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INMUNOLOGA BSICA CURSADA 2012 La Inmunologa estudia un sistema sumamente interrelacionado y dinmico, pero la metodologa de estudio por temas, obliga a separar contenidos ntimamente relacionados que deben ser finalmente integrados. Es importante considerar esta caracterstica desde el primer da de clases para encarar su estudio intentando incorporar paulatinamente los temas y alcanzar la comprensin global. Nuestro objetivo es que puedan comprender el funcionamiento del Sistema Inmune y utilizarlo como herramienta de decisin en el diagnstico, profilaxis y solucin de problemas de la prctica profesional. En la cursada 2012 hemos decidido abordar los contenidos de Inmunologa Bsica a travs de diferentes metodologas de Trabajos Prcticos:

Durante las clases terico-prcticas se analizarn y resolvern preguntas y problemas en forma grupal. El objetivo de estas preguntas es utilizarlas como eje temtico, para que guen al alumno en el estudio de cada tema. Se espera que los alumnos sean capaces de contestar stas u otras preguntas similares despus de haber estudiado el tema. Algunas clases consistirn en la discusin de trabajos cientficos relacionados con los temas tratados durante el curso. Nuestro objetivo es que comprendan la metodologa de trabajo y de investigacin en Inmunologa y que a travs de esta discusin puedan integrar contenidos de la materia. Los trabajos prcticos de laboratorio sern realizados en forma directa por los alumnos y supervisados por los docentes. Los alumnos, formarn grupos de trabajo y presentarn un informe por cada trabajo prctico realizado en el laboratorio.

La presente gua de Inmunologa est destinada a facilitar el abordaje de los contenidos que se tratarn en las clases prcticas, por lo que es complementaria y de ninguna manera reemplaza a la bibliografa recomendada.

Esperamos que la informacin presentada en esta gua les sea til. Si tienen dudas o dificultades, acerquen sus inquietudes a los docentes participantes del curso y responsables de la redaccin de la presente gua.

La Sra. Viviana Chevaga, secretaria del rea, los orientar administrativamente en el horario de 13.30 a 19.30 en forma telefnica (4524-8450) o por mail a inmuno@fvet.uba.ar.

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Docentes del curso 2012

Dra. Med. Vet. Silvia L. Mundo Profesora Adjunta a cargo MS. Md. Vet. Adriana M. Fontanals J.T.P. Dra. Md. Vet. Ana M. Jar J.T.P. Dra. Lic. Silvia Colavecchia J.T.P. Md. Vet. Liliana Ramayo Ayudante de 1era. Vet. Lucas Goldman Ayudante de 1era. MS. Md. Vet. Federico Hoffman Ayudante de 1era. MS.Vet. Ana Jolly Ayudante de 1era. Vet. Ana Stempler Ayudante de 1era. Vet. Laura Bass Ayudante de 1era. Vet. Brbara Fernndez Ayudante de 1era. Med. Vet Liliana Gilardoni Ayudante de 1era. Alumna Mara Laura Fortuny Ayudante de 2da

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INDICE Sistema de evaluacin 4

Condiciones para promocionar 4

Condiciones para regularizar 4

Condiciones para quedar en condicin de asistencia cumplida 4

Bibliografa fundamental 5

Bliografa ampliatoria 5

Programa analtico 5

Conceptos bsicos de bioseguridad 8

Toma de muestras para la evaluacin del sistema inmune 12

Tcnicas de evaluacin de inmunidad innata 16

Complemento 23

Anticuerpos 25

Purificacin y fraccionamiento de anticuerpos 27

Protenas del plasma y suero 36

Electroforesis 37

Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 42

Introduccin a las tcnicas serolgicas 48

Diliciones 48

Conversin serolgica o seroconversin 50

Sensibilidad y especificidad 52

ELISA 53

RIA (radioinmunoensayo) 62

Inmunoblot 63

Inmunocromatografa 66

Inmunohistoqumica 67

Inmunofluorescencia 69

Citometra de Flujo 73

Tcnicas de interaccin secundaria: precipitacin y aglutinacin 79

Grupos sanguneos 90

Linfoproliferacin 94

Tcnica de seroneutralizacin 98

Inhibicin de la hemoaglutinacin 104

Tcnica de fijacin de complemento 106

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Tcnica de polarizacin fluorescente 109

Citotoxicidad 112

Tcnicas para la deteccin de anticuerpos maternales 117

Inmunoelectroforesis 120

Ejercicos y problemas de aplicacin 124

El cronograma de las clases se encuentra en el diarito y aparacern en cartelera web. Los das de laboratorio, consulte con su docente dnde y en qu horario debe concurrir. No olvide traer el guardapolvo.

REQUISITOS PARA CURSAR

REGULARES: Parasitologa Fisiologa Microbiologa APROBADAS: Qumica biolgica Histologa

SISTEMA DE EVALUACIN

Los alumnos sern evaluados a travs de: a) El desempeo en los trabajos prcticos. b) La aprobacin de los informes de laboratorio. c) Dos parciales obligatorios.

CONDICIONES PARA PROMOCIONAR Haber cumplido con el 75% de asistencia a los terico-prcticos. Aprobar todos los informes (de carcter grupal) correspondientes a los trabajos prcticos de

laboratorio. Aprobar los parciales con por lo menos el 80% de los contenidos de cada uno. Aprobar un coloquio integrador en fecha a convenir con los alumnos. CONDICIONES PARA REGULARIZAR Haber cumplido con el 75% de asistencia a los terico-prcticos Aprobar todos los informes (de carcter grupal) correspondientes a los trabajos prcticos de

laboratorio. Aprobar los parciales con por lo menos el 60% de los contenidos. CONDICIONES PARA QUEDAR EN CONDICIN DE ASISTENCIA CUMPLIDA Haber cumplido con el 75% de asistencia a los terico-prcticos. Aprobar todos los informes (de carcter grupal) correspondientes a los trabajos prcticos de

laboratorio. REQUISITOS PARA DAR EL FINAL

APROBADAS: Fisiologa. Microbiologa. Parasitologa.

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BIBLIOGRAFA FUNDAMENTAL

FAINBOIM, L. y GEFFNER, J. Introduccin a la Inmunologa Humana. 5ta Edic. 2005 editorial Mdica Panamericana.

TIZARD, I. Inmunologa Veterinaria. 8Va. Edic. 2009. Editorial Harcourt Grade de Espaa SA. 592PP.

Gua de Trabajos Prcticos. rea de Inmunologa. 2010

BIBLIOGRAFA AMPLIATORIA

ABBAS, A; LICHTMAN, A; PILLAI, S. Inmunologa Celular y Molecular, 6ta. Edic. 2008. Editorial Elsevier.

DAY M.J. Clinical Immunology of the Dog and Cat 2da. ed., Editorial Blackwell. 2008.

MURPHY K., TRAVERS P., WALPORT M. Inmunobiologa de Janeway, 7ma. ed., Editorial Mc Graw Hill. 2010.

REGUEIRO GONZALEZ J., LOPEZ LARREA C., GONZALEZ RODRIGUEZ S., MARTINEZ NAVES E. Inmunologa: Biologa y Patologa del Sistema Inmunitario, 4ta. ed., Editorial Panamericana. 2010

ROITT I., inmunologa. Fundamentos, 11va. ed., Editorial Panamericana. 2008.

PARSLOW T., STITES D. Inmunologa Bsica y Clnica, 10ma ed., Editorial Manual Moderno. 2005.

PROGRAMA ANALTICO

Unidad 1: Mecanismos de Defensa RGANOS Y TEJIDOS LINFOIDES rganos linfticos primarios y secundarios: Estructura. Diferencias en las especies domsticas: Bolsa de Fabricio. Ganglios linfticos en cerdos. Glndulas de Harder. Patrones de migracin celular: molculas asociadas. SISTEMAS INMUNES Barreras naturales: piel y mucosas. Mecanismos humorales: va alternativa del complemento; protenas de fase aguda; interferones. Mecanismos celulares: fagocitosis y lisis. Citotoxicidad natural. Importancia de la respuesta T gama-delta y LB1 en las especies domsticas y de produccin. SISTEMA INMUNE ESPECIFICO Propiedades: especificidad, adaptabilidad y memoria. Organizacin clonal. Molculas de superficie: concepto de receptor. Clulas que reconocen al antgeno en forma especfica: Linfocito B (LB), Linfocito T (LT). FILOGENIA DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA ONTOGENIA DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA EN LAS ESPECIES DOMESTICAS Y DE PRODUCCIN.

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Unidad 2: Inmunoqumica ANTGENOS Antigenicidad e Inmunogenicidad. Estructura fsico-qumica de los antgenos. Haptenos. Carriers. Concepto y tipos de determinantes antignicos. Tipos de Antgenos: propios (de rgano; de grupos sanguneos; de gnero H-Y) y extraos (de patgenos, de tumores, de transplantes). ANTICUERPOS Inmunoglobulinas (Igs) de membrana y secretadas. Estructura fsico-qumica: cadenas pesadas y livianas, dominios constantes y variables. Clases y subclases. Caractersticas de las Igs en las diferentes especies domsticas y de produccin: IgT en equinos, IgY en aves e Igs en camlidos. La Ig como antgeno: isotipo, alotipo e idiotipo. Funciones biolgicas de las diferentes clases de Igs. Distribucin en el organismo. RESULTADO DE LA UNION DEL ANTICUERPO CON EL AG. Neutralizacin. Opsonizacin. Activacin del Complemento. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). PASAJE DE IGS MATERNO FETAL. Incidencia de los diferentes tipos de placentacin en el pasaje de Igs. de la madre al feto en las especies domsticas. Composicin en Igs. del calostro y leche. Importancia de la ingestin de calostro. Tcnicas de determinacin de la ingestin de calostro. Unidad 3: Molculas de membranas relacionadas con el reconocimiento antignico MADURACION DE LOS LINFOCITOS B Generacin de diversidad de las Igs: Recombinacin somtica, hipermutacin, conversin gnica, diversidad N-Terminal. Mecanismos caractersticos en las diferentes especies. Ontogenia del linfocito B. Exclusin allica, exclusin isotpica. Splicing alternativo. MOLECULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD Molculas de histocompatibilidad clase I y clase II: Estructura. Localizacin. Funcin. Complejo mayor de histocompatibilidad: nomeclatura y herencia. Mapa gentico en las especies domsticas y de produccin. Molculas de histocompatibilidad no clsicas. RECEPTOR ANTIGENICO DEL LT Estructura, molculas asociadas (CD3, CD4, CD8) y otras molculas de adhesin. MADURACION DE LOS LINFOCITOS T Generacin de diversidad de los receptores T. Educacin tmica de los LT. MECANISMOS DE AUTOTOLERANCIA PROCESAMIENTO Y PRESENTACION ANTIGENICA Va endoctica y va biosinttica. Unidad 4: Respuesta Inmune COLABORACIN CELULAR Activacin de los LT, Interleuquinas. Influencia del antgeno y el microambiente en la cooperacin celular: Perfiles Th 1 y Th 2. Colaboracin T-B: Activacin de LB y produccin de Igs: Switch isotpico. Antgenos timo-dependientes y timo-independientes. Colaboracin T-T: Citotoxicidad ejercida por LT citotxicos. Colaboracin T-Macrfagos: Macrfagos activados. Memoria inmune.

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REGULACIN DE LA RESPUESTA INMUNE Regulacin intrnseca: Efecto de la desaparicin del Ag., Niveles de Igs: retroalimentacin. Regulacin por linfocitos T (Th 3). Regulacin extrnseca: neuroinmunoendocrinologa. Regulacin en sitios privilegiados: ojo, placenta, sistema nervioso central. CINTICA DE LA RESPUESTA INMUNE Respuesta inmune sistmica. Respuesta inmune en mucosas: caractersticas diferenciales en las especies domsticas. Unidad 5: Daos producidos por el Sistema inmune HIPERSENSIBILIDAD TIPO I Alergia. Shock anafilctico: rgano de choque en las diferentes especies. HIPERSENSIBILIDAD TIPO II Daos por anticuerpos en enfermedades autoinmunes y en reacciones alogeneicas. Anemia hemoltica en equinos y cerdos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO III Daos por complejos inmunes en enfermedades autoinmunes y en enfermedades infecciosas crnicas. Pimetra en caninos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO IV Bases celulares de la hipersensibilidad retardada. Granuloma tuberculoso. Dermatitis por pulgas en caninos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO V Anticuerpos anti-receptores. FENMENOS DE AUTOINMUNIDAD Concepto. Ejemplos de enfermedades autoinmunes especficas de rgano y sistmicas. INMUNODEFICIENCIAS Inmunodeficiencias primarias y secundarias. Virus inmunosupresores que afectan las diferentes especies. TRANSPLANTES Mecanismos de rechazo del injerto. RESPUESTA INMUNE A TUMORES Unidad 6: Respuesta Inmune a Patgenos RESPUESTA INMUNE A BACTERIAS, VIRUS, PARSITOS Y HONGOS Antgenos involucrados. Mapeo de epitopes. Ciclo biolgico del patgeno. Inmunidad innata. Inmunidad especfica. Mecanismos de evasin. Consecuencias desfavorables. Unidad 7: Inmunoprofilaxis INMUNOPROFILAXIS PASIVA Ventajas e inconvenientes de su uso. ELABORACIN DE SUEROS HIPERINMUNES Uso de aves en la elaboracin de sueros hiperinmunes. Produccin de anticuerpos por biotecnologa. INMUNOPROFILAXIS ACTIVA Tipos de vacunas. Ventajas e inconvenientes de su uso: Vacunas atenuadas. Vacunas inactivadas.

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Vacunas a subunidades. Vacunas a pptidos. Vacunas recombinantes (a vectores). Vacunas deleteadas. Vacunas a DNA desnudo. METODOLOGA DE PREPARACIN DE VACUNAS Proceso de produccin de inmungenos a escala industrial. Requisitos de bioseguridad. Controles durante las diferentes etapas de produccin. Mtodos de inactivacin. Mtodos de atenuacin. Uso de adyuvantes. Aprobacin de vacunas por organismos oficiales. Controles de inocuidad, esterilidad y potencia. ADMINISTRACIN DE VACUNAS Vas de inmunizacin. Esquemas de vacunacin en las diferentes especies animales. Vacunas mixtas. Fracasos de la vacunacin. Reacciones adversa a la vacunacin. Unidad 8: Tcnicas Inmunolgicas de Diagnstico TCNICAS DE IDENTIFICACIN DE IGS. Precipitacin salina. Cromatografa. Electroforesis. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). TCNICAS DE INTERACCIN (AG-AC) PRIMARIA Tcnicas inmunoenzimticas: ELISA. Inmunoblot. Inmunohistoqumica. Inmunofluorescencia. Citometra de flujo. Radioinmunoensayo. TCNICAS DE INTERACCIN (AG-AC) SECUNDARIA Inmunodifusin. Inmunoelectroforesis. Aglutinacin. Lisis por Complemento. TCNICAS DE INTERACCIN (AG-AC) TERCIARIA Inhibicin de la hemoaglutinacin. Seroneutralizacin. Seroproteccin. Intradermorreaccin. Fijacin de Complemento. TCNICAS CELULARES Fagocitosis. Linfoproliferacin. Intradermorreaccin. Citotoxicidad. APLICACIN DE LAS TCNICAS INMUNOLGICAS Evaluacin del sistema inmune en un individuo. Deteccin de la respuesta inmune frente a patgenos. Diagnstico de hipersensibilidades. Evaluacin del resultado de la inmunoprofilaxis. HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS MONOCLONALES Hibridomas: Produccin y seleccin. Anticuerpos monoclonales: Produccin. Aplicaciones. Conceptos Bsicos de Bioseguridad

Cuando en un ambiente se manipulan agentes infecciosos se producen una serie de riesgos a los que estn expuestas las personas, el medio ambiente e incluso toda la comunidad. Estos riesgos varan segn el agente, su patogenia y otros factores como las maniobras o procedimientos empleados. Las Normas de Bioseguridad pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulacin de material peligroso. Por ello, se efecta una evaluacin de los riesgos biolgicos para darles a las personas una contencin (instalaciones, equipo de proteccin y

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prcticas de trabajo) que reduzca la exposicin hasta lmites mnimos, de forma que estn expuestos al menor riesgo posible (aclarando que, el riesgo cero no existe). Clasificacin de agentes biolgicos

Los agentes biolgicos se clasifican en grupos segn su peligrosidad hacia el hombre: Grupo 1. Microorganismos que presentan poca probabilidad de causar enfermedad en el hombre. Ejemplos: Bacillus subtilis, Saccharomyces sp. Grupo 2. Aqullos que pueden causar una enfermedad en el hombre y pueden suponer un peligro para las personas expuestas, siendo poco probable que se propaguen a la poblacin. Generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos: Actinomyces sp, Bacteroides sp, Enterobacterias, Salmonella sp, Shigella sp, Candida sp, Cryptococcus neoformans. Grupo 3. Microorganismos que pueden causar enfermedades graves en el hombre y presentan un serio peligro para las personas expuestas, con riesgo de que se propaguen a la poblacin. Generalmente existe generalmente profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis y bovis, Brucella sp, Histoplasma capsulatum, Neisseria meningitidis, Coccidioides inmitis, Chlamydia trachomatis, Virus de la encefalomielitis equina. Grupo 4. Agentes que, causan enfermedades graves en el hombre, y suponen un serio peligro para otras personas expuestas, con muchas probabilidades de que se propague a la poblacin. Generalmente no se cuenta con profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos: Virus de Lassa, Machupo y Ebola. Niveles de contencin

El primer principio de Bioseguridad es la contencin. El trmino "contencin" se emplea para describir los mtodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. El propsito de la contencin es reducir al mnimo la exposicin del personal de los laboratorios, de otras personas y del entorno, a agentes potencialmente peligrosos. Se suelen describir cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, que consisten en la combinacin, en menor o mayor grado, de tres elementos de seguridad biolgica: la tcnica microbiolgica, el equipo de seguridad y el diseo de la instalacin. Cada combinacin est especficamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las vas de transmisin de los agentes infecciosos y la funcin o actividad del laboratorio. a) Nivel de contencin 1: Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biolgicos del grupo 1. Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prcticas de universidades o centros docentes donde se emplean cepas no patgenas (E. coli K12, B. Subtilis, Naegleria sp, Saccharomyces cerevisiae, etc.). Ejemplos tpicos son todos los microorganismos que se utilizan en la industria de la alimentacin para la elaboracin de quesos, cerveza, embutidos, etc. b) Nivel de contencin 2: Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de originar patologas infecciosas humanas de gravedad moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado (tcnicos de laboratorio, especialistas en Microbiologa) y son los que con ms frecuencia se estudian en el Laboratorio de Diagnstico Veterinario (Ascaris sp, Estafilococos, Salmonella, Toxoplasma, Clostridium sp, etc.). c) Nivel de contencin 3:

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Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biolgicos del grupo 3, microorganismos que cursan con patologas graves, de difcil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas y son capaces de producir la muerte. El mayor y ms frecuente peligro que entraan stos es la infeccin adquirida a travs de aerosoles y fluidos biolgicos. Por ello, las principales medidas a tomar en este caso son la correcta manipulacin y la utilizacin de cabinas de seguridad. En los Laboratorios de Diagnstico Veterinario debe evitarse la contaminacin ambiental y la infeccin del operador con patgenos como M. tuberculosis, Brucella sp, Virus de la encefalomielitis equina, etc. Estos microorganismos slo pueden ser procesados por personal calificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contencin 3, es decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculacin de aire, con gradiente de presin, cabinas de seguridad, etc. d) Nivel de contencin 4: Es el nivel requerido cuando se trabaja con un agente patgeno extico o no, que produce una enfermedad infectocontagiosa, de alta mortalidad y para la cual no existe tratamiento o el tratamiento existente es poco fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Agentes del grupo 4 animales de experimentacin infectados con ellos: Ejemplos de este nivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo, virus Ebola, etc. Adems, deben incluirse en este nivel de contencin los microorganismos propios del grupo 3 que adquieran propiedades patgenas que los eleven al grupo 4. Un ejemplo sera Mycobacterium bovis multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso teraputico. En la prctica veterinaria diaria, el profesional se encuentra expuesto a agentes patgenos pertenecientes a los grupos 2, 3 y eventualmente al grupo 4, que son potencialmente peligrosos tanto para l mismo como para sus pacientes y otras personas. Por lo tanto, deben tomarse todas las precauciones y establecer y respetar medidas de contencin adecuadas para evitar el riesgo de la diseminacin a la comunidad. El inicio de algunas enfermedades profesionales es lento y muchas veces enmascarado por otros trastornos fsicos. Por esto, el profesional veterinario tiene que tener una clara conciencia del riesgo de su profesin y conocer en cada una de sus actividades los riesgos a los cuales puede verse expuesto. Slo si se conocen las posibles enfermedades a las que se expone el veterinario, su forma de transmisin, produccin y exposicin, se podrn realizar las acciones correspondientes a fin de prevenirlas. Bioseguridad en el consultorio veterinario. Durante la revisacin clnica se contaminan las manos del profesional, por lo tanto deben lavarse entre la atencin de pacientes. Asimismo, debe desinfectarse la camilla y todos los elementos empleados durante la consulta. Es comn la toma de muestras (sangre, orina, materia fecal, biopsias, etc.) para efectuar anlisis complementarios que ayuden al diagnstico o al seguimiento de un caso clnico. Estas muestras, en general, son analizadas por laboratorios de diagnstico externos a la clnica, por lo tanto debe evitarse la diseminacin de patgenos durante su traslado: Los tubos de sangre deben estar correctamente tapados e identificados. Nunca se debe

enviar la sangre dentro de la jeringa de extraccin. Si se toman muestras de orina o muestras de rganos para diagnstico histopatolgico

(conservados en formol al 10%), los frascos deben estar cerrados hermticamente. Las muestras de rganos remitidas en fro para diagnstico microbiolgico deben colocarse

en bolsas plsticas cerradas. Nunca se deben colocar muestras de diferentes rganos en la misma bolsa.

Todas las muestras deben remitirse dentro de cajas, preferiblemente de telgopor (con refrigerantes, cuando se requiera) y adecuadamente precintadas para evitar su apertura accidental.

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Las muestras deben ir acompaadas de un protocolo de remisin de muestras que incluya el tipo de muestra que se enva, el anlisis solicitado y una resea clnica del caso. Esta resea debe contener la especie animal de la que provienen las muestras, edad, sexo, sintomatologa observada, hallazgos de necropsia y el diagnstico presuntivo; de manera que el destinatario est advertido de los riesgos potenciales antes de tomar contacto con la muestra.

Residuos patognicos:

Son considerados residuos patognicos todos aquellos desechos o elementos materiales en estado slido, semislido, lquido o gaseoso que presumiblemente presenten o puedan presentar caractersticas de infecciosidad, toxicidad o actividad biolgica que puedan afectar directa o indirectamente a los seres vivos o causar contaminacin del suelo, del agua o de la atmsfera, que sean generados en la atencin de la salud humana o animal por el diagnstico, tratamiento, inmunizacin o provisin de servicios, as como tambin en la investigacin o produccin comercial de elementos biolgicos o txicos. (Ley 154 de la Ciudad Autnoma de Buenos Aires, 18 de febrero de 1999). Residuos patognicos son, por ejemplo: Los provenientes de cultivos de laboratorio, restos de sangre y sus derivados. Restos orgnicos provenientes del quirfano, de servicios de hemodilisis, hemoterapia,

anatoma patolgica, morgue. Restos, carcasas y excrementos de animales de experimentacin biomdica. Algodones, gasas, vendas, jeringas, objetos cortantes o punzantes, materiales descartables

y otros elementos que hayan estado en contacto con agentes patognicos y que no se esterilicen (Nivel de bioseguridad 3).

Todos los residuos, cualesquiera sean sus caractersticas, que se generen en reas de alto riesgo infectocontagioso (Niveles de bioseguridad 3 y 4).

Restos de animales provenientes de clnicas veterinarias, centros de investigacin y acadmicos.

Frascos de medicamentos y vacunas vacos. Los residuos patognicos deben tratarse de manera especial hasta su destino final. Esta actividad est reglamentada en la ley N 154 de la Ciudad Autnoma de Buenos Aires. Todos los residuos patognicos deben colocarse en bolsas rojas de ms de 120 micrones de espesor. Estas bolsas se colocan en cajas de cartn o en recipientes plsticos debidamente sellados e identificados. El tratamiento de estos residuos es llevado a cabo por empresas especializadas que cuentan con la infraestructura necesaria para esterilizarlos sin riesgo de eliminar patgenos al medio ambiente. En general los residuos patolgicos son incinerados en hornos a temperaturas mayores a los 1200C que dejan como residuo vapor de agua y cenizas inocuas (hornos pirolticos). Bioseguridad en la produccin agropecuaria Son varias las zoonosis que el profesional puede adquirir durante prcticas rutinarias en la produccin agropecuaria, por lo tanto tambin deben tomarse precauciones. Usar mameluco descartable o de algodn resistente al lavado intenso y botas de goma. Revisar el estado de la manga, andenes, cepos, puertas laterales, etc. Usar guantes para realizar tacto rectal o necropsias. Comprobar el buen funcionamiento de las jeringas metlicas, verificar que no tengan

prdidas cuando se inyecta. Desinfectarlas y lavarlas muy bien luego del uso. No reutilizar las jeringas descartables. Luego del trabajo en la manga, desinfectar las botas y colocar la ropa en una bolsa plstica

y luego lavarla, separada de otras, en agua a 90C. Enterrar o incinerar los cadveres de animales sospechosos de haber muerto por

enfermedades infecciosas graves o zoonticas. La prctica depender de la enfermedad de la que se sospeche.

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Remitir las muestras al laboratorio siguiendo las indicaciones descriptas anteriormente. Bioseguridad en el laboratorio de diagnstico El laboratorio de diagnstico recibe muestras que deben ser consideradas como potencialmente peligrosas y deben tomarse todos los recaudos necesarios para evitar el contagio y la diseminacin de los agentes infecciosos. No comer, beber o fumar en el laboratorio. Debe usarse guardapolvo u otra indumentaria diferente a la ropa de calle. Utilizar guantes para manipular las muestras. Nunca pipetear con la boca, usar pipetas automticas, propipetas o peras de goma. Luego de trabajar, desinfectar las mesadas y todos los elementos utilizados. Luego de procesadas, tratar las muestras como residuos patognicos. Rotular todos los frascos utilizados en el laboratorio indicando su contenido, la fecha de

apertura o preparacin, la fecha de vencimiento y la peligrosidad de la solucin o sustancia qumica (irritante, carcinognica, inocua, etc.).

Toma de muestras para la evaluacin del Sistema Inmune La toma de muestras es el primer paso antes de indicar cualquier prueba de laboratorio; sin ella no hay sustrato sobre el cual comenzar a trabajar, por lo cual es el primer tema que se trata.

Se entiende la importancia de detenerse en algunos puntos sobre ellas si se piensa qu pasara si se cometen errores durante su recoleccin: el estudio de muestras inapropiadas o mal conservadas puede llevar a resultados falsos que invaliden la prueba.

Por lo tanto, se nombran a continuacin algunos conceptos a tener en cuenta en la toma de muestras, como primer paso, antes de empezar a trabajar.

Se hace hincapi en las muestras de sangre y suero ya que, la evaluacin de la respuesta inmune sistmica se realiza a partir de sangre perifrica, y la obtencin de suero a partir de sangre es frecuente en inmunologa (por ejemplo, para buscar anticuerpos). Las pruebas sobre estas muestras, en laboratorios de inmunologa, se realiza con dos objetivos principales: 1. En el caso del diagnstico de enfermedades infecciosas: - Identificar y tipificar antgenos en una muestra: por ejemplo, Parvovirus canino o

Coronavirus bovino en materia fecal. En estos casos se utilizan anticuerpos especficos contra el patgeno o contra subtipos o cepas del mismo.

- Identificar la produccin de anticuerpos especficos contra un determinado patgeno, por

ejemplo: anticuerpos antiBrucella abortus, anticuerpos antiVirus de la Fiebre Aftosa, etc., obteniendo como resultado:

presencia o ausencia de anticuerpos, si la tcnica es cualitativa; el ttulo de estos anticuerpos, si la tcnica es semicuantitativa; los miligramos de anticuerpos especficos, si la tcnica es cuantitativa.

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2. En el caso de la evaluacin del sistema inmune (SI): - Determinar los niveles de inmunoglobulinas en general o de alguna clase de

inmunoglobulina en particular, por ejemplo, cuando queremos saber si un animal tiene niveles normales de IgG en suero.

- Determinar la relacin entre las clulas pertenecientes al sistema inmune; por ejemplo, relacin CD4/CD8.

- Evaluar la funcionalidad de las clulas del sistema inmune, midiendo su proliferacin o la produccin de citoquinas.

Conocer la tcnica que se va a usar permitir: *Elegir la tcnica ms adecuada, segn el objetivo del inmunodiagnstico. *Tomar la muestra correcta. *Evaluar los resultados de forma de cumplir los objetivos planteados. Es por eso que, consecuente con la toma de muestras se describirn las tcnicas, ya que es necesario conocerlas para saber qu muestra tomar y cmo prepararla. Toma de muestras de sangre:

La toma de muestras de sangre es una de las prcticas ms habituales en la clnica diaria. Se realiza en razn de mltiples objetivos, entre los cuales tenemos desde una prueba bioqumica hasta un examen de funcionalidad celular. De acuerdo con estos objetivos, vara la manipulacin y preparacin de las muestras. Es por ello que es importante conocer algunos conceptos bsicos para que la maniobra realizada resulte en datos que nos puedan servir de base para formular un diagnstico exacto.

A continuacin se enumeran algunos consejos particularmente tiles: - Extraer la cantidad mnima necesaria para las pruebas. Esto es crtico cuando se deben

hacer sangras sucesivas a pequeos animales. - Consultar con el laboratorio que procesar la muestra. Algunas de las pruebas realizadas

en los laboratorios de Inmunologa clnica deben tener una notificacin previa (como la prueba de estimulacin de linfocitos) y requieren del envo de una muestra control junto con la muestra del paciente. Cuando la muestra debe ser extrada con anticoagulante, previo a la extraccin debe ser consultado el laboratorista, quien indicar el ms conveniente para las pruebas que deba realizar. Los ms usados son los quelantes del Ca++ como el citrato de Na o la solucin de Alsever que tiene glucosa para proteger a los eritrocitos y citrato de Na como anticoagulante.

- Trabajar cuidadosamente para obtener la muestra en las condiciones ms aspticas posibles. Siempre es recomendable usar jeringas y agujas descartables o esterilizadas por calor seco.

- Evitar la hemlisis. La presencia de hemoglobina puede afectar algunos resultados. El uso de elementos sucios o mojados (excepto con anticoagulantes), el manipuleo brusco y la formacin de espuma cuando trasvasamos la muestra de la jeringa al tubo de ensayos pueden producir hemlisis. La susceptibilidad a sta, segn las especies y en orden creciente es: equinos, bovinos, ovinos, aves, felinos y caninos.

- Tener en cuenta que lo ptimo es obtener la muestra en el mismo laboratorio para evitar el deterioro que sufre durante el envo; esto es de particular importancia en los estudios que impliquen evaluacin de clulas o de los factores del complemento.

- Las pruebas que requieren clulas viables hacen necesario que la sangre se transporte en hielo hasta el laboratorio en pocas horas. Si esto no es posible, se debe enviar la muestra acondicionada del modo ms conveniente para cada caso y lo ms rpidamente posible.

- Rotular las muestras de forma inequvoca y acompaar las muestras con el correspondiente protocolo que contenga la mayor cantidad de informacin posible. Es comn observar que los profesionales remitan muestras en las cuales slo se detalla, por ejemplo, el nombre de la mascota en tratamiento. Es importante aclarar no slo las pruebas que se solicitan al laboratorio, sino tambin adjuntar fecha, especie, sexo, diagnstico

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presuntivo y una breve resea del caso en cuestin, ya que esto ser de suma utilidad a la hora de interpretar los resultados por parte del personal del laboratorio. (Se adjunta como ejemplo el protocolo de envo de muestras utilizado en el servicio que brinda el rea de Inmunologa).

Extendidos de Sangre: Los extendidos de sangre conviene hacerlos inmediatamente despus de extrada la muestra, junto al animal. Para esto se utilizan las ltimas gotas de sangre que quedan en la aguja. Preparados correctamente, estos extendidos son estables an si no estn fijados. Pueden teirse hasta varios das despus si se conservan secos y protegidos de la humedad. Envueltos en papeles limpios y colocados en un recipiente hermtico, pueden remitirse por correo. El mtodo de fijacin puede variar segn la tincin, pero en general se pueden fijar con calor o con distintos alcoholes. Los extendidos fijados son de estabilidad casi indefinida. Extraccin de Suero: Para extraer el suero de la sangre total obtenida, se la deja coagular. Una vez formado el cogulo, se lo desprende del vidrio con la ayuda de una aguja o varilla. Para obtener la mayor cantidad posible de suero, se coloca el tubo en una estufa a 37oC durante 30 minutos a 1 hora y luego, para obtener la mayor retraccin del cogulo, se lo deja en heladera (4oC) durante una noche. A partir de aqu, se puede centrifugar el tubo (a 3000 r.p.m. durante 30 minutos) o extraer directamente el suero (sobrenadante) con una pipeta. En ambos casos debe operarse cuidadosamente tratando de evitar tocar el cogulo para no producir hemlisis. El suero puede mantenerse a 4oC durante 48-72 horas. Si hay riesgo de contaminacin, conviene agregarle una pizca de azida sdica (este conservante puede ser txico por lo que es conveniente consultar al profesional del laboratorio antes de hacerlo). Si no se va a usar dentro de ese lapso, el suero debe congelarse a temperaturas inferiores a -20oC (lo ptimo es a -70oC). Si bien a estas temperaturas prcticamente no hay degradacin proteica, s la hay durante cada ciclo de congelacin descongelacin. Para los exmenes serolgicos de diagnstico especfico no tiene mayor importancia, pero para exmenes electroforticos conviene evitar el congelamiento si es posible Es conveniente aclarar en el protocolo si la muestra ha sido congelada o mantenida a 4oC y cualquier otra observacin que se considere necesario. Tambin se puede enviar la sangre entera, siempre que no se tarde ms de unas pocas horas. La sangre entera se conserva refrigerada, nunca congelada, pero si se prevn demoras entre la extraccin y la llegada al laboratorio, lo mejor es enviar el suero ya separado.

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Ej. : PROTOCOLO DE ENVO DE MUESTRAS

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

AREA INMUNOLOGA SERVICIO DE DIAGNSTICO INMUNOLGICO

N DE PROTOCOLO Fecha de recepcin: / / Examen solicitado:............................................................................................................ Muestra remitida:............................................................................................................... Observaciones de la muestra:........................................................................................... DATOS DEL PACIENTE

Especie: C F Raza:................................................................................................................................. Edad:................................................................................................................................. Sexo: M H DATOS DEL PROPIETARIO

Apellido y Nombre:............................................................................................................ Telfono:............................................................................................................................ DATOS DEL PROFESIONAL

Apellido y Nombre:............................................................................................................ Telfono:............................................................................................................................ Pertenece al Hospital Canepa: SI NO N de Historia Clnica:............................. DIAGNOSTICO PRESUNTIVO:........................................................................................ ANALISIS COMPLEMENTARIOS REALIZADOS:.......................................................... MEDICACIN RECIBIDA:...........................................................................................

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Tcnicas de evaluacin de inmunidad innata

La respuesta inmune innata representa la primera lnea de defensa del husped a la infeccin. Una de sus caractersticas primordiales es la capacidad de responder a patgenos que no ha visto previamente. Esta capacidad inherente del sistema innato se debe a su habilidad de reconocer estructuras muy conservadas y compartidas por diversos patgenos. Dichas estructuras son conocidas como patrones moleculares asociados a patgenos (PAMPs, acrnimo proveniente del nombre en ingles: pathogen associated molecular patterns) entre los que podemos ejemplificar a componentes de la pared bacteriana como lipopolisacridos (LPS), peptidoglicanos y cido lipoteicoico entre otras estructuras. Estas molculas pueden ser vistas como firmas moleculares de los microorganismos invasores.

Si bien las bacterias de distintas cepas presentan algunas diferencias estructurales, se describen patrones conservados. Por ejemplo, el lpido A que forma parte del LPS de las bacterias Gram negativas es siempre constante y es el responsable de los efectos proinflamatorios, mientras que el antgeno O es variable entre las distintas especies y no es reconocido por el sistema inmune inespecfico. De esta forma, el sistema inmune innato puede responder a muchas infecciones slo con un repertorio limitado de receptores. El reconocimiento de los PAMPs est mediado por estructuras tambin muy conservadas en la evolucin y que son conocidas como receptores para el reconocimiento de patrones (PRRs, acrnimo proveniente del nombre en ingles: pattern recognition receptors). Entre los PRRs se describen varias familias, entre ellas, los receptores de tipo Toll (TLR) son capaces de reconocer distintos PAMPs. Al menos diez miembros de la familia de TLR se identificaron en mamferos y cada miembro es capaz de reconocer distintos PAMPs. Por ejemplo, el TLR 2 reconoce peptidoglicano y cido lipoteicoico del S. aureus. El TLR 4 reconoce LPS de bacterias gram negativas incluyendo a E. coli. Fagocitosis Los mecanismos que tienen las clulas para incorporar en su interior fluidos, solutos y partculas desde el medio externo son: pinocitosis, endocitosis mediada por receptores especficos y fagocitosis. Mediante el proceso de pinocitosis ingresan a las clulas fluidos y solutos. Por medio de la endocitosis mediada por receptores especficos, entran a la clula macromolculas, virus y otras partculas de pequeo tamao. Ambos mecanismos son independientes de la polimerizacin de la actina. En cambio, la fagocitosis, que es la ingestin de partculas de mayor tamao, ocurre por mecanismos dependientes de la actina. Las clulas ms eficientes para fagocitar partculas son los monocitos, macrfagos y neutrfilos a los que se los denomina fagocitos profesionales. La fagocitosis fue descripta por Metchnikoff en 1882 y es uno de los mecanismos asociados al sistema inmune que aparece ms tempranamente en la escala filogentica. Se conoce como fagocitosis al proceso por el cual una partcula es ingerida por una clula. Las partculas pueden ser bacterias, parsitos, clulas muertas y partculas inertes como el carbn, etc. La partcula puede ser degradada o no luego de la fagocitosis dependiendo de la naturaleza de la misma. No todos los microorganismos son fagocitados; muchos de ellos tratan de evadir el reconocimiento que es la primera etapa de la fagocitosis. Simultneamente con esta evasin, el sistema inmune de los vertebrados ha evolucionado para contrarrestarlo. Se conocen factores sricos denominados opsoninas que favorecen el reconocimiento e ingestin de microorganismos. Las principales opsoninas son los anticuerpos (IgG e IgM), los factores del complemento (C3b, C3bi, etc.) y las protenas de fase aguda. Entre las protenas de fase aguda se encuentran la protena C reactiva, las protenas de unin al lipopolisacrido (LBP) y protenas de alto peso molecular llamadas fibronectinas. El LBP se une al LPS bacteriano y aumenta la unin de stos a la molcula de CD14 presente en la membrana de las clulas fagocticas. La

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fibronectina puede unirse a algunas bacterias como el Staphylococcus aureus y actuar como puente entre la bacteria y el polimorfonuclear (PMN). El reconocimiento del microorganismo est mediado por diferentes receptores de membrana del fagocito pertenecientes a los PRRs o aquellos que reconocen a las opsoninas. Estos receptores pueden estar involucrados tanto en la adherencia como en la activacin del proceso de fagocitosis. Algunos de ellos son, por ejemplo, el receptor para el fragmento cristalizable constante de la inmunoglobulina G (FcR), el receptor para la protena C3b del complemento (CR1)), o para la protena C3 (CR3 o CD11b/CD18), y los receptores de patrones (PRRs) como el receptor de manosa, y el receptor scavenger o carroero. Se ha observado que la cantidad de anticuerpos IgG necesarios para inducir la ingestin de un microorganismo se reduce alrededor de 100 veces si ste adems est recubierto por C3b. Estos receptores actan cooperativamente para estimular vas de sealizacin, no slo para iniciar la polimerizacin de la actina sino tambin para activar la NADPH-oxidasa para la produccin de O2. Este ltimo es uno de los mecanismos citotxicos que entran en juego luego de la fagocitosis. Clulas efectoras de la fagocitosis Los polimorfonucleares se originan en la mdula sea (MO) y son continuamente enviados a la circulacin. Viven pocos das y tan pronto como los microorganismos invaden los tejidos dejan el torrente circulatorio, se adhieren al endotelio celular activado y se mueven a travs de la barrera endotelial hacia el sitio de la lesin. Son considerados como la primera barrera de defensa frente a los microorganismos, ya que son los primeros en llegar al sitio de invasin atrados por los factores quimiotcticos que se generan en el foco inflamatorio. Los factores quimiotcticos son principalmente componentes bacterianos, productos de degradacin de las bacterias, mediadores de la inflamacin y restos de tejidos alterados por la invasin. Los monocitos se originan tambin en MO y pasan a la circulacin, desde donde se extravasan a los tejidos y se diferencian en los distintos rganos, tomando caractersticas propias como es el caso de las clulas de Kupffer en el hgado, los macrfagos alveolares en el pulmn y los histiocitos en el tejido conectivo. La transformacin de monocito a macrfago tisular involucra una serie de cambios morfolgicos y metablicos en la clula, como son el aumento del tamao celular, la modificacin en la calidad y cantidad de enzimas lisosomales, etc. Activacin del polimorfonuclear / macrfago Los PMN responden a una gran variedad de factores quimiotcticos, incluyendo los N-formilpptidos, factores derivados de la activacin del complemento como el C5a, los leucotrienos B4 (LTB4), la interleuquina 8 y el factor activador de plaquetas (PAF). Algunos de los receptores de los factores quimiotcticos han sido identificados como miembros de la superfamilia de los receptores unidos a la GTPasa (protenas G), cuya caracterstica estructural es que poseen 7 dominios transmembrana. Estos receptores existen en estados interconvertibles de alta y baja afinidad a consecuencia de que desarrollan un ciclo de intercambio del nucletido guanina e hidrlisis de GTP durante el cual estas protenas sufren varios cambios conformacionales. Estos estados de alta o baja afinidad dependen del microambiente y los niveles de factores quimiotcticos. Las protenas G funcionan como intermediarios entre los receptores de superficie celular y las enzimas efectoras responsables de la generacin de segundos mensajeros: AMPc inositoltrifosfato (IP3), Ca2+, diacilglicerol (DAG), cido fosfatdico (PA), cido araquidnico (AA). Estos segundos mensajeros son generados directa o indirectamente como consecuencia de la activacin de las fosfolipasas A2, C y D. La activacin de los segundos mensajeros permite la remodelacin de la membrana citoplasmtica, el aumento del metabolismo de los fosfolpidos, la polimerizacin de la actina y el estallido respiratorio. Los eventos tempranos de activacin estn interrelacionados y son fundamentalmente cuatro:

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1- fosforilacin en tirosina de protenas de membrana y citoplasmticas 2- hidrlisis del fosfolpido inositol de membrana 3- incremento del Ca2+ citoplasmtico 4- incremento de la actividad de la proteinquinasa C (PKC)

Los neutrfilos contienen una gran variedad de quinasas de serina/treonina y de tirosinas. Estas enzimas son blanco especfico de los segundos mensajeros. El entrecruzamiento de FcR induce la activacin de diversas familias de quinasas y de tirosinas. Macrfagos y PMN defectivos para estas quinasas exhiben una considerable disminucin de la fagocitosis y produccin de O2. Mecanismo de fagocitosis La interaccin receptor-ligando entre el fagocito y la partcula a ingerir activa la maquinaria de la fase de ingestin para lo cual es necesario la modificacin de las protenas involucradas en el remodelamiento de la membrana y el citoesqueleto: actina, miosina y protenas de unin a la actina. Los microfilamentos de actina en la porcin de citoplasma que subyace al sitio de unin comienzan a polimerizarse. Esta polimerizacin lleva a que la membrana envuelva la partcula, formndose seudpodos (extensiones de la membrana en forma de dedos). Estos rodean a la partcula y finalmente se fusionan formando la vescula fagoctica o fagosoma primario. Mientras esto ocurre, los grnulos citoplasmticos se funden con la membrana del fagosoma y se produce un fagolisosoma. En el interior del fagolisosoma, la partcula ingerida queda expuesta a sistemas microbicidas que pueden clasificarse como oxgeno independientes y oxgeno dependientes.

Molculas efectoras independientes del oxgeno Estas sustancias estn localizadas en los lisosomas o grnulos citoplasmticos, se liberan dentro de los fagolisosomas y no requieren la produccin de oxidantes para ser activas. Pueden actuar tanto intra como extracelularmente en el caso de que la partcula sea muy grande para ser ingerida generando lesin en el tejido subyacente y efecto conocido como fagocitosis frustrada. Estos agentes incluyen proteasas y enzimas hidrolticas como fosfolipasas, glicosidasas y lisozima; la fagocitina y las leucinas que actan sobre las membranas bacterianas; la lactoferrina fija el hierro privando a las bacterias de este elemento indispensable para su crecimiento y la lisozima, que cliva los mucopptidos de la pared celular bacteriana.

Molculas efectoras dependientes del oxgeno Durante el proceso de fagocitosis las clulas pueden incrementar en 50 veces la cantidad de oxgeno consumido y metabolizar grandes cantidades de glucosa. Debido al gran consumo de oxgeno, este fenmeno se denomina estallido respiratorio. El consumo de oxgeno es utilizado para la produccin de metabolitos txicos como anin superxido, perxido de hidrgeno, radicales hidroxilo, oxgeno singulete, hipocloritos y cloraminas. Se ha confirmado experimentalmente la relacin entre la citoxicidad de los macrfagos y la produccin aumentada de los reactivos del nitrgeno e intermediarios del oxgeno. En los sobrenadantes de cultivo de macrfagos activados por citoquinas se encuentran niveles elevados de nitritos inorgnicos (NO2-) y de anin superxido (O2-), ambos asociados con la actividad antimicrobiana. Las vas oxidativas productoras de estos dos metabolitos son diferentes y no comparten precursores comunes. El siguiente esquema muestra las vas de produccin de molculas efectoras, sealando algunos de los estmulos necesarios para su activacin, a saber: interfern gamma (IFN), lipopolisacrido de E. coli (LPS) y forbomiristil acetato (PMA).

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L-arginina oxgeno

xido ntrico anin superxido (NO) (O2)

nitrito perxido de hidrgeno (NO2-) (H2O2) nitrato radicales hidroxilo (NO3-) (OH)

Existen mecanismos para incrementar la capacidad microbicida del H2O2, Uno de ellos es la accin de la mieloperoxidasa (MPO), que cataliza la oxidacin y halogenacin de diferentes estructuras presentes en los microorganismos. El xido ntrico (NO) posee una vida media de pocos segundos, interacta con una serie de molculas dando como resultado citotoxicidad. En presencia de oxgeno y agua, el NO genera otros reactivos intermedios del nitrgeno y por ltimo se descompone para formar NO2- y NO3-. Los niveles de formacin de los reactivos del oxgeno y produccin de NO estn relacionados con el grado de susceptibilidad a las infecciones. A modo de ejemplo, podemos citar la Enfermedad Granulomatosa Crnica que se presenta en individuos genticamente deficientes en la enzima NADPH oxidasa. Mtodos de evaluacin de las fases de la fagocitosis a) Quimiotaxis: La quimiotaxis es el movimiento de los PMN a travs de un gradiente de concentracin de sustancias (como la formil-metionina) que producen migracin dirigida. Los factores quimiotcticos provienen principalmente de componentes bacterianos, de la degranulacin de los mastocitos durante el proceso inflamatorio y de la activacin del complemento (el C5a est considerado como uno de los ms potentes factores quimiotcticos). Las pruebas de quimiotaxis se utilizan, en determinados pacientes sospechados de padecer una inmunodeficiencia, para evaluar la capacidad de sus clulas principalmente neutrfilos frente a factores comprobadamente inductores de migracin Tcnica de migracin celular bajo capa de agarosa: Consiste en preparar un medio soporte de agarosa sobre un portaobjeto en el cual se siembran las clulas en posicin central, ubicando frente a las mismas la sustancia quimiotctica y una sustancia control. Durante la incubacin las clulas migran. Luego se fijan con metanol, se desprende la capa de agarosa y se tien las clulas. La migracin de los PMN se evala microscpicamente comparando la distancia recorrida en direccin al factor quimiotctico (dirigida) y la migracin espontnea de las clulas (al azar). Los valores normales deben determinarse para cada especie y en el laboratorio de referencia. b) Quimiotaxis y adherencia

Tcnica de migracin y adherencia a travs de una membrana: para ello se utiliza la cmara de Boyden, que posee una membrana microporosa con poros de 3 micrones de dimetro. Se colocan las clulas en un compartimento y los factores quimiotcticos en otro y se

NADPH oxidasa

Oxido ntrico sintasa (INOS)

Estimulacin por fagocitosis o

tratamiento con PMA

Otros reactivos intermediarios y molculas efectoras

Activacin por INF y LPS

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lleva a incubar. La capacidad de las clulas para migrar hacia el estmulo se evala tiendo las que quedan retenidas en la membrana. Los resultados se comparan con los obtenidos con clulas del mismo animal (sin estmulo) y con PMN de un individuo normal utilizado como control de valor de animal sano. b) Activacin: La activacin de las clulas fagocticas se sealiza a travs de eventos de fosforilacin y desfosforilacin de las protenas celulares involucradas en la trasmisin de la seal de activacin. La posibilidad de identificar protenas fosforiladas con el uso de anticuerpos monoclonales que detectan, por ej., tirosinas fosforiladas, permite identificar el primer paso de activacin de las clulas fagocticas. Para esta evaluacin es necesario recurrir a las tcnicas de PAGE e Inmunoblot a partir de las clulas activadas (ver captulos correspondientes en la presente gua). La identificacin de la migracin de protenas del citoplasma al ncleo celular para regular la trascripcin de molculas relacionadas con la inflamacin y fagocitosis constituye tambin una manera de identificar los primeros eventos de activacin celular. Como ejemplos de estos sistemas podemos incluir la activacin del factor NF-kB que involucra la degradacin del factor inhibidor de kB citoplasmtico (protena IkB) y el incremento de sus componentes p50 y p65 en el ncleo celular. Esta modificacin en los componentes proteicos celulares tambin se estudia utilizando anticuerpos marcados y mediante el uso de tcnicas de SDS-PAGE e inmunoblot. c) Ingestin: La etapa de ingestin se puede evaluar utilizando como partcula a ingerir diferentes microorganismos. La utilizacin de levaduras como por ejemplo el Saccharomyces cerevisiae, se fundamenta en el tamao de las partculas (fcil de ver en el microscopio ptico) y la estructura de manosas que poseen estos microorganismos que son fcilmente detectados por los PRRs. La capacidad de ingestin de las clulas provenientes del individuo a evaluar se determina realizando una cuantificacin del nmero de levaduras ingeridas en un determinado tiempo de incubacin. El recuento de las partculas o microorganismos ingeridos puede ser realizado mediante diversas metodologas: - Tincin de las clulas con las coloraciones de Wright o Giemsa; de esta manera se diferencian las clulas que han ingerido de las que no. Se deben contar por lo menos 200 clulas y determinar cuentas partculas por citoplasma celular es considerado como ingestin positiva. Los mtodos microscpicos requieren una laboriosa observacin para determinar la asociacin de los microorganismos a las clulas y discriminar si estos microorganismos fueron ingeridos o no. -Marcacin de las partculas a ingerir con fluorescena; se utiliza la marcacin de la partcula con isotiocianato de fluorescena u otro colorante fluorescente previo a la incubacin con las clulas, luego se elimina por lavado las partculas no ingeridas y se detectan las clulas que ingirieron por microscopia de fluorescencia o citometra de flujo (ver captulo correspondiente en la presente gua). La utilizacin de la coloracin combinada diferencial con bromuro de etidio permite identificar las bacterias extracelulares (fluorescen en color rojo-naranja) de aqullas internalizadas (permanecen de color verde correspondiente a la fluorescena). -Marcacin de componentes bacterianos como protenas, DNA y/o RNA con sustancias radiactivas. Las bacterias se marcan durante su fase de crecimiento con aminocidos o nucletidos marcados con 14C, 35S amino 3H nucletidos: tritio y luego del experimento de ingestin en el que se incuban las clulas y las bacterias durante un periodo de tiempo generalmente entre 30 a 60 minutos a 37C se lavan las clulas para eliminar las bacterias no ingeridas y se utiliza un detector de radioactividad como un contador de centelleo lquido o slido para cuantificar la radiactividad retenida por el sedimento celular. Esta actividad se relaciona con el nmero de partculas radiactivas ingeridas y por lo tanto con la capacidad de ingestin de las clulas fagocticas del individuo evaluado.

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d) Digestin:

Evaluacin del estallido respiratorio

Reduccin del colorante nitroazul de tetrazolio El nitroazul de tetrazolio (NBT) es un aceptor de un electrn utilizado para detectar en forma indirecta la produccin de superxido por parte de los PMN estimulados. El NBT de color amarillo y soluble, se transforma en formazn de color azul e insoluble que precipita intracelularmente. NBT (color amarillo y soluble) + O2- ---------- Formazn (color azul e insoluble) + O2

Para esta prueba se pueden utilizar PMN provenientes de sangre entera aislados del individuo, estimulados con levaduras o forbolmiristilacetato (PMA) Luego de una incubacin de 30 minutos a 37C, la formacin del formazn puede ser evaluada cuali o cuantitativamente.

Los cristales pueden identificarse intracelularmente por microscopa y realizar un recuento del nmero de clulas que sufrieron estallido respiratorio, o bien los cristales pueden ser solubilizados utilizando N,N dimetilformamida y realizar la cuantificacin por espectrofotometra obteniendo los datos en densidad ptica.

Quimioluminiscencia El estallido respiratorio en los PMN normales est asociado con la generacin de energa luminosa conocida como quimioluminiscencia, la cual es dependiente de la produccin del oxgeno singulete (1O2). Este oxgeno se produce cuando uno de los electrones desapareados de oxgeno es elevado a una rbita superior con la inversin del spin. La luz se emite cuando el electrn retorna a su nivel inicial y se mide como quimioluminiscencia. El oxgeno singulete es producido por la reaccin entre H2O2 y el hipoclorito: H2O2 + OCl- ---------- 1O2 + H2O + Cl- La luz emitida se mide por la deteccin fluoromtrica apropiada. La sensibilidad del ensayo se incrementa por el uso de hidracina cclica, 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol) que actan como substrato para el 1O2. La luminiscencia se mide en un contador de centelleo usando el canal del 3H. Evaluacin de la produccin de xido Ntrico (NO) Puede realizarse mediante la evaluacin de la produccin de NO o de la enzima que cataliza su produccin (iNOS o NOS2)

Produccin del NO Los niveles de produccin de NO en los cultivos de macrfagos estimulados con bacterias o productos bacterianos nos permiten evaluar el grado de activacin de estas clulas. La vida media del NO es de segundos, por esto, la evaluacin de su produccin se realiza mediante la cuantificacin de nitritos en el medio de cultivo. La sntesis de nitritos comienza 4 a 6 horas luego del tratamiento con IFN y LPS en un cultivo de macrfagos y es lineal por 72 horas. La identificacin de este metabolito en los sobrenadantes de cultivo se realiza mediante la utilizacin del reactivo de Greiss (sulfanilamida y naftiletilendiamina) que se colorea cuando reacciona con nitritos y nos permite relacionar la coloracin con los niveles producidos en un cultivo. El cambio de color se evala por espectrofotometra a 550 nm. Se realiza una curva patrn utilizando diferentes concentraciones conocidas de NaNO2 y reactivo de Greiss. De esta curva se obtiene la relacin que permite estimar la produccin de NO in vitro.

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Los anlogos de la L-arginina,como la NG-monomethyl-L-arginina (L-NMA), poseen accin inhibitoria de la produccin de nitritos a partir del NO por la va de la iNOS por un fenmeno competitivo. La utilizacin de estas molculas permite confirmar que el aumento de produccin de nitritos en un cultivo est dado por este mecanismo. Incremento de la sntesis de la enzima xido ntrico sintasa inducible (iNOS o NOS2) La produccin de NO en altos niveles se cataliza por la accin de la enzima xido ntrico sintasa inducible. La expresin de esta enzima se produce por la accin de IFN y LPS en los cultivos y se relaciona con la activacin de macrfagos in vivo. Para la evaluacin del aumento en la produccin de esta enzima se utilizan anticuerpos monoclonales que reconocen su estructura marcados con enzimas que se utiliza para identificarla en los extractos proteicos celulares evaluados mediante las tcnicas de SDS-PAGE e Inmunoblot. Evaluacin del efecto bacteriosttico o bactericida La digestin de las partculas ingeridas depende no slo de los mecanismos O dependientes y O independientes descriptos sino de la capacidad del microorganismo de evadir o inhibirlos, las bacterias intracelulares pueden permanecer en estas clulas fagocticas que se transforman en su habitat. En el caso de bacterias extracelulares u otros patgenos este mecanismo se constituye como capaz de contener o eliminar al agente agresor constituyndose en un mecanismo efector bacteriosttico o bactericida. Estos mecanismos pueden ser evaluados utilizando tcnicas de cultivo bacteriano y determinando el nmero de unidades formadoras de colonias sobrevivientes al proceso de fagocitosis. Deficiencias en el mecanismo de fagocitosis Las deficiencias pueden estar dadas en el nmero de clulas fagocticas que posee un individuo (diferencias cuantitativas) o sobre la funcionalidad de alguno de los mecanismos descriptos (diferencias funcionales). Las granulocitopenias son frecuentes en las deficiencias secundarias a enfermedades linfoproliferativas, tratamientos inmunosupresores o excesiva destruccin mediada por anticuerpos anti-leucocitarios. Las deficiencias funcionales pueden afectar la movilidad y adherencia o la capacidad de ingestin y digestin. Algunas de las deficiencias descriptas como entidades clnicas son: Enfermedad Granulomatosa Crnica Deficiencia en la adhesin leucocitaria Deficiencia en glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa Deficiencia en los grnulos secundarios Para el diagnstico de estas inmunodeficiencias se trabaja con niveles de complejidad crecientes. Ensayos de nivel bsico:

1. Determinacin cuantitativa y morfolgica de los granulocitos y monocitos. 2. Estudios de mecanismos microbicidas oxigeno dependientes.

a) Prueba de la reduccin del nitroazul de tetrazolio. b) Quimioluminiscencia. Ensayos de nivel complejo:

1. Estudio de la expresin de las protenas de adhesin (antgenos LFA-1, CD11b/CD18, etc.) 2. Ensayos de quimiotaxis. 3. Estudios enzimticos: mieloperoxidasa, glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa, etc.

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Bibliografa 1. Wyllie J. Currents Protocols in Immunology.1994. 2. Margni R.A. Inmunologa e Inmunoqumica. Fundamentos. Editorial Mdica Panamericana

S A 1996. 3. Baehner RL, Nathan DG. Quantitative nitroblue tetrazolium test in chronic granulomatous

disease. N.Engl. J. Md. 278: 971-976. 1968. 4. Abramson JS, Wheeler JG. The Neutrophil. Oxford University Press. 1992. 5. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocitosis in macrophages. Ann Rev Immunol

1999. 17:593-623. Complemento El sistema de complemento (C) est formado por unas 30 protenas del suero que interaccionan entre s de modo regulado formando una cascada enzimtica que permite una amplificacin de la respuesta inmune humoral. Las principales consecuencias de la activacin del C son: 1. Lisis del microorganismo o clula diana 2. Opsonizacin, con la consiguiente mejora de la fagocitosis y destruccin del

microorganismo fagocitado 3. Quimiotaxis sobre los fagocitos 4. Accin anafilotxica, 5. Eliminacin de inmunocomplejos circulantes El complemento puede activarse por tres vas: 1. La va alternativa, en la que interacciona directamente con la superficie del microorganismo. 2. La va de las lectinas, una especie de variante de la va clsica, pero que se inicia sin

necesidad de anticuerpos 3. La va clsica, a travs de la interaccin del C con inmunocomplejos. Las tres rutas comparten las ltimas fases, consistentes en el ensamblaje del denominado complejo de ataque a la membrana (CAM). El complemento puede ser estudiado para determinar su concentracin o funcionalidad en un animal sospechoso de padecer una inmunodeficiencia o una enfermedad autoinmune. La concentracin de los factores del complemento en un suero problema se miden por inmunodifusin simple radial o prueba de Mancini (ver captulo sobre reacciones secundarias). La funcionalidad del complemento en un suero problema se evala por la tcnica de hemlisis. Por otra parte, el complemento puede ser utilizado como un indicador de que la reaccin Ag-Ac tuvo lugar, ya sea para identificar antgenos como anticuerpos. Por ejemplo, la lisis por complemento se puede utilizar para tipificar grupos sanguneos en animales utilizando anticuerpos especficos. Mientras que, la tcnica de fijacin de complemento se emplea para detectar Acs especficos para el diagnstico de algunas enfermedades infecciosas, utilizando un Ag de referencia. Fundamentos de la hemlisis mediada por complemento: Cuando a una suspensin de GR sensibilizados con anticuerpos especficos se le agrega complemento, se produce la hemlisis y la consiguiente liberacin de hemoglobina (Hb) en el sobrenadante. Esta concentracin de Hb est en funcin directa con el grado de hemlisis que tuvo lugar en la muestra y puede ser evaluada por absorcin a 542 nm en un espectrofotmetro. Los estudios de cintica de esta inmuno-hemlisis han demostrado que la sensibilidad de estas valoraciones es mayor cuando el ttulo se establece sobre la base de la dosis de complemento que produce la lisis del 50% de los hemates del sistema. Esto tiene una explicacin clara si se analiza la curva que resulta de graficar los porcentajes de hemlisis en funcin de la cantidad de complemento agregado al sistema, puede observarse que dicho grfico no corresponde a una recta, sino a una curva sigmoidea que presenta una marcada pendiente en la zona que va del 25 al 75% de hemlisis. Los extremos de la curva,

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que corresponden a la zona que va del 0 al 25% y del 75 al 100 % de hemlisis, presentan una pendiente significativamente menor o nula. De este grfico se deduce que, cuando se hacen cuantificaciones de C a 50% de hemlisis, el consumo de pequeas cantidades de complemento produce cambios significativos en el porcentaje de hemlisis. Esta relacin no se observa cuando las cuantificaciones de C se realizan sobre la base del 100% de hemlisis. Por esto, la tcnica es ms sensible basndose en el 50% de hemlisis. Se define as la unidad de complemento hemoltica 50% (CH50), que corresponde a los mililitros de suero fresco completo (como fuente de complemento) que son necesarios para producir la lisis del 50% de los GR sensibilizados con anticuerpos, durante una hora de incubacin a 37C. La unidad CH50 se calcula sobre 5 X 108 eritrocitos ptimamente sensibilizados, resuspendidos en un volumen total de 7.5 ml, en presencia de concentraciones ptimas de Calcio y Magnesio, a una fuerza inica y a un pH ptimo para cada especie. Evaluacin de la funcionalidad del complemento en un suero problema En la prueba para evaluar la funcionalidad del complemento, los sueros de los animales problema y de referencia se diluyen en forma seriada en un rango que va desde 1/20 a 1/320. Luego se agrega una suspensin estndar de eritrocitos ptimamente sensibilizados a cada dilucin de suero. El complemento presente en el suero se activa por los Acs que recubren los GR (complejos inmunes) y causa la lisis de los eritrocitos (hemlisis). El porcentaje de hemlisis es proporcional a la concentracin de complemento dentro de cada dilucin de cada suero en particular. La hemoglobina liberada se mide en un espectrofotmetro luego del perodo de incubacin. Se deben realizar los siguientes controles: 0% de hemlisis (buffer + GR sensibilizados), y 100% de hemlisis (agua destilada + GR sensibilizados). El porcentaje de hemlisis para cada dilucin de suero evaluado se calcula de la siguiente forma: DO (problema) - DO (0%lisis) % de hemlisis = x 100

DO (100% lisis) - DO (0%lisis)

Figura 1: Porcentaje de hemlisis en una muestra de GR sensibilizados en funcin de la cantidad de complemento agregado. El porcentaje de hemlisis se mide como la

concentracin de Hb que se obtiene en el sobrenadante por absorcin a 542 nm. Fuente de complemento: suero fresco de cobayo.

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Este ensayo produce tambin una curva sigmoidea si se grafica el % de hemlisis vs. la dilucin del suero problema. El valor del 50% de hemlisis es el elegido para definir el ttulo de un suero como la inversa o recproca de la dilucin del suero que produce un 50% de hemlisis. Las muestras de suero que van a ser utilizadas para evaluar la funcin del C deben ser conservadas a -70C dentro de las 2 hs de extradas, dada la labilidad de las protenas del C. Mediante esta tcnica se evala la va clsica de activacin del complemento. Este ensayo tambin puede ser realizado usando placas de agarosa que contienen GR sensibilizados. El suero se agrega en hoyos cavados en la placa de agarosa y se permite que difunda durante 20 hs a 4C. Las placas se incuban luego a 37C por 90 min para permitir la hemlisis, que se ve como un anillo rodeando los hoyos, cuyo dimetro es proporcional al logaritmo de la concentracin del complemento en el suero. Anticuerpos Obtencin de anticuerpos policlonales o sueros hiperinmunes: Cuando se inmuniza un animal con un antgeno y se provoca una respuesta inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Igs especficas frente al antgeno empleado. Esto es la consecuencia de la seleccin clonal de los linfocitos B que producen anticuerpos contra el antgeno, el cual puede presentar diferentes epitopes, y cada uno de ellos ser reconocido por varios clones de linfocitos B que producirn inmunoglobulinas especficas. Como consecuencia de esta respuesta inmune humoral especfica se acumulan un nmero desconocido, posiblemente elevado, de diferentes molculas de inmunoglobulinas especficas frente al antgeno en el suero del animal inmunizado. Se trata de un suero producido por la accin de sntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello se ha denominado policlonal. (Figura 1)

Figura 1: Produccin de anticuerpos policlonales.

Anticuerpo policlonal

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El proceso de inmunizacin es aquel en el que se inyecta al animal el antgeno slo o con adicin de adyuvantes, cuya funcin es favorecer su inmunogenicidad. Cuando la inmunizacin se realiza sobre animales vrgenes o naive, a la primera dosis se la describe como: inmunizacin primaria o respuesta primaria. La primer dosis induce la sensibilizacin del individuo generando la expansin de los clonos especficos y la aparicin de clulas de memoria, pero la calidad de la respuesta en niveles de anticuerpos y clulas especficas puede ser incrementada y mejorada en dosis sucesivas, por lo tanto en los planes de inmunizacin se aplican diversas dosis. Existen numerosos protocolos de inmunizacin, con una duracin variable, aunque una fase de inmunizacin primaria suele durar de 1 a 3 meses con inyecciones cada 15 a 21 das, y el proceso puede durar de 3 a 6 meses (puede variar tambin de acuerdo con la especie a inmunizar). La cantidad de antgeno depender del animal empleado. Los ms comnmente utilizados son ratn, rata, conejo, cabra y gallina. Las cantidades oscilan de los 50 a 1000 g de antgeno para una dosis en ratn a los 0,25 a 5 mg por dosis en el caso de la cabra o los 15 mg en el caso de caballo. Cuando nuestro objetivo es obtener sueros hiperinmunes para utilizar como reactivos de diagnstico o inmunidad pasiva, los planes estn compuestos por varias dosis. Si nuestro objetivo es sueros anti-sueros de diferentes especies, debemos considerar la distancia filogentica para la eleccin de la especie dadora de suero. Como ejemplo, la utilizacin de la gallina como especie para obtencin de anticuerpos tiene dos ventajas: la distancia filogentica existente con los mamferos, y la purificacin de los anticuerpos de la yema del huevo, es engorrosa pero su obtencin no afecta la vida del animal dador. En conclusin, se denomina suero hiperinmune al obtenido de animales que han respondido a mltiples inoculaciones de un antgeno determinado. Las aplicaciones son numerosas, por ejemplo, como reactivos para el diagnstico de ciertas enfermedades. Estos sueros contendrn anticuerpos policlonales en alta concentracin contra los distintos componentes de un antgeno. Anticuerpos monoclonales

Kohler y Milstein desarrollaron una tcnica que permiti la produccin de anticuerpos producidos a partir de un solo clon de linfocitos B. El fundamento de la tcnica consiste en fusionar linfocitos B provenientes de un ratn inmunizado con el antgeno de inters con lneas celulares provenientes de mielomas no secretante murino. Los hbridos resultantes presentan dos propiedades: secretan anticuerpos especficos hacia el antgeno empleado en la inmunizacin, proliferan indefinidamente y pueden ser mantenidos como lneas celulares. Esta tecnologa ha revolucionado el empleo de los anticuerpos, tanto en lo referido al enfoque diagnstico como teraputico. Es importante destacar que mediante esta metodologa se pueden obtener anticuerpos homogneos (ya que proviene de un nico clon de linfocitos B) y de muy alta especificidad, lo que facilita la puesta a punto y repetitividad de varias tcnicas inmunolgicas. Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas secretadas por un nico clon de linfocitos B y por lo tanto, con idntica secuencia aminoacdica en sus regiones variables. Poseen una especificidad nica, con una afinidad hacia el antgeno determinada e invariable y presentan un nico isotipo. En estas caractersticas residen las principales ventajas que presentan los anticuerpos monoclonales para su uso en investigacin y diagnstico. Por el contrario, los anticuerpos policlonales consisten en una mezcla de inmunoglobulinas provenientes de distintos clones de linfocitos B. A continuacin se enumeran las principales diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales: Anticuerpos monoclonales: 1. Son qumicamente homogneos, poseen las propiedades individuales de la secuencia de

aminocidos de ese particular anticuerpo. 2. Son de especificidad definida porque todas las molculas tienen la misma regin

hipervariable.

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3. Poseen una nica avidez y afinidad. 4. Su estabilidad fsico-qumica depende de cada anticuerpo monoclonal en particular. Pueden

ser sensibles a cambios de pH, temperatura, liofilizacin y marcacin con enzimas o istopos.

5. En general, no poseen reactividad secundaria, o sea, no forman complejos antgeno-anticuerpo insolubles con antgenos mono o bivalentes. Pueden hacerlo si el antgeno tiene epitopes repetitivos.

6. Se pueden producir en cantidades ilimitadas. Anticuerpos policlonales: 1. Son heterogneos. Sus propiedades constituyen un promedio de las propiedades de los

distintos anticuerpos constituyentes (del antisuero). 2. Son una mezcla de anticuerpos con especificidades propias para cada epitope del

inmungeno. Por lo tanto, la probabilidad de reacciones cruzadas con epitopes de otros antgenos es mayor a la de los anticuerpos monoclonales.

3. Su avidez y afinidad corresponden al conjunto de la mezcla de anticuerpos y varan en funcin del momento de la respuesta inmune en que se realiz la determinacin. As, la afinidad media de los anticuerpos detectada al comienzo de una respuesta inmune ser menor que la detectada a medida que la respuesta inmune avanza. Estos se debe a que a medida que la respuesta inmune se va desarrollando, se produce la maduracin de la afinidad de los anticuerpos.

4. Son estables como consecuencia de su heterogeneidad, lo que permite que sean ms resistentes frente a distintos cambios fsico-qumicos.

5. Poseen reactividad secundaria debido a la presencia de mltiples anticuerpos dirigidos contra distintos epitopes en la molcula antignica, lo que permite la formacin de una red antgeno-anticuerpo.

6. Se producen en animales inmunizados. Por lo tanto, es difcil de estandarizar. Purificacin y fraccionamiento de anticuerpos

1-Aislamiento y Purificacin de Anticuerpos El aislamiento o la purificacin de anticuerpos se requiere para un gran nmero de tcnicas, tanto de diagnstico como de investigacin. Existe una amplia variedad de mtodos utilizados para purificar anticuerpos. La correcta eleccin del mtodo de purificacin depender de un nmero de variables, que incluyen: el uso posterior de los anticuerpos purificados, la especie y el material a partir del cual se parte, la clase y subclase de Ig (en el caso de un anticuerpo monoclonal). En la tabla 1 se muestran las posibles fuentes de anticuerpos para su purificacin. Tabla 1: Comparacin de diferentes fuentes de anticuerpos

Fuentes Tipo de Anticuerpo

Concentracin de Anticuerpos

totales (mg/ml)

Concentracin de Anticuerpos especficos

(mg/ml)

Anticuerpos contaminantes

Posible pureza de anticuerpos

especficos (%)

Suero policlonal 10 1 (10% mximo) Otros Ac del suero 10% como

mximo Sobrenadante de cultivo de

hibridoma (con 10% de Suero Fetal Bovino)

Monoclonal 1 0.05 (5%) Anticuerpos bovinos > 95%

Sobrenadante de cultivo (sin Suero Fetal)

Monoclonal 0.05 0.05 (100%) Ninguno >95%

Lquido asctico Monoclonal 1-10 0.9-9 (90%) Anticuerpos de ratn 90%

Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp726.

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Mtodos de Aislamiento y purificacin 1-a Precipitacin Las interacciones de una protena en agua ocurren entre las molculas de protena-agua y protena-protena. Cuando predominan las interacciones protena-agua, stas se hallan en solucin; cuando predominan las segundas (protena-protena), stas precipitan. Cuando a una protena que se encuentra en solucin acuosa agregamos una sal, como la sal es ms hidroflica que la protena, interacciona con el agua, le quita el agua y hace que predominen las interacciones protena-protena. Por lo tanto, la protena precipita. Es importante considerar el pH de la solucin de trabajo: Cuando el pH de la solucin es igual al punto isoelctrico (pI) de la protena, la carga neta de dicha protena es cero y por lo tanto sus molculas no se repelen, se aglomeran y precipitan. Es conveniente trabajar con sulfato de amonio a 4C: A mayor temperatura, mayor solubilidad proteica y viceversa; esto se cumple para el rango de 0 a 40C. En resumen, los factores que afectan la concentracin salina a la cual una protena en particular precipitar son: 1- el nmero y la posicin de los grupos polares; 2- el peso molecular de la protena a purificar; 3- el pH de la solucin; 4- la temperatura a la que se desarrolla la precipitacin. Precipitacin salina La precipitacin salina es un mtodo que permite separar las distintas fracciones proteicas del suero. Las sales mas comnmente utilizadas son el sulfato de amonio y el sulfato de sodio. La ventaja de trabajar con sulfato de amonio es que no se cristaliza a temperaturas bajas ni a temperatura ambiente, como lo hace el sulfato de sodio. La concentracin de sal a la cual precipitan los anticuerpos vara segn la especie. Por ejemplo, la mayora de los anticuerpos de conejo precipitan con una solucin saturada al 40%, mientras que los anticuerpos de ratn necesitan entre 40-50%. Precipitacin con cido caprlico La adicin al suero de cidos grasos de cadena corta como el cido caprlico en condiciones medianamente cidas, precipita la mayora de las protenas con excepcin de las IgGs. Esta metodologa, por lo tanto, permite obtener IgG purificada a partir de suero si se la realiza en combinacin con otras metodologas (por ejemplo, cromatografa de intercambio inico). 1-b Cromatografa La caracterstica que distingue a los mtodos cromatogrficos es la presencia de dos fases mutuamente no miscibles (una mvil y una estacionaria) que se hallan en contacto. La muestra a purificar se introduce en la fase mvil, por lo que es transportada a lo largo de una columna que contiene la fase estacionaria homogneamente distribuida. Los diferentes componentes de la muestra experimentan repetidas interacciones entre la fase mvil y la fase estacionaria. Durante el proceso, los componentes de la muestra se separan en funcin de su interaccin con la fase estacionaria: el componente que menos interacta es el menos retenido y eluye primero, el que ms interacta resulta retenido ms fuertemente y eluye ltimo. Una separacin ptima entre dos componentes de una muestra se obtiene cuando el componente que eluye en segundo trmino es retenido lo suficiente como para impedir su superposicin con el componente que eluy en primer trmino. Las macromolculas biolgicas difieren en sus caractersticas fisicoqumicas: tamao, forma, carga, hidrofobicidad y arreglo de sus grupos funcionales dentro de su estructura tridimensional. La separacin de las muestras entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades fisicoqumicas de cada uno de los componentes de una muestra dada. Es lgico, por lo tanto, que los mtodos cromatogrficos ms comunes para la purificacin de estas molculas sean:

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Cromatografa de exclusin molecular (discriminacin por tamao y forma), Cromatografa de intercambio inico (discriminacin por carga), Cromatografa de interaccin hidrofbica (discriminacin por superficie hidrofbica), Cromatografa de afinidad (distribucin de aminocidos especficos en la superficie de las protenas, inmovilizacin de metales). Cromatografa de Exclusin Molecular

Fundamentos: Este tipo de cromatografa utiliza como soporte esferas de gel con poros de diferente tamao. Una columna construida de esta manera tendr dos volmenes medibles, el volumen externo (Vo), constituido por el volumen intersticial (el espacio que queda entre las esferas de gel), y el volumen interno (Vi) que es el volumen de las esferas a los que los solutos y solventes pueden acceder cuando se introducen dentro de aqullas a travs de sus poros. Las molculas que no puedan acceder al Vi, debido a que su tamao es mayor al de los poros, slo se equilibrarn en el Vo, mientras que las de menor tamao se equilibrarn en ambos volmenes. Cuando una muestra compleja de protenas y otros componentes, disuelta en un pequeo volumen, es aplicada a una columna con estas caractersticas, filtrar a travs de la misma. Las protenas de mayor peso molecular eluirn con el Vo y por lo tanto eluirn primero, mientras que las protenas de menor tamao, que pueden acceder al Vi, eluirn ms tardamente y en un volumen de elucin (Ve) determinado que depender de su peso molecular. Ver esquema

Aspectos metodolgicos: La matriz ms utilizada en este tipo de cromatografa es Sephadex , que se expende en

forma de polvo y puede tener diferentes tamaos de poro, lo que implica la separacin de protenas de diferente tamao.

Las muestras no pueden contener una concentracin proteica de ms de 50 mg/ml. Las muestras deben ser clarificadas por centrifugacin a fin de eliminar todo el material insoluble que pueda disminuir el flujo de la columna y contaminar la matriz de la misma previo a la cromatografa.

La fuerza inica de los solventes cromatogrficos debe ser lo suficientemente elevada como para impedir la adsorcin inespecfica del soluto a la matriz por interacciones electrostticas o uniones de Van Der Waals

Como las molculas de IgM son mucho ms grandes que las molculas de IgG y de otras protenas que se encuentran en el suero, la cromatografa de exclusin molecular puede

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ser usada para separar IgM. Cuando se requiere obtener una preparacin pura de IgM, se puede utilizar esta tcnica combinada con la precipitacin con sulfato de amonio.

Cromatografa de Intercambio Inico

Fundamentos: La cromatografa de intercambio inico trabaja mediante la unin de biomolculas con una carga determinada, a una matriz estacionaria de carga opuesta. Las biomolculas se unen a resinas de intercambio inico cuando tienen carga opuesta a la de los iones fijos de la resina. Esta unin es de tipo electrosttico y reversible: La fuerza de esta unin puede ser modificada variando la concentracin salina y el pH de la solucin buffer utilizada como eluyente. La separacin de dos o ms sustancias mediante la utilizacin de resinas de intercambio inico se consigue por un mecanismo de adsorcin reversible, que consiste en la fijacin inicial y posterior remocin de tales sustancias a una resina estabilizada. Si las sustancias fijadas tienen diferentes propiedades elctricas, mediante la variacin del pH o fuerza inica del eluyente se conseguir que cada una de ellas eluya por separado. Matrices y solventes: La matriz puede estar constituida por silicato de aluminio, resinas sintticas, polisacridos como la celulosa o el dextrano, etc. La naturaleza de los grupos cargados es la que determina el tipo y la fuerza de unin del in intercambiador. Los dos tipos de resinas ms utilizadas son: de intercambio catinico (con matrices con carga negativa) y de intercambio aninico (con matrices con carga positiva). La eleccin correcta de la resina, en especial en lo que se refiere al grupo funcional que le aporta la carga, depender de la carga neta de la sustancia que se desea separar. En los casos de molculas anfotricas como las protenas, que poseen grupos cargados positiva y negativamente, su carga neta depender del pH del medio. Estas sustancias, segn sea el pH del medio, podrn unirse a resinas aninicas o catinicas; en su punto isoelctrico (pI), tendrn carga neta cero y no se fijarn a ningn tipo de resina intercambiadora. Cromatografa de Afinidad Fundamentos: La tcnica de cromatografa de afinidad es una de las tcnicas ms utilizadas para la purificacin de protenas. Consiste en una cromatografa de adsorcin en la que se aprovecha la especificidad de interacciones biolgicas como las interacciones antgeno-anticuerpo, enzima-inhibidor, hormona-receptor, lectina-hidrato de carbono, etc. La biomolcula que se quiere purificar (por ejemplo, un anticuerpo) usualmente tiene un sitio de reconocimiento a travs del cual puede interactuar con otra molcula natural o artificial a la que se llama ligando. El ligando es inmovilizado sobre una matriz polimrica y es usado para capturar selectivamente a la biomolcula que se desea purificar, cuando sta se encuentra en una mezcla impura. La biomolcula deseada puede ser eluda del ligando por cambios en las condiciones externas (pH, fuerza inica, solventes y temperatura) que desestabilizan la interaccin biomolculaligando y permiten que la molcula deseada sea eluida en forma purificada. Existe una gran diversidad de biomolculas que pueden purificarse por este mtodo cromatogrfico, entre ellas: antgenos, anticuerpos, enzimas, protenas unidas a hormonas, protenas unidas a vitaminas, receptores, glicoprotenas, lectinas, ARN, ADN, bacterias, virus, fagos, clulas y protenas producidas por ingeniera gentica. La naturaleza de la matriz a la que se fijan los ligandos es muy importante, ya que en las condiciones experimentales debe ser fsica y qumicamente estable, no debe actuar como tamiz molecular y debe asegurar un buen flujo durante la elucin. Existen numerosas matrices comerciales disponibles en su forma activada o sin activar para ser utilizadas como soporte para el ligando. La activacin de la matriz se realiza para que el

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ligando quede inmovilizado en ella a travs de una interaccin qumica que produzca una unin estable entre matriz y ligando. En general, se utilizan matrices de naturaleza polisacrida, en su mayora derivados de la agarosa. Debido a su estructura qumica, estas matrices tienen la caracterstica de ser casi inertes, de forma que no producen interacciones inespecficas. Esto es esencial porque la cromatografa de afinidad se basa en interacciones especficas. La seleccin del ligando utilizado en cromatografa de afinidad debe tener en cuenta: 1- que la afinidad de unin del ligando sea especfica y reversible por la sustancia que ser purificada. 2- que el ligando posea grupos qumicamente modificables que permitan su unin a la matriz sin que se destruya su capacidad de unin a la sustancia que ser purificada. Por ejemplo, si el ligando es un anticuerpo, ste se va a unir a la matriz a travs de su porcin Fc, y por lo tanto, quedar libre el sitio de unin al antgeno. Al agregar un antgeno, ste ser reconocido y unido por el anticuerpo inmovilizado en la columna. Las dems molculas presentes pero no unidas a la matriz (no reconocidas por el ligando) se eliminan por lavado. Posteriormente, el antgeno unido al anticuerpo de la columna se eluye y se obtiene en forma pura. El ligando idealmente debera tener una afinidad de unin de 10-4 a 10-8 M-1 en solucin. Si la constante de disociacin es mayor que 10-8 M-1 esta tcnica no puede ser utilizada para la purificacin de estas molculas pues la unin es muy estable y la separacin de la biomolcula del ligando se hace muy difcil. Estas afinidades muy altas corresponden a la interaccin hormona-receptor para lo cual este mtodo no resulta til.

Ejemplos:

Purificacin por columna de protena A-sepharosa: La protena A se encuentra en las paredes celulares de Staphylococcus aureus y tiene la particularidad de unirse al fragmento Fc de anticuerpos. Se han encontrado protenas similares en otras bacterias (por ejemplo protena G en Streptococcus sp.). Aunque se de