Manual de prácticas Microsanit

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TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC

DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

ECATEPEC, EDO. DE MÉXICO

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ACADEMIA DE BIOQUÍMICA

MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA SANITARIA

SÉPTIMO SEMESTRE

Elaboró: M. en C. María Aurora Martínez Trujillo

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PRESENTACIÓN

En las industrias de alimentos, la calidad de los mismos depende en gran medida de las

características microbiológicas de éstos. Lo anterior sugiere el estudio detallado de los

principales microorganismos contaminantes o patógenos, así como los parámetros

fisicoquímicos que permiten conservar los alimentos del ataque microbiano.

El presente manual ha sido elaborado con el objeto de dirigir el trabajo experimental del

alumno hacia el manejo de muestras y material en microbiología, así como el empleo

de los métodos de conservación más comúnmente empleados en la industria de los

alimentos al comprender el efecto que estos tienen sobre la viabilidad y el crecimiento

microbiano.

Para ello se presentan seis prácticas que los estudiantes realizarán durante las

primeras 9 semanas del semestre, empleando las cuatro horas que tienen asignadas

para el trabajo en laboratorio.

Estas prácticas han sido estructuradas con el objetivo de que el alumno tenga un punto

de partida para el desarrollo de las mismas, pero evitando que el trabajo de laboratorio

se reduzca a la repetición o ensayo de técnicas de análisis, ya que, de la manera en la

que están planteadas, el alumno podrá:

a) Elegir el alimento con que desea trabajar, y todo lo que ello implica, como

obtención, preparación y tratamiento de la muestra.

b) Seleccionar sus variables de trabajo.

c) Plantear los objetivos específicos de acuerdo a sus intereses.

d) Plantear su propia hipótesis de trabajo.

e) Seleccionar la técnica o técnicas de análisis mas adecuadas para el alimento

que eligió.

Todo lo anterior siempre dentro del cumplimiento de los objetivos.

Se sugiere que para el desarrollo de las prácticas, se trabajen tipos de alimentos y/o

técnicas de análisis (según sea el caso) diferentes en el grupo y después se

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intercambien resultados para poder establecer comparaciones. En ocasiones, dos o

tres prácticas podrán convertirse en una sola, empleando un diseño experimental, en la

que cada equipo del grupo desarrolle una parte. En este caso, la práctica final se

conformará con los resultados obtenidos por todo el grupo, y se discutirán y analizarán

en una sesión especial.

Después de realizar las prácticas, los estudiantes deberán desarrollar un proyecto de

investigación aplicada para el diseño de una planta que proponga la elaboración de un

producto alimenticio de elevada calidad, de acuerdo a los temas vistos en clase,

empleando, de ser necesario, algunas de las técnicas aprendidas durante el desarrollo

de las prácticas de este manual.

Con esta forma de trabajo se pretende que el alumno adquiera madurez académica y

desarrolle una visión encaminada a la investigación apoyando así el modelo de

educación que sigue el TESE, fortaleciendo principalmente el saber hacer y el innovar.

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INDICE

Reglamento de trabajo en el laboratorio de microbiología y

procedimientos generales de trabajo en el laboratorio de

microbiología

Práctica 1. Preparación del material para esterilizar

Práctica 2. Aislamiento y recuento de bacterias aerobias

Práctica 3. Aislamiento y cultivo de hongos filamentosos y

levaduras

Práctica 4. Efecto de la actividad de agua sobre la viabilidad

y el crecimiento microbiano

Práctica 5. Efecto de la temperatura de incubación sobre el

crecimiento microbiano

Práctica 6. Influencia del pH sobre el crecimiento microbiano

Proyecto de investigación

1

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19

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32

38

44

1

Reglamento de trabajo en el laboratorio de microbiologia y procedimientos generales de trabajo en

el laboratorio de microbiología

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ASIGNATURA: Microbiología Sanitaria CARRERA: Ingeniería Bioquímica

Reglamento de trabajo en el laboratorio de microbiología Tomando en consideración que los microorganismos con los que se trabaja en este curso pueden llegar a ser patógenos, se deberán seguir estrictamente las indicaciones de este documento. No se debe menospreciar el riesgo a la salud que representan muchas de las substancias que se emplean ni las precauciones en el uso de mecheros de gas, debiendo dar aviso inmediato en el caso de fugas o derrames.

� De preferencia, las horas de entrada y salida del laboratorio deben cumplirse

puntualmente. � Dentro del laboratorio, deberá tenerse la bata puesta y abotonada. � No se permitirá la entrada a personas ajenas al laboratorio. � Las chicas deberán traer el cabello levantado mediante una coleta.

� Limpiar la mesa de trabajo con una solución desinfectante antes de empezar y al terminar el trabajo.

� Se deberán colocar todos los objetos personales en fuera del área de trabajo. � Abstenerse de comer, fumar, beber, aplicarse maquillaje e introducirse objetos a

la boca. � En la medida de lo posible, el trabajo debe realizarse sentado. No se

debe pasear entre las mesas del laboratorio, tratando de hablar sólo lo necesario cuando se esté trabajando ante el mechero.

� Deberá leerse con sumo cuidado el diagrama de flujo que se realice con la ayuda del profesor antes de empezar la práctica. Si no entiende, pregunte.

� Se deberá informar al profesor sobre cualquier accidente que ocurra. � Depositar en los botes para basura todo el material de desecho no

contaminado, como papel, algodón, cerillos, etc. � Al finalizar cada sesión, deberá colocarse el material debidamente

separado en los lugares asignados para ello: material contaminado para esterilizar, sin etiquetas; material sucio para lavar; material para incubar; y reactivos debidamente cerrados y ordenados.

� El material para incubar debe llevar la siguiente identificación: Grupo, Equipo, nombre del alumno, nombre del profesor, condiciones de la incubación, fecha y nombre del microorganismo o experimento.

� Colocar los bancos debajo de la mesa al terminar la sesión y lavarse las manos antes de salir del laboratorio.

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Procedimientos generales de trabajo en el laboratorio de microbiología.

El trabajo en el laboratorio de microbiología sanitaria requiere de un lugar

apropiado y de una serie de procedimientos rutinarios que aseguren la realización de operaciones limpias y sin riesgo. El laboratorio es un lugar especial de trabajo en el que se requieren condiciones apropiadas.

Como medida de precaución ante la posibilidad de que el operador reciba derrames o salpicaduras de material indeseable, se deberá trabajar con una bata, preferentemente blanca, de algodón, con manga larga, que se cierre de tal forma que cubra el frente del cuerpo. Ya que la naturaleza del trabajo requiere la observación minuciosa de recipientes, a veces abiertos, y manipulación de objetos delicados, las manos deben estar limpias y el cabello largo debe estar recogido firmemente en la nuca.

Las operaciones de pipeteo deberán ser realizadas con el uso de una pera de hule o algún otro dispositivo de succión controlable, evitando tanto como sea posible el uso de la boca, sobre todo cuando se trate del manejo de organismos peligrosos, líquidos cáusticos, corrosivos, tóxicos o que produzcan vapores. Debe cuidarse de poner un filtro de algodón en la boquilla de la pipeta para el manejo de muestras microbiológicas.

Es muy importante que del lado izquierdo se coloquen las gradillas con tubos, matraces, cajas de petri y toda clase de recipientes que se habrán de manipular. Del lado derecho deben estar cerillos o encendedor, asa y pota asa, marcador, tijeras, pipetas y un recipiente de dimensiones apropiadas para desechar los diferentes materiales que se deberán esterilizar, principalmente pipetas y los tapones de algodón que se ponen al final de estas. Al frente, a unos 30 cm del borde de la mesa se coloca el mechero, cuya llama debe ser estable y de unos 15 cm de altura.

Para el trabajo en condiciones asépticas, si no se dispone de una campana de flujo laminar, se deben hacer las manipulaciones a una distancia horizontal no mayor de 20 cm y a una altura de 5 a 10 cm de la base de la llama. Este espacio constituye la zona de seguridad del mechero.

Siempre debe esterilizarse el asa bacteriológica, antes y después de usarla. El procedimiento consiste en introducir en la llama del mechero el alambre en posición inclinada a unos 45º y dejar que alcance el rojo vivo, después se flamea el porta asa hasta una distancia igual a la profundidad de los recipientes que se utilicen, sean tubos o matraces.

La boca de tubos y matraces se debe flamear, con objeto de quemar los filamentos de algodón que puedan adherirse provenientes del tapón, igualmente para destruir los contaminantes de la mano, que se adhieren en el momento de retirar el tapón, esta operación se realiza inmediatamente antes de volverlo a colocar. No se debe exagerar esta operación sobrecalentando, ya que esto puede hacer que el tapón se queme, o que cualquier manejo subsecuente del material ocasione una quemadura al operador.

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Diferentes tipos de operación. Toma de una muestra de un tubo con líquido. Se esteriliza el asa, se toma el tubo con la mano izquierda, con el dedo meñique y la palma de la mano derecha se sostiene firmemente el tapón y se retira rotando el tubo suavemente y con firmeza. Se flamea la boca del tubo. Con el tubo inclinado, nunca en posición horizontal, se introduce el asa tocando la pared del tubo hasta entrar en el líquido, cuidadosamente se retira el asa con un movimiento que permita la adhesión de una gotita en el circulo de alambre. No basta con que se forme una película. Se saca el asa sin tocar la pared del tubo, se flamea la boca del tubo y se tapa. Descarga de la gota acarreada en el asa. La gota que se ha tornado asépticamente puede tener diferentes destinos: a) El más simple es que se deposite en el centro de un portaobjetos para hacer alguna preparación. Inmediatamente después se debe esterilizar el asa. b) A menudo, el destino de una gota tomada con el asa es servir de inóculo, para lo cual se deben seguir los pasos siguientes:

i) Inóculo a otro medio liquido en tubo o matraz. La operación es similar a la toma de la muestra, se sostiene firmemente el recipiente con la mano izquierda y el tapón se retira con el dedo meñique de la mano derecha, se flamea la boca del recipiente y se introduce el asa cuidadosamente sin tocar las paredes hasta romper la superficie del liquido, ahí se hace un ligero movimiento de rotación y se retira el asa, se flamea la boca del recipiente, se coloca su tapón y se esteriliza el asa.

ii) Si es a un medio sólido, se hace una estría con el asa, observando que parte del material tornado quede extendido a lo largo del trazo. A menos que se indique, no se debe romper la superficie del medio sólido.

Toma de una muestra de un medio sólido. Las operaciones son las mismas

descritas anteriormente, excepto que con el asa se debe tocar y separar un fragmento del material de interés, ya sea una colonia bacteriana, o parte de una pasta o material viscoso. El destino de la muestra puede ser el mismo que en el párrafo anterior.

i) Si se va a hacer una preparación para observar al microscopio, el material se suspende en una pequeña gota de agua destilada colocada previamente en el centro de un portaobjetos.

ii) Si va a ser un inoculo, se trata igual como se describió si es a un medio liquido. iii) Si es a un medio sólido, se hace una estría con el asa, observando que parte del

material tornado queda extendido a lo largo del trazo. A menos que se indique, no se debe romper la superficie del medio sólido.

Manipulación de cajas de Petri. Estos recipientes generalmente contienen un medio de cultivo solidificado con agar, cuya firmeza depende de la concentración del mismo, la cual regularmente es del 2.5 %. En la mayoría de los casos esta sustancia es inerte y no interfiere con el desarrollo de los microorganismos. A menos que se indique lo contrario, las cajas de petri se mantienen con la tapa abajo y la base arriba, con lo cual el agua de condensación que se forma en la tapa no cae sobre el medio de cultivo y la tapa permite levantar la caja sin destaparla accidentalmente.

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Con la mano izquierda se toma la caja y con un giro de la muñeca se tiene la caja en posición invertida, la base abajo y la tapa arriba, se deja caer la base en la palma de la mano y se sostiene la tapa can la yema de los dedos, se invierte el giro de la muñeca y se deja la tapa de la caja sobre la mesa junto al mechero. Sosteniendo la base entre los dedos se vuelve a girar la muñeca y la superficie del medio de cultivo queda expuesta al operador. En estas condiciones se puede observar la superficie del medio, tomar una muestra, inocular con el asa, etc. Cualquiera que sea la operación debe hacerse en un tiempo mínimo, ya que aunque se trabaje en la zona de seguridad del mechero, la probabilidad de que los contaminantes lleguen aumenta al prolongar el tiempo de exposición. En caso de tener que transferir un volumen de líquido con una pipeta, se recomienda un procedimiento diferente: Se coloca la caja sobre la mesa, junto al mechero, con la tapa arriba y la base abajo, se destapa suavemente con la mano izquierda al tiempo que se introduce la punta de una pipeta y se descarga el volumen deseado. Inmediatamente después se retira la pipeta y se coloca la tapa. Otra forma de manipular las cajas de Petri, que se recomienda sólo después de tener cierta habilidad y confianza en el trabajo es el de tomar la caja de petri con la mano izquierda, en posición invertida, la base abajo y la tapa arriba, la base se apoya sobre los dedos meñique y anular, mientras que la tapa se sostiene con los dedos índice y pulgar y haciendo un movimiento de tijeras se abre una rendija por la cual se hace la operación deseada. Con cierta práctica se puede abrir la caja casi por completo. Aislamiento de colonias. Una vez que se ha depositado en la superficie del medio en la caja de Petri el material que en general sirve de inóculo, se debe extender éste, para lo cual se siguen diferentes procedimientos. Para aislar colonias, se extiende el inóculo con el asa haciendo varios trazos en forma de secante cada vez mayor de la orilla hacia el centro, pero solamente una distancia de 1 a 2 cm de la orilla. Se esteriliza el asa, se deja enfriar o se introduce en el medio en un lugar que no interfiera con las siguientes estrías. Se gira la caja de Petri un quinto de vuelta y con el asa esterilizada se hace una nueva serie de estrías que deben extender una pequeña porción de la primera serie en forma similar con trazos que vayan de la orilla hacia el centro. La operación se repite dos veces más y en la quinta se hace una serie de estrías abiertas Crecimiento uniforme o masivo en la superficie. En caso de requerir que ocurra un crecimiento uniforme del inóculo, este se debe extender ya sea con el asa o con un hisopo, haciendo numerosas estrías en todas direcciones o bien, con la ayuda de una varilla de vidrio acocada, la cual se esteriliza flameándola después de introducirla en alcohol, se deja enfriar y se hace un movimiento de vaivén sobre la superficie del medio al tiempo que se hace girar varias veces la caja de petri sobre la mesa, extendiendo el inóculo hasta cubrir toda la superficie. Toma de muestras con pipeta. Se rompe el papel de envoltura cerca de la boquilla. Se siguen los pasos correspondientes a la manipulación de tubos y matraces, introduciendo en el liquido la punta de la pipeta, succionando el volumen deseado, aforando a la marca correspondiente, se retira sin tocar las paredes, se flamea y tapa el recipiente, manteniendo la punta de la pipeta dentro de la zona de seguridad del

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mechero. Se toma el recipiente al que se va a transferir el líquido manipulándolo como se describió antes y se descarga el volumen deseado del contenido de la pipeta en el recipiente. Esta operación debe ser muy rápida, pues el calor del mechero hace que el aire dentro de la pipeta se dilate y expulse el líquido, lo que causa derrames indeseables sobre la mesa, la bata u otros recipientes. La pipeta se debe desechar introduciéndola en un recipiente con una solución desinfectante, después de lo cual se puede lavar o si se quiere se puede esterilizar con todo el material sucio en el autoclave. Alternativamente, se puede colocar nuevamente en la envoltura de papel en la que se esterilizó, mientras se termina el trabajo y se dispone la esterilización de todo el material sucio. Toma de muestras e inoculación con hisopo. Un hisopo consiste de un palillo de madera de unos 15 cm de largo, con un poco de algodón enredado en un extremo. Estos instrumentos se esterilizan en tubos gruesos o envuelto en papel. Se saca un hisopo cuidadosamente de su contenedor con la mano derecha sin tocar el extremo con algodón, que servirá para impregnarse del material que interesa., se introduce el extremo con algodón y se deja humedecer o empapar, se retira el hisopo son tocar las paredes y se lleva a sui destino. Si es un medio líquido basta con un movimiento de inmersión o extracción. Si es a un medio sólido se descarga humedeciendo la superficie con un movimiento suave. Si se quiere conservar la muestra tomada en el hisopo se introduce este en un tubo estéril ya sea seco o con un líquido conservador para su transporte y se sujeta con el propio tapón del tubo, dejando fuera la parte que ha sido tocada con los dedos. Una vez que se ha utilizado el hisopo, para desecharlo hay varios caminos: se le sumerge en una solución desinfectante o se le pone en un recipiente para su posterior esterilización o se incinera. Preparación de medios de cultivo. En la mayoría de las ocasiones, los medios de cultivo se adquieren comercialmente de diversos proveedores y marcas, son preparados deshidratados en polvo, cuya composición varía de acuerdo con las necesidades. En general, el fabricante señala la cantidad de polvo que debe usarse por cada litro de medio de cultivo. En un recipiente del doble del volumen que se desea preparar se pone el polvo y agua destilada para disolverlo. Si el medio contiene agar se requiere del calentamiento hasta ebullición para lograr la disolución del mismo, en el caso en que este medio deba ser utilizado para preparar tubos inclinados. Cuando este agar se prepara para vaciar en cajas, esta disolución no es necesaria, puesto que se alcanzará sin problemas durante la esterilización. Hay que tener mucha precaución, ya que los medios con agar tienden a hervir abrupta y violentamente, lo cual podría causar quemaduras graves del operador. Por lo anterior, se recomienda que al realizar la ebullición del mismo, la boca del matraz nunca apunte en dirección del operador y que éste utilice guantes de asbesto para su protección y esté atento en todo momento del matraz. El paso siguiente consiste en envasar los volúmenes convenientes en los tubos de cultivo y esterilizarlos en autoclave. Si el medio se va a utilizar en cajas de petri, se tapa con algodón el recipiente en que se disolvió, se cubre con papel y se esteriliza en autoclave.

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Después de esterilizar. a) Medios de cultivo líquidos. Los tubos y otros recipientes con medio de cultivo líquido se sacan del autoclave y se dejan enfriar a temperatura ambiente. b) Medios de cultivo sólidos. Los recipientes con medio sólido se sacan del autoclave y se hace lo siguiente:

i) Si son tubos, se dejan enfriar en posición inclinada de tal modo que se forme una superficie plana larga y que no alcance el límite del tapón de baquelita. Al enfriarse se solidifica el medio de cultivo cuando alcanza una temperatura entre 40 y 45°C.

ii) Si son recipientes cuyo contenido se va a utilizar en cajas petri, se dejan enfriar hasta alcanzar una temperatura de 45 a 50°C, y se p rocede a verter el medio todavía líquido en las cajas estériles, en una operación aséptica cerca de la llama del mechero, evitando la formación de burbujas. En caso de que se formen burbujas, se pueden romper flameando ligeramente la superficie con el mechero. Cada caja puede contener de 12 a 15 ml. Se dejan enfriar sobre la mesa hasta que el medio solidifique. Se invierten para que la tapa quede abajo y la base arriba. Si no se utilizan en ese momento, las cajas pueden mantenerse en refrigeración, debidamente etiquetadas y selladas con papel parafilm, con la tapa hacia abajo y la base de la caja en la parte superior.

Rotulado. En todos los casos, se debe rotular cada portaobjetos, tubo, matraz, caja de Petri o cualquier otro recipiente en el que se haga un cultivo, reactivo o prueba, con el fin de conocer sin lugar a dudas lo que se tiene entre manos. Nunca se debe depositar toda la confianza en la memoria. En caso de que no hubiera espacio suficiente para poner todos los datos necesarios, se debe utilizar una clave simple y confiable, que contenga la iniciales del operador, material, cultivo, cepa, muestra o prueba y fecha. Esto mismo debe registrarse en el cuaderno de trabajo en donde estarán explícitos todos los datos.

Material personal Cada estudiante debe tener bata blanca de manga larga que cubra el frente, un cuaderno de trabajo, lápices de colores, un rollo de cinta adhesivo, tijeras, pinzas de disección de punta roma, asa y porta asa, botes de lamina (de los usados para conservas y alimentos enlatados) y cerillos o encendedor.

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PRACTICA No. 1

Preparación del material para esterilizar

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PRÁCTICA No. 1

PREPARACION DEL MATERIAL PARA ESTERILIZAR

I.- RELACIÓN DE CONOCIMIENTOS:

Conocimientos requeridos Conocimientos por adquirir

- Conceptos de microbiología general.

- Bases teóricas de los

procedimientos utilizados en el

laboratorio de microbiología.

- Metodologías adecuadas para el

manejo de materiales y muestras

que contengan microorganismos.

- Unificación de criterios para el

adecuado trabajo en microbiología,

de acuerdo al profesor que imparte

la materia

II.- OBJETIVO:

General

Preparar para esterilizar el material de vidrio más usado en el laboratorio de

Microbiología sanitaria. Conocer el material y equipo más común para la esterilización y

el trabajo en condiciones de esterilidad.

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III.- INTRODUCCIÓN:

La esterilización es un proceso mediante el cual se eliminan por muerte o remoción

todos los organismos viables de un objeto, superficie o medio. Un objeto libre de

cualquier forma de vida se dice que esta estéril. El concepto de esterilidad es absoluto,

es decir no existe un material casi, más o menos, o 99% estéril.

Para realizar un estudio de microorganismos en una muestra o área determinada en el

trabajo cotidiano de un laboratorio de microbiología es necesario que todo el material

utilizado, tal como pipetas, tubos de ensaye, cajas de Petri de vidrio o de plástico,

medios de cultivo y soluciones estén estériles. Por lo tanto el material a esterilizarse

deberá prepararse para que se conserve estéril. Existen varios métodos físicos y

químicos de esterilización. La selección de uno u otro depende de la naturaleza del

material que se piensa esterilizar. La tabla 1 muestra la clasificación de los métodos de

esterilización comúnmente utilizados en un laboratorio de microbiología, respecto a su

fundamento físico o químico, así como los materiales que se esterilizan por cada uno de

los métodos mencionados.

Tabla 1. Métodos de esterilización

Métodos físicos

Calor

Húmedo Vapor a presión (autoclave) → medios líquidos.

Seco

Aire caliente (horno) → material de vidrio.

Flameado → asas bacteriológicas y espátulas.

Filtración Filtros de membrana o filtros

absolutos → sustancias termolábiles.

Radiaciones

No ionizantes

Rayos ultravioleta Rayos infrarrojos

Ionizantes Rayos X

Rayos γ (cobalto-60)

Métodos químicos Gases Oxido de etileno

Líquidos Formaldehído, β-propiolactona, alcohol al 70%, benzal, etc.

La muerte de los organismos contaminantes ocurre principalmente por

desnaturalización de las macromoléculas (proteínas, RNA y DNA) y coagulación de

proteínas.

La esterilización con calor seco se usa principalmente para material de vidrio y

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materiales sólidos estables al calor, requiere mayor duración e intensidad porque la

conducción del calor es menos rápida que en un ambiente húmedo. La temperatura que

se utiliza es generalmente entre 160 y 180°C durant e 1.5 horas. Las cajas de Petri de

vidrio y las pipetas se colocan en cilindros de metal con aberturas que permitan el paso

del aire caliente. La inactivación de los contaminantes ocurre por pérdida de agua y

oxidación de todos sus componentes esenciales.

El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de sus proteínas

celulares.

La filtración a través de membranas se usa para esterilizar soluciones de sustancias

termolábiles en donde los microorganismos son retenidos en el filtro. El filtrado estéril

debe recibirse en un recipiente también estéril.

En las campanas de flujo laminar que se usan como áreas estériles en el trabajo

microbiológico, el aire se esteriliza por filtración a través de mallas de fibras de diversos

materiales (filtros absolutos).

IV.- MATERIAL Y METODOLOGÍA:

El alumno determinará la cantidad de material que utilizará para comprender o recordar

la forma de preparar y esterilizar matraces, pipetas, cajas petri y medios de cultivo. La

lista de material de laboratorio será elaborada por el estudiante, una vez que haya

revisado con profundidad los métodos de esterilización antes mencionados, y haya

preparado una metodología adecuada que revise detenidamente con el profesor.

El alumno deberá desarrollar una adecuada búsqueda bibliográfica que le permita

generar un diagrama de flujo que lo guíe en esta etapa experimental. Con el uso de

dicho diagrama, el alumno determinará el orden en que desarrollará las actividades

dentro del laboratorio. Deberá considerar que esta práctica es sólo de repaso y que no

deberá durar más de una sesión. De esta forma, antes de realizar cualquier actividad,

deberá discutir con el profesor las actividades que pretende desarrollar. Las actividades

que deberá desarrollar para la construcción del diagrama de flujo son:

1. Preparación de tubos de vidrio y matraces con solución (solución salina o medio

de cultivo respectivamente) para esterilizar en la autoclave, siguiendo las reglas

básicas de la microbiología.

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2. Preparación de pipetas y cajas de petri para esterilizar en la autoclave y calor

seco.

3. Preparación del sistema de filtración en membrana para esterilizarlo en la

autoclave (sólo será demostrativo).

4. Conocimiento de las autoclaves y campanas de flujo laminar. Esto con el objetivo

de conocer o repasar su funcionamiento, para utilizarlas de manera adecuada en

las prácticas futuras.

V.- ANÁLISIS DE RESULTADOS:

- El alumno deberá analizar los resultados obtenidos de la experiencia de manera

comparativa para detectar ventajas y/o desventajas de los métodos empleados.

- El alumno deberá escribir el reporte científico con base en lo discutido en clase

con el profesor. Esta será la primera oportunidad que ambos tengan para revisar y

reformular el trabajo en el laboratorio, corrigiendo vicios futuros.

VI.- CONCLUSIONES:

Deben ir referidas al logro de los objetivos planteados al principio de la práctica.

VII.- CUESTIONARIO:

1. Cual es el método mas apropiado para esterilizar el siguiente material? ¿Porqué?

MATERIAL METODOLOGÍA

Solución de vitaminas

Cajas de Petri de plástico de desecho

Aceite mineral

Medios de cultivo para vaciar en cajas petri

Membranas para filtración de sustancias lábiles.

Solución de glucosa al 50%.

2. ¿Con qué finalidad se les pone a las pipetas un filtro de algodón?

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5. ¿Cual es el diámetro del poro en los filtros de esteres de celulosa utilizados para

esterilizar por filtración? y ¿Cuanto mide una bacteria de las mas pequeñas que se conocen?

6. ¿Porqué las cajas de petri con un medio de cultivo sólido deben incubarse con la tapa hacia abajo?

7. ¿Pasteurización es sinónimo de esterilización? Diga en qué casos se aplica la Pasteurización. Fundamente la respuesta.

VIII.- BIBLIOGRAFÍA

No. Autor / Año Título Editorial / Edición

1 Madigan, M.; Martinko, J.;

Parker, J. 2000

Biology of

Microorganisms.

Ninth edition.

Prentice Hall. Inc.

New Jersey

2 Breach, M.R. 1976 Esterilización: Métodos de

Control.

Ed. EI Manual

Moderno, S.A.

3 Gerhardt, P. (Ed.). 1994.

Manual of Methods for

General and Molecular

Bacteriology

American Society for

Microbiology.

Washington, D.C.

4 JM Jay, MJ Loessner, DA

Golden, DA Golden - 2005 Modern Food Microbiology Springer

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PRÁCTICA No. 3

PRACTICA No. 2

Aislamiento y recuento de bacterias aerobias

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Determinación del contenido de proteínas en un alim ento.



- Clasificación de las bacterias

- Características de las bacterias

- Alimentos que contaminan las

bacterias.

- Metodologías adecuadas para aislar

y cuantificar las bacterias contenidas

en un alimento.

- Importancia del aislamiento y

cuantificación de bacterias

contaminantes de alimentos.

II.- OBJETIVO:

General

Obtener un cultivo axénico de una bacteria aerobia a partir de un alimento contaminado

Específicos

� Aprender y practicar las técnicas de aislamiento por medio de la estría cruzada y

el método de las diluciones.

� Realizar la estimación cualitativa y cuantitativa del contenido microbiano de

diferentes muestras de alimento.

� Obtener cultivos axénicos de las especies presentes en la muestra analizada.


Los microorganismos generalmente se encuentran en la naturaleza como poblaciones

mixtas y para poder caracterizar e identificar un tipo particular de microorganismo, este

debe ser aislado y conservado como un cultivo puro o axénico, que significa que esta

formado por microorganismos de la misma especie.

Para estudiar a los microorganismos de una muestra es importante considerar la

naturaleza de esta. Si es líquida se tendrá que homogenizar para distribuir a los

microorganismos en la misma y al tomar una alícuota esta sea representativa de la

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original. Si la muestra es sólida se deberá tratar de tal manera que se separen sus

componentes en un diluente para que se suspendan los microorganismos en el líquido.

Para el aislamiento de microorganismos se cuenta con varios métodos. Los más

usados son el método de la estría cruzada y el de las diluciones.

Las colonias aisladas presentan características morfológicas diferentes debido a que

cada grupo filogenético de microorganismos tiene características peculiares que se ven

influidas por las condiciones del medio. Una colonia se desarrolla en el medio sólido y

procede de una sola bacteria, espora o agrupación de microorganismos de la misma

especie, a los que se denomina unidades formadoras de colonias (UFC). Para calcular

el numero de UFC en una muestra procesada por el método de las diluciones, se

cuenta el numero de colonias formadas en las placas, de preferencia aquellas que

tengan entre 30 y 300, se determina el número de UFC contenidas en 1 mililitro de la

dilución usada para inocular cada placa y se multiplica por la inversa de la dilución

correspondiente.

No todos los microorganismos viables presentes en la muestra pueden cultivarse in

vitro; dependiendo de la muestra, se estima que solamente crecen en los diferentes

medios de cultivo entre un 20 y 50% de las especies presentes, y en casos como

ambientes extremos, solamente del 0.1 al 1 %. Esto es debido a que algunas de ellas

viven en simbiosis obligada, son inhibidas por microorganismos presentes, crecen muy

lentamente en los medios usados, son inhibidas por los componentes de los medios de

cultivo, tienen requerimientos nutricionales que el medio de cultivo no les proporciona,

etc.

Para el éxito del aislamiento de microorganismos a partir de muestras de ambientes

naturales también se puede requerir de medios de transporte especiales o de técnicas

de enriquecimiento previas, y medios de cultivo ricos, selectivos o diferenciales.

El oxigeno puede ser esencial para algunos microorganismos pero tóxico para otros. La

capacidad de los microorganismos para crecer en presencia o ausencia de oxigeno

está directamente relacionada con su metabolismo y con la presencia o ausencia de

enzimas que los protegen del efecto tóxico de los productos del oxigeno (por ejemplo,

superoxido dismutasa y catalasa). Con base en los requerimientos de oxigeno, los

microorganismos se han agrupado en aerobios estrictos, anaerobios facultativos,

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anaerobios estrictos, anaerobios aerotolerantes y microaerofilicos.

Los microorganismos aerobios estrictos respiran usando al oxigeno como aceptor final

de electrones en su cadena respiratoria; los anaerobios facultativos pueden obtener su

energía tanto por procesos respiratorios como fermentativos, es decir, pueden tener

como aceptores finales de electrones al oxigeno o compuestos orgánicos. Los

microorganismos microaerofílicos requieren oxigeno pero a tensiones menores del

15 %.

IV.- MATERIAL.

El alumno determinará la cantidad de material que utilizará para homogenizar la

muestra del alimento que analizará, y desarrollar el análisis microbiológico adecuado.

Para lo anterior, deberá desarrollar un diagrama de flujo, que deberá ser discutido con

el profesor con base en el material bibliográfico consultado por el alumno.

V. METODOLOGÍA:

El alumno deberá hacer una extensa búsqueda bibliográfica que le indique el tipo de

bacterias que puede contener el alimento de su elección, y deberá plantear la

metodología adecuada para realizar dos actividades principales:

1. Aislamiento de bacterias por el método de las diluciones.

2. Aislamiento de bacterias por la técnica de la estría cruzada.

La búsqueda bibliográfica deberá incluir los fundamentos de cada uno de los métodos

de aislamiento de bacterias, mencionando pros y contras en cada caso.

VI.- ANÁLISIS DE RESULTADOS:

- El alumno deberá analizar los resultados obtenidos de manera comparativa para

detectar ventajas y/o desventajas de las determinaciones hechas.

- Deberá relacionar las características fisiológicas y morfológicas de las colonias

aisladas con los resultados de su búsqueda bibliográfica, para poder identificar

el tipo de bacteria que ha aislado.

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- Se deberá conservar un tubo inclinado con el cultivo axénico de la cepa aislada,

para emplearlo en futuras prácticas. De preferencia, la cepa aislada no deberá

ser una especie patógena.

VII.- CONCLUSIONES:

Deben ir referidas al logro de los objetivos planteados en un principio, así como a las

características de la especie contaminante del alimento.

El alumno deberá concluir acerca de:

a) aspectos técnicos de la determinación realizada

b) efecto en la relación de variables seleccionadas, de haberlas.

VIII.- CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué el método de las diluciones es cualitativo y cuantitativo?

2. ¿Por qué es importante el método de la estría cruzada para verificar la pureza de

un cultivo?

3. Mencione dos técnicas físicas y dos químicas de enriquecimiento para

microorganismos que estén en baja concentración en una muestra.

4. Si como se menciona en la introducción, el oxígeno molecular es un agente

oxidante muy tóxico, ¿cómo es que los microorganismos aerotolerantes lo

soportan a concentraciones tan altas como la atmosférica del 21%?

X.- BIBLIOGRAFÍA




2 Bibek Ray - 2004 Fundamental Food

Microbiology

CRCV, Press,

Tercera Edición

19

PRACTICA No. 3

Aislamiento y cultivo de hongos filamentosos y levaduras

20




PRACTICA No. 3

Aislamiento y cultivo de hongos filamentosos y leva duras



- Clasificación de los hongos y las

levaduras

- Características fisiológicas y

morfológicas de hongos y levaduras

- Alimentos que contaminan los

hongos y las levaduras.

- Metodologías adecuadas para aislar

y cuantificar los hongos y levaduras

contenidos en un alimento.

- Importancia del aislamiento y

cuantificación de hongos y levaduras

contaminantes de alimentos.

II.- OBJETIVO:

General

Aislar, cultivar y reconocer la morfología colonial y microscópica de hongos y/o

levaduras obtenidos de muestras de distintos alimentos contaminados.

Específicos

� Aprender y practicar las diferentes técnicas utilizadas para el aislamiento de

hongos y levaduras a partir de una muestra de alimento.

� Realizar la estimación cualitativa y cuantitativa del contenido microbiano de

diferentes grupos de microorganismos de diferentes muestras de alimento.

� Obtener cultivos axénicos de las especies presentes en la muestra analizada.

21


Los hongos son microorganismos eucarióticos unicelulares o pluricelulares heterótrofos,

quimioorganotróficos, aerobios o anaerobios facultativos que se nutren por absorción. Con

base en las características morfológicas, forma de reproducción y modo de crecimiento,

los hongos se dividen en dos grandes gropos: hongos filamentosos y levaduras.

Los hongos filamentosos están constituidos por células cuyo diámetro de 1 a 30 µm y

tienen una pared celular constituida por polisacáridos, (quitina en su mayoría y celulosa en

los oomicetos) y forman filamentos o hifas las cuales son estructuras tubulares en cuyo

interior fluyen los organelos contenidos en el material citoplásmico y además presentan un

crecimiento apical (por las puntas o ápices). El conjunto de hifas se ramifica y forma una

red que se denomina micelio.

A lo largo de Ia hifa pueden presentarse invaginaciones, que se derivan de la pared, y

formar tabiques con un orificio central llamado poro. Al miceIio que presenta estos

tabiques se Ie denomina micelio septado.

Existe también un grupo importante de hongos fiIamentosos cuyas hifas carecen de

septos, así que más bien se Ie denomina micelio cenocítico o micelio continuo. En ambos

tipos de micelio se pueden encontrar células mono y multinucleadas. La presencia o

ausencia de septos o tabicaciones en el micelio constituye un criterio taxonómico.

Algunos hongos son capaces de producir pigmentos que cuando se acumulan en el

interior de las hifas dan origen al micelio pigmentado; este pigmento puede ser de tipo

carotenoide (cuando la estructura química del compuesto corresponde a los carotenos) o

bien fuliginoso (cuando se deriva de la melanina). El micelio hialino se puede observar en

los hongos que no producen ni acumulan ningún pigmento en el interior de sus hifas.

También existen en la naturaleza algunos hongos que producen pigmentos pero los

vierten al entorno, lo que provoca un cambio en el color del medio que los rodea.

Generalmente son inmóviles, aunque algunos poseen zoosporas móviles. Su

reproducción puede ser asexual por fragmentación en las formas filamentosas, por

gemación en las formas levaduriformes y por formación de esporas. También en muchos

hongos se han descrito la reproducción sexual ya sea con hifas homotálicas de hongos

hermafroditas o con hifas heterotálicas de hongos dióicos que inician la secuencia de la

plasmogamia, cariogamia, meiosis y formación de esporas sexuales. Las esporas de los

22

hongos, aunque son ligeramente más resistentes que el micelio vegetativo a las

condiciones de estrés (temperatura elevada, radiaciones, desecación, etc.), no son formas

de resistencia como las endosporas bacterianas sino más bien de propagación. Existe una

clasificación de las esporas de los hongos basada en su origen asexual o sexual y en la

forma de la estructura que los contiene.

Son microorganismos ubicuos como saprófitos, simbiontes, parásitos o hiperparásitos, las

enfermedades causadas por hongos se llaman micosis.

Los hongos tienen un crecimiento lento comparado con el de la mayoría de las bacterias.

Esto puede dificultar su aislamiento de fuentes naturales donde abundan las bacterias.

Para evitar el crecimiento de bacterias, se usan medios selectivos con altas

concentraciones de azúcar (4%) con un pH ácido (5 a 6) y con inhibidores del crecimiento

bacteriano (colorantes o antibióticos).las levadura, a diferencia de los hongos filamentosos

cuyo crecimiento es apical, tienen un tipo de crecimiento isodiamétrico, uniformemente

distribuido en toda la superficie de la célula. Se reproducen asexualmente por gemación

dando origen a dos células iguales e independientes. Esta forma de reproducción y

crecimiento da como resultado la formación de colonias con aspecto húmedo y

consistencia cremosa. La morfología macroscópica y microscópica de las levaduras es

completamente diferente a la de los hongos filamentosos, pero su ultraestructura es muy

parecida.

Los hongos son importantes desde el punto de vista industrial, ya que producen una gran

cantidad de metabolitos, tales como ácidos orgánicos, cetonas, enzimas, vitaminas,

antibióticos, etc.) de importancia en diversas industrias alimenticias y farmacéuticas.

Ciertos hongos se adicionan a quesos como el Roquefort, Camembert y Cabrales para

proporcionarles sabores, aromas y texturas especiales. Por otra parte, hay varios hongos

que producen micotoxinas en algunos alimentos que pueden provocar intoxicaciones

alimentarias y cáncer. Además, su presencia en algunos alimentos puede generar

pérdidas importantes para las industrias encargadas de transformar y comercializar dichos

alimentos. Algunas levaduras por su parte, son utilizadas para la elaboración de pan y en

la preparación de bebidas fermentadas, como la cerveza, el vino y la sidra.

23

IV.- MATERIAL.





V. METODOLOGÍA:

El alumno deberá hacer una extensa búsqueda bibliográfica que le indique el tipo de

hongos y/o levaduras que puede contener el alimento de su elección, y deberá plantear

la metodología adecuada para realizar cuatro actividades principales:

1. Aislamiento por diluciones del material biológico contenido en la muestra a analizar.

2. Cultivo y descripción de la morfología colonial de levaduras.

3. Descripción de la morfología colonial de los hongos filamentosos.

4. Observación de cigosporas (esporas sexuales).


de aislamiento de estos microorganismos, mencionando ventajas y desventajas en

cada caso.



detectar ventajas y/o desventajas de las determinaciones hechas.

- Deberá relacionar las características fisiológicas y morfológicas de las colonias

aisladas con los resultados de su búsqueda bibliográfica, para poder identificar

el tipo de microorganismo que ha aislado.

- Se deberá conservar un tubo inclinado (levadura) o una caja petri (hongo) con el

cultivo axénico de la cepa aislada, para emplearlo en futuras prácticas. De

preferencia, la cepa aislada no deberá ser una especie patógena.

24

VII.- CONCLUSIONES:


características de la especie contaminante del alimento.


a) aspectos técnicos de la determinación realizada



1. Mencione tres ejemplos de hongos (género y especie) que tengan: Importancia médica

a) Patógenos del hombre Importancia agrícola

a) Patógenos de plantas b) Formadores de micorrizas

Importancia industrial a) Productores de ácidos orgánicos b) Productores de antibióticos

Importancia alimentaria a) Comestibles b) Venenosos c) Alucinógenos

2. Analice y discuta las dificultades e inconvenientes (no debidos a errores en la realización de la técnica de las diluciones) que existen para contar hongos a partir de un alimento determinado? Dicho de otro modo, ¿pueden contarse en forma confiable los hongos filamentosos?. 3. Menciones tres diferencias entre las esporas de los hongos y las endosporas de bacterias.

4. ¿Qué son una micorriza y un liquen? ¿En que se parecen y en que son diferentes? 5. Mencione cinco semejanzas y cinco diferencias entre los hongos y las bacterias.

25

X.- BIBLIOGRAFÍA


1 Smith, J.E. y Berry, D.R. 1975 The filamentous fungi. Vol.

1 Industrial Mycology

Ed. Arnold, Great

Britain, London

2 Wainwright. 1992

Introducción a la

Biotecnología de los

hongos

Ed. Acribia

3 Martinelli, S. y Kinghorn, J.R.

1997

Aspergillus: 50 years on.

Progress and industrial

microbiology, vol 29.

Ed. Elsevier,

Amsterdam



26

PRACTICA No. 4

Efecto de la actividad de agua sobre la viabilidad y el crecimiento microbiano

27




Práctica No. 4

Efecto de la actividad de agua sobre la viabilidad y el crecimiento microbiano



- El concepto de actividad acuosa.

- La clasificación de los

microorganismos respecto a la

actividad acuosa en la que crecen.

- Métodos de conservación de

alimentos que tengan como

fundamento el control de la actividad

acuosa.

- Desarrollo de experimentos que

permitan observar el efecto de la

actividad acuosa en la viabilidad y

crecimiento de los microorganismos.

II.- OBJETIVO:

Observar el efecto de la baja actividad de agua promovida por elevadas

concentraciones de cloruro de sodio y sacarosa sobre el crecimiento microbiano.

Observar el efecto de la desecación sobre la viabilidad de varios microorganismos.


Todos los organismos requieren de agua para vivir. Sin embargo la disponibilidad

del agua en diferentes ambientes varia debido a que esta se puede encontrar

fuertemente adsorbida o en solución formando parte de la esfera de solvatación de una

molécula o ion. La disponibilidad del agua se expresa de diferentes maneras, pero la

28

más simple es mediante el término actividad de agua (aw). El agua destilada pura tiene

una aw = 1.0. Si se adiciona azúcar, 1a actividad de agua disminuye. Así por ejemplo, el

jarabe de arce (maple) tiene una actividad de agua de 0.9. Del mismo modo, una

solución saturada de cloruro de sodio tiene una aw de 0.8 (Tabla 1). La actividad de

agua es un índice del agua disponible que puede ser utilizada por los microorganismos.

Cada microorganismo tiene requerimientos de aw que permiten su proliferación.

Algunas bacterias, hongos y las levaduras son capaces de crecer mejor en medios con

una actividad de agua baja. Hay microorganismos, conocidos como xerotolerantes, que

pueden crecer a aw muy baja, como algunas levaduras que crecen en soluciones

concentradas de azúcar con una aw de 0.60. Sin embargo esas mismas levaduras son

incapaces de crecer con una aw de 0.98 conseguida con la adición de NaCl. Como regla

general, los hongos son capaces de crecer en aw más bajas que otros

microorganismos, como las bacterias, y es por esta razón que pueden ser encontrados

creciendo en la superficie de miel, jaleas, mermeladas o frutas deshidratadas. La

incapacidad de la mayoría de los microorganismos para crecer en bajas aw es

aprovechada para la conservación de alimentos en salmueras, almíbares, salados o

azucarados.

La variación en la concentración del soluto no sólo altera la disponibilidad de

agua, sino también la presión osmótica, que es 1a fuerza que resulta de las diferencias

en la concentración de soluto en ambos lados de una membrana.

E1 interior de las células tiene concentraciones de solutos más altas que la

mayoría de los ambientes naturales y medios de laboratorio, por lo que existe una

constante tendencia a que entre agua, creando una presión osmótica de dentro hacia

afuera. Esta presión no destruye la integridad de la membrana debido a que la pared

celular compensa esa fuerza. En ausencia de esta envoltura las células se romperían.

En cambio, el aumento en la concentración externa de soluto por arriba de la

encontrada en el interior de la célula, promueve la salida del agua, lo que provoca una

disminución del volumen 10 que hace que e1 citoplasma se encoja y la membrana se

separe de la pared. Este fenómeno se denomina plasmolisis y la pérdida de agua

disminuye y detiene el metabolismo y la división celular, aunque las bacterias no

mueren de inmediato (efecto bacteriostático). Esta es la razón por la que los alimentos

29

conservados por desecación no son estériles, ya que contienen una población

microbiana en estado latente que puede crecer y dañar el producto, después de que

este es reconstituido con agua.

Los organismos que pueden proliferar aunque mas lentamente (con una

velocidad de crecimiento menor) en medios con altas concentraciones de solutos (baja

actividad de agua), se denominan osmotolerantes. En cambio, los osmofílicos requieren

para su crecimiento óptimo concentraciones elevadas de solutos. Específicamente, se

les denomina halofílicos y sacarofílicos cuando son el NaCI y la sacarosa

respectivamente los solutos requeridos. Algunas arqueas halofílicas extremas como

Halobacterium y Halococcus requieren concentraciones de saturación de NaCl

(aproximadamente 25%).

IV.- MATERIAL.





V. METODOLOGÍA:

El alumno deberá hacer una extensa búsqueda bibliográfica que le indique los tipos de

microorganismos que puede contener un alimento de acuerdo a su actividad acuosa, y

clasificará a los cultivos axénicos que obtuvo en las prácticas anteriores de acuerdo a

este criterio. Posteriormente, deberá plantear la metodología adecuada para realizar

tres actividades principales:

1. Determinar el efecto del cloruro de sodio sobre el crecimiento de los

microorganismos.

2. Determinar el efecto de la sacarosa sobre el crecimiento de los microorganismos.

3. determinar el efecto de la desecación sobre el crecimiento de los microorganismos.


utilizados, lo cual facilitará la discusión de resultados por parte del alumno.

30



determinar el nivel de actividad acuosa en el que los microorganismos de sus

cultivos axénicos pueden ser o no viables.

- Deberá analizar los distintos métodos de conservación de alimentos que

emplean el control de la actividad acuosa como posibles agentes capaces de

reducir o erradicar la contaminación de alimentos por los microorganismos con

los que cuenta en sus cultivos axénicos.

VII.- CONCLUSIONES:


características de los cultivos axénicos respecto a la actividad acuosa en la que son

capaces de crecer.


a) aspectos técnicos de los experimentos desarrollados



1. Defina el témino "actividad de agua".

2. Mencione el nombre (género y especie) de tres bacterias osmofílicas, indicando

si se trata de bacterias halofílicas o sacarofílicas.

3. Diga si Ia deshidratación de alimentos, Ia cual crea un efecto de disminución en

Ia actividad de agua, resulta en una esterilización de los mismos. Discuta su

respuesta.

4. Cual será Ia utilidad práctica de conocer Ia actividad de agua a la que se

desarrolIan los microorganismos?

5. Si usted desea aislar una levadura sacarofílica, ¿dónde la buscaría?

6. Mencione !as estructuras bacterianas que determinan la resistencia a la baja

actividad de agua originada por la desecación.

31

7. Diga tres nombres (género y especie) de microorganismos resistentes a la

desecación y tres de sensibles a ella.

IX.- BIBLIOGRAFÍA


1 Bremer E. Y R Kramer.

2000.

Osmoregulation through

acumulation and Release of

Compatible Solutes in

Bacteria. En Bacterial Stress

Responses. Edit. por G.

Storz y R Hengge Aronis

ASM Press,

Washington., D.C.

2 Hocking, H.D. 1988

Strategies for microbial

growth at reduced water

activities. Micr. Sciences

5:280-284

3 Kushner, D.l 1988.

What is the true internal

environment of halophilic and

other bacteria? Can. J.

Microbiol. 34:482-487.



32

PRÁCTICA No.5

Efecto de la temperatura de incubación sobre el crecimiento microbiano.

33




PRÁCTICA No.5

Efecto de la temperatura de incubación sobre el crecimiento microbiano.




microorganismos respecto al rango de

temperaturas en el que son capaces

de sobrevivir y desarrollarse.



fundamento el control de la

temperatura de

cocción/almacenamiento de los

alimentos.


permitan observar el efecto de la

temperatura de

cocción/almacenamiento sobre la

viabilidad y crecimiento de los

microorganismos.

II.- OBJETIVO:

Observar el efecto de la temperatura de cocción/almacenamiento sobre el crecimiento y

determinar la temperatura de crecimiento óptimo de los microorganismos con los que se

cuenta.

34


La temperatura es un factor ambiental que afecta todas las reacciones bioquímicas y

por lo tanto el crecimiento de los organismos.

Los límites de temperatura dentro de los cuales pueden encontrarse organismos vivos

son amplios y van desde temperaturas menores a 0 °C hasta superiores a 100 °C

(Tabla 1). En general, los organismos eucarióticos tienen limites superiores de

temperatura de crecimiento menores a los de los procarióticos, y entre estos, las

arqueas tienen los límites superiores de crecimiento más elevadas. Algunos

microorganismos crecen en intervalos de temperatura muy estrechos por lo que se les

denomina estenotérmicos, como Neisseria gonorrhoeae que crece entre 30 y 38 °C.

Otros procarióticos crecen en intervalos de temperatura muy amplios por lo que se les

conoce como euritérmicos, como Enterococcus faecalis capaz de crecer entre 0 y 44

°C.

Todos los microorganismos tienen temperaturas mínima, óptima y máxima de

crecimiento a las que se conocen como las temperaturas cardinales. De acuerdo con

las temperaturas cardinales (principalmente la óptima de crecimiento), los

microorganismos se han clasificado en psicrofílicos, psicrotróficos o psicrofílicos

facultativos, mesofílicos, termofílicos y termofílicos extremos.

Algunos ambientes naturales en los que se pueden encontrar microorganismos

psicrofílicos son los océanos, las regiones polares y de alta montaña. Una de las

adaptaciones que poseen los microorganismos psicrofílicos radica en la alta proporción

de lípidos insaturados de la membrana celular que permiten que esta estructura se

mantenga fluida a temperaturas cercanas al punto de congelación del agua. Los hongos

y bacterias psicrotróficos o psicrofílicos facultativos son los principales causantes de la

descomposición de la comida refrigerada, aunque también los podemos encontrar en

forma natural en el suelo y en el agua. Los microorganismos mesofílicos posiblemente

sean son los mas ampliamente distribuidos en la naturaleza; a este grupo pertenecen

casi todos los microorganismos patógenos para los humanos. Los termofílicos y

termofílicos extremos pueden encontrarse en manantiales termales y fumarolas

volcánicas terrestres y marinas. Las adaptaciones que tienen los microorganismos

35

termofílicos son múltiples e incluyen una alta proporción de ácidos grasos saturados en

la membrana celular, como en el caso de las arqueas, la membrana celular está

compuesta por lípidos atípicos que forman una monocapa con una mayor rigidez y

estabilidad que en una bicapa. Asimismo los termofílicos poseen proteínas, enzimas y

ácidos nucléicos que son estables a temperaturas altas. Las temperaturas bajas son

utilizadas como una forma para limitar el crecimiento microbiano y así conservar las

cepas, las macromoléculas y productos con actividad biológica.

Los microorganismos termofílicos están siendo utilizados cada vez más en procesos de

fermentación; con arqueas metanógenas se hace el tratamiento microbiano anaerobio

de desechos sólidos, líquidos o sustancias recalcitrantes. Actualmente varias enzimas,

entre ellas amilasas, isomerasas, proteasas y celulasas obtenidas de termofílicos, se

usan en procesos industriales. Asimismo, varias enzimas que se usan en ingeniería

genética se están comercializando, como las DNA polimerasas, Taq de Termus sp., las

Pfu de Pyrococcus furiosus, la Tbr de Thermus brockianus y Vent de Thermococcus

litorales usadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR); la transcriptasa

reversa Tht de Thermus thermophilus; la RNA polimerasa de Thermus sp.; y varias

enzimas de restricción de Thermus sp., Bacillus sp., y Sulfolobus sp.

Es importante reconocer la diferencia que existe entre un organismo termofílico y uno

termorresistente. Un microorganismo termofílico es aquel que requiere temperaturas

elevadas para su crecimiento individual y poblacional, mientras que un termorresistente

es aquel que soporta altas temperaturas. Los termorresistente pueden ser psicrofilicos o

mesofílicos incapaces de crecer a altas temperaturas. La termorresistencia suele estar

relacionada a la presencia de endosporas.

IV.- MATERIAL.





36

V. METODOLOGÍA:


microorganismos que puede contener un alimento de acuerdo a su temperatura de

acocción/almacenamiento, y clasificará a los cultivos axénicos que obtuvo en las

prácticas anteriores de acuerdo a este criterio. Posteriormente, deberá plantear la

metodología adecuada para realizar la siguiente actividad:

1. Determinar el efecto de utilizar diferentes temperaturas sobre el crecimiento del

microorganismo, utilizando experimentos independientes que se trabajen a las mismas

condiciones de concentración de medio de cultivo, así como porcentaje de inóculo





determinar el rango de temperatura en el que los microorganismos de sus

cultivos axénicos pueden ser o no viables.


emplean el control de la temperatura de cocción/incubación como posibles

agentes capaces de reducir o erradicar la contaminación de alimentos por los

microorganismos con los que cuenta en sus cultivos axénicos.

VII.- CONCLUSIONES:


características de los cultivos axénicos respecto al rango de temperaturas en los que

son capaces de crecer.




37


1. ¿Qué ventajas tiene realizar un proceso de fermentación para la obtención de un

metabolito de interés industrial a altas temperaturas?

2. En 1983 en la revista más prestigiada del ambiente científico, Nature (303: 423-

426), J. A. Baross y J.W. Deming publicaron un artículo titulado “Growth of “Black

smoker” bacteria at temperaturas of at least 250ºC”. Discute la posibilidad de vida

a estas temperaturas desde un punto de vista químico.

IX.- BIBLIOGRAFÍA





Microbiology

CRCV, Press,

Tercera Edición

38

PRÁCTICA No.6

Influencia del pH sobre el crecimiento microbiano.

39




PRÁCTICA No.6

Influencia del pH sobre el crecimiento microbiano.




microorganismos respecto al rango de

pH en el que son capaces de

sobrevivir y desarrollarse.



fundamento el control del pH de los

alimentos.


permitan observar el efecto del pH

sobre la viabilidad y crecimiento de los

microorganismos.

II.- OBJETIVO:

Observar el efecto del pH del medio de cultivo sobre el crecimiento y determinar el pH

de crecimiento óptimo de los microorganismos con los que se cuenta.


El pH de una solución representa a la concentración molar de iones hidrogeno [H+]

expresada como logaritmo negativo según la ecuación:

[ ]+−= HpH log

La escala de valores de pH va de 0 a 14. Una so1ución es neutra cuando tiene un valor

40

de pH de 7.0, acida con un pH menor a 7.0 y alcalina con un pH mayor de 7.0.

El crecimiento microbiano depende del valor de pH en el medio de cultivo. Todos los

microorganismos tienen un intervalo de crecimiento específico fuera del cual su

multiplicación se detiene y en ocasiones mueren.

El metabolismo fermentativo de azúcares de los microorganismos produce y acumula

ácidos orgánicos que disminuyen el pH del medio de cultivo, lo que puede detener el

crecimiento microbiano aun cuando el medio contenga suficientes nutrientes. Por otro

lado, los microorganismos pueden degradar proteínas, aminoácidos y otras sustancias

nitrogenadas liberando amonio que alcaliniza el medio, lo que afecta el desarrollo

microbiano. Estos efectos pueden ser minimizados adicionando reguladores o

amortiguadores de pH al medio.

Los microorganismos, de acuerdo con los pHs que requieren para su crecimiento se

pueden clasificar como acidofilicos, neutrofilicos o alcalofilicos. Se dice que los

acidofilicos y alcalofilicos son obligados cuando son incapaces de crecer o mueren en

un pH cercano a la neutralidad.

En la naturaleza existen ambientes con pHs que van desde 1 hasta 12 y a partir de

ellos se han podido aislar microorganismos. Asi, existen bacterias que requieren un pH

cercano a la neutralidad y que son incapaces de crecer a un pH menor de 5.5 o mayor

de 9. Otros microorganism os procarióticos son acidofilicos obligados, como la bacteria

Thiobacillus y las arqueas Sulfolobus y Thermoplasma requieren de un pH de 1 a 2

para crecer, o como Alcaligenes, que requiere un pH de 10 para desarrol1arse. La

mayoría de los hongos y levaduras requieren de medios ligeramente ácidos para su

crecimiento óptimo o esporulación.

En los microorganismos no adaptados a condiciones extremas de pH este puede

afectar la estructura de la membrana, pared celular y membrana externa, cambiar la

conformación de las enzimas inhibiendo su actividad o precipitándolas, afectar el

metabolismo central, el transporte de sustancias nutritivas o los mecanismos de

acoplamiento del ATP. Asimismo los microorganismos acidofilicos extremos obligados

pierden la estabilidad de su membrana y se destruyen cuando se transfieren a medios

con un pH neutro.

Existen varias pruebas bioquímicas útiles para la identificación de microorganismos

41

basadas en la capacidad que tienen algunos de ellos para fermentar ciertos substratos,

producir ácidos orgánicos y modificar el pH del cultivo.

La capacidad del pH acido para limitar el crecimiento microbiano es utilizada en la

industria alimenticia para conservar bebidas y alimentos. Thiobacillus que produce

H2S04 se utilizan en minería para liberar metales a partir de los minerales. Helicobacter

en el estómago es el responsable de las úlceras gástricas y posiblemente uno de los

factores que desencadena cáncer en esa localización.

IV.- MATERIAL.





V. METODOLOGÍA:


microorganismos que puede contener un alimento de acuerdo a su pH, y clasificará a

los cultivos axénicos que obtuvo en las prácticas anteriores de acuerdo a este criterio.

Posteriormente, deberá plantear la metodología adecuada para realizar la siguiente

actividad:

1. Determinar el efecto de utilizar diferentes pHs sobre el crecimiento del

microorganismo, utilizando experimentos independientes que se trabajen a las mismas

condiciones de concentración de medio de cultivo, así como porcentaje de inóculo.





determinar el rango de pH en el que los microorganismos de sus cultivos

axénicos pueden ser o no viables.

42


emplean el control del pH como posibles agentes capaces de reducir o erradicar

la contaminación de alimentos por los microorganismos con los que cuenta en

sus cultivos axénicos.

VII.- CONCLUSIONES:


características de los cultivos axénicos respecto al rango de pH en los que son capaces

de crecer.





1. De acuerdo con los resultados de la práctica, ¿en qué grupo clasificaría cada

una de las cepas estudiadas y por que?

2. Cómo demostraría que el pH de un medio de cultivo detuvo el crecimiento aún

en presencia de nutrientes?

3. Mencione 3 metabolitos microbianos que aumentan y 3 que disminuyen el pH del

medio de cultivo.

4. ¿Cómo podría formular un medio de cultivo de pH neutro que en forma visible

indique que se alcanza un pH ácido?

5. Mencione 3 indicadores químicos del pH.

6. ¿Qué son los reguladores de pH y qué efecto tienen en el crecimiento?

43

IX.- BIBLIOGRAFÍA





Microbiology

CRCV, Press,

Tercera Edición

44

Proyecto de Investigación

45




Proyecto de Investigación



Todos los conocimientos teóricos

aprendidos en el curso, las herramientas

desarrolladas durante la realización de las

prácticas anteriores

Desarrollo de un producto alimenticio que

incluya buenas prácticas de laboratorio y el

sistema de análisis de puntos críticos de

control, como factores que afectan la

calidad final del producto.

II.- OBJETIVO:

Que los estudiantes de séptimo semestre de la carrera de Ingeniería Bioquímica

adquieran la capacidad de desarrollar un proyecto de investigación aplicada enfocado

hacia la innovación y/o mejora de un producto alimenticio, aplicando los conocimientos

adquiridos en relación a la calidad microbiológica de los alimentos, así como la

aplicación de los controles de calidad (nutricional y sensorial) en materia prima y

producto terminado.

46

III. Metodología :

Esta actividad será muy guiada por el profesor, deberá hacerse hincapié en las

características de un proyecto de investigación, antes de iniciar el trabajo experimental,

será necesario presentar un protocolo de investigación para evaluar sus alcances y

objetivos. Las hipótesis que se establezcan en el proyecto, deberán ser el resultado de

un análisis minucioso del tema de estudio.

Manual de prácticas Microsanit

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