INFORME ACETÓLISIS Y CARACTERIZACIÓN DEL POLEN PARA LA ESPECIEDelostoma Integrifolium D. Don

DAIRO ALEXANDER ARANGO VALLEJO 20062010033LAURA VIVIANA ROA GARCÍA 20081010037

PRESENTADO A:INGENIERO FORESTAL LUIS JAIRO SILVA HERRERA

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDASFACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

PROYECTO CURRICULAR DE INGENIERÍA FORESTALFITOMEJORAMIENTO

BOGOTÁ2012

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN............................................................................................................................ 3

OBJETIVOS....................................................................................................................................4

MARCO TEÓRICO......................................................................................................................... 5

MATERIALES................................................................................................................................. 8

METODOLOGÍA........................................................................................................................... 10

RESULTADOS..............................................................................................................................11

ANÁLISIS DE RESULTADOS.......................................................................................................13

1. Estructura Nexina..................................................................................................................13

2. Forma del grano....................................................................................................................13

3. Otras formas contempladas..................................................................................................13

4. Tipo de grano........................................................................................................................14

5. Ornamentación de la exina..................................................................................................14

6. Apertura del grano................................................................................................................ 15

7. Forma de las aperturas.........................................................................................................15

8. Medición................................................................................................................................16

CONCLUSIONES......................................................................................................................... 17

BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................................. 18

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INTRODUCCIÓN

La caracterización del polen es importante en el avance de identificación de especies así como la paleo-arquebotánica (Solari M. 2000), reconstrucción de la vegetación, cambios climáticos, ciencia forense, melisopalinología (Belmonte J. Pérez R & Roure 1986: Ramírez & Sandoval s.f). El polen como elemento de dispersión y reproducción floral está siendo en los últimos años un importante campo de la biología y ecología. Aportando información en la diversidad y comportamiento de poblaciones tropicales, sin embargo previo a este desarrollo investigativo es necesario obtener herramientas de caracterización de las estructuras físicas, las cuales se pueden describir posteriormente al proceso de la técnica conocida como acetólisis (eliminación de la protección del grano de polen). En la siguiente guía se detalla el proceso para realizar en el laboratorio. El polen, los gametos especializados en la reproducción de las plantas más evolucionadas, presenta gran variedad de formas y estructuras de la exina, colpos y poros, diferentes clases y tipos de granos, tipos de aperturas que es necesario identificar y clasificar para entender la dinámica de complejas adaptaciones y relaciones altamente evolucionadas entre plantas insectos medio ambiente (Gómez, 2002). El polen se somete un proceso de laboratorio llamado acetólisis, que elimina la protección externa para poder observar e identificar sus partes y estructuras. Es muy importante el estudio de la caracterización del polen con el fin de describirlo y clasificarlo, contribuyendo con una base bibliográfica para complementar los pocos estudios y por ende la escasa información que existe acerca de estos temas, también para entender las características ambientales a las cuales se ha adaptado la especie, como lo es el desarrollo de una exina lisa para ser dispersado por el viento, o de una exina rugosa para ser dispersado por insectos vit y Santiago (2008), con el fin de propagarse y diseminarse conservando así la base genética de la especie. El estudio de la morfología del polen es importante también para clasificar botánica y taxonómicamente los géneros y especies a partir de características del polen propias de las especies.

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OBJETIVOS

Generales

Realizar el proceso de acetólisis para la posterior caracterización del polen de la especie Delostoma integrifolium D. Don (urapín).

Específico

Localizar y describir las diferentes estructuras que componen el grano de polen de la especie de la especie D. Integrifolium D. Don (urapín).

Localizar y describir las forma que componen el grano de polen de la especie de la especie D. Integrifolium D. Don (urapín).

Mostrar la diferencia de las capas morfológicas del polen para determinar su composición previa al pre y post proceso de Acetólisis.

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MARCO TEÓRICO

Acetólisis

Es una práctica de laboratorio realizada a partir de la colecta previa de anteras y la posterior obtención de polen, que mediante la elaboración de unos procedimientos y la aplicación una serie de tratamientos químicos simples por medio de algunos reactivos, permite eliminar el protoplasma y la intina del polen que impide la transmisión de luz y no permite ver claramente los detalles de la exina bajo el microscopio. El tratamiento químico hace brillar más la exina y aumenta el contraste microscópico importante para observar sus estructuras con el objetivo de analizarlo y clasificarlo.

Morfología del Polen

Exina

La exina está conformada por la sexina y la nexina que son un conjunto de capas, una estructura de tres capas se denomina ektexina completa, con un estrato externo llamado tectum, uno interno llamado pie y una estructura intermedia denominada columnella.

Sexina

Esta conformada por la ektosexina y la Endosexina, en las que hay tres estructuras llamadas tectum, columnella y pie, denominadas ektesina.

Nexina

La conforma la ektonexina, Mesonexina y Endonexina

Ornamentación de la exina

Comprende los elementos externos sin referencia a la constitución interna, tiene que ver con el ordenamiento y la forma de los elementos de la ektexina.

Psilada o lisa Escabrado Reticulado Baculado Clavado Equinado Gemado Verrugado Estriado Rugulado Foveolado Fosulado Perforado Compuesto

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Forma del grano

La forma del grano relaciona el área polar y la anchura total en una vista ecuatorial. Las clases de forma del grano son:

Peroblado Oblado Subesferoidal Suboblado Oblado esferoidal Prolado-esferoidal Subprolado Prolado Perprolado Esferoidal Peroblado Rectangular Romboidal Manzana Reniforme

En una vista polar se presentan formas de grano:

Angular Circular Circular-lobado Hexagonal Interangular Interhexagonal Interlobado Intersemiangular Intersemilobado Intersubangular Lobado Rectangular Semiangular Semilobado Subangular Tubular

Tipo de grano

Se pueden presentar en forma:

Simple (granos de polen aislados) Tétrade (combinación de cuatro microesporas originadas de una célula madre) Poliade (granos de polen unidos en grupo) Tetragonal (cada uno de los cuatro granos unidos en un tetrehedro, los puntos de

contacto forman un triangulo isósceles.

Apertura del grano

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Los granos se clasifican por el número y de tipo de aperturas que poseen.

Inaperturado ( sin aperturas) Monosulcado (1 colpo) Tricotomosulcado (con apertura sulcoide distal de 3 lados) Monocolporado (1 colporo) Monoporado (1 poro) Dicolpado (2 colpos) Tricolporado (3 colporos) Triporado (3 poros) Espiroaperturado (colpo en espiral) Estefanocolpado (>3 colpos ubicados meridionalmente) Estefanocolporado (>3 colporos ubicados meridionalmente) Estefanoporado (>3 poros restringidos al área ecuatorial) Fenestrado (tectum se rompe en orificios en patrón simétrico) Heterocolpado (algunos colpos solos otros con poros ausencia de poros aislados) Parasincolpado (colpo o sus extensiones se bifurcan y se encuentran cerca a los polos) Pericolpado (aperturas distribuidas en forma regular sobre la totalidad de la superficie

del grano) Pericolporado (colporos uniformemente distribuidos sobre superficie del grano) Periporado (poros uniformemente distribuidos por la superficie del grano) Sincolpado (colpos unidos en los polos) Vesiculado (con vesículas o vejigas)

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Fuente: Belmonte et al., (1986).

Forma de las aperturas o poros (vista ecuatorial)

Circular a transversalmente elíptico Circular longitudinalmente elíptico (lolongado) Transversalmente elíptico (lalongado) Transversalmente paralelo Rectangular transversal Rectangular longitudinal Rectangular transversal

Forma de las aperturas o poros (vista polar)

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Atrio Mazo Globular Gota Vestíbulo Labro Apérculo Margo

Colpos (según la proporción del área del grano)

Total del área polar 2/3 del área polar ½ - ¼ del área polar ½ del área polar 2/3 – ½ del área polar ¾ del área polar

MATERIALES

Para la elaboración de la guía de laboratorio N° 2 (Acetólisis y caracterización del polen) se necesita:

Polen de la especie. Cajas petri, pipetas, Baker, probetas y agitadores. Succionadores. Centrifuga. Horno. Microscopio. Estereoscopio. Cámara.

Reactivos

Hidróxido de Potasio KOH al 1%. Agua destilada. Mezcla acetolítica. Alcohol etílico. Ácido Acético Glacial. Glicerina.

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Imagen tomada d

ehttp://recursosbiologicos.eia.edu.co

Imagen tomada http://www.instrumentacion

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Imagen tomada http://www.google.com.co

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METODOLOGÍA

Proceso de Acetólisis

Para iniciar el proceso de acetólisis, previamente se debe realizar la extracción por medio de un equipo de disección.

1. En los tubos de ensayo con polen, agregar 2 ml de ácido acético glacial, luego de esto se lleva a centrifuga programada a 4000 rpm durante 5 minutos. Luego se procede a descartar el sobrenadante, teniendo cuidado de no succionar granos de polen.

2. Luego se adiciona 4 ml de mezcla acetólica (9:1), llevándola a estufa con 80ºc, durante 5 minutos. Los tubos de ensayo se dejan enfriar, previa introducción a la centrifuga programada a 4000 rpm durante 5 minutos. se procede a descartar el sobrenadante, teniendo cuidado de no succionar granos de polen.

3. Posteriormente se agregan 2 ml de alcohol etílico, agitando para limpiar el polen de la mezcla acetólica, en seguida es lleva a centrifuga programada a 4000 rpm durante 5 minutos. se procede a descartar, teniendo cuidado de no succionar granos de polen. Se repite este último hasta alcanzar la limpieza del polen.

4. Luego de eliminar adecuadamente los sobrantes del polen se ubicar en vial, y añadir 2 gotas de glicerina.

5. Los viales se introducen en horno por 12 horas a una temperatura de 40ºc.

A partir del proceso de acetólisis se obtiene el polen necesario para realizar la caracterización de la especie Delostoma integrifolium D. Don (urapín).

Proceso de caracterización de Polen

1. Realizar una previa revisión del marco teórico general sobre morfología y anatomía de estructuras de polen en diferentes especies forestales preferiblemente si existe para la familia y la especie escogida por cada grupo de trabajo.

2. El polen guardado en viales (proceso de acetólisis) es extraído para realizar montajes con la ayuda de porta y cubre objetos en el microscopio, es necesario realizar varios montajes, donde se puedan observar las estructuras y las formas, de la misma forma con polen que no sufrió el proceso de acetólisis y sugerir posibles diferencias.

3. Caracterizar aperturas, tamaños (si es posible), forma, polaridad, estrías y demás singularidades de la especie seleccionada.

4. Cada elemento importante de la especie debe ser fotografiado teniendo en cuenta cada uno de los aumentos del microscopio y que nos aporta a la hora de observar el polen.

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RESULTADOS

ACETÓLISIS

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Tubo de ensayo + polen + ácido acético glacial

Centrifuga 4000 rpm (5 minutos)

4 ml de mezcla acetólica (9:1)

Estufa 80ºC (5min) Descartar sobrenadante

Dejar enfriarCentrifuga 4000 rpm (5 minutos)

Descartar sobrenadante

Agregar 2 ml de alcohol

etílico

Centrifuga 4000 rpm (5 minutos)

Descartar sobrenadanteAgregar en un vial + 2 gotas glicerina

Repetir

Llevar a estufa por 24 h

PreparaciónDel montaje

Montaje

ANÁLISIS DE RESULTADOS

1. Estructura Nexina

(Vista 100x)

2. Forma del granoA partir de la literatura consultada según Belmonte J. (2003) y Gentry y Spencer (1979) la forma del grano presenta una forma simple.

3. Otras formas contempladas3.1 Vista ecuatorial

(Vista 100x)

3.2 Vista polar

(Vista 100x)

a

La estructura de la Nexina (Sanabria M. et al 2007) se constituye por dos partes la exina

(a) y el tectum (b), para el polen de la especie caso se tiene que es tectada.

A partir de la vista ecuatorial tenemos que presentar una forma esferoidal.

A partir de la vista polar tenemos que presentar una forma semiangular.

4. Tipo de granoSegún la caracterización presenta forma simple o aislada como se observa a continuación:

Antes de acetólisis Después de acetólisis

(Vista 100x) (Vista 100x)Apreciación de los granos de polen sin haberse realizado el proceso de acetólisis, donde aún se observa la intina en el polen con forma simple.

Apreciación de los granos de polen con el proceso de acetólisis, donde se puede observar solamente la exina de los mismos.

5. Ornamentación de la exinaObservación Bibliografía

(Vista 100x)

(Microscopio de barrido)

Según la descripción de Faegri & Iversen (1975), la ornamentación del polen presenta un patrón Croton.

Areolas de grano 10 µm (Alwyn H. Gentry & Spencer 1979). Para la clasificación usada en el laboratorio corresponde igualmente a un patrón crotón.

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6. Apertura del grano

(Vista 40x)

7. Forma de las aperturas

7.1 Poros Vista ecuatorial

(Vista 40x)

7.2 Poros Vista polar

Según el número y aperturas del polen la especie D. Integrifolium, es tricolpado, este se intuye a partir de la vista polar. Se aclara que en la imagen solo se observa una apertura.

En las imágenes podemos observar que las aperturas son alargadas lo que corresponde a

unas aberturas simples (colpo) y proladas.

En las imágenes podemos observar que las aperturas entran dentro de la clasificación

atnal.

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(Vista 100x)

8. Medición

Con la ayuda de un papel milimetrado se elaboró una estimación del número de granos de polen para un área de 1mm2 a un aumento de 10x arrojando los siguientes datos:

Conteo Nº de granos de polen1 372 653 564 37

Cuyas medidas de tendencia central son:

Y media 48.75S 14.06

Cv% 28.83Sy 7.03Em 14.97

Em% 30.71

En conclusión se puede decir que el número total de esporas para una área de 1mm 2 con una probabilidad de 95% y una precisión de 30.71 % es de 48.75 +/- 14.97 esporas. Sin embargo el Em% es demasiado alto por lo cual se recomienda un aumento de datos de conteo.

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CONCLUSIONES

A partir de los caracteres como tamaño, forma, aperturas y ornamentación estudiados en la caracterización del polen, es posible que estos resultados se puedan utilizar en la elaboración de claves taxonómicas para familias especies y subvariedades presentes en especies forestales.

Muchos estudios tanto empíricos como teóricos corroborados por (Gómez J. 2002), sugieren que la especialización de muchas plantas se debe a la relación intrínseca entre polinizadores y la especie, este derivado por el principio del polinizador más eficiente, es así como el grano de polen es una respuesta evolutiva para asegurar la permanencia de la misma, un ejemplo de esto es el ornamento del polen que para la especie D. Integrifolium presenta un patrón crotón, indicando así que su agente dispersor es una variada gama de grupos insectiles.

La especie presenta Nexina tectada con grano de forma simple, esferoidal en la vista ecuatorial y semiangular en la vista polar. El tipo de grano es simple la ornamentación presenta un patrón crotón con las areolas del grano de 10 µm.

La apertura del grano es tricolpada, simples colpo y porada, con aperturas etnal, con un promedio de esporas de 48.75 ± 14.97 / mm2.

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BIBLIOGRAFÍA

Alwyn H. Gentry & Spencer. 1979. Taxonomic Implications of Bignoniaceae Palynology Missouri Botanical Garden. 66(4): 756-777.

Belmonte J., Pérez R & Roure J. 1986. Claves para la determinación de los polenes de las principales especies melíferas de la península ibérica. 2: 27-54.

Belmonte J. 2003. Técnica para captar e identificar pólenes. Laboratori d´Análisis Palinológiques Unitat de Botánica Universitat Autónoma de Barcelona. Zaragoza. Disponible en pdf en: http://www.uab.es/I-analisis-palinologiques/aerobio.htm.

Gomez Jose M. 2002. Generalización en las interacciones entre plantas y polinizadores. Revista Chilena de historia natural. Universidad de granada. España. 75: 105-116.

Ramírez & Sandoval. S.f. revisión del polen del herbario JERZY RZEDOWSKI. Universidad Autónoma de Querétaro. Pp4.

Sanabria M., Naciel N. Cumana L. & Delgado R. 2007. Estudio del grano de polen en especies del genero Heliconia L. bajo el microscopio óptico. Revista Facultad de Agronomía (LUZ). 24:22-33.

Solari M. 2000. Antropología, modo de empleo: en torno a paisajes, maderas y fogones. Revista Austral de Ciencias Sociales, Universidad Austral de Chile. Valdivia Chile 4: 167-174.

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