Lineamiento Montaje Estandarizacion y Validacion - Colombia 2014-04-25

7/25/2019 Lineamiento Montaje Estandarizacion y Validacion - Colombia 2014-04-25

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INSTITUTO NACIONAL DE SALUDDireccin Redes en Salud Pblica

Subdireccin de Gestin de Calidad de los Laboratorios de Salud Pblica2014-04-25

LINEAMIENTOS TCNICOS PARA LA ESTANDARIZACIN Y VALIDACIN DE MTODOSDE ENSAYO

CONTENIDO

Objeto 1Alcance 1Definiciones 2Introduccin 10Estandarizacin 11Criterios para la seleccin de un mtodo de ensayo 11Organizacin y Personal 12Instalaciones 12Equipos, Reactivos, Material y Muestras 12Sistemas Experimentales 13Desarrollo del ejercicio de estandarizacin 14Validacin 16Validacin de Mtodos Cualitativos de Anlisis Microbiolgico 16Validacin de Mtodos Cuantitativos de Anlisis Microbiolgico 24Validacin de Mtodos Cuantitativos de Anlisis Qumico 34

Referencias 52

OBJETOEl presente documento tiene como propsito presentar los lineamientos generales para laestandarizacin y validacin de mtodos de ensayo. Se abordan los aspectos tcnicos de formaamplia y general de forma que los conceptos aqu mostrados sean aplicables a la gran mayora delos mtodos de ensayo que se utilizan normalmente en los laboratorios dedicados a la vigilanciade eventos de inters en salud pblica.

ALCANCEEl presente documento aplica para los LSP que se encuentren en proceso de implementacin desistemas de gestin de calidad basados en las normas NTC GP1000:2009 y NTC ISO/IEC17025:2005 o que dentro de sus organizaciones se est proyectando la implementacin de

sistemas para el aseguramiento de la calidad de los resultados analticos.


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DEFINICIONES

Validacin:Verificacin de que los requisitos especificados son adecuados para un usoprevisto. [VIM 2012]

EJEMPLO Un procedimiento de medida habitualmente utilizado para la medicin de laconcentracin en masa de nitrgeno en agua, puede tambin validarse para la medicinen el suero humano.

Validacin primaria: Establecimiento de las especificaciones para el desempeo de unnuevo mtodo y/o verificacin experimental de que un mtodo cumple criterios de calidad

derivados tericamente. [GTC84:2003]

Validacin Secundaria: Demostracin mediante experimentos, de que un mtodoestablecido funciona de acuerdo con sus especificaciones cuando lo emplea el usuario.[GTC 84:2003].

Revalidacin: Repeticin total o parcial de la validacin de un mtodo analtico debido amodificaciones en el propio mtodo, equipos, muestras a analizar, etc., al objeto degarantizar que los resultados continan siendo fiables. [AEFI 2000].

Rplicas: Anlisis sucesivos de una muestra en las mismas condiciones, utilizando elmtodo analtico completo, desde la preparacin de la muestra hasta la medicin final del

analito. [AEFI 2000]

Repeticiones: Inyecciones o mediciones repetidas de la muestra final (duplicado,triplicado, etc.). [AEFI 2000]

Dato: Se refiere a los atributos cualitativos o cuantitativos de variables o un conjunto devariables.

Dato atpico: Un valor atpico es una observacin que es numricamente distante delresto de los datos.Una observacin atpica es la que parece desviarse considerablementede otros miembros de la muestra en que se produce.

Blanco: Es un sistema fsico que no contiene muestra real y por consiguiente no deberacontener el analito de inters, pero que debe contener todos los reactivos que se utilizanen el mtodo de anlisis y es sometido a las mismas condiciones y procedimientos quelas muestras y patrones. [AEFI 2000]

Blanco, placebo o matriz de la muestra: Muestra preparada para la lectura final peroque no contiene analitos. Puede ser un blanco de los reactivos o bien un blanco de la


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muestra problema que contenga todos los ingredientes de la muestra problema exceptolos analitos. En este ltimo caso se denomina placebo o matriz de la muestra [AEFI 2000]

Relacin seal-ruido o Ruido de fondo: En sistemas instrumentales es la seal residualo lnea de base registrada con concentracin cero de analito. Es decir la seal-ruido queproporciona un blanco o placebo. Matemticamente suele expresarse como la desviacinestndar de la respuesta de un cierto nmero de blancos. [AEFI 2000]

Exactitud de medida, f exactitud, f: Proximidad entre un valor medido y un valorverdadero de un mensurando. [VIM 2012]Para el enfoque de anlisis cualitativo,corresponde a la correcta caracterizacin de muestras positivas/negativas, es decirverdaderos positivos/verdaderos negativos.

NOTA 1 El concepto exactitud de medida no es una magnitud y no se expresa numricamente.Se dice que una medicin es ms exacta cuanto ms pequeo es el error de medida.

NOTA 2 El trmino exactitud de medida no debe utilizarse en lugar de veracidad de medida,al igual que el trmino precisin de medida tampoco debe utilizarse en lugar de exactitud demedida, ya que esta ltima incluye ambos conceptos.NOTA 3 La exactitud de medida se interpreta a veces como la proximidad entre los valoresmedidos atribuidos al mensurando.Veracidad de medida, f veracidad, f:Proximidad entre la media de un nmero infinito devalores medidos repetidos y un valor de referencia. [VIM 2012]

NOTA 1 La veracidad de medida no es una magnitud y no puede expresarse numricamente,aunque la norma ISO 5725 especifica formas de expresar dicha proximidad.

NOTA 2 La veracidad de medida est inversamente relacionada con el error sistemtico, perono est relacionada con el error aleatorio.NOTA 3 No debe utilizarse el trmino exactitud de medida en lugar de veracidad de mediday viceversa.Precisin de medida, f precisin, f: Proximidad entre las indicaciones o los valoresmedidos obtenidos en mediciones repetidas de un mismo objeto, o de objetos similares,bajo condiciones especificadas [VIM 2008]

NOTA 1 Es habitual que la precisin de una medida se exprese numricamentemediante medidas de dispersin tales como la desviacin tpica, la varianza o el

coeficiente de variacin bajo las condiciones especificadas.NOTA 2 Las condiciones especificadas pueden ser condiciones de repetibilidad, condicionesde precisin intermedia, o condiciones de reproducibilidad (vase la norma ISO 5725-1:1994).NOTA 3 La precisin se utiliza para definir la repetibilidad de medida, la precisin intermedia yla reproducibilidad.NOTA 4 Con frecuencia, precisin de medida se utiliza, errneamente, en lugar de exactitudde medida.


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Repetibilidad (de resultados de mediciones): El grado de concordancia entre losresultados independientes obtenidos con el mismo mtodo material de ensayo, en lasmismas condiciones (mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y despusde breves intervalos de tiempo).

En algunos contextos repetibilidad se puede definir como el valor por debajo del cual seencuentra la diferencia absoluta entre dos resultados individuales obtenidos en lascondiciones anteriores, con una probabilidad especificada. [IUPAC Orange Book].

Repetibilidad (de un instrumento de medicin): Aptitud de un instrumento de medicinpara proporcionar indicaciones muy semejantes entre s por aplicaciones repetidas delmismo mensurando bajo las mismas condiciones de medicin. [IUPAC Orange Book].

Reproducibilidad:El grado de concordancia entre los resultados independientesobtenidos con el mismo mtodo material de ensayo,pero en condiciones diferentes (operadores diferentes, aparatos diferentes, diferenteslaboratorios y / o despus de diferentes intervalos de tiempo.

En algunos contextos reproducibilidad se puede definir como el valor por debajo del cualestla diferencia absoluta entre dos resultados individuales obtenidos con materialidntico en las condiciones anteriores, con una probabilidad especificada. Se debe teneren cuenta que una declaracin completa de la reproducibilidad requiere la especificacinde las condiciones experimentales que se modifican. [IUPAC Orange Book].

Precisin Intermedia: Medida de la precisin de los resultados de un mtodo de ensayoen condiciones diferentes de analista/observador, da, equipo y lote de reactivos, dentrodel mismo laboratorio. [ICH].

Lmite de Deteccin: Valor medido, obtenido mediante un procedimiento de medidadado, con una probabilidad de declarar errneamente la ausencia de un constituyenteen un material, dada una probabilidad , de declarar errneamente su presencia. [VIM2012]

NOTA 1 La IUPAC recomienda por defecto los valores de y iguales a 0,05.

NOTA 2 En ingls algunas veces se usa la abreviatura LOD.

NOTA 3 No debe utilizarse el trmino sensibilidad en lugar de lmite de deteccin

Lmite de Cuantificacin: La menor concentracin de un analito que puede determinarsecon una precisin (repetibilidad) y una exactitud aceptables bajo las condicionesestablecidas de la prueba. [NATA Technical Note #17]


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Curva de Calibracin: Representacin grfica de la seal de medicin como una funcinde la cantidad de analito. [AOAC - PVMC]

Linealidad: capacidad del mtodo para proporcionar resultados que son directamente (opor medio de transformaciones matemticas) proporcionales a la concentracin del analitoen la muestra dentro de un rango establecido. [AEFI 2000]

Residual: Es la diferencia entre el valor observado experimentalmente y el valor estimadoen una recta de regresin o una curva de calibracin.

Intervalo de Linealidad: Es la amplitud entre las concentraciones inferior y superior delanalito (incluyendo estos niveles) en el cual se puede determinar al analito con un niveladecuado de precisin, exactitud y linealidad, utilizando el procedimiento segn sedescribe por escrito. [USP-NF].

Selectividad: Es la capacidad de un mtodo para determinar exactamente yespecficamente el analito de inters en presencia de otros componentes en una matrizde muestra bajo las condiciones de prueba establecidas.[NATA Technical Note #17]

Selectividad (en un anlisis): Cualitativa - la medida hasta la cual otras sustanciasinterfieren en la determinacin de una sustancia de acuerdo a un procedimiento dado.Cuantitativa - un trmino usado en conjuncin con otros sustantivos (por ejemplo,constante de, coeficiente de, ndice de, factor de, nmero de) para lacaracterizacin cuantitativa de interferencias [IUPAC Orange Book].Para el enfoque de

anlisis cualitativo, corresponde a la correcta caracterizacin de muestras negativas, esdecir verdaderos negativos.

Especificidad: Se utiliza como sinnimo de la selectividad, aunque debera reservarsepara aquellas situaciones, donde la respuesta obtenida solo se puede producir con unanica entidad qumica. [AEFI 2000].

Sensibilidad: El cambio en la respuesta de un instrumento de medicin dividido por elcorrespondiente cambio del estmulo.[IUPAC Orange Book]. Capacidad de un mtodoanaltico para detectar pequeas concentraciones de analito. [AEFI 2000]Para el enfoquede anlisis cualitativo, corresponde a la correcta caracterizacin de muestras positivas, esdecir verdaderos positivos.

Nota: El estmulo puede ser por ejemplo, la cantidad del mensurando presente. Lasensibilidad puede depender del valor de estmulo. Aunque esta definicin se aplicaclaramente a un instrumento de medicin, tambin puede aplicarse al mtodo analticocomo un todo, tomando en cuenta otros factores tales como el efecto de los niveles deconcentracin. [IUPAC Orange Book]


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Robustez: Medida de la capacidad de un mtodo analtico para permanecer inalteradoante pequeas pero deliberadas variaciones en ciertos parmetros, proporcionando ideade su fiabilidad o estabilidad durante su empleo de rutina. [AEFI 2000].

Material de Referencia: Material suficientemente homogneo y estable con respecto apropiedades especificadas, establecido como apto para su uso previsto en una medicino en un examen de propiedades cualitativas.

NOTA 1 El examen de una propiedad cualitativa comprende la asignacin de un valor adicha propiedad y de una incertidumbre asociada. Esta incertidumbre no es unaincertidumbre de medida.

NOTA 2 Los materiales de referencia con o sin valores asignados pueden servir para controlar laprecisin de la medida, mientras que nicamente los materiales con valores asignados puedenutilizarse para la calibracin o control de la veracidad.

NOTA 3 Los materiales de referencia comprenden materiales que representan tanto magnitudescomo propiedades cualitativas.

EJEMPLO 1 Ejemplos de materiales de referencia que representan magnitudesa) agua de pureza declarada, cuya viscosidad dinmica se emplea para la calibracin deviscosmetros.b) suero humano sin valor asignado a la concentracin de colesterol inherente, utilizadosolamente como material para el control de la precisin de la medida.c) tejido de pescado con una fraccin msica determinada de dioxina, utilizado comocalibrador.

EJEMPLO 2 Ejemplos de materiales de referencia que representan propiedades cualitativasa) carta de colores mostrando uno o ms colores especificados.b) ADN conteniendo una secuencia especificada de nucletido.c) orina conteniendo 19-androstenediona.

NOTA 4 Algunas veces un material de referencia se incorpora a un dispositivo fabricadoespecialmente.

EJEMPLO 1 Sustancia de punto triple conocido en una clula de punto triple.EJEMPLO 2 Vidrio de densidad ptica conocida, en un soporte de filtro de transmitancia.EJEMPLO 3 Esferas de granulometra uniforme montadas en un portamuestras demicroscopio.

NOTA 5 Algunos materiales de referencia tienen valores asignados que son metrolgicamentetrazables a una unidad de medida fuera de un sistema de unidades. Tales materiales incluyenvacunas a las que la Organizacin Mundial de la Salud ha asignado Unidades Internacionales (UI).

NOTA 6 En una medicin dada, un material de referencia puede utilizarse nicamente paracalibracin o para el aseguramiento de la calidad.NOTA 7 Dentro de las especificaciones de un material de referencia conviene incluir su trazabilidad,su origen y el proceso seguido.NOTA 8 La definicin segn ISO/REMCO es anloga, pero emplea el trmino proceso de medidapara indicar examen (ISO 15189:2007, 3.4), el cual cubre tanto una medicin de la magnitud comoel examen de una propiedad cualitativa.


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Material de referencia certificado (MRC): Material de referencia acompaado por ladocumentacin emitida por un organismo autorizado, que proporciona uno o variosvalores de propiedades especificadas, con incertidumbres y trazabilidades asociadas,empleando procedimientos vlidos.

Trazabilidad Metrolgica: Propiedad de un resultado de medida por la cual el resultadopuede relacionarse con una referencia mediante una cadena ininterrumpida ydocumentada de calibraciones, cada una de las cuales contribuye a la incertidumbre demedida

NOTA 1 En esta definicin, la referencia puede ser la definicin de una unidad de medida,mediante una realizacin prctica, un procedimiento de medida que incluya la unidad de medidacuando se trate de una magnitud no ordinal, o un patrn.NOTA 2 La trazabilidad metrolgica requiere una jerarqua de calibracin establecida.NOTA 3 La especificacin de la referencia debe incluir la fecha en la cual se utiliz dichareferencia, junto con cualquier otra informacin metrolgica relevante sobre la referencia, tal comola fecha en que se haya realizado la primera calibracin en la jerarqua.NOTA 4 Para mediciones con ms de una magnitud de entrada en el modelo de medicin, cadavalor de entrada debiera ser metrolgicamente trazable y la jerarqua de calibracin puede tenerforma de estructura ramificada o de red. El esfuerzo realizado para establecer la trazabilidadmetrolgica de cada valor de entrada debera ser en proporcin a su contribucin relativa alresultado de la medicin.NOTA 5 La trazabilidad metrolgica de un resultado de medida no garantiza por s misma laadecuacin de la uNOTA 6 La comparacin entre dos patrones de medida puede considerarse como una

calibracin si sta se utiliza para comprobar, y si procede, corregir el valor y la incertidumbreatribuidos a uno de los patrones.NOTA 7 La ILAC considera que los elementos necesarios para confirmar la trazabilidadmetrolgica son: una cadena de trazabilidad metrolgica ininterrumpida a un patrn internacionalo a un patrn nacional, una incertidumbre de medida documentada, un procedimiento de medidadocumentado, una competencia tcnica reconocida, la trazabilidad metrolgica al SI y los intervalosentre calibraciones (vase ILAC P-10:2002).NOTA 8 - Algunas veces el trmino abreviado trazabilidad se utiliza en lugar de trazabilidadmetrolgica as como para otros conceptos, como trazabilidad de una muestra, de un documento,de un instrumento, de un material, etc., cuando interviene el historial (traza) del elemento encuestin. Por tanto, es preferible utilizar el trmino completo trazabilidad metrolgica para evitarconfusin.

Acuerdo:Corresponde a la probabilidad de encontrar el mismo resultado en dos muestras

idnticas, analizadas en el mismo laboratorio, bajo condiciones de repetibilidad. [ISO16140:2003]

Concordancia:Corresponde a la probabilidad de encontrar el mismo resultado en dosmuestras idnticas, cuando son analizadas en condiciones de reproducibilidad o precisinintermedia. [ISO 16140:2003]


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Desviacin Negativa: (Falsos Negativos) Ocurre, en anlisis cualitativo, cuando elmtodo alternativo da un resultado negativo sin confirmacin y el mtodo de referencia daun resultado positivo. Esta desviacin se convierte en un resultado negativo falso cuandopuede demostrarse que el resultado verdadero es positivo. [G-ENAC-04]. Para el enfoquenormal de anlisis cualitativo, corresponde a muestras que arrojan resultado negativocuando la correcta caracterizacin indica que es positivo.

Desviacin Posit iva: (Falsos Positivos) Ocurre, en anlisis cualitativo, cuando el mtodoalternativo da un resultado positivo sin confirmacin y el mtodo de referencia da unresultado negativo. Esta desviacin se convierte en un resultado positivo falso cuandopuede demostrarse que el resultado verdadero es negativo. [G-ENAC-04]. Para el enfoquenormal de anlisis cualitativo, corresponde a muestras que arrojan resultado positivocuando la correcta caracterizacin indica que es negativo.

Las siguientes definiciones estn directamente relacionadas con el procesocorrespondiente a la estandarizacin y validacin de mtodos de anlisis microbiolgico:

Mtodo de referencia: Mtodo reconocido internacionalmente y ampliamente aceptado.[EN ISO 16140:2003].

Mtodo alternativo: Mtodo de anlisis que demuestra o estima para una categora dadade productos, el mismo analito de la misma forma que el mtodo de referencia. [EN ISO16140:2003].

Porcin de ensayo: Volumen de una suspensin de partculas inoculado en una unidaddetectora. [GTC 84:2003].

Intervalo de aplicacin: Intervalo de concentraciones de partcula que rutinariamente sesometen a medicin mediante un mtodo. [GTC 84:2003].

Recuentos paralelos: Cantidades de partculas o colonias en porciones analticas igualestomadas de la misma suspensin. [GTC 84:2003].

Detector: Placa de matriz slida o tubo de lquido que contiene un medio nutriente parael recuento o deteccin de partculas microbianas vivas.[GTC 84:2003].

Conjunto de deteccin: Combinacin de placas o tubos sobre los cuales se basa elclculo cuantitativo de concentracin microbiana en una muestra. [GTC 84:2003].

Distribucin homognea de Poisson: Distribucin completamente aleatoria decantidades de partculas cuando se muestrea una suspensin perfectamente mezclada.[GTC 84:2003].


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INTRODUCCIN

Los procesos de estandarizacin y de validacin de los mtodosde ensayo son requisitosimportantes en la prctica diaria delos laboratorios de anlisis. Sin embargo, la percepcin de suimportancia, porqu deben hacerse ycundo, y exactamente que necesita hacerse, parece serdeficiente entre el personal encargado de los laboratorios de ensayo. En la literatura tcnica existeya mucha informacinrelacionada a la estandarizacin y validacin de mtodos, especialmente enlo que concierne amtodos especficos, pero muy frecuentemente es subutilizada. Algunosanalistasven los procesos de estandarizacin y validacin de mtodos como tareas que slopueden hacerse en colaboracincon otros laboratorios y por consiguiente no la realizan.

El propsito del presente lineamiento es discutir los aspectos tcnicos relacionados con los

procesos de estandarizacin y validacin de mtodos de ensayo e incrementar la comprensin delos lectores de lo que est involucrado,de porqu esimportante y dar alguna idea de cmo puedelograrse.

La Subdireccin de Gestin de Calidad de Laboratorios de Salud Pblica del INS espera que elpresente lineamiento sea de gran utilidad para a) los coordinadores de los laboratorios de saludpblica, quienes son responsables de asegurar que los mtodos de ensayo bajo suresponsabilidadestn adecuadamente estandarizados y validados y b) los analistas responsablesde llevar a cabolosestudios sobre los mtodos de ensayo con propsitos de estandarizacin yvalidacin. Igualmente, algn otro miembro de la organizacin puede encontrar el presentelineamiento como fuente de informacin de soporte para el personal experimentado y para elpersonal nuevouna completa herramienta de aprendizaje.

De igual manera, el presente lineamiento est dirigido a aquellos laboratorios de salud pblica quepresentan la necesidad de estandarizar y validar mtodos de ensayo, pero que por diversascondiciones estn apenas en proceso de implementacin de los mtodos de ensayo o que con unsistema medianamente implementado, an estn en condiciones de participar en ensayosinterlaboratorios. El presente documento pretende dirigir al lector hacia los protocolos establecidosinternacionalmente sistos existen y cuando no, se da una introduccin sencilla al procesoinvolucrado enla validacin y proporciona algunas ideas basadas en conceptos estadsticos, quepermitan disearsus propias estrategias de validacin.


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ESTANDARIZACIN

La estandarizacin de un mtodo analtico puede definirse como la demostracin,mediante evidencia objetiva es decir mediante resultados de anlisis, que un mtodose comporta de conformidad con los requerimientos especficos de un laboratorio oentidad. Actualmente, dada la gran oferta de mtodos de ensayo disponibles en elmercado es preciso que las personas a cargo de los laboratorios tengan claridad acercade los factores que se deben tener en cuenta en el momento de seleccionar los ensayosque se realizan en el laboratorio. A continuacin se mencionan los criterios ms relevantesal momento de seleccionar un mtodo de ensayo,

Criterios ms importantes en la seleccin de un mtodo de ensayo

En primer lugar, es el laboratorio y sus necesidades los que definen los requerimientosanalticos de los mtodos, dichas necesidades usualmente responden a las necesidadesde los clientes y a las especificaciones que se encuentren establecidas en la normatividadvigente. Una vez identificadas las necesidades y requerimientos, el mtodo de ensayopuede ser seleccionado. Los criterios de seleccin del mtodo usualmente responden alas variables matriz de anlisis, el rango de anlisis, el costo asociado a la realizacin delensayo, rapidez del ensayo, la infraestructura con la que el laboratorio cuente al momentode implementar el mtodo, las condiciones de bioseguridad bajo las cuales se realiza elensayo y la disponibilidad del personal para llevar a cabo el proceso de estandarizacinde la metodologa de ensayo.

Por ejemplo, para la determinacin de E. Coli en agua para consumo humano, puedenutilizarse dos mtodos diferentes (en el ejemplo), un mtodo de filtracin por membrana yel otro es un mtodo de sustrato definido. Es el laboratorio quien define que mtodo debeescoger, de conformidad con los costos de realizar los anlisis, la rapidez en la obtencindel resultado, la infraestructura existente en el laboratorio al momento de realizar laimplementacin, la experiencia del personal del laboratorio con respecto a los mtodosseleccionados. nicamente despus de realizado un anlisis de este tipo, el laboratoriopuede tener la confianza al seleccionar el mtodo analtico.

Otro aspecto muy importante a tener en cuenta al momento de seleccionar un mtodo para realizarla estandarizacin es si se cuenta con mtodos normalizados para determinar el analito de interso si, por el contrario, es necesario el desarrollo de un mtodo propio. Dichos mtodos normalizados

son los que normalmente se encuentran documentados en normas ISO, ASTM, AOAC, USP,Standard Methods, entre otros. La gran ventaja de utilizar los mtodos normalizados se debe aque ya se cuenta con informacin amplia y detallada acerca del desempeo del mtodo de ensayobajo condiciones normales, por lo tanto la informacin a obtener en el ejercicio de estandarizacinconsiste en demostrar mediante resultados experimentales, que el mtodo normalizado secomporta dentro de los valores esperados en las condiciones del laboratorio que realiza el ejerciciode estandarizacin.


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Organizacin y personalEl laboratorio que tiene como objetivo la estandarizacin de sus mtodos de ensayo, debe disponerde una estructura organizacional en la cual las responsabilidades y roles del personal involucradoen las labores de anlisis estn claramente definidas en concordancia con las actividadesasignadas, igualmente es muy importante que el entrenamiento y calificacindel personalinvolucrado en los ejercicios de estandarizacin permita que el desarrollo de las competenciastcnicas necesarias para desempearse en la operacin de los mtodos de ensayo, toda vez quedicha competencia constituye un elemento crtico para asegurar la confiabilidad de los resultadosemitidos por el laboratorio.De igual manera, la Poltica de Calidad de la entidad debe constituirse como parte fundamental dela poltica general del laboratorio, esta debe ser entendida, implementada y mantenida, con unaformulacin clara y con un plan de formacin del personal de la empresa, de forma que se evite laresistencia personal a la implantacin de las polticas que permitirn el desarrollo de ejercicios deestandarizacin. Por lo tanto,la Poltica de Calidad se debe someter a un constante proceso demejora, que se relaciona con cuestiones de productividad, creatividad, innovacin, necesidadesactuales y proyecciones a futuro del laboratorio.InstalacionesEn cuanto a las instalaciones, el laboratorio deber contar con las instalaciones adecuadas para larealizacin de los ensayos, asegurando que el diseo y la distribucin de los equipos y reactivosen las reas no afecte la confiabilidad de los resultados obtenidos a partir del uso de los mtodosde ensayo. De esta manera, se garantiza que el entorno en el que se realiza el ejercicio deestandarizacin no ser una fuente adicional de errores aleatorios en los mtodos de ensayo quehan sido seleccionados. As mismo, se debe asegurar que el laboratorio cumple con todos losrequerimientos tcnicos de seguridad industrial y salud ocupacional.Equipos, reactivos y material

Equipos

Para garantizar la confiabilidad de los resultados en la estandarizacin de los mtodos deensayo, el laboratorio debe disponer de los equipos necesarios (nmero yespecificaciones tcnicas) y de capacidad adecuada para responder a las exigencias delos ensayos que realizan. En este sentido, es preciso resaltar la gran importancia de unSistema de Gestin Metrolgico que garantice que los equipos se encuentran en ptimascondiciones metrolgicas y que de acuerdo a la planeacin, su desempeo no va a afectarla calidad y confiabilidad de los resultados obtenidos.

Se debe contar con las respectivas instrucciones de manejo y verificacin (cuandoaplique) de los equipos, las cuales deben estar disponibles en los sitios de operacin de

los mismos y ser operados por personal entrenado, que tenga la competencia tcnica yse encuentre autorizado para el uso de los mismos.

Reactivos

Los reactivos deben tener la calidad requerida por el mtodo de ensayo y la preparacinen el laboratorio (si aplica) debe ser realizada por personal calificado. De igual forma lacalidad del agua utilizada en el desarrollo del ejercicio de estandarizacin, debe


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controlarse adecuadamente mediante los anlisis fisicoqumicos y microbiolgicosaplicables segn el uso ver GTC 151:2006. Estas actividades deben ser realizadas deacuerdo a procedimientos que el laboratorio tenga documentados.

Material

Se debe contar segn aplique, con lineamientos de preparacin, manipulacin yalmacenamiento de los Materiales de Referencia, pues estos son fundamentales duranteel desarrollo de un ejercicio, bien sea de validacin o de estandarizacin. De igual manera,el laboratorio debe de garantizar la trazabilidad de la informacin relacionada con laprocedencia, trazabilidad, recepcin, almacenamiento y utilizacin de los mismos.

Se puede contar con diferentes materiales de referencia:

Procedentes de proveedores externos

Materiales de referencia primarios

Materiales de referencia secundarios

Mezclas o diluciones que se preparan en el laboratorio.

Sistemas experimentales

Los estudios realizados en el laboratorio pueden ser desarrollados a partir de sistemasqumicos, fsicos, celulares, microbianos y animales.

Sistemas fsicos y qumicos: La instrumentacin empleada para la obtencin de datosdebe estar correctamente instalada, diseada y dimensionada. Se podrn utilizarmateriales de referencia para verificar estos sistemas experimentales. En los sistemasautomatizados, los datos generados se tratarn como datos primarios y seconservarn como evidencia de idoneidad del sistema.

Sistemas biolgicos: Para asegurar la calidad de los datos que proporcionan estossistemas, se crearn y mantendrn condiciones apropiadas segn aplique, para elcultivo, mantenimiento, alojamiento, cuidado y/o confinamiento de los mismos. Se

debe registrar la informacin que soporte la idoneidad del sistema, tales como pases,identificacin bioqumica, medidas de cuarentena, morbilidad, mortalidad,comportamiento, etc.

El sistema experimental hace parte de las especificaciones del mtodo, el cual a su vezhace parte del sistema analtico.


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Desarrollo del ejercicio de estandarizacin

Antes de hablar de las actividades a realizar durante un ejercicio de estandarizacin, espreciso mencionar que usualmente un ejercicio de estandarizacin tiene un alcancelimitado, dado que su intencin es demostrar mediante evidencia objetiva que el mtodoes capaz de generar resultados estadsticamente vlidos y confiables en las condicionesde trabajo del laboratorio, sin embargo, al tratarse de una aproximacin inicial el nmerode ensayos y la complejidad del ejercicio son bajos. Es decir, la estandarizacin de unmtodo de ensayo es el paso inicial hacia la validacin, bien sea primaria o secundaria deun mtodo, toda vez que proporciona al laboratorio un panorama inicial del desempeodel mtodo en las condiciones normales del laboratorio.

Caractersticas de aplicabilidad

Dentro del anlisis de aplicabilidad, es preciso que el laboratorio evale los parmetrosde aplicabilidad del mtodo: precisin, sensibilidad, grado de selectividad, tiempo deanlisis, tamao de la muestra, cualificacin del personal y se determine si el mtodoseleccionado cumple con el uso previsto y responde de forma adecuada a las necesidadesdel cliente y se ajusta a la disponibilidad de equipos y materiales del laboratorio. Esteestudio inicial se realiza por el rea tcnica del laboratorio la cual conoce plenamente elmtodo que es objeto de estandarizacin.

Estudios de estabilidad de la muestra

La estabilidad de la muestra preparada para analizar se evala durante la fase dedesarrollo del mtodo junto con la robustez.La estabilidad de las disoluciones de lamuestra despus de su preparacin segn el mtodo de ensayo, debe ser evaluada deacuerdo al tiempo requerido para su realizacin. De la misma forma debe demostrarse laestabilidad de las muestras y materiales de referencia preparados si se utilizan durantevarios das.

Puesta a punto

La puesta a punto del mtodo de ensayo, incluye desde los primeros estudios deexploracin con materiales de referencia, hasta la utilizacin en muestras reales quegaranticen el buen funcionamiento del sistema en el momento del anlisis.El estudio de

robustez se utiliza para optimizar y ver la criticidad del valor de los parmetros del mtodoantes de validar. A partir de este estudio se definirn las caractersticas de idoneidad oconjunto de parmetros que garantizan que el sistema responde en el momento delanlisis, a los requisitos fijados.

Caractersticas de desempeo


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Esta ltima etapa permite conocer las caractersticas de desempeo del mtodo para suaplicacin rutinaria.

Las caractersticas de desempeo comprenden los cinco criterios fundamentales devalidacin (no necesariamente aplicables en todos los casos) y de las que se derivan enla prctica todos los parmetros de validacin:

La capacidad de un mtodo para determinar el analito sin interferencias de impurezas,productos de degradacin, excipientes u otras sustancias presentes en la muestra. Serelaciona con el trmino SELECTIVIDAD.

La proporcionalidad entre concentracin del analito y respuesta del instrumento. Serelaciona con los trminos LINEALIDAD Y RANGO.

La dispersin de una serie de resultados alrededor del valor medio o central. Serelaciona con el trmino PRECISIN.

La diferencia entre el valor hallado en el anlisis y el valor verdadero. Se relaciona conel concepto de EXACTITUD.

La cantidad mnima de analito requerida para obtener un resultado significativo. Estrelacionada con los trminos de LMITE DE DETECCIN y LMITE DECUANTIFICACIN.


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VALIDACIN

El vocabulario internacional de metrologa [VIM 2012] define el trmino validacin comouna verificacin de que los requisitos especificados son adecuados para el uso previsto.Ms especficamente, la norma tcnica colombiana NTC ISO/IEC 17025:2005 define elproceso de validacin de un mtodo de ensayo o calibracin como la confirmacin, atravs del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitosparticulares para un uso especfico. Por lo tanto, una validacin es una confirmacinexperimental de que el mtodo de ensayo cumple con los criterios definidos para un usoprevisto. Dada la gran variedad de mtodos de ensayo, el presente lineamiento abordarael esquema de validacin desde tres grandes bloques que son: La validacin de mtodoscualitativos para el anlisis microbiolgico, la validacin de mtodos cuantitativos para elanlisis microbiolgico y la validacin de mtodos cuantitativos para anlisis fisicoqumico.

Validacin de Mtodos Cualitativos de Anlisis Microbio lgico

Condiciones Generales

Los mtodos de ensayo sobre los cuales se pueden aplicar los criterios definidos en el presentelineamiento pueden ser:

o Mtodos biolgicos (se basan en la respuesta de biomodelos, clulas, microorganismos):Inoculacin de biomodelos, aislamientos virales, etc.

o Mtodos bacteriolgicos (se basan reacciones o determinacin presencia/ausencia debacterias): Anlisis presencia/ausencia en diferentes matrices (aguas, material biolgico,etc).

o Mtodos parasitolgicos: (se basan reacciones o determinacin presencia/ausencia deparsitos): Anlisis presencia/ausencia de diversos parsitos en diferentes matrices(aguas, material biolgico, etc)

o Mtodos de estudio viral (se basan en tcnicas biolgicas o de biologa molecular paraidentificacin de virus): Mtodos de PCR, RT-PCR, etc.

Los lineamientos que se presentan en esta seccin corresponden a criterios de orientacingeneral y puede ser necesario consultar la bibliografa relacionada para profundizar en los

detalles de aplicabilidad requeridos. En caso de que existan lineamientos relacionados con elmtodo de ensayo para realizar la respectiva validacin, emitidos por entes internacionales,nacionales o fabricantes que avalan los mtodos adoptados, estos podrn ser aplicados por ellaboratorio siendo pues ello una equivalencia de dicho esquema, con lo declarado en elpresente lineamiento.

Las actividades de validacin deben realizarse sobre muestras naturales o, en su defecto, conmuestras inoculadas, preferiblemente no esterilizadas para que exista microbiota interferente.


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De acuerdo a los parmetros a estudiar puede ser necesario fortificar o adicionar lasmuestras incluidas en el estudio de validacin; para ello se deben seguir los procedimientosdefinidos por el laboratorio para realizar la estandarizacin previa del inculo que servir comomuestra concentrada que ser adicionada.

Antes de iniciar el proceso de validacin, se debe haber trabajado suficientemente con elmtodo de ensayo con el fin de asegurar el conocimiento que ofrezca la garanta de que lavalidacin puede ser satisfactoria [AEFI 2000]. Los aspectos generales para laestandarizacin de un mtodo de ensayo cuando se implementa por primera vez en ellaboratorio se encuentran definidos en el numeral anterior del presente lineamiento.nicamente cuando el mtodo de ensayo est plenamente definido en todos sus detalles y setiene el convencimiento de que las condiciones descritas son idneas para alcanzar los

resultados esperados, debe iniciarse el ejercicio validacin. A continuacin se listan losaspectos relacionados ms relevantes:

o Disponer y revisar detalladamente la norma aplicable (ltima versin vigente o anteriorcon justificacin tcnica de su uso), el procedimiento de anlisis documentado por ellaboratorio y los documentos relacionados, correspondientes a cada ensayo incluidoen el alcance.

o Realizar un inventario de los materiales y reactivos que se necesitan para la el ejerciciode validacin primaria o secundaria: Identificacin, precauciones, calidad, cantidad,grado de pureza, etc.

o Verificacin y optimizacin de las condiciones metrolgicas de los equipos. Se debecontar con los respectivos soportes de mantenimiento, calibracin y/o calificacinsegn aplique, de conformidad con el esquema de aseguramiento metrolgicoestablecido en el laboratorio.

o Aseguramiento de las condiciones ambientales relevantes para la ejecucin de losensayos.

o De acuerdo a la naturaleza del ensayo, el mtodo adoptado y las posiblesmodificaciones que se introduzcan al mismo, se debe definir el tipo de ejercicio adesarrollar, bien sea de validacin primaria o secundaria y de acuerdo a dicho criterio,seleccionar el alcance, extensin y parmetros a incluir en el mismo.

En este punto, es de comn uso la aplicacin de una lista de chequeo en la que severifica el cumplimiento en los aspectos previamente citados. Dicho registro sedebeincluir dentro de las evidencias del ejercicio de validacin.

Contenido

Extensin del ejercicio de validacin


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La extensin y enfoque del ejercicio de validacin depende fundamentalmente del tipo demetodologa analtica que adopta el laboratorio, la naturaleza del mismo y las matrices sobre lascuales se aplique. A continuacin se presentan algunos criterios generales:

El laboratorio utiliza "plenamente" un mtodo normalizado: El laboratorio tiene queverificar que es capaz de alcanzar los rendimientos caractersticos del mtodopublicados (o que sea capaz de cumplir los requisitos de la tarea analtica); deberealizar estudios de precisin (acuerdo y concordancia), exactitud, sensibilidad,selectividad/especificidad, tasa de falsos negativos y falsos positivos.

El laboratorio utiliza un mtodo normalizado, pero se quiere aplicar a una nuevamatriz: El laboratorio tendr que verificar que no se identifican nuevas fuentes de erroren el sistema cuando se aplica a la matriz en cuestin. El mismo tipo de validacindescrito en el tem anterior es requerido; adicionalmente debe estudiarse el efectomatriz y lmite de deteccin para la nueva matriz.

El mtodo ha sido publicado en la literatura cientfica sin caractersticas analticas o sehan desarrollado de forma interna: El laboratorio debe realizar estudios de precisin(acuerdo y concordancia), exactitud, sensibilidad, selectividad/especificidad, tasa defalsos negativos, tasa de falsos positivos, efecto matriz y lmite de deteccin.

Diseo experimental del ejercicio

De manera general para llevar a cabo un ejercicio de Validacin es necesario definir

previamente los aspectos relevantes de ejecucin que den respuesta al objetivo que sepretende, los cuales se detallan a continuacin:

Objetivo

Se debe definir de manera puntual y concreta cul es el objetivo del ejercicio, detallandoel tipo de validacin a realizar, bacteria, virus o parsito target y el respectivo mtodo deensayo.

Alcance

Se debe definir en forma clara el alcance del ejercicio, lo cual incluye el microorganismo

target y las matrices sobre las cuales aplica.Responsables

Relacin del personal responsable de llevar a cabo el ejercicio (analistas) y de los querevisarn y aprobarn los resultados del mismo.

Parmetros a estudiar


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Fundamentado en los atributos del mtodo de ensayo y el tipo de ejercicio a desarrollar,se establecen los parmetros a evaluar dentro del estudio, con el fin de determinar lascaractersticas de desempeo. A continuacin se relacionan dichos parmetros, teniendoen cuenta que de acuerdo a la metodologa, se puede aplicar un grupo especfico de losmismos:

Acuerdo

En el anlisis cualitativo, la variable de acuerdo corresponde al criterio de PRECISIN del mtodode ensayo y es equivalente al enfoque de repetibilidad que se maneja para los mtodoscuantitativos.

En el ejercicio de validacin, el anlisis de acuerdo se estructura sobre la base de los resultadosobtenidos al evaluar rplicas de materiales de acuerdo al tipo de ensayo en condiciones derepetibilidad, es decir manteniendo constante el Profesional Analista, equipos, muestra, mtodo yrealizados en un perodo de tiempo lo ms corto posible.

El anlisis de esta variable se fundamenta en determinar la PROBABILIDAD que los resultadosobtenidos (positivos o negativos segn el enfoque del mtodo) al analizar las rplicas del materialde estudio, sean equivalentes entre s.

De manera consecutiva se van determinando las siguientes probabilidades:

La probabilidad de obtener un resultado determinado en una rplica,mediante la relacin entredicho resultado y el total de muestras analizadas.

La probabilidad que un parde rplicas den resultados iguales, es el cuadrado de la rplicaindividual.

La probabilidad que todas las rplicas den un mismo resultado entre s, es la suma de lasobtenidas para resultados positivos y negativos.

El ACUERDO se calcula promediandolas probabilidades de obtener pares con el mismoresultado y luego transformando el dato obtenido a porcentaje.

Concordancia

En el anlisis cualitativo, la variable de concordancia corresponde al criterio de PRECISIN delmtodo de ensayo y es equivalente al enfoque de reproducibilidad intermedia que se maneja paralos mtodos cuantitativos.En el ejercicio de validacin, el anlisis de concordancia se estructura sobre la base de losresultados obtenidos al evaluar materiales de acuerdo al tipo de ensayo en condiciones deprecisin intermedia, modificando en el sistema de medicin el Profesional Analista y/o el da deejecucin del ensayo (tiempo).


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El anlisis de esta variable se fundamenta en establecer la PROBABILIDAD que cada resultadoobtenido (positivo o negativo segn el enfoque del mtodo), tenga otro(s) equivalente de todos losresultados generados por los diferentes profesionales analistas o en diferentes das de montaje.

De manera consecutiva se van realizando los siguientes clculos: Establecer el nmero total de resultados con los que TERICAMENTE puede ser

comparado cada dato obtenido, realizando posteriormente la respectiva sumatoria.

Establecer el nmero de resultados que en la PRCTICA fueron equivalentes a cadadato obtenido, realizando posteriormente la sumatoria.

Establecer la relacin entre los equivalentes obtenidos en la prctica y los quetericamente deberan presentarse. Es decir:

Equivalencias obtenidas en el ejercicio Equivalencia que tericamente deberan presentarse

Transformar el dato obtenido a porcentaje.

Especificidad/Selectividad, Sensibilidad, Exactitud y Tasa de falsos positivos y falsosnegativos

Las caractersticas de desempeo de un mtodo cualitativo asociadas con la exactitud,especificidad y sensibilidad pueden definirse numricamente. Estas se relacionan con lasproporciones relativas de muestras que se supone son positivos o negativos (segn el

enfoque del mtodo), sobre la base de la primera impresin (presunta), comparada con laverdadera caracterizacin de la muestra utilizada.

Despus de haber realizado n ensayos, sus resultados se dividen en cuatro categoras:

Nmero de muestras positivas, caracterizadas como tal, VERDADEROSPOSITIVOS (VP)

Nmero de muestras positivas, caracterizadas como negativas, FALSOSNEGATIVOS (FN)

Nmero de muestras negativas, caracterizadas como tal, VERDADEROS

NEGATIVOS (VN) Nmero de muestras negativas, caracterizadas como positivas, FALSOS

POSITIVOS (FP)

La caracterizacin de las muestras como POSITIVAS o NEGATIVAS en los ensayoscualitativos, tendr un enfoque particular a cada tipo de ensayo, pudiendo denominarsecomo:


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Para ensayos de identidad: La muestra POSITIVA corresponder a aquella quecontiene el analito de intersy NEGATIVA, la que no lo contiene.

Para ensayos de inocuidad: La muestra POSITIVA corresponder a aquellaque muestra un resultado de no inocuo y NEGATIVA, la que muestra unresultado inocuo.

Para ensayo de neutralizacin: La muestra POSITIVA corresponder a aquellaque posee el componente capaz de realizar la neutralizaciny NEGATIVA,la que no lo contiene.

Estas frecuencias se expresan en una tabla de 2 x 2 o tabla de contingencia, la cualpermite caracterizar el sistema fundamentado en el concepto de probabilidad,diferenciando las muestras en dos categoras, positivo/negativo y estableciendo unacomparacin respecto al resultado obtenido mediante un mtodo de referencia,confirmatorio o una caracterizacin incuestionable.

Caracterizacin real de la muestra

Resultado obtenido alaplicar el mtodo

Positivo (+) Negativo (-)

Presunto resultado (+) VP FP

Presunto resultado (-) FN VN

Posteriormente se calculan los siguientes parmetros:

N = Nmero total de muestras (VP+VN+FP+FN)

N-= Nmero de resultados caracterizados previamente como negativos (VN+FP)

N+= Nmero de resultados caracterizados previamente como positivos (VP+FN)

A partir de esta informacin, se calculan los porcentajes de exactitud, especificidad ysensibilidad as:

Exactitud (VP+VN/N) * 100

Fraccin de positivos y negativos asignados correctamente

Sensibilidad (VP/N+)* 100


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Fraccin de los positivos totales correctamente asignada en el presunto resultado

Especificidad/Selectividad (VN/N-)* 100

Fraccin de los negativos totales correctamente asignados en el presunto resultado

Tasa de falsos posit ivos FP/ (VN+FP)

Fraccin de los positivos observados, asignados errneamente

Tasa de falsos negativos(FN/(VP+FN)

Fraccin de los negativos observados, asignados errneamente

Lmite de deteccin

El lmite de deteccin para pruebas cualitativas se describe mejor como "LOD 50" o nmero deorganismos por gramo o mililitro de muestra en los cuales el 50% de las pruebas son positivas Eltrmino LOD50" no tiene el mismo significado que el Lmite de deteccin (LD) y Lmite decuantificacin (LC) para los ensayos de naturaleza qumica; se utiliza para ensayos microbiolgicospara definir un rango determinado de partculas (bacterias, virus o macromolcula gentica) en elque los mtodos son capaces de detectar la mnima cantidad de analito en una porcin analtica.

El clculo del LD50permite tener en cuenta los fallos en la deteccin debidos a homogeneidadincompleta del analito en la muestra o suspensin inicial. El estudio experimental se realiza as:

Se trabajan blancos adicionados con concentraciones que se estiman cercanas al nivel dedeteccin del mtodo de ensayo o muestras naturalmente contaminadas que se diluyenapropiadamente buscando el citado lmite.

Se deben trabajar por lo menos cuatro niveles de concentracin y realizar mnimo diez (10)rplicas de cada nivel; adicionalmente debe trabajarse el nivel de cero (0) concentracin.

El clculo del LOD50 corresponde a la concentracin en la cual se evidencia un 50% deresultados positivos y 50% de resultados negativos.

Se deben calcular los lmites de confianza a un 95% de confianza utilizando un mtodo noparamtrico tal como Speerman Karber. Los lmites de confianza calculados se asumen con laincertidumbre asociada al LOD 50.

Las estimaciones de los percentiles, como la LOD90 corresponde a la concentracin del analitoen la cual el 90% de los resultados obtenidos son positivos.


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Probabilidad de error asociada al resultado del ensayo

La probabilidad de error asociada al resultado, en mtodos cualitativos est directamenterelacionada con la estimacin de la incertidumbre en la medicin, por lo tanto ser tratadoposteriormente en el presente lineamiento.

Modelo de ejecucin

Categoras y matrices: Se debe especificar el tipo de muestras que se van a utilizar enel ejercicio (naturales, Materiales de Referencia primarios o secundarios, estndaresinternos, controles de kits comerciales, etc.), detallando la identificacin que se va a

dar a las mismas y en el caso de Materiales de Referencia, toda la informacin quesoporte la vigencia y trazabilidad respectiva, incluidos los certificados de calidadexpedidos por el fabricante. Para las muestras naturales que se emplean, se deberegistrar la identificacin de la muestra y los datos que soporten la trazabilidad de lainformacin relacionada con su origen y caracterizacin. De igual forma, de acuerdo ala naturaleza de las muestras, estas pueden ser categorizadas y seleccionadas (porejemplo por el mtodo de bloques incompletos) de tal forma que se logre unarepresentatividad de las diferentes matrices allegadas para estudio.

Tamao de muestra: Debe definirse el tamao de muestra para el ejercicio, criterioque puede proceder de lineamientos establecidos en publicaciones relacionadas oclculo estadstico de la misma.

Obtencin de muestras: Se debe declarar la fuente de las muestras y/o materiales dereferencia empleados en el ejercicio y la evidencia de que han estado en adecuadascondiciones de almacenamiento.

Caracterizacin e identificacin de muestras: Se debe detallar la caracterizacin delas muestras y/o materiales de referencia empleados con evidencia de trazabilidadcuando aplique, as como la identificacin que se manejar en el ejercicio, con el finde tener claridad para el anlisis de datos.

Reactivos: Se deben detallar los reactivos utilizados, especificando lote, vencimiento(si aplica) y anexando los respectivos certificados de anlisis o trazabilidad de losmismos.

Equipos: Se debe realizar un listado de los equipos de medicin y auxiliares,detallando su identificacin y las especificaciones tcnicas e instrumentales de cadauno, segn aplique.

Metodologa de ejecucin


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Fundamento del mtodo de ensayo: Se debe detallar el fundamento del mtodo deensayo.

Competencia tcnica de los analistas: Se debe presentar de manera resumida laevidencia de competencia tcnica del personal analista que participa en el ejercicio.

Fuente de los datos: La recoleccin de datos deber hacerse en formatos de capturade resultados que hacen parte del Sistema de Gestin de Calidad, a partir de loscuales se alimenta el formato que se haya diseado de acuerdo al tipo de anlisis y elparmetro a evaluar.

Presentacin de los datos: Se debe describir la metodologa de presentacin de losdatos, tanto primarios como resultados de anlisis para que se reflejen en el Informede Validacin.

Anlisis de datos: Se debe aplicar la metodologa de anlisis de acuerdo al tipo deensayo y parmetro a estudiar.

Criterios de aceptacin: En este tem se deben definir las especificaciones dedesempeo del mtodo, de tal forma que se tenga el criterio para comparar los datosobtenidos para los diferentes parmetros evaluados en el ejercicio de Validacin.Dichos criterios pueden corresponder individualmente o en conjunto a criteriosdefinidos desde el mtodo de ensayo u objetivos analticos del laboratorio

fundamentados en normatividad vigente y los requisitos del cliente. Cuando dichoscriterios no se encuentren documentados, el objetivo del ejercicio ser determinarlos.

Validacin de Mtodos Cuantitativos de Anlisis Microbiolgico

CONDICIONES GENERALES

Los mtodos microbiolgicos cuantitativos corresponden a ensayos orientados a determinar losrecuentos de microorganismos en una muestra determinada. Para efectos del presente documento,el alcance corresponde a recuentos bacterianos y parasitolgicos.

Los lineamientos que se presentan en este documento corresponden a criterios de orientacingeneral, puede ser necesario consultar la bibliografa relacionada para profundizar en losdetalles de aplicabilidad requeridos. En caso de que existan lineamientos relacionados con lametodologa para realizar la respectiva validacin, emitidos por los entes internacionales,nacionales o fabricantes que avalan los mtodos adoptados, estos podrn ser aplicados por ellaboratorio siendo equivalente dicho esquema, a lo establecido en el presente documento.


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Las actividades de validacin deben realizarse sobre muestras naturales o, en su defecto, conmuestras inoculadas, preferiblemente no esterilizadas para que exista microbiota interferente.

De acuerdo a los parmetros a estudiar puede ser necesario fortificar o adicionar lasmuestras incluidas en el estudio de validacin; para ello se deben seguir los procedimientosdefinidos por el laboratorio para realizar la estandarizacin previa del inculo que servir comomuestra concentrada que ser adicionada.

Para el anlisis de datos es necesario tener claridad que las pruebas estadsticas de estimaciny contraste frecuentemente empleadas se basan en suponer que se ha obtenido una muestraaleatoria de una distribucin de probabilidad de tipo normal o de Gauss. Pero en muchasocasiones esta suposicin no resulta vlida, y en otras la sospecha de que no sea adecuada

no resulta fcil de comprobar, por tratarse de muestras pequeas. En estos casos se disponede dos posibles mecanismos:o Los datos se pueden transformar de tal manera que sigan una distribucin normal,

por ejemplo la transformacin a Log10 y Ln aplicable a los recuentosmicrobiolgicos.

o Aplicar pruebas estadsticas que no se basan en ninguna suposicin en cuanto ala distribucin de probabilidad a partir de la que fueron obtenidos los datos, y porello se denominan pruebas no paramtricas (distribucin free), mientras que laspruebas que suponen una distribucin de probabilidad determinada para los datosse denominan pruebas paramtricas.

Antes de iniciar el proceso de Validacin, se debe haber trabajado suficientemente con elmtodo de ensayo con el fin de asegurar el conocimiento que ofrezca la garanta de que lavalidacin puede ser satisfactoria [AEFI 2000]. Los lineamientos generales para el montaje yla estandarizacin de un mtodo de ensayo cuando se implementa por primera vez en ellaboratorio se encuentran en el presente documento. Solo cuando el mtodo de ensayo estplenamente definido en todos sus detalles y se tiene el convencimiento de que las condicionesdescritas son idneas para alcanzar los resultados esperados, debe iniciarse el ejerciciovalidacin. A continuacin se listan los aspectos relacionados ms relevantes:

o Disponer y revisar la norma aplicable (ltima versin vigente o anterior con justificacintcnica de su uso), el documento que describe el mtodo de ensayo y los documentosrelacionados, correspondientes a cada ensayo incluido en el alcance.

o Inventario de los materiales y reactivos que se necesitan para la Validacin primaria osecundaria: Identificacin, precauciones, calidad, cantidad, grado de pureza, etc.

o Verificacin y optimizacin de las condiciones metrolgicas de los equipos. Se debecontar con los respectivos soportes de mantenimiento, calibracin y/o calificacin

segn aplique, de acuerdo al programa de aseguramiento metrolgico.o Aseguramiento de las condiciones ambientales relevantes para la ejecucin de los

ensayos.o De acuerdo a la naturaleza del ensayo, el mtodo adoptado y las posibles

modificaciones que se introduzcan al mismo, se debe definir el tipo de ejercicio adesarrollar, bien sea de validacin primaria o secundaria y de acuerdo a dicho criterio,seleccionar el alcance, extensin y parmetros a incluir en el mismo.


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CONTENIDO

Extensin del ejercic io de validacin

La extensin y enfoque del ejercicio de validacin depende fundamentalmente del tipo demetodologa analtica que adopta el laboratorio, la naturaleza del mismo y las matrices sobre lascuales se aplique. A continuacin se presentan algunos criterios generales: El laboratorio utiliza plenamente un mtodo normalizado y/o reconocido por la

comunidad cientfica, aplicado estrictamente sobre las matrices definidas por elmismo: El laboratorio tiene que verificar que es capaz de alcanzar los rendimientoscaractersticos del mtodo publicados (o que sea capaz de cumplir los requisitos dedesempeo analtico); debe realizar estudios como mnimo de precisin y

proporcionalidad.

El laboratorio utiliza un mtodo normalizado, pero se quiere aplicar a una nuevamatriz: El laboratorio tendr que verificar que no se identifican nuevas fuentes de erroren el sistema cuando se aplica a la matriz en cuestin. El mismo tipo de validacindescrito en el tem anterior es requerido, pero adicionalmente debe realizar estudiosde efecto matriz, recuperacin y lmite de deteccin.

El mtodo ha sido publicado en la literatura cientfica sin caractersticas analticas o sehan desarrollado de forma interna: El laboratorio debe realizar estudios de precisin,proporcionalidad, recuperacin, exactitud relativa, efecto matriz, lmite de deteccin yrobustez.

Diseo experimental del ejercicioDe manera general para llevar a cabo un ejercicio de Validacin es necesario definirpreviamente los aspectos relevantes de ejecucin que den respuesta al objetivo que sepretende, los cuales se detallan a continuacin:

ObjetivoSe debe definir de manera puntual y concreta cul es el objetivo del ejercicio, detallandoel tipo de validacin a realizar, ensayo, analito y el respectivo documento que detalla elmtodo de ensayo.

Alcance

Se debe definir en forma clara el alcance del ejercicio, lo cual incluye el rango deconcentraciones (segn aplique) y las matrices sobre las cuales aplica, en coherencia conlos objetivos de la validacin.

ResponsablesRelacin de las personas responsables que llevarn a cabo el ejercicio (analistas) y delos que revisarn y aprobarn los resultados del mismo.


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Parmetros a estudiarFundamentado en los atributos del mtodo de ensayo y el tipo de ejercicio a desarrollar,se establecen los parmetros a evaluar dentro del estudio, con el fin de determinar lascaractersticas de desempeo. A continuacin se relacionan dichos parmetros, teniendoen cuenta que de acuerdo a la metodologa, se puede aplicar un grupo especfico de losmismos:

o Efecto matrizPor principio el ejercicio de validacin primaria o secundaria tendr como uno de susobjetivos evaluar el comportamiento del mtodo en las diferentes matrices aplicables. Sin

embargo, si se decide que dicha aplicacin sea gradual o si se identifica la necesidad detrabajar el mtodo con matrices fundamentalmente diferentes a las incluidas, se debevalorar el efecto que la matriz puede tener sobre el resultado de ensayo utilizandoherramientas tales como:

Clculo de los porcentajes de recuperacin en muestras fortificadas: Se preparaninculos de concentraciones baja y media, con los cuales se fortifican las matrices aevaluar, realizando mnimo seis (6) rplicas. Se evala el porcentaje de recuperacinpromedio de conformidad con los criterios de aceptacin establecidos para cadametodologa de anlisis y/o los establecidos previamente en la validacin primaria osecundaria del ensayo.

Aplicacin de ndices de Recuperacin establecidos por los mtodos de ensayonormalizados.

o Precisin: Repetibilidad y Precisin Intermedia

REPETIBILIDAD

La repetibilidad puede ser expresada matemticamente mediante medidas de dispersiny el valor aceptado depende de si se cuenta con la especificacin definida por el mtodoanaltico o en caso contrario, estar orientada a definirla desde la validacin del mismo.De acuerdo a la naturaleza del mtodo de ensayo se pueden utilizar las siguientesherramientas:

Utilizando la desviacin estndar relativa

La desviacin estndar relativa (%RSD) de una serie de medidas, las cuales de acuerdoal comportamiento del mtodo debern ser transformadas para obtener una distribucinnormal de los datos. Los pasos a seguir son:


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Para cada analista participante (A1An) , obtener datos ci.cn de duplicados de losrecuentos de microorganismos, en condiciones de repetibilidad (mismo analista,mismo mtodo, misma muestra, mismas condiciones ambientales y en un perodocorto de tiempo).

Calcular la media y la desviacin estndar relativa de cada corrida, aplicando latransformacin de datos segn se requiera.

Calcular la media de repetibilidad de cada analista as:

%RSDA1 = ((RSDc1)2+ (RSDc2)2 +..(RSDcn)2) /n

A fin de obtener la %RSDragrupada ponderada en donde el laboratorio cuenta conanalistas A1An se realiza el clculo de la media cuadrtica de las repetibilidadespersonales as: (RSDA1)2+ (RSDA2)2+(RSDAn)2 /n

Utilizando el Lmite de repetibilidad

Se calcula la diferencia absoluta entre duplicados de una serie de medidas, las cuales deacuerdo al comportamiento del mtodo debern ser transformadas para obtener unadistribucin normal de los datos y se trazan a un lmite de repetibilidad el cual correspondeal valor por debajo del cual cabe esperar que la diferencia absoluta entre dos resultadosde prueba obtenidos en condiciones de repetibilidad (misma muestra, mismo operador,mismo aparato, mismo laboratorio y breve lapso entre ambos) se encuentre en un margen

especfico de probabilidad (tpicamente 95 %), por lo que r = 2,8 %RDSr.PRECISIN INTERMEDIA

El objetivo del estudio de precisin intermedia es determinar la variabilidad del mtodo,efectuando una serie de anlisis sobre la misma muestra, en un mismo laboratorio, peroen condiciones operativas diferentes. Tpicos factores a estudiar incluyen el da y elanalista. No es necesario estudiar cada uno de estos factores individualmente, sino quees suficiente comprobar que la variabilidad aportada por el conjunto de factores estdentro de los lmites establecidos. Para este estudio las muestras deben ser preparadasindependientemente y analizarse como mnimo por duplicado.

A continuacin se plasma un ejemplo para el diseo experimental:

Instrumento A Analista X Da 1 Da 2Analista Y Da 1 Da 2

Instrumento B Analista X Da 1 Da 2Analista Y Da 1 Da 2

Utilizando la desviacin estndar relativa


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La estimacin de la Precisin intermedia se realiza con el clculo del porcentaje dedesviacin estndar relativa global de las respuestas obtenidas, es decir, considerandocada resultado independientemente. Generalmente se aceptan valores de %RSD de laprecisin intermedia, inferiores al doble del %RSD de la repetibilidad del mtodo. En casode que no se cumpla, es necesario evaluar cul es el factor responsable de estavariabilidad.

Utilizando el Lmite de repetibilidad Se calcula la diferencia absoluta entre los resultados de una serie de medidas obtenidasde acuerdo al factor modificado dentro del sistema de medicin, las cuales de acuerdo alcomportamiento del mtodo debern ser transformadas para obtener una distribucin

normal de los datos y se trazan a un lmite de reproducibilidad (intermedia) quecorresponde al valor por debajo del cual cabe esperar que la diferencia absoluta entre dosresultados de prueba obtenidos en condiciones de precisin intermedia (material idnticoobtenido modificando uno o ms factores en el montaje y utilizando el mtodo de ensayoestandarizado) se encuentre en un margen especfico de probabilidad (tpicamente 95 %);R = 2,8 %RDsR.

REPRODUCIBILIDAD

La reproducibilidad estudia la variacin de los resultados inter-laboratorio. El objetivo deeste anlisis es verificar que el mtodo de anlisis proporciona los mismos resultados endiferentes laboratorios.

o Porcentaje de Recuperacin

Permite evaluar la cantidad de microorganismo target que el mtodo de prueba es capazde recuperar cuando una matriz es inoculada con un nmero conocido demicroorganismos. Para realizar el anlisis se deben fortificar o adicionar (matriz spike)muestras naturales, a las cuales por principio se les debe caracterizar su contenido inicialde microorganismos target.

Con los resultados obtenidos de por lo menos seis corridas analticas montadas porduplicado, se debe calcular la media de la concentracin del microorganismo target,realizando las transformaciones requeridas de acuerdo al comportamiento de distribucinde los datos. Finalmente se debe calcular el porcentaje de recuperacin de acuerdo a lodefinido por el mtodo o aplicando la siguiente frmula:

% Recuperacin = Media de la concentracin de microorganismo targetConcentracin de microorganismo inoculada

X 100


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La evaluacin de este parmetro de igual forma permite inferir un concepto sobre laexactitud del mtodo.

o Proporcionalidad

Este parmetro es aplicable a los mtodos microbiolgicos de recuentos bacterianos y esel equivalente a la linealidad en los mtodos de anlisis qumico. El objetivo esdeterminar la proporcionalidad general de los recuentos de colonias y el volumen demuestra, mediante el clculo del ndice de relacin de probabilidad logartmica (G2), parala concordancia de las sumas de nmeros de colonias en las placas paralelas (duplicados)

con los respectivos volmenes relativos. En este caso se normalizan los datos de losrecuentos obtenidos mediante transformacin a logaritmo natual (Ln)

El ejercicio se fundamenta en obtener n recuentos de colonias (c1, c2cn) del estudio dela misma suspensin de ensayo en volmenes o diluciones que se relacionan con losnmero v1, v2, vn. El clculo de la relacin de probabilidad logartmica (linealidad) de losrecuentos pueden calcularse a partir de:

G2n-1= 2 [ ci* Ln ci/vi - C * Ln (Z/V) ]

Donde:ciColonias contadas en ithplacasvi Volumen de la porcin de test en la placa

n Nmero de placasZ Suma de todos los recuentos de coloniasV Suma de todos los volmenes

El valor obtenido se compara con el tabulado en las tablas de Chi-cuadrado (X2) con n-1grados de libertad. Los valores experimentales que exceden el X2en tablas indican faltade proporcionalidad a un nivel de probabilidad seleccionado, el cual tpicamente ser del95% de confianza.

o Lmite de deteccin/Lmite de cuantificacin

Los lmites de trabajo confiables se pueden inferir ara los mtodos microbiolgicos desdelas especificaciones de los mtodos en cuanto a rangos confiables para el recuento. Porello, en caso que el mtodo lo defina, se deben trabajar los extremos del rango paradeterminar los respectivos Lmites de Deteccin y Cuantificacin. Ambas caractersticaspueden explorarse mediante el uso del ensayo de proporcionalidad y la repetibilidad opara el caso del Lmite de Deteccin a travs de la siguiente metodologa:


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Se trabajan blancos adicionados con concentraciones que se estiman cercanas al nivel dedeteccin del mtodo de ensayo o muestras naturalmente contaminadas que se diluyenapropiadamente buscando el citado lmite.

Se deben trabajar por lo menos cuatro niveles de concentracin y realizar mnimo diez (10)rplicas de cada nivel; adicionalmente debe trabajarse el nivel de cero (0) concentracin.

El clculo del LOD50 corresponde a la concentracin en la cual se evidencia un 50% deresultados positivos y 50% de resultados negativos.

Se deben calcular los lmites de confianza a un 95% de confianza utilizando un mtodo noparamtrico tal como Speerman Karber. Los lmites de confianza calculados se asumen con la

incertidumbre asociada al LOD 50.

Las estimaciones de los percentiles, como la LOD90 corresponde a la concentracin del analitoen la cual el 90% de los resultados obtenidos son positivos.

o Robustez

Las pruebas de robustez incluyen la aplicacin de variaciones deliberadas al mtodo yestudiar el efecto resultante en el desempeo. De esta manera es posible identificar lasvariables que tiene el efecto ms significativo y en base a ello, controlarlascuidadosamente cuando se aplica el mtodo. Cuando se requiere mejorar el mtodo, lasmejoras se pueden realizar sobre aquellas partes que se sabe, son crticas. La robustez

por lo general se evala durante el desarrollo del mtodo y se enfoca hacia determinar elefecto de las variaciones sobre la precisin y la exactitud del mtodo.

Identificar las variables que pueden tener un efecto significativo en el desempeo del mtodo.

Establecer experimentos (analizando materiales de referencia, muestras de composicinconocida o materiales de referencia certificados) para observar el efecto sobre la exactitud y laprecisin de variables que se van cambiando sistemticamente.

Analizar una vez cada serie de condiciones experimentales.

Determinar el efecto de cada cambio de condiciones sobre la media.

Clasificar las variables en orden de mayor a menor efecto sobre el desempeo del mtodo.

Para los mtodos microbiolgicos, se pueden tener en cuenta variaciones en condicionesde incubacin (tiempo, temperatura), efecto de homogenizacin, tiempos de espera pararevivifacin de microorganismos, mecnica de homogenizacin, etc.


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En el diseo experimental se debe detallar el esquema de corrida de las muestras paralos diferentes parmetros a estudiar, en trminos de cantidad, tipo de muestra, das demontaje, entre otros.

Modelo de ejecucin

Categoras y matrices: Se debe especificar el tipo de muestras que se van a utilizar enel ejercicio (naturales, Materiales de Referencia primarios o secundarios, estndaresinternos, controles de kits comerciales, etc.), detallando la identificacin que se va adar a las mismas y en el caso de Materiales de Referencia, toda la informacin que

soporte la vigencia y trazabilidad respectiva (segn aplique), incluidos los certificadosde calidad expedidos por el fabricante. Para las muestras naturales que se empleanse debe registrar la identificacin de la muestra y los datos que soporten la trazabilidadde la informacin relacionada con su origen y caracterizacin. De igual forma, deacuerdo a la naturaleza de las muestras, estas pueden ser categorizadas yseleccionadas (por ejemplo por el mtodo de bloques incompletos) de tal forma quese logre una representatividad de las diferentes matrices allegadas para estudio.

Tamao de muestra: Debe definirse el tamao de muestra para el ejercicio, criterioque puede proceder de lineamientos establecidos en publicaciones relacionadas oclculo estadstico de la misma.

Obtencin de muestras: Se debe declarar la fuente de las muestras y/o materiales dereferencia empleados en el ejercicio y la evidencia de que han estado en adecuadascondiciones de almacenamiento.

Caracterizacin e identificacin de muestras: Se debe detallar la caracterizacin delas muestras y/o materiales de referencia empleados con evidencia de trazabilidadcuando aplique, as como la identificacin que se manejar en el ejercicio, con el finde tener claridad para el anlisis de datos. Para ensayos microbiolgicos es idealutilizar muestras naturalmente contaminadas.

Reactivos: Se deben detallar los reactivos utilizados, especificando lote, vencimiento(si aplica) y los respectivos certificados de calidad, segn aplique.

Equipos: Se debe realizar un listado de los equipos crticos, detallando suidentificacin y las especificaciones tcnicas e instrumentales de cada uno, segnaplique.

Metodologa de ejecucin


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Fundamento del mtodo de ensayo: Se debe detallar el fundamento del mtodo deensayo, declarado en el respectivo documento.

Competencia tcnica de los analistas: Se debe presentar de manera resumida laevidencia de competencia tcnica del personal analista que participa en el ejercicio.

Fuente de los datos: La recoleccin de datos deber hacerse en todos los casos, enlas hojas de trabajo que sirvan como soporte primario al ejercicio, a partir de los cualesse alimenta el formato que se haya diseado de acuerdo al tipo de anlisis y elparmetro a evaluar.

Presentacin de los datos: Se debe describir la metodologa de presentacin de losdatos, tanto primarios como resultados de anlisis para que se reflejen en el Informede Validacin.

Anlisis de datos: Se debe aplicar la metodologa de clculo de acuerdo al tipo deensayo y parmetro a estudiar, anlisis de datos anmalos, aplicando los testestadsticos pertinentes al tamao de las muestras y aplicacin de herramientasestadsticas de acuerdo a los planteamientos o hiptesis a comprobar.

Criterios de aceptacin: En este tem se deben definir las especificaciones dedesempeo del mtodo, de tal forma que se tenga el criterio para comparar los datosobtenidos para los diferentes parmetros evaluados en el ejercicio de Validacin.

Dichos criterios pueden corresponder individualmente o en conjunto a criteriosdefinidos desde el mtodo de ensayo u objetivos analticos del laboratoriofundamentados en normatividad vigente y los requisitos del cliente. Cuando dichoscriterios no se encuentren documentados, el objetivo del ejercicio ser determinarlos.

Informe de validacin

El Informe de Validacin debe dar respuesta a todos los planteamientos definidos en eldiseo experimental del ejercicio de validacin. Con este principio, el informe deberpresentar la informacin relacionada cada uno de los parmetros definidos en el diseoexperimental, registrando segn aplique, la evidencia o referencia de la misma, deaspectos tales como trazabilidad, consolidados de comportamiento histrico de equipos

(segn aplique), intervenciones metrolgicas a equipos (ltimo mantenimiento,calibracin, calificacin operacional o verificaciones), condiciones ambientales relevantes(cuando aplique), entre otros. Adicionalmente el Informe debe contener un apartado deconclusiones que presenta la informacin encontrada fundamentado en los resultados deanlisis estadsticos realizados, se definen las conclusiones del estudio, teniendo encuenta los criterios de aceptacin y/o rechazo para las pruebas estadsticas y loslineamientos de los mtodos de ensayo para los parmetros especficos.


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Revalidacin

La revalidacin corresponde a la verificacin mediante pruebas documentadas de que unmtodo analtico previamente validado, contina siendo suficientemente fiable en eltiempo o tras realizar modificaciones respecto al mtodo inicial. Se puede requerir en lossiguientes casos:

Paso del tiempo: Para demostrar que el mtodo sigue siendo vlido. Tpicamente conperiodicidad anual se realiza un consolidado de datos obtenidos desde los esquemasde aseguramiento de la calidad y se realiza un re-anlisis para robustecer laestimacin de los parmetros asociados.

Cambio en la muestra: Corresponde a la inclusin de nuevas matrices para analizar omodificaciones importantes en la matriz estudiada habitualmente.

Cambios instrumentales: Cuando se produzcan cambios en los equipos utilizados oen los elementos crticos para su funcionamiento.

Modificaciones de parmetros analticos: Cuando se decide realizar algunamodificacin en parmetros como tiempos de agitacin, proceso de extraccin,tiempos de incubacin, etc.

Los pasos a seguir son:

Definir el cambio y documentarlo Ver si el cambio est dentro del mbito de aplicacin, parmetros y lmites

establecidos en el mtodo. Determinar el alcance de revalidacin a realizar en funcin del cambio. Realizar la validacin de los parmetros definidos.

El alcance de revalidacin depende de la naturaleza de los cambios realizados. Acontinuacin se presenta un modelo orientativo de aplicacin:

CAMBIOPROPUESTA DE

PARMETROS A EVALUAR

MATRIZ

Efecto matrizPrecisinRecuperacin

ProporcionalidadLmite de deteccin


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CAMBIOPROPUESTA DE

PARMETROS A EVALUAR

INSTRUMENTAL PrecisinRecuperacin

PREPARACIN DE LAMUESTRA

PrecisinRecuperacin

Lmite de deteccin

Validacin de Mtodos Cuantitativos de Anlisis Qumico

CONDICIONES GENERALES

Los mtodos que emplea el anlisis qumico cuantitativo pueden ser:

Mtodos qumicos (se basan en reacciones qumicas) o clsicos: Anlisis volumtrico yanlisis gravimtrico

Mtodos fisicoqumicos (se basan en interacciones fsicas) o instrumentales: Mtodosespectrofotomtricos, mtodos electroanalticos, mtodos cromatogrficos

Mtodos inmunoqumicos (se basan en complejos inmunes, es decir resultantes deconjugacin de antgeno-anticuerpo): Mtodos de ELISA, EIA, RIA, IFI, etc.

Los lineamientos que se presentan en este documento corresponden a criterios de orientacingeneral, puede ser necesario consultar la bibliografa relacionada para profundizar en losdetalles de aplicabilidad requeridos. En caso de que existan lineamientos relacionados con lametodologa para realizar la respectiva validacin, emitidos por los entes internacionales,nacionales o fabricantes que avalan los mtodos adoptados, estos sern aplicados por ellaboratorio siendo equivalente dicho esquema, al cumplimiento del presente documento.

Solo cuando el mtodo de ensayo est plenamente definido en todos sus detalles y se tiene elconvencimiento de que las condiciones descritas son idneas para alcanzar los resultadosesperados, debe iniciarse el ejercicio validacin. A continuacin se listan los aspectosgenerales , previos a la realizacin de un ejercicio de validacin ms relevantes:

o Disponer y revisar la norma aplicable (ltima versin vigente o anterior con justificacin

tcnica de su uso), el documento que describe el mtodo de ensayo y los documentosrelacionados, correspondientes a cada ensayo incluido en el alcance.o Inventario de los materiales y reactivos que se necesitan para la Validacin primaria o

secundaria: Identificacin, precauciones, calidad, cantidad, grado de pureza, etc.o Verificacin y optimizacin de las condiciones metrolgicas de los equipos. Se debe

contar con los respectivos soportes de mantenimiento, calibracin y/o calificacinsegn aplique, de acuerdo al programa de aseguramiento metrolgico.

o Aseguramiento de las condiciones ambientales relevantes para la ejecucin de losensayos.


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o De acuerdo a la naturaleza del ensayo, el mtodo adoptado y las posiblesmodificaciones que se introduzcan al mismo, se debe definir el tipo de ejercicio adesarrollar, bien sea de validacin primaria o secundaria y de acuerdo a dicho criterio,seleccionar el alcance, extensin y parmetros a incluir en el mismo.

CONTENIDO

Extensin del ejercic io de validacin

La extensin y enfoque del ejercicio de validacin depende fundamentalmente del tipo demetodologa analtica que adopta el laboratorio, la naturaleza del mismo y las matrices sobre lascuales se aplique. A continuacin se presentan algunos criterios generales:

El laboratorio utiliza "plenamente" un mtodo normalizado: El laboratorio tiene queverificar que es capaz de alcanzar los rendimientos caractersticos del mtodopublicados (o que sea capaz de cumplir los requisitos de la tarea analtica); deberealizar como mnimo estudios de precisin, exactitud y si aplica linealidad.

El laboratorio utiliza un mtodo normalizado, pero se quiere aplicar a una nuevamatriz: El laboratorio tendr que verificar que no se identifican nuevas fuentes de erroren el sistema cuando se aplica a la matriz en cuestin. El mismo tipo de validacindescrito en el tem anterior es requerido y adicionalmente debe realizarse el estudiode efecto matriz.

El mtodo ha sido publicado en la literatura cientfica sin caractersticas analticas o se

han desarrollado de forma interna: El laboratorio debe realizar estudios de precisin,sesgo(incluidosestudios de efecto matriz), cuando aplique linealidad y robustez.Esadecuado confrontarlo con otro mtodo plenamente estandarizado y validado en ellaboratorio, que sea comparable al primero. Cuando se trata de un mtodo dedesarrollo propio, se deben considera incluir en la validacin todos los parmetrossegn corresponda ejemplo: lmite de deteccin, lmite de cuantificacin, linealidad,robustez, precisin, exactitud, especificidad, etc.

Diseo experimental del ejercicio

De manera general para llevar a cabo un ejercicio de Validacin es necesario definirpreviamente los aspectos relevantes de ejecucin que den respuesta al objetivo que se

pretende, los cuales se detallan a continuacin:

ObjetivoSe debe definir de manera puntual y concreta cul es el objetivo del ejercicio, detallandoel tipo de validacin a realizar, ensayo, analito y el respectivo documento que detalla elmtodo de ensayo.

Alcance


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Se debe definir en forma clara el alcance del ejercicio, lo cual incluye el rango deconcentraciones (segn aplique) y las matrices sobre las cuales aplica, en coherencia conlos objetivos de la validacin.

ResponsablesRelacin de las personas responsables que llevarn a cabo el ejercicio (analistas) y delos que revisarn y aprobarn los resultados del mismo.

Parmetros a estudiarDependiendo del tipo de ensayo (normalizado, normalizado modificado, reconocido por lacomunidad cientfica, o desarrollado internamente), en los atributos del mtodo de ensayo

y el tipo de ejercicio a desarrollar, se establecen los parmetros a evaluar dentro delestudio, con el fin de determinar las caractersticas de desempeo. A continuacin serelacionan dichos parmetros, teniendo en cuenta que de acuerdo a la metodologa, sepuede aplicar un grupo especfico de los mismos:

Estudio de estabilidad

Dado que la estabilidad del analito tiene influencia directa los parmetros que se estudiandurante la Validacin primaria o secundaria, cuando se considere necesario demostrar laestabilidad de las muestras allegadas para estudio, controles de kit comerciales y/o lassoluciones de materiales de referencia, se pueden evaluar los siguientes aspectos segnde determine como necesario:

Muestras:o Tiempo de transporte al laboratorio y condiciones de refrigeracin durante

dicho perodoo Tiempo y condiciones de almacenamiento en el laboratorioo Efectos de congelacin-descongelacin de muestraso Tiempo comprendido entre su preparacin y la finalizacin del anlisis,

especialmente en aquellos mtodos en los cuales las muestras permanecenpor perodos prolongados de tiempo en el equipo, para ser analizados.

Controles de kit comerciales, materiales de referencia y soluciones de materiales dereferencia:

o

Tiempo y condiciones de almacenamiento en el laboratorioo Tiempo comprendido entre su preparacin y la finalizacin del anlisis,especialmente en aquellos mtodos en los cuales los materiales de referenciao sus soluciones permanecen por perodos prolongados de tiempo en elequipo, para ser analizados.

Es importante destacar que el estudio de estabilidad debe situarse de forma racional,dentro de lo que se considera la prctica real y la rutina de anlisis del laboratorio o del


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transporte de las muestras, por lo cual, no ser necesario establecer la estabilidad en unplazo que exceda el tiempo definido segn la naturaleza del ensayo, muestra, control omaterial de referencia.

De manera general, el ejercicio se puede desarrollar mediante corrida de tres alcuotasdel material (muestras, controles, materiales de referencia) de concentraciones alta,media y baja (cuando aplique) y en todos los casos dentro del rango de aplicacin delmtodo, en las situaciones que se definan van a ser evaluadas. Las particularidades enconcentraciones y tiempos de anlisis o almacenamiento, deben establecerse desde eldiseo experimental y detallarse en el respectivo Informe de Validacin.

La metodologa se fundamenta en mediciones iniciales del analito (basales) y medicionesposteriores luego de almacenamiento en condiciones controladas, durante un perodo detiempo relevante segn los lineamientos del mtodo analtico y las propiedades delanalito. La estabilidad se determinar por comparacin de los datos basales y la respuestaobtenida luego del almacenamiento mediante herramientas como:

Porcentaje de recuperacin: Se puede establecer mediante un criterio estadstico quedemuestre si existe o no existe diferencia significativa entre la recuperacin media y el100%.

Comparacin de medias: Utilizando herramientas estadsticas tales como un anlisisANOVA.

En caso de que se evidencia incumplimiento frente al criterio establecido, se debenanalizar, revisar y ajustar los factores que se establezca, estn influyendo en la estabilidadde la muestra, control y/o materiales de referencia.

Efecto matriz

El efecto matrizconsiste en una disminucin o aumento de la respuesta instrumental delanalito de inters debido a la presencia de otros componentes. En otras palabras, para lamisma concentracin de analito, el anlisis de una muestra real o de una solucin estndardel analito puro no proporciona la misma respuesta instrumental. La evaluacin del efecto

matriz s

Lineamiento Montaje Estandarizacion y Validacion - Colombia 2014-04-25

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