MEDIOS DE CULTIVO1. OBJETIVOS

Conocer los diferentes tipos de medios de cultivo existentes para el crecimiento de

microorganismos en el laboratorio. Identificar los diferentes pasos a seguir en la elaboración de un medio de cultivo.

2. INTRODUCCION

En los laboratorios de Microbiología se utiliza una gran variedad de medios de cultivos para mantener las cepas, aislar o identificar microorganismos con varias finalidades: determinar la existencia de contaminación de alimentos, medicamentos o cosméticos; diagnosticar alguna enfermedad, elaboración de vacunas bacterianas, etc.

3. MARCO TEÓRICO

De manera general se denomina “Medio de Cultivo” a cualquier material presente una adecuada combinación de nutrientes para permitir el crecimiento o el incremento del número de células de una población microbiana.

El objetivo último del cultivo es variado: antibiograma, identificación, multiplicación. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

SEGÚN SU ESTADO FÍSICO

a) LÍQUIDOS: Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes de suelos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej.: caldo nutritivo.

b) SOLIDOS:Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden 1.5 a 2 % de agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej.: Agar nutritivo.

c) SEMISÓLIDOS:Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden 0.1 a 0.3% de agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel.

SEGÚN LA NATURALEZA DE SUS CONSTITUYENTES

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.

b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cualitativamente y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.

c) SEMISINTÉTICOS: son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

SEGÚN SU FORMULACIÓN:

a) Químicamente definidos: se conoce la cantidad exacta de cada uno de los compuestos que hay en el medio.

b) Complejos: se realizan a partir de extractos naturales (extracto de levadura, sangre, etc.); no se conoce exactamente cuál es la composición del medio; sin embargo, presenta la ventaja de que ya están presentes todos o casi todos los elementos que una célula puede requerir.

SEGÚN SUS PROPOSITOS DE USO :

a) Medio general: medio en donde crecen todo tipo de microorganismos, excepto los que necesitan condiciones especiales (por ejemplo, agar CLED).

b) Medio selectivo: permite seleccionar el crecimiento de una especie o grupo determinado (hongos, bacterias entéricas, protozoos...).

c) Medio diferencial: permite identificar una especie con otra, ambas en el mismo medio. Puede ser por su crecimiento, su metabolismo, su respiración, etc. (por ejemplo, medio de McConkey).

d) Medio de enriquecimiento: contiene los nutrientes necesarios para apoyar el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos, se utiliza para la cosecha de diferentes tipos de microorganismos en un mismo medio.

e) Medio mínimo: contiene la mínima cantidad de nutrientes posible que permite el crecimiento de una especie.

f) Medio de transporte: preparado para servir como almacenamiento temporal a especímenes transportados o en transferencia; mantienen su viabilidad y su concentración simple.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Siempre es recomendable y se incluye como una regla básica la de leer las instrucciones de las etiquetas de los medios de cultivo, por ello no se recomienda re envasar los medios sino, mantenerlos en los recipientes originales.

Para lograr una preparación adecuada de los medios de cultivo es recomendable seguir las siguientes instrucciones:

PREPARACION DE LA SOLUCION

Los medios de cultivo deben ser mezclados o hidratados en recipientes limpios, libres de detergente. El agua que se utiliza para su mezclado debe ser destilada o desmineralizada.

Los medios de cultivo que no contienen agar ni gelatinas, (liquidos) pueden ser disueltos en agua fría o ligeramente caliente. Pero si contienen alguna de las dos sustancias deben ser calentados hasta ebullición para solubilizar el agar. Nunca sobre calentar porque se puede alterar su composición.

Los medios que presentan turbidez debido a sus componentes insolubles, deben ser agitados para homogenizarlos adecuadamente.

ESTERILIZACION

Se esteriliza por autoclave o por ebullición de acuerdo a las instrucciones para cada preparación. Cuando se esterilizan volúmenes grandes de medio se debe aumentar el tiempo de esterilización para permitir la penetración del calor al interior del recipiente.

SERVIDO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Una vez estéril los medios de cultivo deben ser enfriados a temperatura promedio de 45° - 55°C para ser adicionados en los recipientes finales teniendo en cuenta nuevamente las técnicas asépticas.

4. MATERIALES

4 Erlenmeyer de 100ml 8 cajas de Petri 8 tubos de ensayo 4 pipeta de 10 ml 4 probeta de 100ml Espátula Balanza Autoclave, estufa y horno Agar nutritivo EMB y caldo nutritivo

5. PROCEDIMIENTO

Realizar los cálculos respectivos para agar y caldo teniendo en cuenta que para para cada caja deben servir 15-18 ml de agar y para cada tubo entre 7-10 ml de caldo.

Ejemplo: Para preparar 8 cajas con agar, multiplique 8 po15 ml = 120ml Mida el volumen de agua destilada según sus cálculos. Teniendo en cuenta el volumen de agua a utilizar, haga la relación de polvo de agar que

debe pesar de acuerdo a lo especificado en la etiqueta del medio. Pese la cantidad del medio necesario de acuerdo a los cálculos. Mezcle el polvo con la mitad del volumen de agua medida anteriormente, agite y

adicione el restante de agua Lleve a hervir si es necesario Esterilizar en el autoclave a 15 lb de presión a 121 °C por 15 min. Sirva 15-18 ml aproximadamente de agar en cada caja cuando la temperatura este a 50-

55 °C, tápelas y deje solidificar, Lo mismo con los caldos sirva 7-10 ml en cada tubo y tápelos.

Déjelos enfriar y guárdelos en la nevera hasta su utilización.

6. CUESTIONARIO

1.- ¿Qué es Agar, de donde se extrae?

Agar-Agar, es un extracto de color blanco-crema que se obtiene de distintos tipos de algas rojas, como el Gelidium, y aunque principalmente se recogen en el Océano Atlántico, también se puede encontrar en el Mar Cantábrico y Océano Pacífico. Es muy rico en fibra soluble y minerales, por lo que ayuda a regular el tránsito intestinal, colesterol, diabetes, y prevenir el sobrepeso. Debido a su capacidad de absorber agua, se utiliza en cocina para espesar

y gelificar alimentos, ya sean dulces o salados, sin añadir ningún sabor, como la gelatina.

2.- ¿Qué es gelatina de donde se extrae?

La gelatina es una proteína natural que se obtiene del colágeno procedente de los tejidos conectivos de animales (la gelatina vegetal se conoce como agar-agar). Para su

obtención, se extraen por hidrólisis las proteínas del colágeno obtenidas de la piel, hueso

hervido y molido, pezuñas, huesos, tendones y vísceras de ganado vacuno, porcino, ovino, equino y avícola. Es decir, todo lo que no vale de los animales para venderlos en las carnicerías.

3.- ¿Por qué se utiliza agua destilada en la preparación de los medios de cultivo?

Para la preparación de medios, soluciones y tampones, debe utilizarse agua destilada que haya sido sometida a controles periódicos que aseguren su calidad.

Requisitos del agua destilada: Se debe llevar un registro actualizado de los mismos

Conductividad, pH, Contaminación microbiana, Libre de sustancias bactericidas Inhibidoras o interferentes,

4.- Elabore una tabla indicando medio de cultivo, azúcar fermentable, sistema indicador.

MEDIO DE CULTIVO

M.O QUE CRECE

AZÚCAR FERMENTAB

LE

TIPO DE MEDIO

SISTEMA INDICADOR

Agar EMB E.coli Lactosa y/o sacarosa

Medio de cultivo

selectivo y diferencial

Indicadores: eosina y azul de metileno.

Agar MacConkey

E. coli, Citrobacter, Salmonella,

Shigella

Lactosa Medio de cultivo

selectivo y diferencial

Indicadores: cristal violeta, rojo neutro.

Agar citrato de Simons

Klebsiella pneumoniae, S. typhimurium.

citrato Medio de cultivo

diferencial

Indicadores: azul de bromotimol

Agar LIA Salmonella spp glucosa Medio de cultivo

diferencial

Indicador: citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, purpura de bromocresol

Agar SS Salmonella y Shigella.

lactosa Medio de cultivo

diferencial

Indicadores: rojo de metilo

Agar TSI P. mirabilis, S. typhimurium, S. enteritidis.

Glucosa o sacarosa, lactosa

Medio de cultivo

diferencial

Indicadores: rojo de fenol

Agar TCES(Agar Tiosulfato

Citrato Bilis Sacarosa)

Vibrio cholerae,

Vibrio parahemolyticu

s.

sacarosa Medio de cultivo

selectivo

Indicadores: azul de timol y azul de bromotimol

Agar manitol Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis, Klebsiella

pneumonia.

Manitol Medio de cultivo

selectivo y diferencial.

Indicador; rojo de fenol

Agar bilis verde brillante.

Coliformes totales y fecales,

Klebsiella pneumoniae, Enterobacter

spp.

Lactosa y sacarosa

Medio selectivo

Indicadores: rojo de fenol