Hace el trabajo de laboratorio más sencillo y minimiza elriesgo de errores.



PureSperm® Buffer

Solución salina equilibrada diseñada espe-cíficamente para diluir PureSperm®100para hacer las diferentes capas densidadesen gradiente discontinuo. La formulación optimizada de PureSperm®Buffer está dise-ñada para maximizar la supervivencia de losespermatozoides durante la centrifugación.



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Productos

Componentes

Sílice recubierto de silanoKClNaCl CitratoGlucosa LactatoPiruvato HEPESEDTA Agua Purificada

Componentes

NaCl EDTAKCl CitratoHEPES GlucosaLactato Agua PurificadaPiruvato

Componentes

Sílice recubierto con silanoAgua PurificadaNaCl CaClGlucosa KClEDTA HEPES

ProInsertTM

El ProInsert reduce el riesgo de re-con-taminación del pellet durante el proceso de recuperación del mismo cuando se pre-para la muestra de semen por medio de gradientes de densidad. El ProInsert™ es un dispositivo fácil y seguro de utilizar, paraser usado con los productos Nidacon.


QA Test de eficiencia – MEA

PureSperm® Wash

Solución salina estéril isotónica. Está optimizada para el lavado de los espermato-zoides recuperados de la preparación de gradiente de densidad. Para uso en procedi-mientos de Swin-Up, para extensión delsemen antes de IUI o como medio para el mantenimiento de espermatozoides.

Periodo de validez 1 año.


PureSperm® SpeediKit

Es un kit que ofrece todos los compo-nentes necesarios para preparar 5 muestras de semen para IUI. Contienetubos de muestra para semen, tubos lis-tos para su uso por centrifugación de unasola capa de coloide y tubos listos para

su uso con PureSperm®Wash para el lavado del Pellet después de lacentrifugación. Un producto per-fecto para las pequeñas clínicas, 5 pacientes/kit.

Periodo de validez 1 año.


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Componentes

Tubo para centrifuga que contiene el ProInsert™Tubo para centrifuga para el medio de lavadoPRP (Pipeta Retiro Pellet)

Componentes

NaCl PiruvatoMgSO4 KClEDTA KH2PO4

Agua Purificada GlucosaHEPES NaHCO3

LactatohSA (Albúmina de suero humana)

Componentes

Sílice recubierto de silanoKCl NaClCitrato GlucosaLactato PyruvateHEPES EDTAAgua Purificada MgSO4NaHCO3hSA (Albúmina de suero humana)

Productos

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Productos

Sperm CryoProtecTMII

Solución salina estéril que contiene glicerol,optimizado para la congelación tanto de lacapacitación espermática por medio de gra-dientes como el eyaculado sin procesar. Ni-dacon recomienda la técnica de congelaciónpor vapor de nitrógeno, ya que esta técnicaproporciona mejor resultado después de ladescongelación

Periodo de validez de 1 año.

QA Esterilidad – Endotoxinas – PH Rata de recuperación post descongelación

Sperm VitalStainTM

Técnica de un solo paso para la evaluaciónde la vitalidad de los espermatozoides. Unaherramienta básica en el análisis del semen.


QA pH – Análisis funcional

Sperm MorfoStainTM

Una clásica tinción Romanovsky. Técnica deun solo paso para la evaluación morfológicaespermática.


QA Test morfológico

SpermCatchTM

Para la desaceleración de los espermato-zoides antes de ICSI, sin el uso de polivinil-pirrolidona (PVP). Evita la inyección de PVP durante el ICSI, solamente contieneproductos naturales para aumentar la visco-sidad.

Periodo de validez 1 año


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Componentes

NaCl EDTAKCl NaHCO3HEPES LactatoGlucosa GlicerolMgSO4 PiruvatoKH2PO4 Agua Purificada

Componentes

NaCl NigrosinaEosina FormalinaAgua Purificada

Componentes

Metanol May GrunwaldEosina Y GiemsaMetileno B Asur B

Componentes

NaCl PiruvatoMgSO4 LactatoKCl EDTAKH2PO4 Agua PurificadaGlucosa HEPESNaHCO3 Ácido hialurónicohSA (Albúmina de suero humana)

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Productos

NidOilTM

Aceite de parafina estéril, para uso comocapa durante el cultivo en la incubadora degametos, cigotos y pre-embriones, o durantelas manipulaciones fuera de la incubadora.No contiene aditivos; empaque protecciónUV.


QA Densidad – Esterilidad – Endotoxinas – SupervivenciaMEA – Análisis de peróxidos

VitriBlast TM

Kit para vitrificación de blastocistos basadosen formulaciones probadas. Muchas publi-caciones demuestran su eficacia tanto en larelación con las tasas de supervivencia comocon las tasas de embarazo.

Periodo de validez 9 meses.

QA Esterilidad – Osmolaridad – EndotoxinaspH – MEA

ThermoBlastTM

Kit óptimo para usar en el calentamiento de blastocistos vitrificados con el kit de VitriBlast.

Periodo de validez 9 meses.

QA Esterilidad – Osmolaridad – EndotoxinaspH – MEA

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Componentes

NaCl KClMgSO4 KH2PO4Glucosa NaHCO3

Pyruvate EDTAAgua Purificada SucrosaHEPES LactatohSA (Albúmina de suero humana)

Componentes

NaCl KClMgSO4 KH2PO4Glucosa NaHCO3Piruvato EDTAFicoll Agua PurificadaHEPES LactatoSucrosa EtilenglicolDMSOhSA (Albúmina de suero humana)

Componentes

Aceite de parafina

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Productos

Una muestra de semen normal (eyaculado) está constituida por fluido seminal que contiene una serie dediferentes células, restos celulares y sustancias microbio-lógicas como biológicas.

Las diferentes tipos de células que contiene el semenson, espermatozoides motiles normales, espermatozoidesjóvenes, espermatozoides senescentes (sin capacidad de fertilizar) y espermatozoides con ruptura en el ADN.También están presentes células epiteliales del tracto reproductor masculino, células inmunes del varón, y desechos celulares (detritus) así como también bacterias y posiblemente virus.

Por otra parte, el líquido seminal contiene sustanciasbiológicas tales como factores decapacitantes del semen yespecies reactivas de oxigeno (ROS), con efectos negativosen la fertilización.

Después de la eyaculación in vivo, normalmente el esperma migra rápidamente del liquido seminal al cérvixuterino de la mujer, separándose de las condiciones adver-sas y de los factores anteriormente mencionados.

En el laboratorio de andrología de una clínica de IVF, la separación de los espermatozoides motiles del liquidoseminal y su contenido, se puede lograr utilizando gradi-ente de densidad discontinuo o por Swim-Up.

� Todas las soluciones deben ser llevadas a temperaturaambiente antes de su uso para evitar las fluctuacionesde la temperatura que son perjudiciales para la super-vivencia de los espermatozoides.

� Abrir y cerrar las botellas dentro de una cámara de flujo laminar, utilizando técnicas estériles para evitar la contaminación.

� Guarde todas las botellas abiertas a 2-8°C después decerradas.

Cuidados Generales y usos

Fundamentos

Aspectos positivos de un gradiente de densidad discontinuo según Nidacon.

Si el gradiente de densidad se ha hecho correctamente, el pellet de esperma debe contener solamente espermatozoides funcionales y fértiles.

Aspectos Gradiente de densidad Swim-up

Separa los espermatozoides mótiles de otros tipos de células � �

Separa espermatozoides inmaduros, senescentes y moribundos �

Separa los espermatozoides morfológicamente anormales �

Separa los espermatozoides con daño en la cromatina �

Remueve las bacterias y los virus �

Muestra inicial Sedimento Prep. Final Prueba de t pareada

Swim-up 21.5 9.5 19.6 9.7 22.0 9.5 0.6

PureSperm gradiente 33.9 21.2 25.0 19.8 12.4 12.6 P 0.001

Uso de la técnica de gradiente de doble densidad por centrifugación y el método swim-uppara preparar espermatozoides con daños en la cromatina y anormalidades en el DNA.

D. Sakkas et al. (2000) Human Reprod.

The mean percentage of spermatozoa positive to Chrmomomycin A3 – decreased presence of protamine.

Preparación de un gradiente de densidad

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Si usted usted tiene una muestra con alto volúmen (>3ml),puede preparar dos gradientes de PureSperm® por cada muestra de semen. Esto reduce el riesgo de sobrecargar

el gradiente único; proporciona seguridad al manipular los tubos o recuperando el pellet de esperma y proporcionados tubos para equilibrar el rotor de la centrífuga.

PureSperm® 100 PureSperm® 40 PureSperm® 80 PureSperm® Buffer PureSperm® Wash

1. Si utiliza PureSperm®100, diluir con PureSperm®Buffer para hacer su gradiente, por ejemplo añadir 2 mL de PureSperm ®Buffer a 8 mL de PureSperm 100 para obtener10 mL de PureSperm 80%. Agregar 6 mL de PureSperm®Buffer a 4 mL de PureSperm®100 para obtener 10 mL de PureSperm® 40%. En su lugar puede utilizar las soluciones ya listas de PureSperm® 40 y 80.

2. Utilizar una pipeta estéril para agregar 2mL de PureSperm® 80% en un tubo cónico.

3. Utilizar una pipeta nueva estéril y con cuidado agregar 2 mL de PureSperm® 40% en la parte superior de la capa de 80%. Es importante de no perturbar las dos capas y mantener una interface definida.

4. Deposite el semen en estado de licuefacción sobre el gradiente.Recomendamos no tomar más de 1.5 mL/gradiente o corre el riesgo de sobrecargar el gradiente y no obtener un buen resultado.

5. Centrifugue a 300 x g por 20 minutos. Asegúrese que su centrifuga uses las correctas fuerzas g (use la ecuación) No utilice el freno.

6. Aspirar desde la superficie con movimientos circulares todo, excepto el pellet y unos 4 a 6 mm de la capa de PureSperm® 80%. Si no se ve el pellet después de la centrifugación, remover todo el líquido, excepto los últimos 0,5 mL.

7. Utilizar una pipeta nueva para aspirar el Pellet (o los 0,5 mL). Transfiera el Pellet de esperma a un nuevo tubo y resuspenda el Pellet en 5ml de PureSperm® Wash. Siempreutilice un nuevo tubo con PureSperm® Wash para evitar la contaminación del eyaculado. Combine los pelles si ha realizado un procedimiento doble.

8. Centrifugar a 500 x g durante 10 minutos. No utilice el freno.

Recomendaciones

PureSperm®100 más PureSperm® Buffer oPureSperm®40 y 80Pipetas Pasteur Estériles

PureSperm®WashPipetas estériles de 2ml y 10mlCentrifuga con rotor basculante

Reactivos y Equipos

Procedimiento

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Plasmaseminal

Inmóviles, esperma muerto, basura, células epiteliales, leucocitos, bacterias

Espermatozoides móviles

Después de la centrifugación

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Semen

Capa de gradiente superior

Capa de gradiente Inferior

Antes de la centrifugación

Interfasesuperior

InterfaseInferior

Inmaduros y espermatozoides viejos

Pellet (sedimento),población móvil

selecta

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Plasmaseminal

Inmóviles, esperma muerto, basura, células epiteliales, leucocitos, bacterias

Espermatozoides móviles

Después de la centrifugación

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Semen

Capa de gradiente superior

Capa de gradiente Inferior

Antes de la centrifugación

Interfasesuperior

InterfaseInferior

Inmaduros y espermatozoides viejos

Pellet (sedimento),población móvil

selecta

2

9. Aspire el sobrenadante de PureSperm®Wash dejando la menor cantidad posible de líquido sobre el pellet. Si no se ve el Pellet deje unos 0,25 mL de líquido del fondo.

10. Re-suspender el Pellet de esperma en un volúmen adecuado de medio. La muestraesta lista para su uso.

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� Las capas de gradientes deben sobreponerse inmediata-mente antes de su uso, pero las diferentes soluciones de densidades de PureSperm® se pueden preparar con anterioridad, asegurándose que se guarden a 4°C y antes de su uso dejarlas a temperatura ambiente.

� Cuando se recupere el pellet después de la centrifuga-ción por gradiente, debe tener cuidado para evitar la contaminación del Pellet con componentes del eyaculado o las capas de gradientes superiores. Por lo tanto le recomendamos que utilice una pipeta nuevaestéril tras haber eliminado la mayor parte del gradientepara evitar contaminación, por ejemplo por bacterias.

Trucos

Preparación de un gradiente de densidad

Calibración de la centrifuga, para alcanzar las fuerzas G correctas use la siguiente ecuación:

Rpm = √[ (g/(1.118 x r)] x 10³g = Fuerza centrifuga

r = Radio de rotación, la distancia (mm) desde el centro del rotor al fondo del tubo de centrifugado en el cubo cuando se levanta en posición horizontal

Por ejemplo; para alcanzar 300 x g cuando el radio = 165 mm la velocidad de la centrifuga debe ser:

Rpm = √[ (300/(1.118 x 165)] x 10³ = 1275

Tabla de conversión – tiempos gravedad /x g) y la velocidad del rotor (RPM)

http://cabinet.weblog.com.pt/arquivo/TR0040dh4-Centrifuge-speed.pdf

G Force /RPM calculadora

http://drycake.com/calculator/gforce.php

1

6 87 9 10

2 3 4 5

16

SpeediKit

PureSperm® SpeediKit

� Todo lo que necesita es lamuestra de semen, una cen-trifuga con rotor basculante,pipetas estériles, el resto loencontrará en el kit.

Trucos

Recomendamos especialmente el PureSperm® Speedikit,para las clínicas más pequeñas o para las clínicas que realizan procedimientos de (IUI). El SpeediKit® es una alternativa rápida y eficaz para la preparación de semen.Todo está incluido en el Kit para la rápida preparación delsemen, basado en la centrifugación efectiva a través de una

sola capa de PureSperm® Colide en lugar de un gradientede dos capas, seguido por el lavado de los espermatozoidescon PureSperm® Wash. El kit contiene el colide y el PurSperm® Wash para 5 pacientes, los tubos de centrifugapreviamente preparados, más los tubos para recoleccióndel semen. Usted no necesita incubadora.

1. Utilizar una pipeta estéril y con cuidado deposite unacapa de semen en estado de liquefacción (Hasta 1,5 mL)en la parte superior de PureSperm® Unilayer. Si tieneuna muestra de más de 1,5 mL de volúmen, use dostubos.


3. Utilizar una nueva pipeta estéril para aspirar el sobre-nadante, dejando unos 5 mm de líquido por encima del pellet, Si no se ve el pellet de la centrifugación, quitetodo el líquido excepto 0,5 mL de la parte más baja.

4. Utilizar una nueva pipeta estéril para aspirar el pellet (o los 0,5 mL de la parte más baja).

5. Transfiera el pellet de esperma al tubo que contiene PureSperm® Wash y resuspenda el esperma.

6. Centrifugar a 500 x g durante 10 minutos. No utilizarel freno.

7. Utilizar una nueva pipeta estéril para aspirar el sobre-nadante, dejando la menor cantidad posible de líquidosobre el pellet. Si no se ve el pellet, deje 0,25 mL de líquido de la parte más baja.

8. Re suspender el pellet en el resto de PureSperm® Wash.La preparacion de esperma está lista para su uso.

Fundamentos

Tubos para colección de semen (Incluidos en el kit)Tubos listos para su uso con PureSperm® Unilayer y PureSperm®Wash (incluidos en el Kit)

Tubos para balance (Incluidos en el Kit)Centrífuga con rotor basculantePipetas Pasteur estériles

Reactivos y Equipos

Procedimiento

87

1 2 3 4

5 6

1 2 3 4

5 6 7 8

103 4 5 6 9 11 12

17

1. Abrir el kit de ProInsertTM y retire el tubo de centrífugaque contiene el ProInsertTM.

2. Con una pipeta con punta estéril, agregar 2 mL de PureSperm®80 por el canal exterior en la parte superiordel ProInsertTM. El gradiente bajara por la cámara del ProInsertTM a través de un agujero, ubicado en laparte inferior de la misma y se deslizara por la pared deltubo para formar una capa en la parte inferior del tubo.

3. Repita el paso número 2, usando una nueva punta de pipeta estéril y el PureSperm®40, de nuevo a travésdel canal exterior.

4. Una vez más, utilice otra punta de pipeta estéril y concuidado, deposite el semen en estado de licuefacción(hasta 1,5 ml) de nuevo a través del canal exterior sobreel gradiente de densidad. Tenga mucho cuidado de no tocar los bordes del canal central con el semen.

5. Tape el tubo, centrifugar a 300 x g durante 20 minutos. No use el freno de la centrífuga. Calcular las correctas RPM de la centrífuga.

6. Añadir 5 mL PureSperm® Wash al segundo tubo decentrífuga (no en el gráfico).

7. Coloque PRP Pipeta de Recuperación del Pelet del ProInsertTM Kit a una jeringa de 1-2 mL, (no en el gráfico).

8. Pase la pipeta (PRP) lentamente por el ProInsertTM a través del canal central, hasta el pellet de esperma (ver gráfico). Tenga cuidado de no perturbar el pellet.Mediante la jeringa, aspirar sólo el pellet de esperma.Retirar la pipeta hasta que la punta de la pipeta esta por encima de la superficie del líquido, aspirar un pocode aire y entonces retraer la pipeta del canal central. (Este procedimiento garantizar que no se pierde contenidos en la pipeta durante la transferenciaal PureSperm®Wash). Transfiera el pellet al tubo quecontiene el PureSperm®Wash.

9. Centrifugar a 500 x g durante 10 minutos. No utilice el freno de la centrifuga.

Aspirar el sobrenadante PureSperm®Wash, dejando unmínimo posible de liquido por encima del pellet. Si nose ve el pellet, deje 0,25 mL de líquido del fondo.

Vuelva a suspender el pellet de esperma en un volumenadecuado de medio de cultivo para transferencia (porejemplo, PureSperm®Wash) para obtener la concentra-ción de espermatozoides necesarios para FIV, ICSI o IUI.La muestra de semen está lista para su análisis y/o uso.

Tubo para centrífuga que contiene el ProInsertTM

Tubo para centrifuga para el medio de lavado (PureSperm®Wash)

PRP (Pipeta Retiro Pellet)Centrifuga con rotor basculantePipetas estériles

Reactivos y Equipos

Procedimiento para el uso de ProInsertTM

2 3 4 5 8 9 10 11

ProInsert

ProInsertTM

El gradiente de densidad elimina linfocitos, células epite-liales, espermatozoides anormales o inmaduros, restoscelulares, líquido seminal, bacterias y en algunos casosvirus. Cuando se realizar un gradiente de densidad la forma de recuperar el pellet de esperma del fondo del tubo es, ya sea directamente a través de las capas corriendo el riesgo de perturbarlas y contaminar el pellet, o eliminarla mayor cantidad posible de las capas, atravesar el con-tenido restante y todavía correr el riesgo de re-contaminar

el pellet. Puesto que en el gradiente hay muchos contami-nantes potencialmente peligrosos, es crucial que el pelletde esperma no se vuelva a contaminar. El ProInsert™ eliminará este riesgo de re-contaminación. El inserto estáincluido con el tubo de centrífuga y después de obtener elpellet, este puede ser recuperado a través del canal centralque conduce hasta donde se encuentra el pellet, sin entraren contacto con el gradiente contaminado.

Fundamentos

10.

11.

18

Swim-up

PureSperm® Wash

� Si tiene una mu-estra muy viscosa,tenga cuidado alremover la capasuperior despuésde la incubación.Es muy fácil que la muestra de semen sepegue y pertur-bar las capas.

adicionar antibióticos cuando use la técnica swim-up enla preparación del semen para ART. Recomendamos queutilice Penicilina en una concentración de 100 U/mL.

1. Transferir 1mL de semen en estado de licuefacción a un tubo estéril para centrifugación de fondo redondo.Si la muestra es demasiado viscosa, trate antes de diluirla muestra con PureSperm®Buffer.

2. Utilizar una pipeta nueva estéril, y con cuidado depositeuna capa de 1,5 mL de PureSperm®Wash sobre elsemen.

3. Sin perturbar las capas, coloque el tubo en un ángulode 45° en la incubadora de CO2 a 37°C durante 60 minutos.

4. Retire con cuidado la capa superior (0,5-1,0 mL) de medio que contine los espermatozoides motilesusando una pipeta estéril.

5. Coloque este líquido en un tubo estéril de fondo cónico que contiene previamente 5 mL PureSperm®Wash.


7. Aspirar el sobrenadante, dejando no más de 2 mm de profundidad de líquido sobre el pellet.

8. Re-suspender el pelle de esperma en un volumenadecuado de medio para obtener la concentración de espermatozoides requeridos. La muestra está lista parasu análisis o su uso.

Trucos

PureSperm®WashTubos para centrifugación de fondo redondoTubos desechables estériles para centrifugación de fondo cónico

Pipetas estérilesCO2 incubadoraCentrifuga con rotor basculante

Reactivos y Equipos

PureSperm®Wash no contiene ninguna clase de antibióti-cos y la técnica de swim-up no garantiza la eliminación decontaminación por bacterias, por lo tanto es recomendable

Recomendaciones

Procedimiento

87

1 2 3 4

5 6

87

1 2 3 4

5 6 87

1 2 3 4

5 6

Para la mayoría de situaciones Nidacon recomienda el uso de gradientes de densidad discontinua para la prepa-ración del semen. Sin embargo, muchos clientes en algún momento necesitan utilizar la técnica de swim-up y el producto más idóneo para este propósito es

PureSperm®Wash. PureSperm®Wash es una solución salina equilibrada y ajustada para la nutrición y larga supervivencia de los espermatozoides humanos. Funcionaexcelentemente bien para este propósito.

Fundamentos

1 2 3 4

5 6 7 8

19

Congelación de espermatozoides

Sperm CryoProtecTMII

SpermCryoProtecTMII y PureSperm®Wash Pipetas estérilesTubos desechables estériles para centrifugación (ejemplo Falcon 2075)

Viales desechables estériles para criopreservación o pajillas.TijerasCryoFloaterTM (Nidacon)

concentración de glucosa está presente como agente osmó-tico para reducir el agua intracelular, lo que disminuye los daños debido a la formación de cristales de hielo.

Reactivos y Equipos

El crio protector de Sperm CryoProtect™II es el glicerol en una proporción reducida en la medida de lo posible para minimizar la toxicidad en el esperma sin dejar de pro-porcionar la crioprotección. Por otra parte una alta

Fundamentos

Es posible congelar semen sin preparación, pero recomen-damos que prepare el eyaculado usando el método de gradientes de densidad PureSperm®. Este método elimina

el plasma seminal a si como ROS y sus fuentes, lo que garantiza una recuperación óptima de espermatozoidesmotiles después de la descongelación.

Recomendaciones

Muestra de semen SCPII™ Muestra de semen SCPII™ Muestra de semen SCPII™(µL) (µL) (µL) (µL) (µL) (µL)

100 33 1100 367 2100 700

200 67 1200 400 2200 733

300 100 1300 433 2300 767

400 133 1400 467 2400 800

500 167 1500 500 2500 833

600 200 1600 533 2600 867

700 233 1700 567 2700 900

800 267 1800 600 2800 933

900 300 1900 633 2900 967

1000 333 2000 667 3000 1000

Tabla de dilución

Para otros volúmenes diferentes a los listados anteriormente, calcular:

Ejemplo: 300 µL muestra de semen / 3 = 100 µL SCPII

� Para evitar el shock osmótico de los espermatozoides,es importante mezclar lentamente CryoProtect™II con la muestra de semen, pero no por más de 5 minutosya que el glicerol es tóxico para las células a temperaturaambiente.

� El tiempo de incubación antes de la congelación se puede reducir a 15 minutos, pero lo recomendableson 60 minutos.

Trucos

Volumen de la muestra de semen/3=Volumen SCPII

3

2 3 4

1

1

2

2 3 4 51

5

H2O

LN2

6

76

3

2 3

1

1

2

2 3 4 51

5

H2O

6

76

LN2

8 9

6


20

1. Cuando utilice semen preparado, re-suspender el pellet de esperma en un volumen pequeño de Pure-Sperm®Wash para obtener la concentración deseada de esperma.

2. Añadir gota a gota 1 parte de Sperm CryoProtectTMII a 3 partes de muestra (ver tabla de dilución) asegurecede mezclar muy bien después de agregar cada gota.

3. Rellene las pajillas con la suspensión de esperma oalícuotas en los viales.

4. Equilibre las pajillas o viales en el refrigerador durante30-60 minutos.

5. Coloque las pajillas horizontalmente en vapor de nitrógeno líquido, 1 cm encima de la superficie de nitrógeno líquido en un pedazo de espuma de polieti-leno (CryoFloater™). Dejar durante 30 minutos.

6. Transfiera rápidamente las pajillas en el nitrógeno líquido y posteriormente, almacenar en nitrógeno líquido. No toque la pajilla con sus manos.

Eyaculado procesado

1. Mida el volumen del eyaculado.

2. Mescle el eyaculado con el SCPII, en una dilución 1:3(Ver tabla), asegúrese de mezclar muy bien después deagregar cada gota para evitar el shock.

3. Transfiera 0,8-1,8 mL de la mezcla a crio viales de 2 mL.

4. Coloque los viales en le refrigerador (4-5°C) por 30 minutos.

5. Congele los viales horizontalmente en el congelador o en vapor de nitrógeno sobre la superficie de nitró-geno líquido en un pedazo de espuma de polietileno(CryoFloater™). Manténgalo por 30 minutos.

6. Almacene en nitrógeno liquido.

Eyaculado sin procesar

1 2 53 4 6

1 2

6

3 5 6

3

2 3

1

1

2

2 3 4 51

5

H2O

6

76

LN2

8 9

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9

21


1. Retire las pajillas del tanque de nitrógeno líquido.

2. Coloque las pajillas en agua a 37°C por 30 segundos.

3. Seque muy bien la superficie de la pajilla.

4. Corte un extremo de la pajilla.

5. Sujete la pajilla contra el tubo previamente preparadocon 5 mL de PureSperm®Wash y corte el otro extremode la pajilla. Cualquier resto de la suspensión con esper-matozoides puede ser expulsado con una pipeta.

6. Centrifugar a 500 x g durante 10 minutos. No utilizarel freno.

7. Aspirar el sobrenadante de PureSperm®Wash dejandotanto líquido como se requiera para la concentración deseada. Si no se ve el pellet, deje 0,10 mL de líquido del fondo.

8. La muestra esta lista para su uso.

Procedimiento de descongelación eyaculado procesado

1. Retirar los viales del tanque de nitrógeno.

2. Colocar los viales en agua a 37°C hasta que los cris-tales de hielo hayan desaparecido, aproximadamente 2-3 minutos.

3. Diluir el material descongelado con 0,5 mL de PureSperm® Wash.

4. Preparar el material descongelado en un gradiente de densidad 40% y 80%. Use 1 mL de cada gradiente ydeposítelos en un tubo para centrifuga y adicione nomas de 1 mL del eyaculado descongelado en el gradiente.

5. Centrifugar a 300xg por 20 minutos.

6. Aspire todo excepto el pellet y unos 4-6 mm del PureSperm 80%.

7. Use una nueva pipeta para aspirar el pellet. Transfieraa un nuevo tubo que contenga 4ml PureSperm® Wash.

8. Centrifugue a 500 x g por 10 minutos.

9. Aspire el sobrenadante de PureSperm® Wash y la muestra esta lista para su uso.

Procedimiento de descongelación eyaculado sin procesar

H2O

1 2 3 4 5 6 7

ICSI

22

SpermCatchTM

� Las cajas para ICSI deben prepararse muy rápidamentepara evitar el cambio de la osmolaridad en el medio. Solamente prepare 2 al mismo tiempo.

� Es conveniente tener dos cajas por paciente.

1. Coloque una gota de 10 µL de SpermCatchTM en elcentro del caja de petri.

2. Coloque el medio de inyección en 4 gotas de 10 µL cada una al rededor de la caja de petri.

3. Cubra inmediatamente las gotas con NidOil.

4. Incubar durante 30 minutos en medio ambiente de CO2 a 37°C.

5. Añadir 1 µL de la suspensión preparada de espermato-zoides en el medio de la gota de SpermCatchTM.

6. Incubar durante 10 minutos en medio ambiente de CO2 a 37°C.

7. Llene la pipeta de inyección con SpermCatchTM para evitar que el esperma se pegue en el interior de la pipeta. También la ayudara a hacer una inyección controlada.

8. Inmovilizar el espermatozoide usando la pipeta de inyección para fracturar la cola del espermatozoide.

9. Aspirar el espermatozoide inmóvil.

Dirigirse a una de las gotas de los ovocitos. Enfóqueseen el ovocito y mantenga el ovocito con la pipeta (holding). Lleve hacia bajo las pipetas de inyección y inserte el espermatozoide. Asegúrese que la zona pelu-cida este rota antes de expulsar el espermatozoide.

Trucos

SpermCatchTM es una alternativa al PVP (polivinil-pirrolidona) que hoy es la sustancia más comúnmenteusada para la desaceleración de los espermatozoides antesde ICSI. Sin embargo, se ha reportado que el PVP causa problemas, como el daño de la membrana plasmática delespermatozoide y también puede interferir con la descondensación espermática del núcleo. SpermCatchTM

es una solución sin PVP que contiene ácido hialurónico quees un componente natural. Varios estudios han demo-strado que SpermCatchTM da los mismo resultados o incluso mejores, que el PVP. Ya que el SpermCatchTM es una solución que contiene ácido hialurónico, consulte la siguiente referencia para sus ventajas (Ref. 21).

Fundamentos

Procedimiento

SpermCatchTM

NidOilTM

Medio de Inyección

Pipetas estérilesEquipos de ICSICaja de petri

Reactivos y Equipos

10.

1 – 4 5 – 6 7 – 9

SpermCatch™ SpermCatch™

23

NidOil

NidOilTM

Antes de su uso, NidOilTM debe equilibrarse de la mismaforma que los medios de cultivo para evitar las diferencias

en temperatura y contenido de gases entre los componen-tes del sistema de cultivo.

El aceite mineral se ha venido utilizando muy ampliamenteen los laboratorios de IVF para la superposición de cultivos.NidOilTM contiene aceite de parafina que ha sido específi-camente elegido y luego tratado en nuestros laboratoriosde producción para asegurar que su pureza y características de manejo sean adecuadas para usar en la superposición cuando se hacen los cultivos de gametosy embriones.

NidOilTM no requiere de lavado antes de su uso, y no es ni demasiado pegajoso ni demasiado viscoso para facilitar el pipeteado.

Se han planteado últimamente muchas preguntas sobre siel aceite que se utiliza para la cobertura en el cultivo deembriones en realidad puede dañar el embrión.

Hoy en día todos los lotes de aceites de distintos fabricantes se someten a pruebas de esterilidad, endotox-inas y ensayo de embriones de ratón para mostrar el desarrollo del blastocisto. Esto aparentemente no es sufi-ciente ya que se ha observado daños en los cultivos con lotede aceites aprobados.

Una respuesta podría ser la peroxidación del aceite, que se ha reportado en varias investigaciones publicadas y han determinado que es perjudicial para la fertilización

Controles estrictos de garantía de calidad se llevan a cabo en cada uno de los lotes para asegurar la ausenciade agentes contaminantes microbiológicos y bajos nivelesde endotoxina.

Varios informes indican que los aceites de parafina pue-den ser embrio-tóxicos después de estar expuestos a la luz en la mesa de trabajo en el laboratorio. Como medidade precaución contra cualquier posible cambio inducidopor la luz, NidOilTM se envasa en botellas ámbar con tapónde rosca.

Fundamentos

Nuevo test de calidad

Recomendaciones antes de su uso

Estudio prospectivo aleatorio para comparar cuatro aceites minerales diferentes usados en el cultivo de embriones humanos IVF/ICSIOI terapia.

Presentado en ESHRE 2008 por Dr. Sifer, Paris.

Comparación entre;

1. Mineral Oil (CryoBioSystem)

2. Liquido de parafina (MediCult)

3. NidOil (Nidacon)

4. Ovoil (Vitrolife)

Grupo 1 2 3 4

No 129 126 126 119

GQE dia 3 2,1 1,6 2,2 2,6

Tasa Impl. 22,1 21,7 30,0 24,6

% Emb. Clin. 31 29 38 36

y desarrollo embrionario, cuando se alcanza cierto nivel.También se ha demostrado que el nivel de peroxidasa en el aceite puede aumentar con el tiempo, debido a la exposición a la luz o altas temperaturas.

La prueba de peroxidasa se incluye tanto en el certifi-cado de garantía de calidad que viene con cada lote como enel de materia prima antes de realizar el pedido. De esteforma le ofrecemos un aceite para su cultivo seguro de usary confiable con la larga vida y almacenamiento a tempera-tura ambiente antes de su apertura.

Si usted tiene alguna pregunta acerca de nuestras pruebas, por favor háganoslo saber.

Vitrificación y calentamiento de blastocistos

24

VitriBlast™ Kit ThermoBlast™Kit

1. Etiquetar el plato de NUNC con la identificación del paciente y con número en cada pozo por cada soluciónes decir 1, 2, 3.

Equipo Adicional:Cánula de criopreservación para el almacenamiento de los tubos de crio preservaciónCrystalwandPinzas para sostener el tubo de criopreservaciónCryoloop

Nota: Si las sustancias adicionales se almacenan en el refrigerador, retírelas con el tiempo suficiente antes de su uso. El DMSO se solidifica por debajo de los +18°C. Las sustancias adicionales pueden ser almacenadas fueradel refrigerador en su caja, incluso después de abierta. El DMSO se puede calentar en la mano si es urgente.

Pozo 1

VitriBlast™1 1000 µL

Pozo 2

VitriBlast™2 850 µLDMSO: 75 µLEG: 75 µL

Pozo 3

VitriBlast™3 700 µLDMSO: 150 µLEG: 150 µL

El problema principal cuando se congelan células es la formación de cristales de hielo intracelular, tanto en el enfriamiento como en el calentamiento, ya que estoscristales de hielo tienen un efecto perjudicial en la super-vivencia celular. La vitrificación es una técnica de congela-

ción ultra rápida de material celular, que permite congelarlas células sin que se formen cristales de hielo dentro de la célula. El resultado de la vitrificación es una estructurahomogénea y cristalina amorfa.

Fundamentos

Procedimiento de vitrificación usando el cryoloop

VitriBlast™ y ThermoBlast™ KitPipetas estérilesDispositivo para vitrificaciónIncubadora de CO2Cronómetro o temporizador

Depósito de nitrogeno líquidoNitrogeno LíquidoPlato de cultivo (NUNC 4-pozos)Platina de calentamientoMicroscopio invertido

Reactivos y Equipos

VitriBlast™ puede ser utilizado con diferentes tipos de dispositivos para vitrificación como, el cryotop, cryoloop,o el HSV (pajilla de alta seguridad). El método descrito acontinuación es con el cryoloop, pero el mismo protocolopuede ser utilizado para los otros dispositivos. Trabaje los

blastocistos en un escenario caliente en todo momento. Nodeje que los blastocistos sean expuestos a la luz del micros-copio durante su incubación.

Recomendaciones

2. Pipetear los medios de vitrificación como se describe acontinuación. Cuando agregue el DMSO y el etilenglicol(EG) que está incluido en el Kit, a la solución 2 y 3 pipetear las dos sustancias, arriba y abajo un par vecespara obtener una mezcla óptima del medio.

Blastocisto vitrificado y calentado con excelente morfología.

Blastocistos Hatching. Después de la vitrificación y el calentamiento.

1 2

3

25


3. Incubar a 37°C en 5-6% de CO2 durante 30 minutos (máximo 1 hora, ya que por más tiempo, dificulta lacreación de la película en el loop).

5. Retire el plato de NUNC de la incubadora y colóqueloen la platina de calentamiento (asegúrese que el controlde calentamiento este lo suficientemente alto para alcanzar 37°C en los medios)

6. Coloque el blastocisto puncionado y colapsado en la solución número 1. Inicie el cronómetro.

7. Después de 1.5 a 2 minutos, aspire solución 2 en la punta de la pipeta, coger el blastocisto de la solución1 y transfiéralo en la solución 2 ( pozo 2)

4. Durante la incubación en el plato por 30 minutos, colapse el blastocisto. Esto se puede hacer de dos formas, ya sea por laser (Fertilase, red, 5 ver fotos de abajo) o usando una pipeta de ICSI.

Laser• Si utiliza el laser, dispare lo más alejado posible de la masacelular interna (ICM). El láser dispara verticalmente comose ilustra a continuación..• Asegúrese de crear un agujero en la zona y el trofoecto-dermo.

Pipeta de ICSI• Si se utiliza una pipeta de ICSI o cualquier otro instru-mento afilado, puncione la capa de células trofoblásticaen el blastocele, asegúrese de puncionar lo más lejos posible de la ICM.. La pipeta se debe insertar en la posición uno en puntopor el blastocisto a las once en punto.


8. Incubar en la platina de calentamiento por EXACTA-MENTE 2 minutos. Ponga en marcha el cronó-metro y preste atención cuando se esté acercando a los 2 minutos (es más fácil iniciar el cronómetro ydejar que corra a los 2 minutos que ponerlo en cuentaregresiva ya que evita el estrés del sonido cuando termina la cuenta regresiva) mientras se incuba, conti-núe con el paso 9 abajo.

No deje que el blastocisto este expuestoa la luz del microscopio cuando se estéincubando.


26

13. Sumerja en nitrógeno líquido.

12. Cubra el loop con la solución con los otros 10ul y coloque el blastocisto en el loop

Nota: El uso de gotas reduce el riesgo de perder el blastocisto. El blastocisto tiende a flotar en el medio viscoso 3. También es importante incubar la solución3 en las mismas condiciones que las otras dos soluciones. De ahí el uso de 1 mL.

14. Fije el tubo de criopreservación a la pinza y sumerja el tubo en el nitrógeno líquido dejando que se llene. Inserte con mucho cuidado el loop en el tubo Mantengael loop en nitrógeno líquido durante todo el proce-dimiento. Use la crystalwand para cerrar el tubo.

15. Fije el tubo a la cánula de cryopreservación para alma-cenar en nitrógeno líquido.

9. Durante la incubación de 2 minutos, preparar 2 x 10 µLgotas de solución 3 en el centro de la caja (ver diagramaabajo). Las gotas se evaporan rápidamente; prepárelaslo más tarde posible.

10. Adjuntar el loop al Crystalwand.

11. Después de los 2 minutos, aspire solución del pozo 3 con la punta de la pipeta y transfiera el blastocisto que esta en solución 2 a la solución 3 -10 µL. El blastocisto debe permanecer en la solución 3 EXACTAMIENTE 30 segundos, incluyendo el tiempoen el loop. No más ni menos tiempo.


1 2

3

27


1. Etiquetar el plato NUNC con la identificación del paciente, así como cada número de la solución, es decir4, 5, 6 y 6 respectivamente.

2. Pipetear los medios de calentamiento 4,5 y 6 como se describe a continuación.

3. Incubar a 37°C en 5-6% en CO2 por 30 minutos.

4. Separe con cuidado el loop del tubo de criopreservación,asegúrese de no tocar el interior del tubo con el loop (el blastocisto se puede perder). Desenroscar la partesuperior y mover el loop del tubo son los momentos de más riesgo del procedimiento.

5. Sumergir el loop en la superficie de la solución 4. Dejeque el blastocisto caiga. Identificar su presencia en elpozo e incubar durante 2 minutos en la platina de calentamiento. ( 2 minutos incluido el tiempo utilizadopara localizar el blastocisto).

6. Aspire solución 5 en la punta de la pipeta, coger el blastocisto de la solución 4 y transferirlo a la solución 5. Incubar durante 3 minutos en la solución 5.

7. Mueva el blastocisto aspirando solución 6 en la puntade la pipeta, recoger el blastocisto de la solución 5 y transferirlo a la solución 6. Mueva el blastocisto al rededor para enjuagar y luego trasládelo al segundopozo que contiene solución 6.

8. Incubar durante 5 minutos.

9. Transfiera el blastocisto al medio de cultivo y deletiempo para que el blastocisto se reexpanda. Espere de 1 a 4 horas antes de su análisis. Si el blastocisto no se ha reexpandido después de 4 horas, la probabili-dad que se reexpanda es casi nula.

Proceso de calentamiento

1 2

3

Pozo 1

ThermoBlast™4: 1000 µL

Pozo 2


Pozo 3


Tinción de vitalidad

28

Sperm VitalStainTM

� El objetivo 100 x con aceite de inmersión, le dará unaclara visión entre espermatozoides teñidos y no teñidos.

1. Agite la botella de SpermVitalStainTM antes de su uso.

2. Tome la misma cantidad de Sperm VitalStainTM como de la muestra de semen (por ejemplo 50 µL SVS + 50 µL muestra). Utilizar por ejemplo un tubo de eppendorf.

3. Mezclar muy bien.

4. Dejar a temperatura ambiente por 30 segundos.

5. Prepare las láminas usando un método convencional o use el método recomendado por Nidacon.

6. Transferir una gota 20 µL en una lamina etiquetada,con una pipeta, haciendo una línea de líquido en el medio de la lámina.

7. Cubra la lámina con una segunda lámina y cuando la gota se distribuya uniformemente entre las dos láminas, sepárelas una de la otra en posición horizontal,como resultado tendrá dos buenas láminas para examinar.

8. Seque al aire las dos láminas y examinar. Si desea almacenar para uso posterior, montar las láminas con DPX o medio de montaje equivalente y cúbralas.

9. Examine usando un campo brillante 40 x objetivo o un objetivo de 100 con aceite de inmersión.

Cuente 200 espermatozoides, los blancos (sin tinción)son clasificados como vivos y los rojos o rosados sonclasificados como muertos. Espermatozoides con tin-ción únicamente en la región del cuello son clasificadoscomo vivos.

Trucos

La vitalidad espermática se debe determinar en muestrasde semen con el 50% o más de espermatozoides inmóvilesde acuerdo con el manual de laboratorio de la OMS para el examen de esperma humano.

Sperm VitalStain utiliza la técnica de eosina-nigrosina, método de un solo paso para establecer el porcentaje de

espermatozoides vivos. Se basa en el principio por el cuallas células muertas (es decir aquellas con daño en la membrana plasmática) van a incorporar la eosina y teñirde rojo. La nigrosina proporciona el fondo para facilitar la visualización de las células vivas no teñidas (Blanco).

Fundamentos

Procedimiento

10.

6

7

Microscopio con Luz (40-100 x aumento)Láminas

PipetasProbeta

Reactivos y equipos

29

Morphology Staining

Sperm MorfoStainTM

� Use lápiz en vez de marcador para marcar las láminas ya quela tinción remueve la tinta de marcadores permanentes.

1. Haga un frotis con el semen en una lámina con un método convencional o con el método recomendadopor Nidacon.

2. Transferir con una pipeta, una gota de 20 µL en una lámina etiquetada haciendo una línea en el medio de la lámina.

3. Cubra esta lámina con una segunda lámina y cuando la gota se distribuya uniformemente entre las dos láminas, sepárelas una de la otra en posición horizontal.Como resultado tendrá dos buenas láminas para examinar.

4. Deje secar al aire los frotis.

5. Sumergir los frotis secos en la solución de tinción por8 segundos.

6. Enjuague con agua destilada, cambiando el agua 3 veces. Acueste la lámina y deje que se seque por completo.

7. Monte las láminas con cubreobjetos y DPX o líquidoequivalente de montaje, y deje que se seque completa-mente antes del examen.

8. Examine usando un campo brillante con objetivo 100 x con aceite de inmersión.

9. Clasificar por lo menos 200 espermatozoides, clasifica-ción de acuerdo con el manual de NAFA de 2002 y ESHRE SIGA o los principios básicos de análisis de semen.

Trucos

La técnica se basa en el principio que los espermatozoidescon diferentes características se tiñen por lo que se puedendiferenciar. El número estimado de espermatozoides anormales en el eyaculado, ayuda en el juicio si se requierey qué tipo de tratamiento de fertilidad es necesario.

El esperma se teñirá de un color más oscuro (azul) y elfondo será más claro. En consecuencia, la forma, el tamañoy la integridad de los espermatozoides se puede determinarfácilmente con el uso del objetivo 100 x, en inmersión deaceite.

Fundamentos

Procedimiento

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Tarro de Coplin o similarLáminas

Microscopio con luz (40-100 x objetivo)Pipetas

Reactivos y equipos

Referencias

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CalidadMs. Marina Danilova

FinanzasMs. Kim Henderson-Young

LogísticaMr. Dennis Johansson

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