InmovilizaciónInmovilizaciónde enzimasde enzimas

Inmovilización de enzimasInmovilización de enzimas

Se entiende por enzima inmovilizada (EI) Se entiende por enzima inmovilizada (EI) aquella física/químicamente asociada a, o aquella física/químicamente asociada a, o contenida en, un soporte/matriz no contenida en, un soporte/matriz no esencial para su actividad.esencial para su actividad.

La inmovilización permite la utilización de La inmovilización permite la utilización de las enzimas en procesos continuos, lo que las enzimas en procesos continuos, lo que permite aumentar su productividad, ó bien permite aumentar su productividad, ó bien para facilitar la separación del catalizador para facilitar la separación del catalizador de sus productos, simplificando la etapa de sus productos, simplificando la etapa posterior de purificación.posterior de purificación.

Inmovilización de enzimasInmovilización de enzimas

Inmovilización de enzimasInmovilización de enzimas

La utilización de enzimas La utilización de enzimas inmovilizadas o no dependerá de inmovilizadas o no dependerá de una evaluación económica de las una evaluación económica de las alternativas, donde se considerarán alternativas, donde se considerarán datos de cinética y estabilidad, datos de cinética y estabilidad, costo, propiedades fisicoquímicas, costo, propiedades fisicoquímicas, eficiencia de inmovilización y carga eficiencia de inmovilización y carga del soporte.del soporte.

Se torna evidente que si el costo de Se torna evidente que si el costo de una enzima es muy bajo, la una enzima es muy bajo, la factibilidad de su utilización en forma factibilidad de su utilización en forma inmovilizada es poco probable.inmovilizada es poco probable.

Inmovilización de enzimasInmovilización de enzimas

Ejemplos de enzimas Ejemplos de enzimas inmovilizadasinmovilizadas

SoportesSoportes

Un soporte para inmovilización debe tener las Un soporte para inmovilización debe tener las siguientes propiedades:siguientes propiedades:

Elevada resistencia mecánica, química y Elevada resistencia mecánica, química y biológicabiológica

InsolubilidadInsolubilidad HidrofilicidadHidrofilicidad Elevada razón área/volumenElevada razón área/volumen RegenerabilidadRegenerabilidad Bajo costoBajo costo Por regla, no todas estas propiedades están Por regla, no todas estas propiedades están

simultáneamente presentes en un simultáneamente presentes en un determinado soporte: necesario evaluar determinado soporte: necesario evaluar todas las alternativas.todas las alternativas.

SoportesSoportes

Los soportes orgánicos presentan:Los soportes orgánicos presentan: Buena relación área/volumenBuena relación área/volumen Muy flexibles en su configuraciónMuy flexibles en su configuración Bajo costo en algunos casos Bajo costo en algunos casos

(residuos orgánicos)(residuos orgánicos)Los soportes inorgánicos a su vez Los soportes inorgánicos a su vez

presentan:presentan: Mayor resistenciaMayor resistencia Mayor regenerabilidadMayor regenerabilidad Propiedades físicas (ej. porosidad) Propiedades físicas (ej. porosidad)

controlablescontrolables

Sistemas de inmovilizaciónSistemas de inmovilización

Las enzimas normalmente se inmovilizan a Las enzimas normalmente se inmovilizan a través de algún tipo de interacción entre través de algún tipo de interacción entre sus residuos aminoacídicos y el soporte.sus residuos aminoacídicos y el soporte.

Esto puede producir perdidas Esto puede producir perdidas considerables de actividad, al comprometer considerables de actividad, al comprometer los aminoácidos en el, o vecinos del, sitio los aminoácidos en el, o vecinos del, sitio activo.activo.

Para minimizar este problema se inmoviliza Para minimizar este problema se inmoviliza por intermedio de las moléculas de por intermedio de las moléculas de carbohidratos (enzimas glicoproteicas) o carbohidratos (enzimas glicoproteicas) o por la utilización de espaciadores.por la utilización de espaciadores.

Sistemas de inmovilizaciónSistemas de inmovilización

Los métodos de inmovilización Los métodos de inmovilización se pueden dividir en:se pueden dividir en:

Sistemas de inmovilización - Sistemas de inmovilización - AdsorciónAdsorción Este un método simple de inmovilización, Este un método simple de inmovilización,

en el que el soporte es mezclado con las en el que el soporte es mezclado con las enzimas, en condiciones apropiadas de pH enzimas, en condiciones apropiadas de pH y fuerza iónica, dejados en contacto por un y fuerza iónica, dejados en contacto por un determinado periodo y después lavado determinado periodo y después lavado para remover la proteína no adsorbida.para remover la proteína no adsorbida.

Este método permite valores elevados de Este método permite valores elevados de carga enzimática (hasta 1 gramo de carga enzimática (hasta 1 gramo de enzima por gramo de soporte).enzima por gramo de soporte).

Las interacciones implicadas son Las interacciones implicadas son resultantes de fuerzas de van der Waals, resultantes de fuerzas de van der Waals, efectos hidrofóbicos y de carga iónicaefectos hidrofóbicos y de carga iónica

Sistemas de inmovilización - Sistemas de inmovilización - AdsorciónAdsorción La selección del soporte pasa por su La selección del soporte pasa por su

capacidad de retener la enzima, sin dejar capacidad de retener la enzima, sin dejar desorber nuevamente al seno del liquido, desorber nuevamente al seno del liquido, actividad enzimática obtenida, posibilidad actividad enzimática obtenida, posibilidad de regeneración y costo.de regeneración y costo.

Como ejemplos de soporte tenemos Como ejemplos de soporte tenemos materias orgánicas neutras (carbón activo materias orgánicas neutras (carbón activo y celulosa) y cargadas (y celulosa) y cargadas (quitinaquitina, , intercambiadores aniónicos y catiónicos), intercambiadores aniónicos y catiónicos), además de materia inorgánica (bentonita, además de materia inorgánica (bentonita, alúmina, vidrio y sílica porosa).alúmina, vidrio y sílica porosa).

Sistemas de inmovilización - Sistemas de inmovilización - AdsorciónAdsorción Ejemplo: preparación de invertasa Ejemplo: preparación de invertasa

inmovilizadainmovilizada

SoporteSoporte

DEAE-SephadexDEAE-Sephadex

(intercambiador aniónico(intercambiador aniónico))

CM-SephadexCM-Sephadex

(intercambiador (intercambiador catiónico)catiónico)

pH 2.5pH 2.5 00 100100

pH 4.7pH 4.7 100100 7575

pH 7.0pH 7.0 100100 3434

Sistemas de inmovilización Sistemas de inmovilización – Enlace Covalente– Enlace Covalente La unión covalente se produce entre La unión covalente se produce entre

grupos funcionales del soporte y grupos funcionales del soporte y determinados grupos en los residuos determinados grupos en los residuos aminoacídicos de la molécula enzimática.aminoacídicos de la molécula enzimática.

Estos grupos son reactivos según la Estos grupos son reactivos según la siguiente orden:siguiente orden:

-S- > -SH > -O-S- > -SH > -O-- > -NH > -NH22 > -COO > -COO-- > -OH >> -NH > -OH >> -NH33++ La reacciones químicas que se pueden La reacciones químicas que se pueden

utilizar incluyen la acilación, la alquilación, utilizar incluyen la acilación, la alquilación, la diazotación, la disulfuración y la la diazotación, la disulfuración y la activación a través de sales de metales de activación a través de sales de metales de transición.transición.

Sistemas de inmovilización Sistemas de inmovilización – Enlace Covalente– Enlace Covalente Ejemplo de químicos son la carbodiimida y Ejemplo de químicos son la carbodiimida y

el glutaraldeído.el glutaraldeído. Este ultimo es ampliamente utilizado para, Este ultimo es ampliamente utilizado para,

además de inmovilizar enzimas a soportes, además de inmovilizar enzimas a soportes, hacer el entrecruzamiento entre las hacer el entrecruzamiento entre las enzimas ó mezcladas con otras proteínas enzimas ó mezcladas con otras proteínas inertes, hasta se producir agregados inertes, hasta se producir agregados insolubles de tamaño considerable.insolubles de tamaño considerable.

Se puede combinar la adsorción con la Se puede combinar la adsorción con la formación de enlaces covalente, con lo que formación de enlaces covalente, con lo que se obtiene un aumento sustancial de la se obtiene un aumento sustancial de la estabilidad del catalizador.estabilidad del catalizador.

Sistemas de inmovilización Sistemas de inmovilización – Enlace Covalente– Enlace Covalente

Como ejemplo tenemos la Como ejemplo tenemos la inmovilización de invertasa en inmovilización de invertasa en quitina de camarón:quitina de camarón:

Sistemas de inmovilización Sistemas de inmovilización – Inclusión en matrices– Inclusión en matrices En este método, la enzima es En este método, la enzima es

contenida entre las cadenas de una contenida entre las cadenas de una red polimérica, lo suficientemente red polimérica, lo suficientemente compacta para retener la enzima, compacta para retener la enzima, pero capaz de permitir el libre flujo pero capaz de permitir el libre flujo de reactantes.de reactantes.

Esto tiene la implicación que solo es Esto tiene la implicación que solo es útil este tipo de inmovilización útil este tipo de inmovilización cuando se pretende procesar cuando se pretende procesar sustratos y productos de muy bajo sustratos y productos de muy bajo peso molecular.peso molecular.

Sistemas de inmovilización Sistemas de inmovilización – Inclusión en matrices– Inclusión en matrices Este método es más adecuado para Este método es más adecuado para

inmovilizar células, donde el alginato inmovilizar células, donde el alginato de calcio es ampliamente utilizado.de calcio es ampliamente utilizado.

Otros ejemplos de matrices son los Otros ejemplos de matrices son los geles de poliacrilamida y el almidón.geles de poliacrilamida y el almidón.

Estos presentan las desventajas de: Estos presentan las desventajas de: ser no regenerables, una baja ser no regenerables, una baja estabilidad, tener pobres estabilidad, tener pobres propiedades mecánicas y severas propiedades mecánicas y severas restricciones difusionales.restricciones difusionales.

Sistemas de inmovilización Sistemas de inmovilización – Retención por membranas– Retención por membranas En este tipo de sistemas la enzimas En este tipo de sistemas la enzimas

permanece libre el solución, separada del permanece libre el solución, separada del medio de reacción por una membrana medio de reacción por una membrana protectora que solo permite el libre paso de protectora que solo permite el libre paso de los reactantes (sustrato/producto).los reactantes (sustrato/producto).

Como ejemplo, tenemos las membranas Como ejemplo, tenemos las membranas de ultrafiltración y diálisis.de ultrafiltración y diálisis.

Otro método consiste en la Otro método consiste en la microencapsulación, en la cual se produce microencapsulación, en la cual se produce una reacción de polimerización en la una reacción de polimerización en la superficie de las gotas de solución superficie de las gotas de solución enzimática, dispersas en un solvente enzimática, dispersas en un solvente inmiscibles con agua, que produce una inmiscibles con agua, que produce una delgada película (nylon), casi sin delgada película (nylon), casi sin restricciones difusionales.restricciones difusionales.

Principales características de Principales características de los métodos de inmovilización:los métodos de inmovilización:

CaracterísticasCaracterísticas AdsorciónAdsorción EnlaceEnlace

covalentecovalente

Inclusión en Inclusión en

matricesmatrices

Retención porRetención por

MembranasMembranas

PreparaciónPreparación SimplesSimples dificildificil dificildificil SimplesSimples

CostoCosto bajobajo elevadoelevado moderadomoderado elevadoelevado

Fuerza de Fuerza de ligaciónligación

variablevariable fuertefuerte flacaflaca fuertefuerte

Liberación de Liberación de enzimaenzima

sisi nono sisi nono

AplicabilidadAplicabilidad ampliaamplia selectivaselectiva ampliaamplia Muy ampliaMuy amplia

Problemas en Problemas en la utilizaciónla utilización

elevadoselevados bajosbajos elevadoselevados elevadoselevados

Efectos de la Efectos de la matrizmatriz

sisi sisi sisi nono

Restricciones Restricciones difucionalesdifucionales

nono nono sisi sisi

Protección Protección microbianamicrobiana

nono nono sisi sisi

Parámetros de inmovilizaciónParámetros de inmovilización

Hay dos parámetros a considerar en la Hay dos parámetros a considerar en la inmovilización: el rendimiento de inmovilización: el rendimiento de inmovilización y la capacidad de carga del inmovilización y la capacidad de carga del soporte.soporte.

El rendimiento de inmovilización (RI) es El rendimiento de inmovilización (RI) es dada por:dada por:

Algunos autores usan:Algunos autores usan:

Parámetros de inmovilizaciónParámetros de inmovilización

Ejemplo del rendimiento de Ejemplo del rendimiento de inmovilización (%) de inmovilización (%) de glucoamilasa:glucoamilasa:

Parámetros de inmovilizaciónParámetros de inmovilización

La capacidad de carga (CC) del soporte se La capacidad de carga (CC) del soporte se define como la actividad cargada define como la actividad cargada expresada en el catalizador (EI) por unidad expresada en el catalizador (EI) por unidad de peso seco del soporte (W), lo que viene de peso seco del soporte (W), lo que viene dada por:dada por:

Ambos los parámetros, EI y CC, están Ambos los parámetros, EI y CC, están frecuentemente en compromiso, es decir, frecuentemente en compromiso, es decir, para aumentar la CC se tiene que para aumentar la CC se tiene que sacrificar el EI y viceversa.sacrificar el EI y viceversa.