III. HEMOSTASIA PRIMARIA

Alteraciones plaquetariasBioq. Esp. Claudia Patricia Serrano

Alteraciones plaquetariasEvaluación

Recuento de plaquetasRecuento de plaquetas-anticoagulante: EDTA -material adecuado: tubos de polipropileno, vidrio siliconado-toma de muestra adecuada: evitar ruptura de tejido

Métodos manuales-sangre entera: oxalato de amonio 1% (vn: 150-400x103/mm3)-plasma rico en plaquetas: EDTA 2% (vn: 300-800x103/mm3)

Contadores hematológicos

Es conveniente observar un frotis de sangre periférica dondese evaluará número, forma y tamaño plaquetario.

IMPEDANCIAEnfoque hidrodinámico

Recuento de plaquetas

Recuento de plaquetas

Alteraciones plaquetariasEvaluación

Recuento de plaquetas

Trombocitopenia TrombocitosisRecuento normal

Búsqueda de causasde trombocitopenia

Búsqueda de causas

de trombocitosis, y alteraciones cualitativas asociadas

Prueba global de la hemostasia primaria.

Es la única prueba que evalúa las interacciones plaquetas pared-vascular “in vivo”

Es función de la cantidad y calidad funcional de las plaquetas, de la cantidad y calidad funcional de vWF y de

la calidad del colágeno.

Duke vn < 2 min

Ivy vn < 4.5 min

Simplate vn < 9.5 minCohibir cuando t > 2 vn

METODOLOGIA DE ESTUDIO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

Tiempo de sangría

Tiempo de sangría

TS:

sensibilidad - especificidad - reproducibilidad

Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad, presión del corte, dirección de la incisión, “barrido” excesivo

ADHESIVIDAD

PLAQUETA SUPERFICIE

•In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157)

•In Vitro : Mann (colágeno)

Hellem II (superficie de vidrio)Scand J Haemat 1970, 7: 37

vW

METODOLOGIA DE ESTUDIO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

columna cp

•Sangre entera

•Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna.

•Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg.

bomba sp

EDTA 2%

EDTA 2%

%Adh = 100- SP- CPSP

ADHESIVIDAD: método de Hellen II

VN > 27%

Alteraciones plaquetariasEvaluación

Adhesividad plaquetaria disminuida

Enfermedad de von WillebrandAlteraciones de GP Ib-IX-V, IIb-IIIa

Déficit de pool de depósito severo

Alteraciones plaquetariasEvaluación

Recuento plaquetario normal

Tiempo de sangría prolongado ó normalAdhesividad plaquetaria disminuida

Enfermedad de von Willebrand

Estudio de trastornosplaquetarios cualitativosCongénitos ó adquiridos

Métodos “point of care”

Sangre entera (800 µL)

1

Comenzar el test

3

Insertar cassette

2

PFA-100

Agregación plaquetaria in vitro

IIHEMA-ANM

Método óptico (Born, 1980)

Método potenciométrico (Challen, 1982)

Condiciones del ensayo:

-Sangre obtenida por punción con agujas 20-18 G

-Tubos de polipropileno

-Anticoagulante: citrato de sodio 3.8% (1:9) sin azida sódica

-Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP): 10-15 min a 150-200 g

-Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP): 15 min 1500 g

-Ajustar concentración del PRP con PPP: 250 – 300 109 / mm3

-Tapar tubos para evitar cambios de pH

- Realizar el ensayo luego de 30 minutos y hasta 4 hs posteriores a la extracción.

AGREGACION

Agonistas panel de rutina:ADR: 10 uM ( adrenérgicos)Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa)AA: 0.5 mM (receptor de Tx)ADP: 2.5 uM, 5.0 uM (P2Y1, P2Y12)Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vW tipo II)

Agonistas especialesTRAP6 : PAR1, PAR4U46619: análogo de TXEndoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintazaIonóforos (A23187): movilización de Calcio

AGREGACION

AGREGACION

Interpretación de la agregación

- Cualitativa (semicuantitativa)

- Cuantitativa

Reacción de liberación de ATP

Permite cuantificar la liberación plaquetariaa través de la medición del ATP liberado por el PRP del paciente en presencia de los diferentes agonistas.

Recuento de plaquetas:326.000/mm3Morfología normal

Glanzmann

RETRACCION DEL COAGULO(TG)

Recuento de plaquetas:92.000 / mm3 (en cámara)Macroplaquetas (frotis)

Bernard-Soulier

Alteración síntesis de tromboxanos

PGG 2PGH2

TROMBOXANO A2/B2

PLC

IP3 DAG

Ca 2+ PKC

TXasa

TP

?

?

RESPUESTA A TROMBOXANOS

100l

PRPn + AA PRPp + ASACO

- +

AA

T : 0 seg

T : 30 seg

T : 1min

T : 4 min

Agregación +Receptores de Tx presentes.

Sin agregaciónAlteración en los receptores de Tx

GENERACION DE TROMBOXANOS

100l

PRPp + AA PRPn + ASACO

- +

AA

T : 0 seg

T : 30 seg

T : 1min

T : 4 min

Agregación +Sin alteración en la formación de Tx

Agregación -Alteración en la formación de Tx. Ciclooxigenasa o Tx Sintetasa?

Estudio de la función plaquetariaEstudio de la vía de formación de Tromboxano A2Evaluación funcional de Ciclooxigenasa y de

Tromboxano A Sintasa

PRP del paciente

AcidoAraquidónico

PRP de normal+

Aspirina

AgregaciónAlteración en la Tromboxano A Sintetasa

Sin agregaciónAlteración en la Ciclooxigenasa

Alteración en la Ciclooxigenasa

Estudio de la función plaquetariaEstudio de Agregación y Secreción plaquetaria

Bernard-SoulierGlanzmann

Citometría de Flujo

Alteraciones de laactivación/secreción

Estudio de gránulos

DisminuidoDéficit de pool de depósito

Gránulos densos:Marcación con Mepacrina por Citometría de flujo

Gránulos : Fibrinógeno, FvW, Fn intraplaquetarios

TromboxanosSíntesisReceptores

DisminuidoSíndrome de las plaquetas grises

FUNCIÓN PLAQUETARIACITOMETRIA DE FLUJO

CITOMETRIA DE FLUJO

Gráfico de puntosde la dispersión frontal y lateral de una suspensión deplasma rico en plaquetas

Plaquetas sin estimular Plaquetas estimuladas

Histograma De fluorescencia

Ventajas

Mínima manipulación .

Detecta cambiossuperficiales.

Estudio de trobocitopenias.

Estudio de subpoblaciones.

Estudio de proteínas intraplaq.

Requiere 5L de SE,PRP,PL.

No usa material radioactivo.

Rapidez

Desventajas

Costo del equipo.

Costo de reactivos.

Semicuantitativo.

Análisis y expresión de resultados

Citometría de flujo

TOMA DE MUESTRA: 5 mL de sangre.

ANTICOAGULANTE (1:10): citrato de sodio3.8%, EDTA 2%, PFA 1%?

PANEL DE MONOCLONALES: ISOTIPO-FITC / PE

CD42b ( Ib ), CD41 ( IIb ), CD61 ( IIIa ), CD29 ( Ia ) , CD36 ( GPIV )

10000 eventos

CELL-QUEST

IIHEMA-ANM

MARCACION EN SUPERFICIE

ALTERACIONES DE LA GP IIb-IIIa • Ausencia del receptor en superficie• Disminución del número de receptores• Incapacidad de fijar Fibrinógeno• Retracción del Coagulo anómala

GLICOPROTEINA IIb-IIIa• Heterodimero calcio dependiente• Integrina mas abundante en superficie• Receptor de Fibrinogeno, vW, Fibronectina

TROMBOASTENIA DE GLANZMANN

IIHEMA-ANM

Agregación ADP 5 μM (TG)

Agregación y liberación con colágeno 8 ug/ml(TG)

TROMBOASTENIA DE GLAZMMAN MARCACION EN SUPERFICIE

MM MM

KG

KG

BERNARD SOULIER

•Ausencia del complejo GP Ib-IX-V

•Autosómico recesivo, infrecuente

•Con-sanguinidad, Cromosoma 17, 23 y 3

•Sangrado moderado a importante

•Trombocitopenia

•Plaquetas de mayor tamaño y deformables

•Sobrevida plaquetaria acortada

Dispersión frontal-Tamaño (FSH)P: 202Madre: 65Control: 47

P

P

P

CD 42-b (GP Ib)(IMF)P:25Madre: 171Control: 257

CD61 (GP IIIa)(IMF)P: 389Madre: 176Control: 167

Paciente

Madre

Sindrome de BERNARD SOULLIER

IIHEMA-ANM

Dispersión frontal-Tamaño (FSH)P: 152Control: 66

CD 42-b (GP Ib)(IMF)P: 145Control: 63

CD61 (GP IIIa)(IMF)P: 463Control: 168

P

P

P

MYH9 ?

IIHEMA-ANM

MYH9: cuerpos de Döhle

NormalPaciente

AGREGACION CON COLAGENO 1g/ml

IIHEMA-ANM

CUANTIFICACION DE GP DE MEMBRANA PLAQUETARIA. CytoQuantTMGp ( Stago)

Microesferas: gráfico de puntos FSCH vs SSCH

Histogramas de fluorescencia

A

B

C

D

Mol

écul

as

de G

p/pl

aq.

IMF

Marker Media Nº GP/esferasM1 (D) 1201 63000M2 (C) 466 19000M3 (B) 112 4500M4 (A) 8 350

MARCACION INTRAPLAQUETARIAGRANULOS DENSOS CON MEPACRINA

TOMA DE MUESTRA- PRP, SE (EXTRACCION CON EDTA 2% o CITRATO)

- MEPACRINA, (QUINACRINA MUSTARD, 0.2 mM CF)

PREPARACION DE LA MUESTRA

40L BUFFER, 5 L MEPA, 5 L PlQ.

40L BUFFER, 5 L BUFFER, 5 L PlQ.

INCUBACION-40min

LAVADO

CITOMETROIIHEMA-ANM

Rango normal ≥37 IFM

NORMAL ( 85 IFM )

NEGATIVO ( 3 IFM )

PACIENTE ( 8 IFM)

MARCACION INTRAPLAQUETARIAGRANULOS DENSOS CON MEPACRINA

IIHEMA-ANM

FIJACION PFA 1%10 min

MARCACION DE PROTEÍNAS INTRAPLAQUETARIAS

FgVw

ADPATP

GP FgVw

ADPATP

GP

PERMEABILIZACION SAPONINA 1%

Marcación:- Controles negativos adecuados- Controles de permeabilización

SuperficieIIb

SuperficieIIIa

TotalIIb

TotalIIIa

Control depermeabilización

CD63

IIHEMA-ANM

METODOLOGÍAPL en Buffer conCa2+ ( 1mM)Incubación con FURA-2Lavado, Resuspensión

Sin Estimulo

Col 1g/mL

Col 8g / mL

MOVILIZACION DE CALCIO

Marcadores de activación plaquetaria (hiperreactividad)

Interacción con matriz sub-endotelial

Interacción con endotelio activado

fisiológico

patológico

GP IIbIIIa inactiva

ADP/ATPCa2+/ Ser

vWf / Fg/ Fn

fibrinógeno

P-SELECTINA /CD62p

GP 53 / CD63

MARCADORES DE ACTIVACION

L

L

GP IIbIIIa activa

estado de reposo

estado activado

unión de fg

PAC-1

IIHEMA-ANM

- expresión de marcadores de activación en la superficie de la plaqueta (ex vivo)

CD62PP-selectina

golll

Condiciones analíticas de difícil estandarización:

- anticoagulantes- tiempo de ensayo- controles negativos adecuados- expresión de resultados(% de eventos positivos, intensidad media de fluorescencia)- escasas referencias de CV intra eInter ensayo

IMF

% positivos

Marcadores de activación plaquetaria:

REPOSO

ACTIVO

GP IIb-III a

RIBS9F9,F2a-Fg

LIBSPAC-1AP6

IIHEMA-ANM

CINETICA DE UNION A RECEPTORES

TOMA DE MUESTRAPRP, SE (EXTRACCION CON CITRATO)

MARCADO DE PLAQUETAS40 L buffer + 5 L Isotipo + estímulo40 L buffer + 5 L Monoclonal + estímulo

INCUBACIONTiempos: 1min, 5min….20min a 37ºC Cortar con PFA 1% (CF) a cada tiempoCompletar la incubación hasta 40min

CITOMETRO

IIHEMA-ANM

CINETICA DE UNION

AGONISTAS:ADP 20M, Thr 1 a 5 U/ml, TRAP

MARCADORES:

DE RECEPTORES: PAC-1, a-FG, a-VWF, GPs

DE ACTIVACION: CD62P, CD63

IIHEMA-ANM

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25

IMF

ó %

IMF Bf 11

% Bf 11

IMFPAC-1 11

% PAC-1 11

CINETICA DE UNION A RECEPTORES

TIEMPO (min)

IIHEMA-ANM

Aplicaciónes de la citometría de flujo

Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: “Trombocitopenia inducida por heparina,

anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”

Tomer A, 1999

- Factor plaquetario 4- Anexina V

Tomer A, 1999

Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: “Trombocitopenia inducida por heparina,

anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”

Tomer A, 1999

CAUSA: Destrucción plaquetaria por anticuerposque reconocen glicoproteínas específicas de la menbrana plaquetaria:IIb-IIIa, Ib-IX, Ia-IIa

TROMBOCITOPENIA INMUNE

2Pool de superficie

(IgG asociada a sup. Plaq.), 100 moléculas,

unión de anticuerpos naturales que reconocen

estructuras modificadas sobre plaquetas

viejas.

IgGPLAQUETAS NORMALES

1Pool intraplaquetario

(IgG totales plaq.)20.000 moléculas

gránulos plaquetarios,adquiridas por pinocitosis

INMUNOGLOBULINASMETODOLOGIAS

•EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS TOTALES

•EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS ASOCIADOS A SUPERFICIE :inmuno-radiometría

inmuno-fluorescencia directa

MAIPA y PAICA (especifidad del anticuerpo)

IGG ASOCIADA A SUPERFICIE PLAQUETARIA

Expresión de resultados

1-IFM

2-INDICE: IFM / FSCH

M1

Media: 36

M1

Media: 92CD41+

Control normal

Paciente

Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria:detección por citometría de flujo

M1

M1

Paciente

Control normal

Negativo3 IFM

IgG10 IFM

IgG34 IFM

IgM3 IFM

IgM31 IFMNegativo

3 IFM

Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria:detección por citometría de flujo