Inmovilizacion d e Celulas Ultimooooo

[ ] 27 de noviembre de 2014

INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

INTRODUCCIÓN

En la actualidad los países desarrollados experimentan grandes avances en el campo

científico y particularmente en el campo de la biotecnología. En el Perú existen pocos

trabajos al respecto .No obstante, el interés de muchos investigadores en el estudio de

inmovilización celular como técnica de aplicación de la biotecnología ha permitido

desarrollar nuevos métodos que han vuelto rentables a muchos procesos y productos

industriales por su simpleza y rendimiento

.Dentro de la industria alimentaria, la inmovilización de microorganismos en soportes

natural eso sintéticos proporciona estabilidad a las funciones celulares. Esta técnica

permite alcanzar altas concentraciones celulares en volúmenes reducidos, así como la

reutilización como biocatalizador y la implantación de sistemas de continuos de

producción

La inmovilización de un biocatalizador consiste en la localización de una célula o

enzima en una región definida de espacio, manteniendo al mismo tiempo una actividad

catalítica deseada. Además, en el caso concreto de las células, esto involucra a su

viabilidad.

BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS Página 1


INVOMILIZACION DE CELULAS (BIOCATALIZADORES)

Uno de los principales principios de cualquier sistema con biocatalizadores

inmovilizados data en el transporte de substratos y productos producidos por

mecanismos difusionales. El uso de biocatalizadores para llevar a cabo

biotransformaciones es un área de la biotecnología en continua expansión.

El uso de biocatalizadores para llevar a cabo biotransfomaciones es un área de la

Biotecnología en continua expansión. Un aspecto clave del proceso es el uso del

catalizador (célula o enzima) en un sistema continuo que permite extender el uso del

mismo en el tiempo dando como resultado una disminución de los costos del proceso

y otras ventajas como una mayor pureza del producto, mayor productividad etc.

También se puede pensar en la reutilización del biocatalizador en procesos batch.

Para lograr este objetivo los biocatalizadores se inmovilizan. La definición de la

EuropeanFederation of Biotechnology(1983) aclara el concepto. "Los biocatalizadores

inmovilizados son enzimas, células u organelos (o combinación de ellos) confinados o

localizados en cierta región definida del espacio, con retención de su actividad

catalítica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo

repetido y continuo.

Es necesario analizar tres de los conceptos incluidos en la definición:

“Confinados o localizados": para cumplir con esta condición es necesario

formar una fase sólida dispersa, macroscópica, de alta densidad y

catalíticamente activa, dentro de, o en contactó con, un medio reactivo líquido

libre de biocatalizador. Se dice que el biocatalizador está compartimentalizado.

Las características de la fase sólida son tales que el transporte de reactivos

hacia y desde el biocatalizador está gobernado por difúsión exclusivamente.

Por la resistencia al transporte difusional se establecen en la partícula

gradientes de concentración o de pH, con lo que el ambiente que rodea a la

partícula de biocatalizador inmovilizado difiere grandemente del seno de la fase

líquida.

“retención de la actividad catalítica (y viabilidad)": los tratamientos a los que

son sometidas tanto las células como las enzimas libres que serán

inmovilizadas afectan en cierto grado la actividad. Si bien es deseable, no es

necesario que se retenga el 100% de la actividad del biocatalizador libre, pero,

para mantener la rentabilidad del proceso, debe alcanzarse un valor que no



debe ser menor al 25%. En el caso de células puede ser necesario mantener la

viabilidad. La inmovilización, entonces, debe tratar de ser realizada en

condiciones tales quela pérdida de actividad sea reducida.

“uso repetido y continuo": surge inmediatamente que la gran ventaja del uso de

biocatalizadores inmovilizados se relaciona con la fácil separación del

catalizador del medio de reacción sin pérdida de actividad, y por consecuencia

directa, con su reutilización. Las células o enzimas inmovilizadas pueden ser

separadas fácilmente. Es necesario saber cómo afecta el método de

inmovilización la estabilidad del biocatalizador, y por ende la extensión de su

uso repetido.

Las células libres en suspensión presentan un rápido decaimiento en su actividad

catalítica; sin embargo, las células inmovilizadas presentan una estabilidad mayor, y

por lo tanto la inmovilización es un requisito necesario para poder reutilizar las células.

El tiempo de vida media, en condiciones operacionales, varía normalmente entre 20 y

50 días.

Un caso particular, ampliamente usado, es aquel en el que se desea efectuar una

reacción de una sola etapa donde la viabilidad celular no interesa. Mas aun esta se

destruye deliberadamente mediante tratamientos fisícos o químicos los que también

estabilizan la estructura celular. En este caso las células no viables actúan como

soporte de la actividad catalítica de interés.



METODOS DE INMOVILIZACION:

Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan actividad y sean estables es

necesario aplicar un método de inmovilización adecuado, que dependerá del tipo de

actividad catalítica de interés. Existen diversos métodos para inmovilizar células, los

cuales pueden dividirse en:

entrecruzamiento fisico (floculacion).

entrecruzamiento covalente.

adsorcion sobre matrices insolubles

enlace covalente con matrices insolubles.

entrampamiento fisico en materiales porosos.

encapsulamiento.

Según la ruta seguida para su preparación los sistemas pueden clasificarse en cuatro:

1. INMOVILIZACIÓN SIN CARRIER:

es el caso de células unidas con otras células, tanto por adsorción o por

uniones covalentes. La floculación de células, durante su fermentación o por

procesos secundarios mediante variación en parámetros fisicoquímicos(pH,

fuerza iónica) es un proceso de unión por adsorción. Este proceso puede

ayudarse por el agregado de pequeñas cantidades de agentes de floculación

(polimeros). Es también común eluso de agentes químicos bifuncionales, tal

como el glutaraldheído para unir células mediante entrecruzamiento químico.

El caso típico es la floculación de algunas cepas de Zymomonasmobilis,

empleadas en la producción de etanol. El método de inmovilización es sencillo,

pues espontáneamente se producen flocs cuando se crecen células en un

medio adecuado sin agitación. Los flocs asíformados se utilizan como inóculo

de medios de cultivo frescos, y pueden ser usados en la producción de etanol a

partir de glucosa en reactores especialmente diseñados. Las células

inmovilizadas son retenidas dentro del reactor.

Este método permite alcanzar altas concentraciones celulares, y se lleva a

cabo en condiciones de reacción suaves, que no perjudican la estabilidad del

biocatalizador. Presenta algunas desventajas: se alcanza una baja resistencia



mecánica frente a la agitación y a la compresión, hay limitaciones difusionales

al transporte de nutrientes, y está limitado a pocas clases de microorganismos.

2. INMOVILIZACION DEL BIOCATALIZADOR EN CARRIERS

PREFORMADOS:

Es la estrategia típica en la inmovilización de enzimas, especialmente por

medio de enlaces covalentes. La matriz puede generarse sin las limitaciones

en condiciones físicas y químicas (temperatura, pH, etc.) impuestas por el

biocatalizador, por lo que pueden mejorarse y optimizarse las características de

estabilidad mecánica, la estructura porosa del material, la resistencia, etc. En el

caso de células, el problema estriba en cómo favorecer la adhesión de las

células (relativamente grandes) a las superficies de la matriz, manteniendo la

estabilidad y la resistencia al lavado. La matriz debe presentar poros de mayor

diámetro que la célula para permitir la penetración a las superficies internas. Se

emplean carriers porosos, que son embebidos por inmersión en suspensiones

celulares. En el caso de enzimas es necesario activar el soporte, mediante la

generación de grupos reactivos capaces de reaccionar con los grupos amino o

carboxilo libres presentes en la enzima.

3. INMOVILIZACION DURANTE LA PREPARACION DEL CARRIER:

Es la estrategia más común en la inmovilización de células enteras Si bien hay

dos métodos, entrampamiento y encapsulamiento, este último es de limitada

importancia.

Debido al tamaño de las células enteras, es relativamente sencillo preparar

redes de porosidadtal que garanticen la completa retención de las células, y

que los procesos de transporte desustratos y productos sean suficientemente

rápidos para obtener alta eficiencia en la actividad catalítica. La dificultad se

encuentra en la búsqueda de condiciones de preparación de carriers que

cumplan con los requerimientos exigidos para que se retenga la actividad del

biocatalizador y/o la viabilidad celular. Es el método de inmovilización más

usado, debido asu flexibilidad y simplicidad, y a las poco agresivas condiciones

de reacción (en el caso depolímeros naturales).

4. INMOVILIZACION POR CRECIMIENTO DE CELULAS

PREVIAMENTEINMOVILIZADAS:



En realidad es un caso particular del criterio anterior. Esta estrategia es

utilizada para aumentar la concentración de células dentro del carrier, por lo

que,evidentemente, sólo sirve para inmovilización de células. Permite

inmovilizar células que contienen sistemas multi enzimáticos, ya sea en estado

estacionario o en condiciones de crecimiento. La desventaja es, al igual que en

caso de células libres, la existencia de reacciones laterales no deseadas.

Generalmente se realiza por entrampamiento en redesiónicas. Es posible

restaurar la actividad catalítica, e inclusive aumentarla. Es un método útil para

obtener células difíciles de inmovilizar como tales, como por ejemplo micelio

celular.

La técnica en este caso consiste en la inmovilización de esporos en matrices

insolubles, los cuales originarán micelio una vez inmovilizados en la matriz.

TIPOS DE CARRIERS.

Lo Carriers son las sustancias implementadas para el soporte de biocatalizadores,

desde el punto de vista químico; pueden ser divididas en orgánicas e inorgánicas,

teniendo por consiguiente un origen sintético y/o natural.

Desde el punto de vista químico, las sustancias usadas para soportar a los

biocatalizadores pueden ser divididas en inorgánicas u orgánicas, y el origen de las

mismas puede ser natural u obtenidas por síntesis.

INORGANICOS:

Naturales: arena, silicatos, arcillas.

Sintéticos: vidrios de porosidad controlada, cerámicas.

ORGANICOS:

Naturales: virutas de madera, antracita, colágeno, celulosa, alginatos,

carragenatos, albúmina.

Sintéticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida, resinas de intercambio iónico,

epóxidos, poliuretanos.

La selección del material se realiza siguiendo algunos criterios heurísticos:

Materiales de alta disponibilidad y bajo costo



Materiales que permitan un proceso de inmovilización simple y efectivo

respecto de la retención de la actividad.

Materiales con alta capacidad y eficiencia

Materiales que permitan un diseño de reactores sencillo.

Los dos primeros criterios apuntan al uso de materiales naturales y que permitan

técnicas de inmovilización por adsorción. Los dos últimos criterios dirigen la elección

hacia carriers orgánicos complejos. Obviamente la elección final deberá tener en

cuenta el biocatalizadór a utilizar, el proceso en el cual va a participar y,

fundamentalmente, el producto que se desea obtener.

De todos los métodos mencionados se hará especial énfasis en aquellos que

involucran la formación de redes poliméricas a partir de prepolímeros de cadena larga,

tales como alginatosy kappa-carragenatos (K-carragenatos). La variedad de sistemas

de este tipo es tan grande que pueden subdividirse según los mecanismos de

formación de las redes poliméricas:

1. Precipitación: formación de red sin reacción química, por separación de fases.

2. Gelificación: formación de redes sin reacción química, por transición de fase

debida a cambios de pH, temperatura, etc.

3. Gelificación ionotrópica: formación de redes con reacción química (intercambio

de iones) debido al entrecruzamiento de cadenas poliónicas con contraiones

multivalentes.

4. Entrecruzamiento covalente: formación de redes con reacción química debida

al entrecruzamiento de polímeros multifuncionales entre sí o con reactivos

bifuncionales de bajo peso molecular.

VENTAJAS

El empleo de biocatalizadores inmovilizados representa un gran número de

ventajas:

Permite la utilización continua del biocatalizador, dado que éste queda

fácilmente retenido en el interior del reactor utilizado, mientras se mantiene en

flujo continuo de entrada y salida de líquido.

Favorece la re-utilización del biocatalizador en el caso de reacciones en

discontinuo.

Con la inmovilización se puede aumentar sensiblemente la concentración de

biocatalizador, con respecto a un proceso en el que el mismo se encuentre en

suspensión.



En cuanto a sistemas operando en continuo, éstos permiten un aumento en las

productividades de los correspondientes biorreactores, dado que permiten

operara a mayor concentración de catalizador, (mayor conversión de substrato)

y con caudales más altos.

En el caso de enzimas inmovilizadas es frecuente observar un aumento de su

estabilidad y su resistencia a la desnaturalización y proteolisis.

Permite reducir los efectos de contaminación accidentales del proceso en las

células; dado que la población de células contaminantes se encuentran en

suspensión y en concentración mucho menor que la población de células

inmovilizadas, ésta puede ser eliminada mucho más fácilmente del reactor.

DESVENTAJAS

Por otra parte, la utilización de estos biocatalizadores inmovilizados presenta

ciertos inconvenientes o desventajas:

Es necesario tener en cuenta que la actividad de una célula o una enzima

puede quedar directamente afectada por las condiciones a que se lleva a cabo

el proceso de inmovilización, perdiendo parte de su actividad o su viabilidad.

La velocidad de difusión de substratos y productos dentro del sistema de

biocatalizadores inmovilizados puede limitar su actividad catalítica y su eficacia,

cuando dicha velocidad sea más lenta que la velocidad de la transformación

que se está llevando a cabo.

La inmovilización de catalizadores involucra la incorporación de una nueva

etapa al proceso, y por tanto un aumento de su complejidad, el cual tiene que

verse compensado por aumentos de productividad claros, mejoras en la

separación entre el producto y el biocatalizador y en tiempos de operación más

largos.

En el trabajo práctico se estudiará la inmovilización de células de levadura con

actividad invertasa en geles de alginato de Ca+2, con el fin de emplearlas en la

hidrólisis de sacarosa.

Por lo tanto, se describirán brevemente los mecanismos de entrampamiento por

gelificación y por gelificaciónionotrópica.

GELIFICACION:



La gelificación por transición de fase suele ser promovida por cambios en temperatura

o en pH. Los agentes gelificantes usados tradicionalmente son gelatina y agar, los

cuales promueven una fácil gelificación pero presentan la desventaja de originar geles

blandos y mecánicamente inestables. Una mejora significativa constituye la

introducción deK-carragenato, heteroopolisacárico con ~-D-galactosa sulfato y 3,6-

anhidro a-D-galactosa,soluble en agua a temperaturas entre 40 y 60 ºC y que gelifica a

temperatura ambiente. Este material permite la formación de bolillas, bloques y

membranas que pueden ser usados como soporte de biocatalizadores.

Hay dos áreas donde se aplica el K-carragenato:

Conversiones catalizadas por sistemas monoenzimáticos, donde pueden

usarse células muertas. La matriz es post-tratada con glutaraldehido o

hexametilendiamina, reactivos que estabilizan la actividad catalítica.

Inmovilización de células vivas, donde hay crecimiento de células en la matriz.

GELIFICACION IONOTROPICA:

El sistema más común es el entrecruzamiento de alginatos con iones Ca+2. Los

alginatos son polímeros de ácido manurónico y gulurónico, solubles en agua a

temperatura ambiente como alginatos de Na+ y que gelifican en presencia de ciertos

iones polivalentes. En general una solución de alginato de Na+ se deja gotear en una

solución de CaCl2 obteniéndose en tiempos cortos, bolillas esféricas de tamaño

controlado y homogéneo. Es un método que presenta gran flexibilidad, pues alginatos

de distinto peso molecular y distinta composición química (distintas proporciones de

ácidos gulurónico y manurónico) rinden geles de muy buenas características químicas

y físicas. El requerimiento de Ca+2 depende de la composición química del gel. La



concentración de CaCl2 en la mezcla de gelificación puede variar entre 0,05 y 2 %. El

rango de temperaturas de operación va desde 0 hasta 80 ºC. Las bolillas que se

obtienen presentan diámetros entre 0,1 y 5 mm.y pueden presentar una alta carga

celular por entrampamiento directo (hasta 30 g de células húmedas por ml de

catalizador). Este sistema puede someterse a un secado parcial, con lo que el tamaño

disminuye y aumenta la estabilidad mecánica sin variación en la porosidad. La

desventaja que presenta es la inestabilidad frente a ciertos agentes capaces de

secuestrar iones Ca+2 (p. ej.: fosfatos).

Los puntos destacables de este método son:

Reversibilidad de la gelificación: obliga a tornar precauciones en cuanto a la

composición del medio a utilizar, principalmente pH y presencia de agentes que

puedan secuestrar a los contraiones por precipitación o por formación de

complejos.

Buena estabilidad mecánica respecto al empaquetado en columna y a la

agitación.

e Formación de bolillas regulares, y con tamaño controlado.

e Formación de redes macroporosas, que se conserva aún después del secado

parcial.

Alta capacidad de carga sin pérdida de estabilidad mecánica, pero con pérdida

de eficiencia debido a resistencias difusionales.

Rendimientos de actividad catalítica de entre 80 y 100% en condiciones de

reacción controladas.

e Método suave, que permite que las células mantengan viabilidad y

estabilidad.

Problemas con la inmovilización de células

Si bien, el uso de células inmovilizadas en matrices solidas ha permitido la

implementación de procesos de fermentación en sistemas de flujo continuo.

Existen numerosos problemas que se presentan a nivel industrial, los cuales

se describen a continuación.

Los sistemas floculados presentan un difícil manejo debido a que la floculacion

depende de factores como el pH, la concentración de Ca2+, temperatura y la

agitacion Ademas, cadacepa de levadura presenta un comportamiento

diferente.Otro caso, es el uso de membranas microporosas como filtros para



retener las levaduras en el reactor, lo cual resulta muy costoso cuando se

emplean reactores continuos.

El mayor problema que presenta esta técnica es el bloqueo que

eventualmente sufren los poros de la membrana debido a particulas o a las

mismas levaduras .Por otro lado, la inmovilización de células por adsorción

sobre la superficie de materiales es fácil deconseguir, pero al ser la adsorción

un fenómeno fundamentalmente electrostatico, durante los procesos en

continuo, especialmente por efecto de la agitación, las células se liberan del

soporte. Además, por este método es difícil inmovilizar grandes cantidades de

biomasa (Verbelen et al., 2006).

Otros métodos de inmovilización de células para procesos de

fermentación

Si bien, existe una problemática alrededor del uso de células inmovilizadas,

hoy en dia se han enfocado esfuerzos en el desarrollo de rutas novedosas que

permitan el desarrollo de sistemas inmovilizados mediante el uso de materiales

porosos diferentes a los polímeros de origen natural que se han usado hasta

ahora. Muchos de estos sólidos porosos podrían encontrar un lugar importante

en los procesos de produccion de vinos y fermentaciones alcohólicas en

general.

Las zeolitas y los diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados

en diversos procesos cataliticos,prueba de ello es su extensa

aplicación .Debido a su tamaño de poro pequeño, no seria posibleinmovilizar

levaduras dentro de sus cavidades. Sin embargo, el uso de membranas

zeoliticas si podría ser de granutilidad en procesos de fermentación en los que

se requiere eliminar el etanol del reactor de forma selectiva .

Para tal aplicacion se podrian emplear materiales zeoliticos hidrofobicos

convencionales como lazeolita beta o materiales hibridos organicos-inorganicos

como los metilaluminofosfatos-alfa ymetilaluminofosfatos–beta .Cabe

mencionar que la produccion de membranas zeoliticas compactas y con

propiedades mecanicas adecuadas no es sencilla y hoy en dia sigue siendo un

reto para muchos grupos de investigación. Los materiales mesoporosos

templados mediante aglomeraciones micelares , aunque siguen sin presentar



el tamaño de poro adecuado para la inmovilización de levaduras, si permiten la

inmovilización de enzimas

Esto hace que estos sólidos tengan un interes especial en la industria vinícola

ya que mediante el uso de enzimas podrían modificarse la naturaleza de

algunas sustancias responsables de aromas y sabores característicos del vino

consiguiéndose productos con propiedades organolépticas diferentes.

Los materiales mesoporosos mas adecuados para la inmovilización de enzimas

serian los solidos del tipo SBA-15 debido a su gran tamaño de poro .La

inmovilizacion de las enzimas se conseguiria por difusión de las mismas en los

poros del solido previamente funcionalizado con moleculas que “anclarian” la

enzima a la pared del material Solidos como los que se proponen aqui podrian

usarse en procesos en continuo o en sistemas fluidizados.

La inmovilizacion de levaduras requiere de materiales macroporosos con radios

del orden de algunas micras. Estos materiales pueden sintetizarse mediante

dos tecnicas:

La primera hace uso de esferas sintetizadas por polimerizacion en

microemulsion, que posteriormente son usadas como moldes que se recubren

con precursores de oxidos, metales u otros materiales .Por medio del proceso

de calcinacion de las esferas es posible sintetizar materiales macroporosos de

cavidades esfericas regulares conectados por ventanas de menor tamano.

Mediante esta técnica seria posible sintetizar biosolidos de gran resistencia

mecanica en los que no habria grandes problemas de difusión de reactivos o

productos. El paso mas complejo de sintesis seria la inoculación de las células

en el interior del solido, ya que aunque los poros pueden ser muy grandes, las

levaduras deben difundir por las ventanas que comunican los poros. La

estructura 3D de canales que estos materiales exhiben podria resultar de

interes para la fabricación de membranas para la retención de levaduras en

reactores en continuo.

El segundo método que posee gran potencial es el uso de materiales porosos

sintetizados por congelación unidireccional y posterior liofilizacion .Esta técnica

de preparación de solidos macroporosos, al ser reciente, es la menos

explorada en el campo de la catalisis. Este metodo implica la congelación de

una solución de partículas que pueden ser polimericas, siliceas, metalicas etc.

a temperatura de nitrógeno liquido de manera unidireccional y a velocidad

controlada. El proceso que parece complejo, es en realidad un metodo sencillo

de fabricación de materiales macroporosos que, además, permite la



incorporación de especies biologicas in-situ en la matriz durante la sintesis del

material debido a que no se requiere calcinacion de ningun molde organico.

Para inmovilizar bacterias dentro de una matriz polimerica Gutierrez et al.

partieron de una suspensión acuosa concentrada de bacterias E. coli

protegidas con alginato de calcio y glucosa. Las cuales incorporaron a la

suspension alcohol polivinilico y la mezcla se transfirio a una jeringa de

insulina.

Esta se introdujo en un baño con nitrógeno liquido a velocidad controlada (5.9

mm/min) y posteriormente se liofilizo. Durante el proceso de congelación

unidireccional se producen frentes de congelación perpendiculares a la

dirección de inmersión en los que los cristales de hielo apartan las “impurezas”,

que en este caso serian las bacterias y el alcohol polivinilico.

Una vez eliminado el hielo por liofilizacion se obtiene una matriz porosa de

alcohol polivinilico en la que quedan retenidaslas bacterias. En este caso las

bacterias se recubrieron con alginato-glucosa para protegerlas durante el

proceso de congelacion criogenica. Métodos similares de protección deben

usarse si se pretende inmovilizar sistemas biologicos sensibles al proceso de

congelación. Otra ventaja de este metodo es que se obtienen monolitos con la

forma y geometria del recipiente que contiene la suspensión que se congela,

en lugar de los clásicos polvos que dan como resultado los otros métodos de

inmovilización. También es posible modular el tamaño de poro al jugar con la

relación masa suspendida/agua de la suspensión a congelar y con la velocidad

de inmersion. De ahi que estos métodos novedosos de inmovilización de

células abran un abanico de posibilidades empleando matrices solidas de

diversa naturaleza, y asi de esta forma lograr diseñar sistemas de fermentación

que trabajen en reactores continuos.

Asimismo, existen otros métodos modernos que no requieren del uso de

dispositivos inmovilizadores complejos. Uno de estos métodos es el uso de

catalizadores artificiales inertes, como los nanotubos de carbono, que inducen

la floculación de los micro-organismos. Utilizando nanotubos de carbono,

células de Saccharomyces cerevisiae han sido inmovilizadas exitosamente por

el método de floculacion . Aunque esta técnica aporta buenos resultados con

respecto a la inmovilización, la síntesis selectiva de nanotubos de carbono

sigue siendo costosa.



Es común que la inmovilización de levaduras y enzimas con los métodos

mencionados anteriormente enfrenten problemas técnicos y científicos. No

obstante, es importante plasmar una visión sobre las expectativas y

potencialidades que tienen estos materiales en el proceso de fermentación

alcohólica. Por lo tanto, surge la motivación para realizar investigación

profunda y novedosa fundamentada en el hecho de que los recientes avances

en la síntesis de micro y nano materiales porosos aun no se han permeado al

campo de la catálisis con levaduras.

Por lo cual, se abren nuevos horizontes en el area de investigación y aplicación

de estos métodos de inmovilización de células.

APLICACIONES DE INMOVILIZACION DE CELULAS:

EN FERMENTACION DE VINO (diversos métodos de inmovilizar células de

levaduras)

1. MATERIALES:



2. PROCEDIMIENTO:

2.1Reactivación del cultivo Saccharomyces sp.

Se sembró por estría en tubos de agar Sabouraud la cepa de levadura. Incubar a

temperatura ambiente por 3 a 4 días.



2.2 Proliferación celular

.A partir de la cepa reactivada se sembró por superficie en 1 placa de agar Sabouraud

con la ayuda de un hisopo estéril. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 4 días.

2.3 Cosecha de células y obtención del inóculo

a. Se colocó 3 ml de solución salina fisiológica (al 0.85%) en la placa sembrada y

5 perlas de vidrio estéril, se movió suavemente la placa hasta obtener la

suspensión celular, colocamos la suspensión en un tubo falcon estéril.



b) Colocar en agitación a 200 rpm por 18 horas a temperatura ambiente

(procedimiento no ejecutado

c) realizar el recuento celular utilizando la cámara de Neubauer (109 cél/ml).

2.4. Inmovilización de células

.a.) Se tomó los 3.4 ml. del inóculo y se mezcló con 100 ml. de agar-agar fundido a

42ºC al 3%,(concentración celular final 10-8cél/ml).



.

b) Con ayuda de pipetas estériles se tomó agar-agar con levaduras (mantenido en

baño maría 42ºC) se deja caer gota a gota en forma rápida en aceite vegetal,

contenido en un frasco de vidrio sumergido en un recipiente con hielo en forma

permanente.



C) Las perlas son lavaron con agua corriente y destilada estéril en forma sucesiva para

desprender el aceite de su superficie

2.5. Producción de alcohol utilizando las células inmovilizadas.

a.)Se preparó un mosto de fruta de 2000 ml. A este se le agregó las células de

levaduras inmovilizadas en agar –agar y se dejó fermentar por espacio de una

semana. Se realizaron las evaluaciones diarias determinando consumo de sustrato

(azúcar) utilizando un refractómetro (realizar la curva consumo de sustrato/tiempo).



b) Posteriormente, una vez terminada la fermentación, las perlas o células

inmovilizadas fueron recuperadas del fermento y colocadas en una solución de

glucosa al 20% (utilizamos agua pasteurizada a 85°C).



3. RESULTADOS

3.1 Evaluación de la Determinación de Azúcares Reductores.



3.2 Análisis Organoléptico del Fermento

DISCUSIÓN

La inmovilización de levaduras disminuye la mayoría de los problemas que plantea la

fermentación utilizando células libres. Este sistema tiene la ventaja de poder manejar

la densidad celular, previa al inicio de la fermentación. Además, facilita el sistema de

operación del proceso de fermentación continua, evitando el paso de eliminar las



levaduras del fermentador. La inmovilización celular desacopla el crecimiento

microbiano de los procesos metabólicos de interés industrial.

Es así, que diversos grupos de investigación han empleado este sistema de levaduras

inmovilizadas especialmente del género Saccharomyces para la obtención de variados

productos de interés industrial como el vino por ejemplo. En el laboratorio tras reactivar

e inmovilizar el cultivo de Saccharomyces y ver su capacidad fermentativa, logramos

determinar que los azúcares (glucosa y fructosa) del mosto disminuyeron en un 80%,

los cuales han sido empleados por las células y esto debido a que ellas necesitan

fuentes carbonadas para su desarrollo.

Durante el proceso de fermentación, hubo la conversión de los azúcares a etanol, que

es el metabolito esperado en estos bioprocesos, sin embargo no se pudo medir los

grados generados en durante el desarrollo de la práctica. Por otro lado no todas las

levaduras se inmovilizaron, ya que hubieron brotes que se filtraron delegar-agar

(debido derrepente a su concentración) y se consolidaron como células libres. Por

último, la gran ventaja de este bioproceso es que se pueden reutilizar las levaduras

inmovilizadas en el agar-agar, siempre y cuando se le suministre una fuente

carbonada que les permita estar viables para una próxima fermentación.

CONCLUSIONES

Existe viabilidad de las levaduras inoculadas en el mosto, ya que hubo una

considerable reducción de azúcares y aumento de acidez.

Adicionalmente se registró la presencia de Etanol, característica descubierta en

el análisis organoléptico.

El Agar-Agar al 3% resultó ser un eficaz inmovilizador celular.

El tiempo es un factor importante cuando se maneja fermentaciones con

células inmovilizadas.



La concentración celular de cada perla fue adecuada para la cantidad de mosto

empleado.

EL aceite común utilizado fue un buen formador de perlas de agar-agar, debido

a su propiedad hidrofóbica.

La inmovilización de células, este proceso puede ayudar a mejorar la

produccion de alimentos, farmacos, quimicos y bioproductos de interes

cientifico y economico.

los procesos que utilizan levaduras inmovilizadas en soportes gelificantes,

proporcionan la oportunidad de superar los largos tiempos de fermentación y

maduración encontrados en las industrias cerveceras tradicionales

BIBLIOGRAFIA:

Casas Alvero, C., González Anadón, G., Lafuente Sancho, F.J, Lema Rodicio,

J.M. (2005). Ingeniería Bioquímica (1ª edición). Síntesis. p. 107. ISBN 84-7738-

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France. 1997.

EDWIN BALDEON CH, VICTOR MEZA C, JULIO GIRALDO H. Evaluación de

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