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INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.

MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.

2008

n

INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO 2008

MEDIANTE EL USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS.

Jorge Echegaray Félix Martínez de Lecea

Iratxe Covela Alberto Hernando

Juan Ángel de la TorreAndres Illana

Diana Paniagua

Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 1 8

2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO. MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS

2 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 8

n



2008

n SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES

DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO 2008 MEDIANTE EL USO DE TÉCNICAS

GENÉTICAS NO INVASIVAS

INFORME REALIZADO

CON LA COLABORACIÓN DE LA LA DIRECCIÓN DE BIODIVERSIDAD Y

PARTICIPACIÓN AMBIENTAL DEL GOBIERNO VASCO Y

LA CAJA DE AHORROS DE NAVARRA (CAN)

Marzo 2009


* A efectos bibliográficos, el informe debe citarse como sigue: Echegaray, J., Martinez de Lecea, F., Covela, I., Hernando, A., De la Torre, J.A., Illana, A. y Paniagua, D. (2009). Seguimiento de las poblaciones de lobos (Canis lupus L., 1758) en la Comunidad Autónoma del País Vasco en 2008 mediante el uso de técnicas genéticas no invasivas. Vitoria-Gasteiz. Informe inédito. 75 pp.

GRUPO

LOBO DE EUSKADI

Apartado de correos 899

www.loboeuskadi.org [email protected] EUSKADIKO

OTSO

TALDEA



n “Hay algunos que pueden vivir sin elementos salvajes y otros que no” Aldo Leopold, A Sand County Almanac, 1949



2008

n AGRADECIMIENTOS

La realización de este estudio no hubiera sido posible sin la estrecha colaboración de

varias personas y entidades, a las que desde aquí queremos dar las gracias. Entre las personas

colaboradoras destacamos especialmente a Mª Ángeles Arribas, que realizó

desinteresadamente itinerarios de registro de excrementos a lo largo de la geografía vasca y

del entorno circundante. A Carles Vilà, Jennifer A. Leonard, Günilla Karf, Robert-Jan den

Tex, Maria Nord, Santiago Castroviejo y Violeta Muñoz, del Departamento de Biología

Evolutiva de la Universidad de Uppsala (Suecia), donde se han realizado los análisis de

laboratorio.

Entre las entidades que han financiado este estudio, agradecemos a la Dirección de

Biodiversidad y Participación Ambiental del Departamento de Ordenación del Territorio y

Medio Ambiente del Gobierno Vasco, así como a la la Caja de Ahorros de Navarra (CAN),

entes que nos han brindado la posibilidad de continuar con los seguimientos genéticos no

invasivos que venimos efectuando de forma ininterrumpida desde 2003.




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n ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN 9 II. ANTECEDENTES 11 III. OBJETIVOS 15 IV. ÁREA DE ESTUDIO 17 V. MATERIAL Y MÉTODOS 21 V.1. Muestreos de campo. 21 V.2. Recolección, caracterización y conservación de las muestras fecales. 23 V.3. Análisis de laboratorio. 26 V.3.1. Extracción de ADN de heces. 26 V.3.2. Amplificaciones de ADN: PCR. 27 V.3.3. Secuenciación de ADN. 29 V.3.4. Identificación de especie. 31 V.5. Análisis de datos. 32 VI. RESULTADOS 33 VI.1. Caracterización de las muestras. 33 VI.2. Identificación de la especie 40 VI.3. Caracterización de los excrementos, identificación y comparación entre

especies. 43

VI.4. Distribución del lobo. 55 VII. DISCUSIÓN 59 VIII. BIBLIOGRAFÍA 67




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n I. INTRODUCCIÓN

La gestión del lobo debe basarse en argumentaciones científicas y socioeconómicas

rigurosas, cimentadas en datos técnicos sobre la especie (Boitani 2000). Estos datos deben

englobar aspectos multidisciplinares (Mech y Boitani 2003), como por ejemplo: la ecología

de la especie, su área de distribución en un contexto territorial definido según características

naturales y no sociopolíticas (Bessa Gómez y F. Petrucci-Fonseca 2003, Cayuela 2004), los

usos del medio natural (no sólo agroganaderos), las estimas serias de tamaño poblacional

(Barrientos 2000, Barrientos y Fernández 2002), la abundancia y evolución de la especie en

tiempos recientes (Naves 2002), el estado de conservación actual, la idoneidad del hábitat

para sustentar de forma natural poblaciones de lobos (Echegaray et al. 2005a), la

conflictividad y los daños ganaderos (Vilà y Echegaray 2007, Talegón, en prensa) y la

percepción social hacia este depredador en el área de estudio.

Por otra parte, no debemos olvidar que la ley Estatal 42/2007 de Patrimonio Natural

y Biodiversidad establece diciembre de 2010 como fecha límite para la redacción y

aprobación de instrumentos de gestión para los espacios protegidos de la Red Natura 2000,

espacios en los cuales, el lobo como Especie de Interés Comunitario cobra especial

protagonismo. Los espacios naturales que albergan poblaciones de lobo, situados en los

sectores más occidentales del País Vasco, abarcan el 31% del total de la superficie propuesta

por las Administraciones Vascas como Red Natura 2000 (Echegaray et al. 2008a).

Resulta evidente que la problemática que genera en la sociedad algunos de los

aspectos relacionados con la gestión del lobo (Fritts et al. 1997, Breitenmoser 1998,

Naughton-Treves et al. 2003, Nie 2003) y particularmente en Euskadi (Sáenz de Buruaga et

al. 1994, Echegaray et al. 2004, 2006, Askacíbar y Ocio 2006). Por todo ello, es necesario

adoptar un plan de conservación y gestión de la especie en el País Vasco que abarque todas y

cada una de las cuestiones anteriormente mencionadas, así como la actualización y revisión

periódica de la información disponible sobre esta especie.




nDentro de cualquier plan de gestión es fundamental conocer el tamaño aproximado

de la población y unos mínimos parámetros demográficos (Fuller 1995). La UICN, en el

Manifiesto y Directrices sobre la Conservación del Lobo del Grupo de Expertos en Lobo,

indica en su punto “d” la necesidad de conocer y actualizar el estatus y distribución de la

especie. Dentro de esta línea de investigación, en este estudio se ha prolongado el seguimiento

de poblaciones de lobo ibérico mediante técnicas genéticas no invasivas en el País Vasco y su

entorno durante 2008, continuando así con las investigaciones iniciadas en el año 2003

(Echegaray et al. 2005a, 2008b).



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n II. ANTECEDENTES

El lobo es un depredador emblemático que ha dejado una profunda huella en la

cultura y mitología vascas (Altuna 1971, Barandiarán 1972, Murga 1978), y cuya presencia en

la Comunidad Autónoma del País Vasco está sometida a fuertes variaciones temporales, tanto

en lo que se refiere a número de efectivos como a su área de distribución (Álvarez et al. 1985,

1998), debido principalmente a su conflictividad con la ganadería extensiva de ovino de raza

“latxa” (Sáenz de Buruaga et al. 1994, Echegaray et al. 2005a, Askacibar y Ocio 2006, Vilà y

Echegaray 2007).

El método habitualmente utilizado, en el contexto internacional para estimar las

poblaciones de lobos, consiste en el conteo de grupos familiares y en la evaluación de la

densidad y tamaño de sus poblaciones durante el período otoño-invierno (Barrientos y

Fernández 2002, Mech y Boitani 2003), debido a la mayor cohesión de los grupos en esta

época (Fuller y Snow 1988).

En el País Vasco resulta difícil conocer su tamaño poblacional debido a su elevada

movilidad e inestabilidad espacio-temporal,, como consecuencia de la ecología espacial de la

especie y de la elevada presión humana a la que está sometida.

La búsqueda de indicios es un modo habitual para intentar detectar la presencia y

abundancia de lobos en una zona, pero la existencia de perros asilvestrados, incontrolados o

mastines que acompañan al ganado ovino, puede dificultar en gran manera la identificación de

los indicios. Debido al avance de las técnicas genéticas no invasivas durante la última década,

es posible confirmar la especie que ha depositado un excremento, así como determinar el

tamaño de una población aún cuando su baja densidad, su comportamiento esquivo y la

humanización del medio dificultan su detección directa.

Para estudiar el tamaño de la población de lobos existente en el País Vasco y zonas

limítrofes, Echegaray et al. (2005a, 2008b) analizaron genéticamente excrementos de cánidos Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea 11

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nrecogidos en las zonas donde se acumulan los indicios de presencia de la especie para

determinar el número mínimo de lobos que la habitan. Desde 2003 a 2007 se recopilaron r185

muestras fecales susceptibles de ser de lobo en un área de 2700 km2 en el límite nororiental

del área de distribución del lobo en la Península Ibérica. Dichas muestras fueron recogidas a

lo largo de casi 874 kilómetros de itinerarios para registro de indicios. En 159 casos (85% del

total) se pudo identificar la especie, mediante la secuenciación de un fragmento de la región

control del ADN mitocondrial, correspondiendo en 51 casos a lobo (Canis lupus signatus C.,

1908), 8 a zorro (Vulpes vulpes L., 1758) y 68 a perro (Canis familiaris L., 1758).

Mediante el análisis de 20 microsatélites localizados en cromosomas no sexuales y con

datos completos para al menos 12 loci, se detectaron al menos 17 genotipos diferentes que

asociamos a diferentes individuos (Echegaray et al. 2005b, 2007a, 2008b). El número

máximo de genotipos diferenciados con al menos 10 loci fue de 23.

Por otra parte, la presencia de lobo fue detectada en 13 cuadrículas UTM de 100 km2

del País Vasco (11,7% del total; N=111), correspondiendo el 84,6% de las mismas a Álava y

el 15,4% a Vizcaya.

AÑO

Nº MUESTRASFECALES

ESFUERZO (Km)

Nº HECES IDENTIFICADAS

ADNMIT (%)

Nº HECES LOBOS

(%)

Nº HECES PERROS

(%)

Nº HECES ZORROS

(%)

Nº DE LOBOS

DISTINTOS

2003 27 137 10 (37%) 4 (40%) 6 (60%) 0 3

2004 109 553 76 (70%) 27 (35%) 47 (62%) 2 (3%) 13-18

2005 9 34 9 (100%) 6 (67%) 2 (22%) 1 (11%) 2

2006 12 45 9 (75%) 3 (33%) 4 (44%) 3 (33%) 2

2007 28 105 22 (79%) 11 (50%) 9 (41%) 2 (95) 2-3 TOTAL 202 874 159 (79%) 51 (32%) 68 (43%) 8 (55) -

Tabla II.1.

Síntesis de los muestreos genéticos efectuados en el período 2003-2007.

12 Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea

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Figura II.1. Distribución del lobo según los estudios basados en análisis genéticos efectuados en el período 2003-2007.




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n III. OBJETIVOS

Teniendo en cuenta que en los anteriores estudios (Echegaray et al. 2005a, 2008b)

quedó demostrada la imposibilidad de distinguir “a visu” entre los excrementos de lobo y los

de algunos perros en determinadas circunstancias, los objetivos concretos que nos planteamos

para este estudio han sido los siguientes:

- La recolección del mayor número posible de excrementos con tipología

compatible con lobo.

- La identificación de la especie, de las muestras fecales recogidas y la detección

de individuos de lobos durante el año 2008 con técnicas moleculares como

metodología estandarizable no invasiva.

- La caracterización de los excrementos encontrados e identificados en función de

parámetros ambientales y geográficos.

- Estima de la distribución mínima del lobo en la Comunidad Autónoma Vasca

durante el período de estudio.




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n IV. ÁREA DE ESTUDIO.

El área de estudio está situada en el límite nororiental de la distribución del lobo

ibérico (Blanco et al. 2002) y comprende el occidente de la Comunidad Autónoma del País

Vasco, nordeste de Burgos (Castilla y León) y una pequeña parte del sureste de Cantabria

(incluyendo el enclave de Trucíos). Tiene una extensión total de 2.700 km2 (Figura IV.1) e

incluye las comarcas alavesas de Estribaciones de Gorbea, Valles Alaveses y Cantábrica, la

vizcaína de Encartaciones, la burgalesa de Las Merindades y la cántabra de Asón. Esta zona

de estudio fue seleccionada tomando en consideración los datos oficiales de daños al ganado

atribuidos al lobo cedidos por las Diputaciones Forales de Vizcaya y Álava durante el período

1999-2002. Se han añadido zonas adyacentes de otras comunidades autónomas en las que la

presencia de lobo era probable, por tratarse de territorios con las mismas características

naturales y ecológicas.

La distribución de esta superficie corresponde al País Vasco en un 62%, el 35% a

Castilla y León y el 3% a Cantabria. Forma parte de dos regiones biogeográficas:

eurosiberiana y mediterránea. La disposición de la mayor parte de sus sierras acentúa y marca

etapas de transición bioclimáticas entre las anteriores regiones biogeográficas que se reflejan

en la variedad de ecosistemas presentes. La altitud media es de 652 metros, con una máxima

de 1.482 y una mínima de 79 m. Destaca por la heterogeneidad de ambientes producto de la

transformación humana y predomina la superficie ocupada por bosques (46%), tanto de pino

silvestre (Pinus silvestris), haya (Fagus sylvatica), encina (Quercus ilex) y roble marojo

(Quercus pyrenaica), como de coníferas exóticas de repoblación. También aparecen etapas de

degradación de bosques (18%), pastizales en los altiplanos serranos (20%), que albergan una

numerosa cabaña ganadera durante casi todo el año, y fondos de valle dedicados a la

agricultura y ganadería (12%) en los valles aluviales más desarrollados.

Dentro de territorio vasco, el lobo aparece en al menos 13 cuadrículas UTM 10x10

km, de las cuales el 85% (N=11) son alavesas (Echegaray et al. 2005a). El Territorio

Histórico de Álava es la mayor de las provincias que forman la Comunidad Autónoma del



nPaís Vasco y cuenta con 301.926 habitantes (INE-Anuario Estadístico de España 2007) en

una extensión 3.047 km2, lo que supone una densidad de 99,1 hab/km2. No obstante, la

distribución poblacional es desigual y el 75,4% de sus habitantes se concentra en su capital

Vitoria-Gasteiz. En cambio, el 75% de la superficie con presencia lobuna presentan una

densidad inferior a los 50 hab/km2.

Para una descripción e información mas detallada del área de estudio, consultar

Echegaray et al. (2005a).

Figura IV.1. Localización del área de estudio.


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n

Figura IV.2. Topografía del área de estudio.




n



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V. MATERÍAL Y MÉTODOS .

V.1. Muestreos de campo.

La detección de poblaciones en baja densidad es una tarea difícil; en primer lugar por

una sencilla cuestión de azar, pero también porque estos carnívoros territoriales son escasos,

no están adscritos a grupo o manadas estables y dejan entonces, proporcionalmente, menos

indicios que aquellos que viven en densidades normales o elevadas (Rothman y Mech 1979),

dificultades que se incrementan en zonas humanizadas (Ayuso y Vilà 2001).

La utilización actual de métodos genéticos no invasivos representa un considerable

avance para determinar presencia y ausencia real de una especie en numerosas zonas evitando

la subjetividad de la identificación de indicios indirectos (Guzmán 2002). Esta subjetividad se

acentúa en zonas de baja densidad de una especie y donde haya varias especies con un

evidente grado de solapamiento y/o confusión a la hora de identificar y adscribir

específicamente indicios indirectos (huellas y excrementos) de lobo, como atestiguaron

Echegaray et al. (2005a, 2008b)

El trabajo de campo, se ha llevado a cabo a lo largo de 2008 y ha consistido en la

búsqueda de excrementos de cánidos compatibles por sus características con los de lobo, en

recorridos prefijados no sistemáticos en zonas donde la probabilidad de detección de muestras

fecales fuera mayor según la información previa disponible (Echegaray et al. 2005a, 2008b).

Así, se han realizado transectos por caminos, pistas y cortafuegos que transcurren por los ejes

de las sierras, revisándose collados y cruces de caminos que constituyen lugares querenciosos

para el marcaje de los lobos (Llaneza 1996). Aunque Echegaray et al. (2005a) demuestran que

los excrementos de lobo y perro no son indiferenciables a visu por las características y

contenido de los mismos en el área de estudio, hemos utilizado preferentemente los criterios

empleados por Balmori et al (2000) a la hora de la asignación de excrementos de lobo frente a

los de otros cánidos. El esfuerzo en los muestreos de campo de este trabajo ha sido dirigido



nhacia aquellos lugares donde la probablidad del hallazgo de excrementos de lobo era mayor,

seleccionando preferentemente las zonas donde Echegaray et al. (2008b) detectaron más

muestras fecales y ejemplares de lobos.



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n V.2. Recolección, caracterización y conservación

de las muestras fecales.

Como acabamos de mencionar, las muestras fecales han sido recogidas en el campo

durante la realización de los itinerarios de muestreo, por personal instruido, que siguió

meticulosamente un protocolo previamente establecido, para evitar contaminaciones y

asegurar el “buen estado de conservación” de las muestras de ADN, así como la propia

seguridad de los investigadores. Para la recogida de heces evitando contaminaciones y

problemas sanitarios, se utilizaron guantes de látex y bolsas de congelados desechables, así

como mascarillas.

Cada excremento recogido se individualizaba en bolsas herméticas, y se etiquetaba

convenientemente para su identificación y localización. Para cada muestra se rellenaba una

ficha con los siguientes campos:

• Autor: identificación del recolector

• Fecha: según el modelo día, mes y año (mm.dd.aaaa)

• Estación: Se agruparon los registros según las estaciones naturales.

o Primavera

o Verano

o Otoño

o Invierno.

• Coordenadas: Se registraban las coordenadas UTM con el Sistema de

Posicionamiento Global (Global Positioning System, G.P.S.).

• Altitud: En metros sobre el nivel del mar registrados con GPS. Después, los

datos se agruparon para un mejor análisis según unas categorías establecidas

en función de las cotas altitudinales existentes en el área de estudio:

o Menos de 800 metros

o Entre 800 y 1.000 metros

o Más de 1.000 metros.

• Vegetación: Según las siguientes categorías de vegetación predominante:



no HAY: hayedo

o ENC: encinar

o PSI: pinar de pino silvestre

o MAT: matorral

o PAS: pastizal montano

o CUL: cultivos

o MEPR: melojar y pinar de repoblación

o ENPS: encinar y pinar silvestre

o PRPAS: pinar de repoblación y pastizal

o MEPS: melojar y pinar silvestre

o QUE: quejigal

o OTROS: indicando cuales.

• Antigüedad: Con la lógica prudencia que una variable de este tipo implica al

tratarse de un carácter subjetivo y orientativo, las muestras fecales se

clasificaron según las siguientes categorías:

o Muy reciente: Menos de 1 día.

o Reciente: Más de 1 día, pero aún con materia orgánica en

descomposición.

o Vieja: Secos y sin materia orgánica en descomposición.

• Localización/Emplazamiento: Según las siguientes categorías:

o Pistas forestales.

o Senderos.

o Otros: indicando cuales.

• Ubicación: Se clasificaron según fueran hallados en el Centro, los Laterales

(márgenes) o en los Cruces (intersecciones) de las pistas forestales, caminos

o senderos.

• Elevación de la deposición: los excrementos se clasificaron según estuvieran

depositados al nivel del suelo o en algún tipo de elevación (sobre plantas,

montículo del terreno, piedras, troncos, etc.).



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n • Componentes: Según un examen a visu, los componentes de cada

excremento fueron caracterizados según su naturaleza:

o Indeterminado: su composición es desconocida.

o Pelos.

o Huesos y/u otros componentes de carácter oseo o queratinoso

(pezuñas).

o Vegetales.

o Combinaciones de elementos anteriores.

• Tipo de contenido: Según se observaran a simple vista componentes

pertenecientes a las tres categorías siguientes: Silvestre (ungulados silvestres

como el corzo, etc.), Doméstico (reses de ganado) e Indeterminado

(desconocido).

Los datos recogidos en el campo se trasladan a una base de datos informática para su

posterior tratamiento estadístico.

Todas las muestras (excrementos y tejidos) se conservaron en etanol 96% hasta su

procesamiento en el laboratorio y se almacenaron en un congelador a -20º C.

Cada muestra fecal se dividió en dos porciones. Una pequeña parte de ellas pasó a

ser llevada al Departamento de Biología Evolutivo de la Universidad de Uppsala (Suecia),

para la realización del análisis molecular y la otra quedó como reserva en congelación para

poder repetir los análisis oportunos en caso de que fuera necesario.



nV.3. Análisis de laboratorio.

V.3.1. Extracción de ADN de heces.

La extracción de ADN a partir de excrementos es posible gracias a las células

epiteliales que se desprenden y se adhieren a los excrementos al pasar por el intestino (Hoss et

al. 1992).

Para estas extracciones se han utilizado los equipos QIAamp® DNA Stool Mini Kits

de la casa QIAGEN, siguiendo las instrucciones establecidas por los fabricantes.

A un trozo de excremento de entre 180-220 mg se le añade 1,6 ml de buffer o

soluciones tampón de extracción ASL que sirven para desnaturalizar las proteínas celulares, y

se agita en vortex hasta que la muestra se homogenice aproximadamente durante un minuto.

Se centrifuga a 13.000 revoluciones por minuto (rpm) durante un minuto para desagregar las

partículas.

Se transfiere 1,4 ml de lo sobrenadante y se le añade una pastilla de InhibitEX, para

permitir que los inhibidores de las reacciones de PCR absorban la matriz de InhibitEX. Se

agita en vortex y la suspensión resultante se deja un minuto a temperatura ambiente y en

reposo. Posteriormente se centrifuga a 13.000 rpm durante tres minutos, se extrae lo

sobrenadante y se vuelve a centrifugar durante otros tres minutos a más de 13.000 rpm. Se

extrae una alícuota de 600 µl y se añade 25 µl de proteinasa K para su digestión enzimática, y

se mezcla agitándola convenientemente hasta que la solución se homogenice.

La disolución resultante es sometida a incubación a 70ºC durante diez minutos, se

agita y se añaden 600 µl de etanol 95%. Se vuelve a agitar convenientemente y se centrifuga a

alta velocidad (13.000 rpm) durante un minuto.

El extracto obtenido pasará ahora por un proceso por triplicado de limpieza a través

de unos tubos con columnas de purificación de productos de PCR (QIAkick de QIAGEN)

para eliminar mayor cantidad de inhibidores enzimáticos que impidan la amplificación de

ADN durante la PCR. Para ello, se extrae tres alícuotas del producto sobrenadante resultado

de otras tantas centrifugaciones de un minuto de duración.



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n Posteriormente, se añaden 500 µl de dos buffers (AW1 y AW2) en una doble etapa

de limpieza, centrifugando uno y tres minutos respectivamente. Por último, el producto final,

que sumará unos 1,6 ml, se centrifuga durante un minuto más, y se le añade 200 µl de un

buffer AE de lavado, que se someterá a la última centrifugación de 1 minuto, cuyo precipitado

será el extracto final de la extracción. Se incluye un control negativo, que es tratado de la

misma manera que el resto de tubos con excrementos, pero en este caso sin excremento, para

detectar las contaminaciones por ADN extraño durante la extracción.

Fueron realizadas al menos dos extracciones independientes por cada muestra fecal.

V.3.2. Ampliación de ADN: PCR (Reacción en cadena por la polimerasa).

Para comprobar si las extracciones realizadas fueron positivas, se procedió a la

amplificación por PCR. La PCR es una técnica in vitro (Mullis y Faloona 1987) basada en

una reacción en cadena por la enzima polimerasa que permite producir importantes cantidades

de ADN a partir de muestras que sólo contienen pequeñas cantidades de ADN. En el caso de

muestras biológicas con escasa cantidad de ADN o elevada contaminación, este proceso es

altamente importante porque ya se parte de cantidades ínfimas de ADN extraído.

Para este proceso se utilizan cebadores o “primers” descritos por Vilà et al. (2003),

que son secuencias perfectamente definidas de ADN, con longitudes 20 a 30 nucleótidos que

coinciden con los extremos de la secuencia deseada. Cada uno de ellos es complementario con

una de las dos hebras del ADN problema. La reacción tiene tres etapas:

1. Desnaturalización o separación de las dos cadenas de la doble hélice de

ADN; se efectúa en un corto período de tiempo a temperatura elevada.

2. Los cebadores se hibridan específicamente con la secuencia correspondiente

de las hebras de ADN sencillas, a temperatura más baja.

3. La ADN polimerasa, en presencia de los desoxirribonucleótidos trifosfato

(dNTP) alarga los cebadores sintetizando una secuencia complementaria al

ADN problema.



nLos cebadores utilizados para esta amplificación han permitido construir secuencias

superpuestas de fragmentos de la región control del ADN mitocondrial de un cierto número

de nucleótidos (ver Tabla V.3.2.1) necesarios para poder identificar inequívocamente

secuencias de lobos y perros, por su divergencia genética en tiempo reciente, evolutivamente

hablando.

Primer Secuencia (5´-3´) Primer Secuencia (5´-3´) Fragmento (bp)

Thr L CAATTCCCCGGTCTTGTAAACC DL H CCTGAAGTAGGAACCAGATG 470

Tabla V.3.2.1. Secuencia de los cebadores o primers utilizados y de los fragmentos de ADN mitocondrial amplificados para la

identificación específica.

Para la realización de las PCRs se utilizaron termocicladores (PCT 225 DNA Engine

Tetrad, PCT 100 Perkin Elmer), cuya función es amplificar ADN mediante ciclos combinados

a diferentes temperaturas para desnaturalizar las hebras de ADN, activar la replicación y la

enzima polimerasa clave en la reacción. Todo el proceso se realiza automáticamente.

Las polimerasas que se utilizan son enzimas que actúan a temperaturas muy elevadas

como ocurre durante la desnaturalización. En nuestro caso fue la HotStarTaq (Qiagen).

Los parámetros de temperatura (ciclos, temperatura de anillamiento), concentración

de los reactivos (magnesio, agua, etc.), volumen de ADN de la muestra y de la disolución

problema), número y duración de los ciclos, fueron modificados, ensayados y optimizados

para obtener un mayor rendimiento y una mayor especificidad de la reacción de PCR.

Las amplificaciones se realizaron en un volumen final 10 µl de disolución acuosa

usando: 0,2 mM dNTP (PCR Nucleotide Mix), 1x PCR buffer HotStar (Qiagen), 25 mM Mg

Cl2, 10 µM del primer “forward”, 10 µM del primer “reverse”, 0,5 U/µl HotStarTaq

polimerasa (Qiagen), y 2 µl de extracto biológico de la muestra problema. Se incluyó un

control negativo, que es tratado de la misma manera que el resto de tubos, pero en este caso

sin muestra biológica, para detectar las contaminaciones por ADN extraño durante la

amplificación.



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n En caso de contaminación, los productos de PCR resultante no son fiables y son

descartados. También se añadió un control positivo, que como en el caso del control negativo,

es tratado de la misma manera que el resto, pero con una muestra biológica de lobo conocida

a priori y de elevada concentración de ADN, para detectar el éxito del proceso de

amplificación de ADN de la reacción de PCR.

Se emplearon ciclos combinados con un primer proceso de desnaturalización de 95ºC

durante 7-15 minutos, 95ºC, un minuto, entre 50 y 57ºC durante 2 minutos, 35 ciclos de 72ºC

durante un minuto y medio, y 72ºC durante 10 minutos, seguidos de una extensión final de

4ºC.

Los productos de la PCR se hicieron migrar mediante electroforesis durante 30

minutos y a 90 Voltios de intensidad de corriente continua, en geles de azarosa (1-2%) usando

marcadores de tamaño de 100 nucleótidos DNA Ladder (Promega, Madison, WI).

Posteriormente se lavaron en bromuro de etidio y se visualizaron con un escáner de luz UV

para comprobar el éxito de dicha reacción.

Las muestras que resultaron amplificadas positivamente se seleccionaron y se

conservaron en congeladores de -20ºC para posteriores tratamientos.

Posteriormente, los productos de la PCR se trataron para la eliminación de los

cebadores y dNTPs no deseados cara a la secuenciación, mediante los QIAQuick PCR

Purification Kits de QIAGEN (ExoSAP-IT™ PCR Purification Kit y DYEnamic™ ET

Terminator Cycle Sequencing Kit), siguiendo las instrucciones de los fabricantes.

V.3.3. Secuenciación de ADN. Todos los productos de amplificación de ADN se secuenciaron en la MegaBACETM

1000 (Amersham Biosciences), que usa un sistema de detección de ADN de 96 capilares.

2008 INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.

nMEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS

Figura V.3.3.1.

Ejemplo de una secuencia de ADN mitocondrial de 30 bp de la muestra fecal denominada 74.

Figura V.3.3.2. Ejemplo de una secuencia de ADN mitocondrial de 40 bp de la muestra fecal denominada I02, en la cual se

puede comprobar la contaminación existente, lo cual hace difícil la lectura e interpretación de dicha secuencia para su identificación.


8



2008


n V.3.4. Identificación de especie.

Las secuencias parciales del citocromo b y/o la región D-loop de la región control

mitocondrial de las muestras biológicas objeto de estudio se ordenaron y se alinearon

mediante el programa SequencherTM 4.1 (Gene Code Corporation, Inc.).

Para la identificación de esas secuencias de adscripción específica indeterminada, se

emplearon secuencias de perros y lobos de referencia (Vilà et al. 1999, C. Vilà, datos

propios), con la ayuda del programa PAUP 4.0 b10 (Swofford 2002) y de las secuencias

homólogas disponibles de cánidos de una base de datos pública (Gene Bank), a través de la

función BLAST 2.0 en la web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

Esto nos ha permitido conocer la identidad de la especie de la que procede la muestra

por porcentajes de similitud.



nV.4. Análisis de datos.

Utilizamos el Sistema de Información Geográfica ArcGIS.9 para el análisis de datos

geográficos así como para el cálculo de las distintas variables y categorías seleccionadas.

Hemos utilizado distintos tipos de cartografía digital como los mapas de vegetación de la

Comunidad Autónoma del País Vasco a escala 1:25.000, las hojas de los mapas topográficos

del área de estudio correspondientes a Álava y Vizcaya escala 1:10.000, y los mapas de

Cultivos y Aprovechamientos del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación.

Para el análisis de los datos genéticos se ha utilizado el programa Microsatellite

Toolkit para Microsoft Excel (Park 2001).

No se ha efectuado ningún tipo de caracterización de la variabilidad genética debido

a que estos análisis requieren el estudio de poblaciones y no de individuos, lo cual significa

un tamaño de muestra significativamente mayor que el obtenido en el presente estudio

Para el análisis estadístico de los datos se ha empleado el programa estadístico SPSS

versión 15.0.

Para comprobar la normalidad de las variables cuantitativas se realizó el test de

Kolmogorov-Smirnov (Sokal y Rohlf 1969). Para analizar las posibles relaciones entre

variables y teniendo evidencias en contra de la normalidad, aplicamos el coeficiente de

correlación de Spearman.

Se utilizó la prueba chi cuadrado para el análisis de las frecuencias y de las

relaciones entre las variables categóricas. La significación se calculó a partir de la técnica de

Monte Carlo, que permite simular 10.000 muestras aleatorias con igual distribución que la

dada y obtener una significación promedio mucho más exacta y con un intervalo de confianza

del 99%.



2008

n


VI.1. Caracterización de las muestras. El material biológico recopilado y objeto de análisis en este trabajo está constituido

por 26 excrementos, con tipología propia de la especie objeto de estudio.

Como resultado de los transectos no sistemáticos efectuados, se han recorrido 123,2

kilómetros y se han recogido 26 excrementos, lo cual supone una media de un excremento

cada 4,74 kilómetros recorridos y un IKA de 0,21 excrementos/km.

Hemos muestreado todas las cuadrículas del área de estudio, aunque con esfuerzos

muy dispares. La media ha sido de 4,56 kilómetros prospectados por cuadrícula.

Hemos conseguido recoger muestras de 8 de las 27 cuadrículas que forman el área de

estudio (29,6%; N=27). En la tabla siguiente se muestra las frecuencias de muesttras

recogidas en las 27 cuadrículas objeto de estudio.

Nº de muestras

Frecuencia cuadrícula Porcentaje

0 19 70,4 1 2 7,4 2 3 11,1 5 1 3,7 6 1 3,7 7 1 3,7

Total 27 100,0

VI. RESULTADOS .

Tabla VI.1.1

Frecuencia de las muestras recogidas en las 27 cuadrículas UTM de 10x10 km, del área de estudio.


nSe ha apreciado una correlación moderada entre los kilómetros recorridos en cada

cuadrícula UTM de 10 km de lado y el número de muestras recogidas (rs =0,645; p= 0,000).

CUADRÍCULA KM RECORRIDOS NÚMERO DE EXCREMENTOS

VN57 1,5 0

VN67 2,0 0

VN68 1,6 0

VN74 2,39 0

VN75 6,50 6

VN76 4,64 1

VN77 6,91 0

VN78 5,99 0

VN84 11,6 2

VN85 8,32 2

VN86 7,12 5

VN87 4,45 0

VN88 9,65 0

VN93 2,78 0

VN94 1,98 0

VN95 10,0 7

VN96 4,68 0

VN97 3,12 0

WN03 2,75 0

WN04 4,87 2

WN05 5,82 1

WN06 2,70 0

WN14 1,54 0

WN15 0,87 0

WN16 2,43 0

WN25 1,24 0

WN26 5,75 0

TOTAL 123,2 26

Tabla VI.1.2.

Kilómetros recorridos y muestras recogidas en cada una de las cuadrículas estudiadas.


8



2008

n

De 1 a 2 km De 2 a 5 km

De 5 a 10 km

> 10 km

Figura VI.1.1. Esfuerzo de muestreo en cada una de las cuadrículas UTM de 10x10 km del área de estudio.



n

Cantabria Burgos Álava Vizcaya

Área de estudio Muestras recogidas en 2008

Figura VI.1.2. Localización de las muestras recogidas durante el año 2008.


8


MEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS. 2008

Grupo Lobo de Euskadi / Euskadiko Otso Taldea

n

0 Excrementos

1 Excremento

De 2 a 3 Excrementos

De 3 a 5 Excrementos

> 5 Excrementos

Figura VI.1.3. Categorización de las cuadrículas según los excrementos recogidos

37 8


nLa distribución mensual de las 26 muestras recogidas durante el periodo de estudio se

ha reflejado en la tabla siguiente. Puede observarse que los meses con más excrementos

recogidos han sido Agosto (38,5%), Mayo (15,4%) y Abril (11,5%).

MES 2008 %

Enero 1 3,9

Febrero 2 7,7

Marzo 1 3,9

Abril 3 11,5

Mayo 4 15,4

Junio 1 3,9

Julio 3 11,5

Agosto 10 38,5

Noviembre 1 3,9

Total 26 100

Tabla VI.1.3.

Distribución mensual de los excrementos recogidos en 2008.

En cuanto a la altitud, 15 excrementos (57,7%; N=26), fueron recogidos en altitudes

comprendidas entre los 800 y 1.000 metros y 10 (38,5%) a menos de 800 metros. La muestra

fecal restante (3,8%) fue recogida a más de 1.000 m.

Entre los distintos tipos de vegetación prospectados, donde más excrementos se

recogieron, fue en las formaciones de pastizales montanos, en concreto 8 (30,8%; N=26),

seguido de formaciones arbustivas y quejigales, con 5 heces cada una de ellas (19,2%). Tanto

en encinares (Quercus ilex ballota) como en zonas cultivadas, se han recopilado 2 muestras

(7,7%). El resto se ha repartido entre formaciones mixtas de roble melojo (Quercus

pyrenaica), pinos silvestres (Pinus silvestris) y plantaciones de coníferas exóticas

En lo que atañe a la antigüedad, la mitad de los excrementos fueron considerados

como Recientes, el 46,2% como Viejos y sólo el 3,8% de los excrementos fueron clasificados

como Muy Recientes.

Los itinerarios han sido realizados preferentemente a lo largo de pistas forestales

puesto que en ellas es más factible la localización de excrementos atribuidos al lobo. Es por




2008

n ello que el 88,5% de los excrementos han sido localizados en ese tipo de vías, el 7,7% en

carreteras y tan sólo el 3,8% en senderos. En lo que se refiere a la ubicación de los

excrementos, un total de 11 muestras fueron recogidas tanto en los márgenes de las pistas

como en el centro de las mismas (42,3%; N=26). Las 4 restantes fueron halladas en cruces de

pistas (15,4%).

También es de destacar que solamente 4 muestras fecales fueron localizadas en

lugares con una cierta elevación en cuanto a su deposición (15,4%; N=26). De ellos, todos se

situaban a menos de 5 cm. En cuanto al sustrato sobre el que se elevaban, 3 se encontraban

sobre plantas (75%; N=4) y 1 sobre otros sustratos (25%; N=4).

En el examen a visu de los excrementos se observaron como componentes

principales la combinación de pelos y huesos con pezuñas en el 46,2% (N=26) y únicamente

pelos en el 26,9% de los casos. La combinación de pelos con vegetales, pelos con hueso y

pezuñas y vegetales, así como la imposibilidad de determinación a visu de componente

alguno se produjo en el 7,7% de los casos. La aparición de heces con únicamente huesos y

pezuñas como elementos principales se da en el 3,8% de los casos.

También a visu se estableció que en el 46,2% de los casos (N=26) no se pudo

determinar si los componentes de los excrementos (a partir de pelos, fundamentalmente) eran

presas silvestres o ganado doméstico. Las presas silvestres aparecieron en el 23,1% de los

casos mientras que restos de ganado doméstico fueron identificados en el 30,8% de las heces.

El corzo fue el tipo de presa silvestre encontrado con más frecuencia (80% de los casos) y lo

hizo en el 19,2% del total de excrementos recogidos (N=26).



nVI.2. Identificación de la especie.

En la secuenciación de su ADN mitocondrial, se ha obtenido el resultado positivo de

identificación de la especie en el 96,1% de los casos (N=26), tan sólo en una muestra no se

pudo identificar la especie. Todas las muestras fecales identificadas pertenecieron a especies

de la familia Canidae. De ellas, 14 correspondieron a lobo ibérico (Canis lupus), 6 a perro

(Canis familiaris) y 5 a zorro (Vulpes vulpes).

Especie Muestras %

Lobo 14 56

Perro 6 24

Zorro 5 20

Total 25 100

Tabla VI.2.1. Distribución de número y de porcentajes de las muestras según la especie identificada con secuencias de ADN

mitocondrial.

En las muestras fecales de lobo identificados se han encontrado dos haplotipos

distintos (lu1 y lu4), lo cual constituye un hecho relevante y novedoso en estos análisis de

ADN mitocondrial, puesto que Echegaray et al. (2005a, 2008b) encontraron un único perfil

genético, que constituye uno de los dos más frecuentes de la Península Ibérica (Vilà et al.

1999).

Estos resultados se pueden apreciar en el mapa de la figura VI.2.1, donde se constata

la presencia inequívoca de lobos en al menos 5 cuadrículas UTM de 10x10 km, lo que supone

el 185% del área de estudio (N=27).

De las cinco cuadrículas con presencia de lobo, cuatro tienen parte total o parcial de

su ámbito geográfico en Álava y la otra restante se localiza fuera del ámbito geográfico de la

CAPV.

Los seis excrementos asignados a perro según los análisis se han localizado en 4

cuadrículas del área de estudio (14,8%; N=27).




2008

n Por último, los cinco excrementos de zorro se han localizado en 3 cuadrículas UTM

del área de estudio (11,1%; N=27), una en la provincia de Burgos y dos en Álava.

Figura VI.2.1. Localización de los excrementos recogidos que han correspondido a lobo (Canis lupus).


INFORME SOBRE EL SEGUIMIENTO DE LAS POBLACIONES DE LOBOS EN LA 2008 COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO.

nMEDIANTE USO DE TÉCNICAS GENÉTICAS NO INVASIVAS

Figura VI.2.2. Localización de los excrementos recogidos que han correspondido a perro (en negro) y zorro (en rojo).


8



2008

n VI.3. Caracterización de los excrementos identificados y comparación entre especies.

Distribución mensual: observamos que en los meses de marzo y junio, todas las

muestras recogidas e identificadas correspondieron al lobo. En el mes de agosto, mes con más

muestras recogidas e identificadas, el porcentaje de muestras correspondientes a lobo es del

67% y es el mes en el que se recogen el 36% de todas las muestras y el 42,9% de las de lobo.

En enero y noviembre, la única muestra identificada correspondió a perro y las únicas dos

muestras identificada del mes de abril, correspondieron a zorro. No se observaron diferencias

significativas (χ2=18,350; gl=16; p=0,304), ni cuando las muestras de zorro se eliminan del

análisis (χ2=6,508; gl=7; p=0,482).

LOBO PERRO ZORRO TOTAL

N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % ** Enero - - - 1 16,6 100 - - - 1 4

Febrero - - - - - - 2 40 100 2 8

Marzo 1 7,1 100 - - - - - - 1 4

Abril 2 14,2 67 - - - 1 20 33 3 12

Mayo 2 14,2 50 1 16,6 25 1 20 25 4 16

Junio 1 7,1 100 - - - - - - 1 4

Julio 2 14,2 67 1 16,6 33 - - - 3 12

Agosto 6 42,6 66,6 2 33,3 22,2 1 20 11,1 9 36

Noviembre - - - 1 16,6 100 - - - 1 4

TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100

Tabla VI.3.1.

Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y el mes en el que fueron recogidas (* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de mes).



n


Gráfico VI.3.1. Distribución comparativa de los porcentajes de mes de las muestras según la especie identificada

Distribución estacional: De todas las muestras recogidas en Verano, el 75%

correspondían a lobo y de las recogidas en Primavera, el 57,1%. En Otoño no se recoge

ninguna muestra de lobo y en Invierno, la mayor parte de las recogidas fueron de perro y de

zorro.

No se han encontrado diferencias estadísticamente significativas en la comparación

por especies y estaciones (χ2=8,25; gl=6; p=0,220), ni cuando solamente comparamos perro y

lobo (χ2=5,224; gl=3; p=0,156).

Tabla VI.3.2

Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y la estación en la que fueron recogidas (* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de estación).

ALTITUD LOBO PERRO ZORRO TOTAL

N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % ** Primavera 4 28,5 57,1 1 16,7 14,3 2 40 28,6 7 28

Verano 9 64,3 75 2 33,3 16,6 1 20 8,3 12 48

Otoño - - - 1 16,7 100 - - - 1 4

Invierno 1 7,2 20 2 33,3 40 2 40 40 5 20

TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100

0255075

100

Enero

Febrer

o

MarzoAbril

MayoJunio

Julio

Agosto

Noviembre

% d

e es

peci

e

Lobo Perro Zorro



2008

n

0

25

50

75

100

Primavera Verano Otoño Invierno

% d

e es

peci

e

Lobo Perro Zorro

Gráfico VI.3.2.

Distribución comparativa de los porcentajes de estación de las muestras para las distintas especies identificadas.

Distibución altitudinal: Los excrementos de lobo, perro y zorro se han encontrado a

una altitud media de 813,3 metros (DS=92,3; Max.=939; Min.=705), 802,2 m. (DS=201,6;

Max.=1.090; Min.=561) y 867,8 m. (DS=57,8; Max.=949; Min.=802), respectivamente. Las

muestras de lobo se encontraron en cotas altitudinales inferiores a los 1.000 m, las de perro

aparecen repartidas en las tres categorías, aunque el 50% se localiza entre 800 y 1.000 m. Por

otra parte, las heces de zorro aparecen entre 800 y 1.000 m. El único excremento recogido a

más de 1.000 m correspondia a perro. No obstante, estas diferencias no resultan significatívas

(χ2=8,486; gl=4; p=0,075) y tampoco cuando eliminamos del análisis al zorro (χ2=6,707;

gl=2; p=0,035).

ALTITUD LOBO PERRO ZORRO TOTAL

N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **

< 800 m 7 50 77,8 2 33,3 22,2 - - - 9 36

800-1.000 m 7 50 46,7 3 50 20 5 100 33,3 15 60

> 1.000 m - - - 1 16,7 100 - - - 1 4

TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100

Tabla VI.3.3 Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y

la altitud donde fueron localizadas (* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de altitud).



n

0

25

50

75

100

< 800 m 800-1.000 m > 1.000 m

% d

e es

peec

ie

Lobo Perro Zorro

Gráfico VI.3.3.

Distribución comparativa de los porcentajes de altitud de las muestras para las distintas especies identificadas.

En cuanto a los tipos de vegetación, los únicos tipos donde encontramos a las tres

especies son en el matorral y en pastizal montano y es en este último donde las muestras de

lobo sobresalen. Los hábitats donde el número de muestras de lobo es mayor que el de los

otros cánidos es en el quejigal, en el melojar con pino y en el pastizal. No se encuentran

muestras de lobo ni en los cultivos ni en los encinares. Podemos resaltar que los excrementos

asignados a lobo aparecen distribuidos entre más tipos de vegetación que los de zorro o perro.

Las muestras de perro aparecen distribuidas en matorrales, cultivos y pastizales

mientras que las de aparecen en casi todos los tipos salvo en los cultivos, quejigales y

melojares. No obstante, las diferencias no han sido significativas (χ2=18,098; gl=14;

p=0,202). Tampoco se han observado diferencias significativas (χ2=8,435; gl=6; p=0,208) en

la comparación entre lobos y perros.




2008

n

VEGETACIÓN LOBO PERRO ZORRO TOTAL

N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **

MAT 2 14,3 40 2 33,3 40 1 20 20 5 20

CUL - - - 2 33,3 100 - - - 2 8

ENC 1 7,1 50 - - - 1 20 50 2 8

QUE 4 28,6 100 - - - - - - 4 16

MEPR 1 7,1 100 - - - - - - 1 4

ENCPS - - - - - - 1 20 100 1 4

PAS 5 35,7 62,5 2 33,3 25 1 20 12,5 8 32

MEPS 1 7,1 50 - 1 20 50 2 8

TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100

Tabla VI.3.4. Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y

el tipo de vegetación donde fueron localizadas (* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de tipo de vegetación).

0

2550

75100

MAT CUL ENC QUE MEPR ENCPS PAS MEPS

% d

e es

peci

e

Lobo Perro Zorro

Gráfico VI.3.4.

Distribución comparativa de los porcentajes de tipo de vegetación de las muestras para las distintas especies identificadas.

En lo que respecta a la antigüedad de los excrementos, podemos observar que el

único excremento recogido como “muy reciente” fue identificado genéticamente como lobo, y

que en las otras dos categorías analizadas, los porcentajes son claramente superiores en el

caso de los lobos que en los de perros y zorros. No se encontraron diferencias significativas



ncomparando las tres especies (χ2=1,796; gl=4; p=0,773), ni tampoco si efectuamos dicha

comparación entre lobos y perros exclusivamente (χ2=1,164; gl=2; p=0,559).

ANTIGÜEDAD LOBO PERRO ZORRO TOTAL

N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **

Muy reciente 1 7,1 100 - - - - - - 1 4

Reciente 7 50 58,3 2 33,3 16,7 3 60 25 12 48

Vieja 6 42,9 50 4 66,7 33,3 2 40 16,7 12 48

TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100

Tabla VI.3.5.

Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y la antigüedad que tenían al ser recogidas

(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de antigüedad).

0

25

50

75

100

Muy reciente < 1 día Reciente < 7 días Vieja > 7 días

% d

e es

peci

e

Lobo Perro Zorro

Gráfico VI.3.5.

Distribución comparativa de los porcentajes de antiguedad de las muestras para las distintas especies identificadas.

En cuanto al emplazamiento, esta variable no es relevante ya que el grueos de las

muestreos se ha realizado en pistas. No se observan diferencias estadísticamente significativas

(χ2=4,843; gl=4; p=0,304). Ni tampoco cuando se elimina del análisis al zorro (χ2=3,193;

gl=2; p=0,203).




2008

n

EMPLAZAMIENTO LOBO PERRO ZORRO TOTAL

N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **

Pistas forestales 12 85,7 54,4 5 83,3 22,2 5 100 22,2 22 88

Otros 2 14,3 66,7 1 16,7 33,3 - - - 3 12

TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100

Tabla VI.3.6.

Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y el emplazamiento en el que fueron localizadas

(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Emplazamiento).

0

25

50

75

100

Pistas Otros

% d

e es

peci

e

Lobo Perro Zorro

Gráfico VI.3.6. Distribución comparativa de los porcentajes de emplazamiento de las muestras para las distintas especies

identificadas.

En lo que respecta a la ubicación de las muestras, la mayor parte de los excrementos

recogidos en los “cruces de caminos” corresponden a lobos, en menor cantidad a perros y

ninguno correspondía al zorro. De los encontrados en la sección “Central” y en los “laterales

de los caminos”, aunque también mayoritariamente son de lobo, las diferencias son menores.

A pesar de ello, estas diferencias no han resultado significativas (χ2=1,724; gl=4; p=0,786), ni

comparando lobo y perro solamente (χ2=0,357; gl=2; p=0,836).



nUBICACIÓN


N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **

Laterales 5 35,7 50 3 50 30 2 40 20 10 40

Centro 6 46,1 54,4 2 33,3 18,3 3 60 27,3 11 44

Cruces 3 30,8 75 1 16,7 25 - - - 4 16

TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100

Tabla VI.3.7.

Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y la ubicación en la que fueron localizadas

(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Ubicación).

0

25

50

75

100

Laterales Centro Cruces

% d

e es

peci

e

Lobo Perro Zorro

Gráfico VI.3.7.

Distribución comparativa de los porcentajes de ubicación de las muestras para las distintas especies identificadas.

En la variable elevación de la deposición, observamos que casi el 86% de los

excrementos de lobo, no estaban depositados sobre ningún tipo de elevación y únicamente el

14,3% restante se hallaba sobre plantas. En el caso de los perros y zorros un 16,7% y un 20%

estaban sobreelevados, respectivamente. No hemos encontrado ninguna muestra fecal sobre

sustrato rocoso. La mitad de las muestras encontradas sobreelevadas correspondía a lobo.

Tampoco hemos observado diferencias significativas (χ2=0,092; gl=2; p=0,955) en el análisis

comparativo.




2008

n ELEVACIÓN

DEPOSICIÓN


N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **

Si 2 14,3 50 1 16,7 25 1 20 25 4 16

No 12 85,7 57,1 5 83,3 23,8 4 80 19,1 21 84

TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100

Tabla VI.3.8.

Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y la elevación de la deposición

(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Elevación).

0

25

50

75

100

Si No

% d

e es

peci

e

Lobo Perro Zorro

Gráfico VI.3.8.

Distribución comparativa de los porcentajes de elevación de la deposición de las muestras para las distintas especies identificadas.

En cuanto al tipo de sustrato sobre el que se localizaban los excrementos

sobreelevados tampoco se encuentran diferencias significativas, ni entre las tres especies

(χ2=4,229; gl=4; p=0,376), ni comparando exclusivamente lobo y perro (χ2=3,193; gl=2;

p=0,203). Además, tampoco se observan diferencias estadísticamente significativas cuando se

comparan las diferentes magnitudes de elevación en cm (χ2=0,19; gl=1; p=0,891) para el caso

de lobos y perros.



n


Tabla VI.3.9.

Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y el sustrato sobre el que se elevaban

(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Tipo de elevación).

Gráfico VI.3.9.

Distribución comparativa de los porcentajes de tipo de elevación de las muestras para las distintas especies identificadas.

Entre los componentes identificados “a visu”, de los excrementos, hemos encontrado

que en las muestras correspondientes a lobo, un 28,6% tenían sólo pelos y un 57,2% pelos y

huesos/pezuñas, lo cual supone casi el 86% del total de las heces correspondientes a esta

especie.

La combinación de pelos y vegetales solo se manifiesta en las muestras de lobos y

zorros, y la incertidumbre en cuanto a los componentes se observa por igual en el 7,1% de las

muestras de lobos y perros. En las tres especies encontramos excrementos con sólo pelos y

excrementos con pelos, huesos y pezuñas. Pero, las diferencias encontradas no han resultado

significativas (χ2=8,988; gl=10; p=0,533), ni cuando se elimina al zorro del análisis (χ2=6,19;

gl=5; p=0,288).

TIPO DE ELEVACIÓN


N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **

Plantas 2 100 66,7 - - - 1 100 23,3 3 75

Otros - - - 1 100 100 - - - 1 25

TOTAL 2 100 1 100 1 100 4 100

0

25

50

75

100

Plantas Otros

% d

e e

spec

ie

Lobo Perro Zorro



2008

n

COMPONENTES LOBO PERRO ZORRO TOTAL

N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **

Huesos/pezuñas - - - 1 16,7 100 - - - 1 4

Pelos 4 28,6 66,7 1 16,7 16,7 1 20 16,7 6 24

Pelos y huesos/pezuñas 8 57,2 66,7 2 33,3 16,7 2 40 16,7 12 48

Pelos y vegetales 1 7,1 50 - - - 1 20 50 2 8

Pelos y vegetal y huesos/pezuñas - - - 1 16,7 50 1 20 50 2 8

Indeterminado 1 7,1 50 1 16,7 50 - - - 2 8

TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100

Tabla VI.3.10. Distribución de número y porcentajes de las muestras con identificación positiva, según la especie identificada y

los restos encontrados en los excrementos o Componentes. (* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Componentes).

0

25

50

75

100

Hue

sos/

Pezu

ñas

Pelo

s

Pelo

s y

hues

os

Pelo

s y

vege

tale

s

Pelo

s, V

eget

ales

yH

ueso

s/Pe

zuña

s

Inde

term

inad

o

% d

e ex

crem

ento

s Lobo Perro Zorro

Gráfico VI.3.10.

Distribución comparativa de los porcentajes de los componentes de las muestras para las distintas especies identificadas.

En cuanto la identificación de la presa o tipo de presa, lo más destacado es la

aparición de presas silvestres y domésticas, tanto en lobos (21,4% y 35,7% respectivamente

como en perros (en ambos casos, 16,7%), y la existencia de un elevado porcentaje de

excrementos cuyo contenido es de adscripción inespecífica a simple vista, con un 43% y un

67%, respectivamente. De entre todos los restos de presas silvestres, el 50% fue encontrado



nen excrementos de lobo y un 17% en las de perro. De entre todos los restos de presas

domésticas, el 71,4 % fueron identificadas en excrementos de lobo y el 14,3% en las de perro.

Pero las diferencias no han resultado estadísticamente significativas (χ2=1,973; gl=4;

p=0,741), ni eliminando del análisis al zorro (χ2=1,032; gl=2; p=0,597).

El corzo, la única presa identificada representativa en el conjunto de muestras fecales

identificadas genéticamente, no ha sido identificado a visu en las heces de perros, pero si

aparece en el 21,4% de los excrementos de lobos (N=14) y en el 40% de los excrementos de

zorro (N=5), aunque las diferencias no resultan significativas (χ2=2,768; gl=2; p=0,251).

TIPO DE

CONTENIDO


N % * % ** N % * % ** N % * % ** N % **

Silvestre 3 21,4 50 1 16,6 16,7 2 40 33,3 6 24

Doméstica 5 35,7 71,4 1 16,6 14,3 1 20 14,3 7 28

Indeterminado 6 42,9 50 4 66,7 33,3 2 40 16,7 12 48

TOTAL 14 100 6 100 5 100 25 100

Tabla VI.3.11. Distribución de las muestras con especie identificada y porcentajes de especie y de tipo de contenido

(* Porcentaje de especie; ** Porcentaje de Componentes).

0

25

50

75

100

Silvestre Doméstica Indeterminada

% d

e es

peci

e

Lobo Perro Zorro

Gráfico VI.3.11.

Distribución comparativa de los porcentajes de tipos de presa de las muestras para las distintas especies identificadas.




2008

n VI.4. Distribución del lobo.

Los datos obtenidos en el presente trabajo nos confirman la presencia inequívoca de

la especie en 5 cuadrículas UTM de 10x10 km, todas ellas pertenecientes, total o

parcialmente, al Territorio Histórico de Álava (Figura VI.2.1). Esto supone el 4,5% del total

de cuadrículas que forman la CAPV (N=111) y el 8,8% de las que conforman Álava (N=57).

Dado el esfuerzo y el tipo de muestreos efectuados, los datos obtenidos sobre la

presencia y ausencia de lobos en cuadrículas UTM de 10x10 km suponen una aproximación a

la distribución real de la especie y pueden servirnos para establecer algunos patrones de

preferencia en cuanto a la ocupación espacial y territorial más o menos permanente que se

observan en los lobos en la CAPV y su entorno. Debemos resaltar que la distribución del lobo

no es uniforme ni homogénea debido a la persecución humana a la que es sometido en

Euskadi y a otros factores relacionados con su propia autoecología, como por ejemplo, que

estos depredadores no ocupan ni seleccionan uniformemente el espacio que ocupan sus

territorios (Mech et al. 1998, Mech y Boitani 2003).

3

28

4 3

1014

1

11

2 2 25

0

5

10

15

20

25

30

2003 2004 2005 2006 2007 2008

Periodos estudiados

Nº

Muestras UTM

Gráfico VI.4.1. Número de muestras de lobo recogidas y número de de cuadrículas UTM de 10x10 km con presencia de la

especie a lo largo de los años en los que se han usado técnicas genéticas no invasivas. Fuentes: Temporadas 2003 y 2004, Echegaray et al. (2005a); Temporadas 2005, 2006 y 2007, Echegaray et al.

(2008b); Temporada 2008, presente trabajo.



n

Figura VI.4.1. Distribución mínima del lobo en la CAPV en cuadrículas UTM de 10x10 km a lo largo de los años en los que se

han usado técnicas genéticas no invasivas. Fuentes: Echegaray et al. (2005a), Echegaray et al. (2008b), presente trabajo.




2008

n

Figura VI.4.2. Número total de muestras de lobo (número superior) y porcentaje (número inferior) sobre el total de excrementos

recogidos (N=62), durante el período 2003-2008 usando técnicas genéticas no invasivas. Fuentes: Echegaray et al. (2005a), Echegaray et al. (2008b), presente trabajo.

.



n




2008

n

La Estrategia para la Conservación y Gestión del lobo en España aprobada en 2005,

siguiendo las recomendaciones de la UICN, indica la necesidad de conocer y actualizar el

estatus y distribución de la especie. Continuando con estas directrices marcadas, hemos

utilizado técnicas genéticas no invasivas en el seguimiento de las poblaciones de lobos de la

CAPV como continuación de un trabajo emprendido en 2003 (Echegaray et al. 2005a,

2008b). De esta manera hemos podido confirmar la presencia de lobos en el País Vasco y su

entorno y estimar su distribución.

VII. DISCUSIÓN .

Las mejoras técnicas y metodológicas experimentadas en los últimos años han

satisfecho las necesidades específicas de los análisis genéticos y han diversificado el campo

de acción de los estudios de la genética de la conservación de poblaciones. La utilización de

una metodología basada en técnicas genéticas no invasivas es la única que permite la

identificación segura de una especie a partir de indicios indirectos, tales como excrementos,

pelos, uñas, etc. (Ayuso 1999, Ayuso y Vilà 2001, Luccini et al. 2002, Creel et al. 2003).

Los métodos genéticos no invasivos han sido utilizadas para el seguimiento de

poblaciones de especies tan dispares como osos pardos (Taberlet et al. 1997, García et al.

2003, Bellemain et al. 2005), coyotes (Kohn et al. 1999), elefantes (Eggert et al. 2003),

tejones (Wilson et al. 2003) y por supuesto, lobos (Ayuso 1999, Luccini et al. 2002, Valière

et al. 2003, Creel et al. 2003). Incluso se ha comparado la eficacia de los muestreos genéticos

no invasivos como alternativa al radiomarcaje masivo para censar las poblaciones de lobo

(Creel et al. 2003). Además, los métodos no invasivos presentan indudables beneficios frente

a otros (como el radiomarcaje) que implican un coste económico y humano más elevado

(Ayuso y Vilà 2001permitiendo acceder a una gran cantidad de información sin representar

una molestia a las poblaciones objeto de estudio.

En la Península Ibérica es frecuente utilizar métodos basados en la identificación

visual de excrementos en trabajos de detección, estima de la abundancia y alimentación de

lobos. Mientras que la asignación específica visual de excrementos de lobo ha de tomarse con

cautela en numerosos lugares, la asignación genética permite confirmar la identidad de los

excrementos (Ayuso 1999, Ayuso y Vilà 2001). A tenor de los resultados obtenidos en



ntrabajos anteriores (Echegaray et al. 2007b) y en otros estudios sobre la alimentación de los

lobos efectuados a finales del s. XX en la Península Ibérica, habría que asumir la existencia de

posibles errores en la atribución de excrementos asignados a lobo, especialmente en áreas de

baja densidad de carnívoros, elevada antropización, abundancia de perros, etc.

Ayuso y Vilà (2001) destacan que a pesar de que el trabajo genético requiere un

análisis muy cuidadoso es posible detectar diferencias entre individuos, algo que es difícil con

otros métodos indirectos (indicios, IKAs, foqueos nocturnos, daños, etc.). Estos métodos de

genética no invasivos se han convertido en una herramienta habitual para el seguimiento de

carnívoros ya que representan una alternativa viable frente a otros métodos, especialmente en

zonas donde su presencia resulte dudosa o se hallen en baja densidad (Ayuso y Vilà 2001,

Vilà y Ayuso 2001, Palomares et al. 2002, Eggert et al. 2003, Flagstad et al. 2003, 2004). De

hecho, Vilà y Ayuso (2001) sostienen que los métodos genéticos no invasivos representan una

herramienta útil en el seguimiento de las poblaciones ibéricas de lobo, especialmente si se

restringen a áreas bien delimitadas y se efectúa un diseño óptimo de muestreo (Taberlet et al.

1999).

Las limitaciones más importantes vienen determinadas por la calidad y cantidad de

ADN de excrementos con la que se trabaja en estos análisis. En todos los casos se trata de un

ADN de baja calidad, fragmentado y con presencia de inhibidores enzimáticos de las

reacciones de PCR. La reducida cantidad y la baja calidad del ADN que se obtiene de

muestras fecales es una fuente de errores, así como la posibilidad de contaminación de las

muestras. En general, las propuestas para minimizar estos errores vienen determinadas por la

realización de un elevado número de réplicas independientes (Ayuso 1999, Taberlet et al.

1999, Waits et al. 2001).

Sobre el éxito de secuenciación de ADN mitocondrial, en el presente estudio se ha

obtenido casi un 93% de éxito, lo cual supone una mejora del 29,8% y del 11% en cuanto a la

tasa obtenida en trabajos previos (Echegaray et al. 2007b, 2008). Esta tasa de éxito, aún

provienente de un tamaño de muestra reducido (n=26), mejora los resultados obtenidos

previamente por nosotros, así como los de otros que han analizado un número de heces

considerablemente mayor y diversas especies, tales como coyotes (Kohn et al. 1999), osos

pardos (Taberlet et al. 1996, Rey et al. 2000, Marshall y Ritland 2002, García et al. 2003,




2008

n Bellemain et al. 2005), e incluso lobos (Valière et al. 2003, Lucchini et al. 2002, Adams et al.

2003).

El éxito conseguido en el presente trabajo, que supone un avance aún sobre los datos

de 2008, es justificable debido a la mejora en los protocolos de recolección y tratamiento de

las heces (Frantzen et al. 1998), a la repetición de los procesos de extracción y de

amplificación de ADN cuando los resultados no son satisfactorios y al reducido tamaño de

muestra (26 excrementos recopilados).

En Echegaray et al. (2005a) se identificaron 86 muestras fecales, de las cuales 31

correspondieron a lobo (36%), 53 a perro (61,6%) y 2 a zorro (2,3%). En el trienio 2005-

2007, dichos autores identificaron 40 muestras, de las que el 50% pertenecían a lobo, el

37,5% a perros y 12,5% a zorros. En el presente trabajo, el porcentaje de las muestras

identificadas como de lobo, experimenta un aumento con respecto a los dos trabajos

anteriores, de 20 y 6 puntos porcentuales, respectivamente. En cuanto a las muestras

identificadas como de perros, se observa una disminución de 37,6 y 16,5 puntos porcentuales

con respecto a ambos trabajos. Por otra parte, el confundir excrementos de lobo y zorro

también ha aumentado (17,7 y 7,5 puntos porcentuales).

2003-2004

N=86 2005-2007 % N= 40

2008 % N= 26

Lobo 36 50 56 Perro 61,6 37,5 24 Zorro 2,3 12,5 20

Tabla VII.1.1 Distribución de los porcentajes de muestras con identificación específica en

los distintos periodos de estudio.

Las causas de estas variaciones pueden explicarse por el contexto y el tipo de

muestreos efectuados. La mayor experiencia e información del equipo de investigadores,

junto con la cautela en la recopilación de excrementos que deben ser analizados

genéticamente podría estar influyendo. No obstante, a juicio del equipo técnico de este

trabajo, el factor condicionante podría derivar de la necesidad de optimizar esfuerzos y de la

información acumulada en trabajos previos (zonas donde más lobos se han venido detectando

porque su presencia espacio-temporal es más estable y continua) lo que ha encauzado los



nmuestreos a territorios donde la probabilidad de hallazgo de excrementos de lobo fuera más

elevada .

Hay que señalar que este tipo de proyectos no podría realizarse sin la financiación de

entidades públicas y/o privadas y por lo tanto la planificación de los muestreos de campo está

condicionada por el tipo de convocatoria, regulación y condiciones que establecen dichas

entidades.

Esto no nos permite la realización de muestreos sistemáticos y con una continuidad

temporal, lo que ha significado una pérdida notable en el número de muestras de lobo

recogidas en territorios menos prospectados, y cuyo resultado podría reflejarse en la

distribución de la especie.

Por otra parte, uno de los hechos más relevantes de este trabajo ha sido el hallazgo de

un nuevo perfil genético (haplotipo lu1) en los muestreos efectuados. Este haplotipo es uno de

los cuatro descritos en lobos ibéricos por Vilà et al. (1999), y constituye uno de los más

frecuentes, aunque en trabajos previos durante 5 años nunca había sido detectado en nuestro

área de estudio. De hecho, este haplotipo corresponde a un lobo no muestreado previamente e

incluso podría tratarse de un individuo emigrante al territorio limítrofe entre Burgos y Álava,

donde ha sido encontrado, o un ejemplar dispersante procedente de los vecinos núcleos

castellano y leoneses más occidentales (Vilà y Sundqvist, en preparación).

En cuanto a la caracterización de los excrementos identificados, no hemos

encontrado diferencias significativas entre las tres especies de cánidos en cuanto a las

variables de localización y composición de los excrementos. A pesar de esta circunstancia,

podemos observar algunas diferencias con respecto a la información previa disponible para el

período 2003-2008 (Echegaray et al. 2005a, 2008b).

Echegaray et al. (2008b) encontraron que era más frecuente de lo esperado el

hallazgo de excrementos de lobos y zorros en infraestructuras viarias semi o totalmente

asfaltadas, pero este hecho no ha sido observado en el presente trabajo, lo cual podría haberse

debido a un hecho azaroso. Por otra parte, en el presente trabajo se ha observado como el 75%

de los excrementos recogidos en los cruces de caminos corresponden a lobo mientras que este

hecho aconteció en el 42,9% de los excrementos considerados en el anterior estudio.

Con frecuencia los excrementos de lobos se localizan en cruces de pistas, sustratos

conspicuos y lugares relativamente más elevados (Vilà et al. 1994). Se ha sugerido que estos




2008

n hechos están relacionados con conductas de marcaje territorial visual y/u olfativo en diversas

especies de cánidos (Kleiman 1966, Allen et al. 1999, Zub et al. 2003). Dichas pautas

también han sido documentadas en los lobos ibéricos (Vilà et al. 1994, Barja et al. 2005).

También se ha propuesto que la elección de sustratos elevados, tales como plantas, en las

cuales los lobos depositan sus excrementos, pueden ser un elemento importante relacionado

con la probabilidad de maximizar la localización visual de las muestras fecales por parte de

otros individuos. Así, dichas heces situadas elevadas en plantas actuarían como balizas

olorosas territoriales entre lobos residentes y no residentes (Barja 2009). En el anterior trabajo

efectuado por nuestro equipo, paradójicamente observamos una aparición mayor de lo

esperado de excrementos de perro en sustratos elevados y en cambio, heces de lobo en zonas

“sin elevación”. Esta situación no ha sido constatada en nuestros muestreos de 2008, lo cual

podría resultar un artefacto estadístico o azar, aunque tampoco se habían registrado

diferencias destacables entre las conductas de marcaje y deposición de heces entre perros y

lobos en ambos períodos. De hecho, si abordamos un análisis conjunto que englobe todas las

muestras recopiladas por nosotros en el período 2005-2008 no observamos diferencias

estadísticamente significativas (χ2=2,55; gl=2; p=0,279) que sustenten la hipótesis de Barja

(2009), a pesar de que en nuestro trabajo hemos contado con excrementos identificados con

técnicas moleculares. Tampoco hemos observado diferencias en cuanto a las categorías de

elevación cuantificadas en número de centímetros (χ2=4,305; gl=3; p=0,230).

Por otra parte, no se han observado diferencias en cuanto a la comparación entre los

componentes identificados a simple vista que integran los excrementos de lobos y perros,

queremos destacar que en el caso de los perros, huesos/pezuñas y la combinación de pelos y

huesos/pezuñas aparece en el 50% de las muestras frente al 13,3% citado en el trabajo

anterior.

En lo que respecta a la categoría de detección a visu de los componentes en las

muestras fecales analizadas, observamos una evolución positiva creciente en cuanto a la

identificación de los mismos si efectuamos una comparación con trabajos previos. Este hecho

puede deberse a un mayor esfuerzo de los muestreadores en el proceso de inventariado y

clasificación de dichos componentes, aunque esta circunstancia no se ha visto reflejada en la

mejoría en la identificación del tipo de contenido o presa (silvestre o doméstica). Esto puede



nreflejar, tal y como hemos demostrado en nuestros trabajos de genética no invasiva, la

imposibilidad de discernir los excrementos de cánidos en determinados ambientes a partir de

su tipología y contenido, sin mediar un análisis genético por medio, al contrario de lo

señalado por algunos autores (Sáenz de Buruaga et al. 1994, Askacíbar y Ocio 2006). De

hecho, la detección a visu de restos de presas silvestres frente a restos de ganado doméstico

sigue siendo destacable: en el caso de los perros, un 40% (Echegaray et al. 2008b) frente a un

16,7% en el presente trabajo y en el caso de lobos, un 35% frente a un 21,4%.

En cuanto a la distribución del lobo, no es razonable utilizar los datos obtenidos en

el presente trabajo para caracterizar y establecer comparaciones espacio-temporales precisas

en cuanto a la presencia de la especie y la evolución de su distribución en el País Vasco

(Madoz 1845, Álvarez et al. 1985, Sáenz de Buruaga et al. 1994, 2000). Esto es debido a que

la información que ha servido para estudiar la distribución del lobo en el País Vasco procede

de metodologías y escalas temporales distintas. De hecho, tampoco se pueden extraer

conclusiones significativas si efectuamos una comparación entre los trabajos efectuados con

técnicas genéticas no invasivas en Euskadi, por la gran diferencia existente en cuanto al

esfuerzo de recopilación de muestras de lobo (Echegaray et al. 2005a, 2008b). Además, en el

presente trabajo no se ha encontrado ninguna muestra fecal atribuible a lobo en el entorno de

la sierra de Ordunte y/o en territorio vizcaino.

No obstante, tal y como señalan Echegaray et al. (2007b), la distribución del lobo en

Euskadi no parece experimentar en los últimos tiempos un cambio notable aún efectuando

comparaciones con los trabajos realizados en las últimas décadas (Sáenz de Buruaga et al.

1994, 2000), lo cual sugiere un cierto estancamiento en la distribución del lobo. A la hora de

hablar de tendencias hay que referirse a escalas temporales concretas y no elegidas

arbitrariamente (Naves 2002). Si consideramos períodos históricos (de centenares de años), la

tendencia de las poblaciones ibéricas de lobos es regresiva (Rico y Torrente 2000). Lo que

puede resultar significativo o evidente para un periodo de tiempo dado puede no serlo para

otro e incluso las tendencias pueden ser contrarias (Naves 2002). Los cambios en los límites

del área de distribución, como es el caso de los lobos que habitan Euskadi, no aportan los

mejores indicios sobre la evolución de sus poblaciones.




2008

n Como conclusión final a este trabajo, al igual que hemos manifestado anteriormente

(Echegaray et al. 2008b), consideramos que con una planificación adecuada (Taberlet et al.

1999) y el apoyo institucional y financiero de las diferentes administraciones vascas, es

posible realizar un seguimiento a corto y medio plazo de las poblaciones de lobo en Euskadi

mediante técnicas genéticas no invasivas, sin descartar otras que pudieran servir de apoyo. La

información así obtenida tiene que servir para establecer las bases científicas del plan de

conservación y gestión de una “Especie de Interés Comunitario”, el único gran depredador

presente en la Comunidad Autónoma Vasca.



n




2008

n VIII. BIBLIOGRAFÍA .

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