HERRAMIENTAS DE BIOTECNOLOGIA

Electroforesis Métodos de extracción de ADN Cuantificación de ADN PCR

MARISOL BONILLA VENEGASZOOTECNISTABOGOTA2009

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1. JUSTIFICACIÓN

Por encima de las consideraciones de tipo ético, que en muchos casos se quedan en lo etéreo, es un hecho de facto que la biotecnología ya está aquí, que para bien o para mal es la ciencia del futuro y que nos afectará a todos.

Dado lo anterior, no podemos quedarnos atrás en el encontrarnos informados acerca del conjunto de conocimientos y técnicas que son el pan de cada día en biotecnología, especialmente si consideramos el gran potencial biológico de nuestro país.

Uno de los más grandes avances de la ciencia contemporánea, ha sido el desarrollo de la ingeniería genética y la biotecnología. Por medio de estas dos disciplinas, muy relacionadas entre sí, se ha logrado manipular genéticamente a los individuos con el fin de propiciarles nuevas características.

Todo organismo, aun el más simple, contiene una enorme cantidad de información. Esa información se repite en cada una de sus células, organizada en unidades llamadas genes, los cuales están formados por ADN. Los genes controlan todos los aspectos de la vida de cada organismo, incluyendo metabolismo, forma, desarrollo y reproducción. De ellos depende la continuidad de la vida, por que constituyen el enlace esencial entre generaciones. Una de las áreas de estudio que avanza con mucha rapidez en la actualidad es la ingeniería genética, es decir la modificación del ADN de un organismo para producir nuevos genes con nuevas características, es así como han surgido técnicas de diagnóstico para diferentes patologías, sirviendo también de apoyo en medicina forense y en investigaciones genéticas.Con el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante, se llegó a métodos de investigación por completo novedosos, aplicándose esta tecnología no solo en estudios genéticos, sino también teniendo un efecto importante en áreas que van desde el desarrollo hasta la evolución.

Para quienes nuestro diario vivir esta relacionado con los seres vivos, ya que nuestro campo de trabajo esta entre animales y plantas, es un imperativo conocer lo más a fondo posible, lo que esta en la vanguardia de las ciencias biológicas aplicadas, que evidentemente es el desarrollo biotecnológico, pues como en cualquier campo solo quien esta actualizado puede ser competitivo, esto es un hecho innegable en la era del conocimiento.

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2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general Conocer las diversas técnicas y herramientas que nos ofrece la biotecnología y sus aplicaciones.

2.2 Objetivos específicos

Identificar los diferentes métodos de extracción del ADN, sus técnicas y aplicaciones.

Distinguir los tipos de electroforesis y su utilización en el campo de la biotecnología.

Conocer las técnicas para cuantificar el ADN.

Determinar los tipos de geles empleados en la técnica de electroforesis y su preparación.

Saber en que consiste la técnica de la PCR y cuál es su procedimiento para realizarla.

Identificar los usos y aplicaciones de la técnica PCR.

Conocer los componentes de la PCR.

Adquirir conocimientos acerca del ADN recombinante.

Recordar las generalidades de los virus.

Conocer el uso de los virus en la elaboración de las vacunas y los fármacos

Destacar la utilización de virus en la terapia génica.

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3. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN

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Figura 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida

3.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida: Técnica de fraccionamiento de proteínas, en la cual éstas se manipulan mediante una corriente que se aplica a través del gel, compuesto por pequeñas moléculas orgánicas (acrilamida) que tienen uniones cruzadas para formar una malla molecular.

3.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (sodiododecilsulfato): Es un tipo de electroforesis desnaturalizante, en donde las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro, SDS que desnaturaliza y recubre a la proteína) y se separan como cadenas polipeptídicas aisladas.

3.3 Electroforesis en gel bidimensional: Las proteínas se separan primero en un gel tubular de acuerdo con su punto isoeléctrico por una técnica llamada “enfoque isoeléctrico”. Tras la separación, el gel se retira y se coloca arriba de una losa de poliacrilamida saturada con SDS (sulfato de dodecilo sódico), para someterla a electroforesis, las proteínas se mueven hacia el gel de la losa y se separan de acuerdo con su masa molecular

3.4 Electroforesis en campo por pulsos: Se utiliza para la separación de moléculas de ADN mayores de 25 kb, en donde la dirección del campo eléctrico en el gel se cambia en forma periódica, lo que ocasiona que las moléculas de ADN se reorienten durante la migración.

3.5 Aislamiento del ADN por la técnica de SALTING OUT: Este método se utiliza cuando se quiere aislar ADN de buena calidad y en alta concentración. El ADN obtenido es apto para estudios de PCR, RFLPs y RAPDs. El ADN genómico total que se encuentra en los núcleos celulares es liberado mediante rompimiento de la membrana celular, por la acción conjunta de enzimas proteolíticas y un detergente iónico (SDS). Las proteínas son removidas por medio de una alta concentración salina y el ADN es recuperado por precipitación con alcohol. Las ventajas que presenta éste método son la facilidad cuando se trabaja un alto número de muestras y el evitar el uso de solventes orgánicos tóxicos.

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3.6 Electroforesis en gel de agarosa: La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un matiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Moléculas de ADN de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de ADN de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del ADN en estudio. A los geles de agarosa se les añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del ADN y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta.

Figura 2. Resultados de electroforesis en gel de agarosa

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Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa

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3.7 Electroforesis capilar: La electroforesis capilar es una versión instrumental de la electroforesis convencional. Es un método de separación que se basa en la diferente velocidad de migración de las especies cargadas y no cargadas en el seno de una disolución amortiguadora, a través de la cual se aplica un campo eléctrico elevado y constante. Esta técnica de separación, fue desarrollada, en primer lugar, por el químico sueco Ame Tiselius, quien durante la década de los años treinta la aplicó al estudio de las proteínas séricas. En 1948 fue galardonado con el premio Nóbel por estos trabajos.

Figura 4. Electroforesis capilar

3.8 Electroforesis en papel: El soporte utilizado en este caso es un papel. El papel está introducido en una disolución acuosa tamponada, la muestra se sitúa en un punto determinado del soporte, un potencial de corriente continua (100 a 1000 V) es generalmente aplicado durante la separación. Las especies iónicas migran hacia puntos específicos del soporte. Después de un tiempo apropiado para la separación, el soporte es retirado y secado. En caso de ser necesario, el papel es tratado con un agente colorante con el fin de observar las bandas de desplazamiento.

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Figura 5. Electroforesis en papel

3.9 Método descrito por Fredericks, el cual se basa en una extracción orgánica del ADN, utilizando benzil alcohol e hidrocloruro de guanidina.

3.10 Método descrito por Waleed Abu Al Soud, basado en dilución, lavado con NaOH y una concentración de la muestra.

3.11 Extracción de ADN a partir de sangre total, utilizando el método fenol/cloroformo-alcohol isoamílico.

3.12 Extracción de ADN a partir de manchas de sangre, utilizando una resina quelante (Chelex 100 Resin/BioRad Labs) con una alta afinidad por iones metálicos polivalentes. El ADN extraído por éste método, se conserva aproximadamente un mes a 4ºC o indefinidamente a -20ºC.

4. TIPOS DE ELECTROFORESIS

Se pueden englobar en 2 tipos fundamentales:1. Electroforesis de frente móvil o libre 2. Electroforesis de zona

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Actualmente solo se utiliza la electroforesis de zona, en la cual la muestra se desplaza sobre un soporte sólido, como papel de filtro, celulosa o gel (agarosa, acrilamida…) y los componentes de la muestra migran en forma de pequeñas bandas, también llamadas zonas.

4.1 Métodos electroforéticos zonales Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de biomoléculas a un

soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que

restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente.

Este método tiene gran poder resolutivo, por que se aplica una cantidad pequeña de biomolécula a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicación.

El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos.

La sensibilidad de la electroforesis en gel es tan alta que las moléculas de ADN que difieren por un solo nucleótido, pueden separarse con ésta técnica.

El empleo de la electroforesis en gel sirve para identificar los fragmentos de ADN que contienen un gen particular, como el gen que codifica la insulina humana

Figura 6. Máquina para electroforesis con gel.

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Existen numerosas variaciones de la electroforesis, en función del equipo utilizado, soporte y condiciones físico – químicas en las cuales se va a llevar a cabo la separación, por ejemplo:

Electroforesis capilar Electroforesis en papel Electroforesis en gel de agarosa Electroforesis en gel de poliacrilamida Electroforesis bidimensional Isoelectroenfoque: La separación está basada en la diferencia entre puntos

isoeléctricos, su principal aplicación es la separación de proteínas.

5. MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE ADN

5.1 Sistemas Semicuantitativos:

Visualización en gel de agarosa Comparación de “gotas” conteniendo diferentes cantidades de muestra

con un patrón de ADN conocido, en presencia de EtBr (Bromuro de etidio). Kits comerciales como el Dip Stick de Invitrogen, que utiliza la intensidad

del color como parámetro de cuantificación y el Nucleic Dot Metric de Geno Technology, que determina la concentración de ácidos nucleicos teniendo en cuenta el diámetro de la macha formada, el fundamento de esta técnica, es la reacción de los ácidos nucleicos con determinados compuestos químicos, para generar un color azulado que es proporcional a la cantidad de ADN presente. Ambos kits presentan la ventaja de su rapidez, comodidad y pequeño volumen empleado, ambos permiten cuantificar volúmenes tan pequeños como 1µl que contengan entre 0,1 – 10 ng (Dip Stick) o entre 1 ng – 10µg (Nucleic Dot Metric) de ADN.

5.2 Sistemas Cuantitativos:

Métodos fluorimétricos (utilizan la bisbenzimida como colorante), tienen la ventaja de su sensibilidad y la desventaja de su puesta a punto, además que requiere sustancias tóxicas.

Métodos espectofotométricos, son los más populares por que son fáciles de ejecutar y proporcionan resultados fiables.

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6. TIPOS Y PREPARACION DE GELES

Gel de poliacrilamida Gel de poliacrilamida desnaturalizante Gel de agarosa Gel bidimensional Gel de almidón

6.1 Preparación de un gel

Figura 7.

6.2 Preparación del gel de agarosa

Para 1 gel de agarosa al 2% en Buffer TBE 0.5 X con 2 peines de 24 pozos cada uno

1. Pesar 6 gramos de agarosa y agregarla a un erlenmeyer que contenga 300 ml de buffer TBE 05X

2. Calentar al microondas el erlenmeyer tapado hasta disolver la agarosa.3. En caso de haber excesiva evaporación, completar el volumen con un poco

de agua destilada.

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4. Dejar enfriar5. Agregar de 10 a 15 l de bromuro de etidio 10mg/ml6. Volcar sobre la base7. Colocar los peines8. Dejar enfriar

IMPORTANTE: Utilizar guantes para manipular los geles, ya que el bromuro de etidio es tóxico y causa mutaciones

6.3 Preparación del gel de poliacrilamida

1. Lavar las placas de cristal a fondo con detergente casero, enjuagar con agua destilada y secar con tejidos desechables.

2. Ensamblar las placas y los espaciadores. Los espaciadores pueden adherirse al cristal con un adhesivo para prevenir que resbalen mientras se vierte el gel. Se sellan los bordes de las placas, con una tira de cinta adhesiva, teniendo una especial atención a las esquinas inferiores.

3. Para un gel al 8% colocar los siguientes reactivos en un vaso de laboratorio limpio: 8 ml 10x tampón de electroforesis TBE, 56 ml de agua destilada y 70µl TEMED

4. Añadir 530µl de una solución fresca, hecha con el 10% de persulfato amónico a una solución al 8% de acrilamida en el vaso de laboratorio y remover cuidadosamente para mezclar. Una vez que el persulfato amónico se ha añadido, comienza la polimerización y el gel debe verterse inmediatamente.

5. Absorber cuidadosamente la solución de acrilamida en una jeringa desechable, intentando evitar la introducción de burbujas de aire.

6. Situar las placas de cristal ensambladas verticalmente en la bandeja y se llenan cuidadosamente las placas de cristal con solución de acrilamida desde una esquina. Ninguna burbuja de aire puede ser traída por inclinación de las placas introducidas mientras se produce el vertido.

7. Insertar el peine apropiado, teniendo cuidado de no atrapar ninguna burbuja de aire y se saca el gel para polimerizar durante 40 minutos con una inclinación de cerca de 10º respecto a la horizontalidad. Cuidar el gel para evitar fugas durante los primeros 25 minutos.

8. Pelar la cinta de sellado y enjuagar cualquier acrilamida de las superficies externas de las placas con golpes de agua. Quitar cuidadosamente el peine.

9. Situar el gel en el aparato de electroforesis y sellarlo firmemente en su lugar, utilizando las 4 tuercas de sellado. Asegurarse de que la llave de drenado de la cámara superior de tampón está cerrada y rellenar las cámara superior e inferior con unos 400 ml de 1x TBE cada uno. Enjuagar la acrilamida no polimerizada de los pozos con 1x TBE, usando una jeringa y una aguja de calibre fino.

10. Llevar a equilibrar todo el aparato de gel a 4ºC durante al menos 4 horas antes de comenzar la electroforesis.

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11. Muestras, preparaciones y electroforesis.

IMPORTANTE: Utilizar guantes, ya que la acrilamida es un potente neurotóxico. La poliacrilamida (ya polimerizada) no es tóxica, sin embargo los geles también deben manipularse con guantes ya que puede quedar acrilamida sin polimerizar.

Tanto los geles de poliacrilamida como de agarosa, presentan grandes ventajas:

Baja electroendósmosis y evaporación. Control del tamaño del poro No reaccionan con el electrolito Se pueden hacer tinciones sobre el gel, en el caso de la poliacrilamida.

El gel presenta discontinuidades:

Gel de separación: Mayor porcentaje de acrilamida y PH 8.8 Gel de concentración: Menor porcentaje de acrilamida y PH 6.8. Va a

concentrar la muestra en una línea para que sea eficazmente resuelta en el gel de separación.

6.4 Preparación de geles de poliacrilamida desnaturalizanteEste gel se prepara a partir de un stock de acrilamida 7% desnaturalizante, que tiene la siguiente composición:

Stock acrilamida 19:1 (acrilamida/bisacilamida) 36 mlUrea 84 gTBE 5X 24 mlAgua destilada hasta completar 200 ml

1. Se limpian bien las placas de vidrio con Etanol 95% y luego se impregnan las caras interiores con una pequeña cantidad de SDS al 10% (se extiende bien con un papel para que quede una delgada capa)

2. Se colocan los espaciadores de 0.8 mm entre ambos vidrios en dos de los lados (las gomas deben estar bien juntas sobre la placa menor) y se sujeta todo con pinzas.

3. Se mezclan 60 ml del stock de acrilamida anterior con 100µl de TEMED y 200µl de APS.

4. Se agita brevemente y se vuelca lentamente la mezcla entre los dos vidrios, inclinando levemente los mismos.

5. Una vez lleno se vuelve a la posición horizontal y se coloca el peine invertido. Se deja polimerizar.

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6.5 Preparación del gel de almidón

1. Se pesan 65 gr. de almidón2. Se agregan en un matraz kitasato de 2 l con 350 ml de amortiguador para el

gel.3. Se agita hasta lograr su disolución completa.4. Se agregan 150 ml de amortiguador precalentado a punto de ebullición.5. Se agita intensamente hasta lograr la completa mezcla, que torna a un color

opalescente, de consistencia espesa y viscosa.6. Inmediatamente se aplica vacío durante 45 a 50 segundos, para eliminar al

máximo el aire que hubiese quedado atrapado durante la agitación.7. Es de gran importancia que previamente se hubiera armado una trampa de

vacío, para retener al máximo los vapores y darle una mayor vida al motor para hacer el vacío.

8. Colocación del gel en la cámara electroforética correspondiente en contacto con la solución amortiguadora específica para el flujo eléctrico, por medio de papel filtro Whatman No. 1

Existen ligeras diferencias en el procedimiento para solidificar el gel y sembrar las muestras, según el tipo de cámara de electroforesis que se utilice, ya sea para mechas o para peines.

7. PCR

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERAZA

Creada en 1983 por Kary B. Mullis de Cetus Corporation en Emeriville California. Es una técnica enzimática que permite copiar de forma experimental una zona concreta de un genoma, pudiéndose obtener hasta cien mil copias de ella en un tubo de ensayo. Permite a los investigadores amplificar millones de veces en pocas horas una muestra diminuta de ADN. Se puede partir de homogenados, extractos crudos de tejido, sangre completa, mezclas de fragmentos de ADN obtenidos con enzimas de restricción, muestras resultantes de la extracción y aislamiento de ADN, etc.

7.1 Etapas del proceso

Se requiere una sucesión de ciclos (generalmente entre 20 y 40, de 1,5 a 5 minutos de duración cada uno) de desnaturalización, hibridación y replicación, para conseguir una enorme amplificación del número de moléculas que contienen la secuencia de interés o diana.La duración total es de alrededor de 2 horas, dependiendo de las condiciones experimentales concretas.Cada ciclo de una PCR consta de tres etapas:

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1. Desnaturalización: Calentamiento para la separación de las dos hebras del ADN, mediante una incubación breve (30 a 120 seg.) a una temperatura entre 68 y 97ºC, que debe ser superior a la de fusión de la región de ADN que se quiere amplificar.

2. Templado o hibridación: Disminución de temperatura (37 a 65ºC que se mantienen entre 10 y 120 seg.) y que permite la reasociación de hebras sencillas tras la desnaturalización térmica.

3. Elongación, extensión o replicación: Etapa de amplificación propiamente dicha, en la que la ADN polimerasa termoestable elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales. La replicación transcurre en dirección 5´ --- 3´ a partir del extremo 3´- OH de cada cebador, hasta terminar la lectura del molde o hasta que comience una nueva etapa de desnaturalización (siguiente ciclo).

Figura 8. Etapas del proceso de la PCR

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Con 35 ciclos repetidos se obtienen 34000 millones de copias.

Además de las 3 etapas de cada ciclo, comúnmente se añade una etapa previa y una final al conjunto de todos los ciclos. La previa a elevada temperatura (incluso superior a la de las etapas de desnaturalización), sirve básicamente para inactivar proteasas y nucleasas de la muestra, así como para asegurar la desnaturalización completa del ADN de partida, especialmente si éste es de gran tamaño o posee regiones muy compactadas. La etapa final, consiste en una prolongación de la última elongación, para permitir que se completen todos los fragmentos.

7.2 Los ciclos son los siguientes:

Figura 9. Ciclo 1 de la PCR

Durante la desnaturalización (cerca de 1 minuto a 95ºC) las cadenas de ADN se separan para formar cadenas sencillas.

Durante la hibridación (cerca de 1 minuto a temperaturas que oscilan entre 45ºC y 60ºC), un cebador se une una cadena de ADN y otro se una a la cadena complementaria. Los sitios de hibridación de los cebadores se han elegido para que fomenten la síntesis del ADN en la región de interés durante la extensión.

Durante la extensión (cerca de 1 minuto a 72ºC) la síntesis del ADN se lleva a cabo en la región de interés y con distancias variables en la región flanqueante, produciendo fragmentos de longitudes variables.

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Figura 10. Ciclo 2 de la PCR

Cuando comienza el segundo ciclo, hay en realidad 2 tipos de patrón:

1. Las cadenas del ADN original2. Las cadenas del ADN recién sintetizadas, que constan de la región de

interés y de fragmentos de longitud variable de la región flanqueante, en el extremo 3´.

Cuando se usa este último patrón en este ciclo, solamente se copia la región de interés.

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Figura 11. Ciclo 3 de la PCR

En el tercer ciclo, la región de interés recién sintetizada (es decir sin regiones flanqueantes) actúa como patrón. La molécula de ADN original está todavía presente y lo estará hasta el final de la reacción. Sin embrago después de unos pocos ciclos, el fragmento de ADN recién sintetizado se establece rápidamente como el patrón predominante.Lo usual es que los ciclos se repitan de 25 a 45 veces. La normalización de las condiciones de funcionamiento del termociclador es esencial para poder reproducir los resultados.

7.3 Algunas características del proceso

Rendimiento: Puesto que los productos de cada ciclo sirven de molde para el siguiente, la acumulación de copias (tanto totales como dianas) es exponencial en vez de lineal. Sin embargo, en la práctica el rendimiento de cada etapa no es completo, por lo que las cifras se ven algo reducidas. A pesar de esto, siguen siendo muy elevadas.

Duración: La duración de cada una de las tres etapas de cada ciclo y el número de ciclos deben optimizarse, dependiendo de la secuencia concreta que se quiera

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amplificar. En muchos casos, la elección de estas condiciones debe hacerse de forma empírica.

Especificidad: Es muy elevada. Esta determinada especialmente por la secuencia de los dos cebadores utilizados y por las condiciones de templado. Se puede determinar la especificidad analizando por electroforesis los productos generados: la aparición de una banda única indica que la técnica es específica.

Capacidad de detección: (común, aunque incorrectamente llamada sensibilidad): Es muy alta (bajo límite de detección), tanto que la PCR puede permitir detectar una única molécula de ADN en casi cualquier tipo de muestra clínica, forense o arqueológica (célula. Pelo, semen, etc.). Sin embargo, esta característica supone también un elevado riesgo de contaminación por moléculas de origen ajeno a la muestra.

Fidelidad: Es la capacidad de copiar secuencias con precisión, sin introducir mutaciones. Esta característica depende sobre todo de que la enzima empleada tenga o no actividad correctora de pruebas. La elección de la enzima dependerá del objetivo de la PCR. No es muy importante la fidelidad si solo se pretende obtener una sonda, pero es fundamental si el objetivo es la identificación de mutaciones poco frecuentes.

7.4 Componentes de la PCR

Agua desionizada estéril Solución tampón de PCR 10X Mezcla de dNTP Cebador Taq polimerasa MgCI ADN patrón

7.5 Equipo para la PCR

Micropipetas Termociclador Unidades de electroforesis Fuente de energía eléctrica Equipo fotográfico

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7.6 Algunos usos de la PCR

Amplificación de fragmentos específicos de ADN. Se emplea en investigaciones criminales para generar cantidades de ADN,

a partir de una muestra de sangre seca en la ropa de un sospechoso o aun del ADN presente en parte de un solo folículo piloso dejado en la escena de un crimen.

Estudios de fragmentos de ADN de fósiles bien conservados que pueden tener millones de años de antigüedad.

Detección de secuencias sin purificación previa. Secuenciación de ácidos nucleicos. Establecimiento de polimorfismos de secuencia. Rastreo de mutaciones. Tipado de ADN para trasplantes. Diagnóstico de enfermedades genéticas, prenatales o no. Determinación de secuencias específicas de ADN, relacionadas con

situaciones patológicas definidas. Estudios evolutivos. Detección de microorganismos infecciosos. Detección de células tumorales. Amplificación de ADN para su posterior clonación celular. Huella genética. Test de paternidad. Identificación de especies.

7.7 Tipos o variantes de la PCR

PCR “larga”Su objetivo es superar los límites de la PCR convencional para amplificar con fidelidad regiones diana de gran tamaño (entre 5 y 40 Kb). El principal factor limitante es la ausencia de actividad correctora de pruebas en la polimerasa Taq, por lo que añada una cantidad menor de otra enzima con capacidad de corrección de pruebas para contrarrestar la carencia de esta actividad y al mismo tiempo, seguir aprovechando la eficacia de elongación de la polimerasa principal.

PCR “anidada”Técnica muy sensible de la PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde, para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy específico.

PCR “inversa”Este tipo de PCR se emplea para clonar regiones desconocidas de un ADN, situados en posición vecinal a secuencias diana conocidas. En lugar de amplificar la región interna, flanqueada por los dos cebadores (PCR convencional), se amplifica la región externa que flanquea a los cebadores. Para ello es necesario

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cortar el ADN a ambos lados de la región diana con una enzima de restricción, de tal forma que los extremos cohesivos resultantes puedan hibridar entre si, formando una molécula circular. Esta es cerrada por una ligasa y se realiza la PCR con cebadores que hibridan con los extremos 5´ de la secuencia conocida, por lo que la elongación se extenderá alrededor del círculo. Se generan copias de un ADN lineal delimitado, como el ADN normal, por la posición de ambos cebadores.

PCR con adaptadoresTambién puede amplificarse una región de ADN de secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de restricción, unos adaptadores, oligonucleótidos sintéticos con extremos cohesivos compatibles con los generados en la muestra. Después de desnaturalizados, se añaden cebadores específicos para las secuencias 3´ de los adaptadores. Se amplifica el conjunto de los adaptadores y secuencia diana, pero se amplifican por igual todos los fragmentos de restricción presentes, no uno sólo.

PCR asimétricaSe trata de generar copias de hebra sencilla de un ADN. Se añaden cantidades muy diferentes de ambos cebadores, de modo que tras los primeros ciclos de PCR, uno de ellos se agota y disponibles ya suficientes copias del ADN diana, sólo una de sus hebras sigue amplificándose gracias al cebador más abundante.

RT-PCR: amplificación de RNADonde el molde inicial es ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, como Tth, para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario).

8. ADN RECOMBINANTE

La tecnología del ADN recombinante, es un procedimiento de ingeniería genética que se viene usando desde hace algunos años y en la actualidad tiene una amplia variedad de aplicaciones. Esta técnica se basa en la inserción de ADN foráneo al genoma de una célula hospedadora, para que ésta lo exprese como si fuese suyo. Este proceso se realiza mediante el uso de enzimas de restricción, vectores de clonación y hospedadores (procariotas o eucariotas) y consiste en aislar un fragmento de ADN con genes de interés para el investigador e introducirlo en un vector, el cual se encarga de llevarlo al hospedero para que ocurra recombinación.

Hay dos tipos de recombinación genética:1. Recombinación homóloga o general2. Recombinación específica de lugar o de sitio

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La recombinación homóloga requiere la presencia de secuencias homólogas en las moléculas de ADN que se van a recombinar y la participación de sistemas enzimáticos específicos. Como resultado, se forman nuevas moléculas de ADN, por la rotura y reagrupamiento de hebras de ADN en los puntos de homología. Este tipo de recombinación tiene lugar, generalmente, entre regiones homólogas alélicas de los pares cromosómicos apareados en la meiosis y originan una redistribución de los genes paternos y maternos en las células germinales, a la hora de la formación de los gametos, lo que permite nuevas combinaciones de genes en la descendencia.

La recombinación específica de lugar, viene mediada por proteínas que reconocen secuencias específicas del ADN (generalmente no superiores a 25 pares de bases), las cuales pueden estar presentes en una sola molécula de las dos que se van a recombinar o en las dos. Una parte muy interesante de la recombinación específica de lugar, se produce durante la diferenciación de las células productoras de anticuerpos.

Figura 12. Tipos de recombinación genética

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8.1 Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante

Cartografía de los genes humanos: Quiere decir la definición de la posición de cada gen en su cromosoma respectivo. Con el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante, se puede asignar el gen que produce una enfermedad a un locus cromosómico específico. Para ello se han diseñado diferentes técnicas como RFLP en híbridos de células somáticas, entre otras. El denominado proyecto genoma humano, pretende cartografiar todos los genes de la especie humana en sus respectivos cromosomas. La información proporcionada por este proyecto, ha repercutido en la identificación de los genes que intervienen en procesos tales como la diabetes, cáncer, hipertensión arterial, enfermedades mentales, alzheimer, todas ellas en las que hay varios genes implicados y la influencia del ambiente es notoria.

Diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas: La tecnología recombinante junto con los métodos de obtención de muestras (amniocentesis y extracción de vellosidades coriónicas) constituyen una herramienta muy sensible para la detección de enfermedades genéticas. Son ejemplos la talasemia y la anemia falciforme.

Diagnóstico de enfermedades genéticas en niños y adultos: Neurofibromatosis

Susceptibilidad a sufrir un tipo determinado de cáncer familiar: Cuando varios miembros de una familia sufren un tipo de neoplasia (mama, colon…), se puede estudiar mediante un simple análisis de sangre a otros miembros de la familia a fin de detectar mutaciones en los genes específicos que pueden estar dañados a nivel familiar. Una vez detectada la mutación en personas sanas, se puede sugerir a este grupo de “nuevos pacientes” un plan de revisión clínica, a fin de detectar a nivel radiológico, por ejemplo, el tumor cuando todavía es de muy pequeño tamaño, pudiendo extirparlo quirúrgicamente antes de que produzcan metástasis masivamente.

Terapia génica: Durante décadas se han utilizado algunos productos genéticos, como la insulina, para tratamientos terapéuticos. La terapia génica persigue modificar el genoma de las células somáticas para que produzcan cantidades adecuadas del producto génico normal. Para ello se usan vectores que portan los genes de interés al interior de las células u organismos. Tanto algunos tipos de cáncer como muchas enfermedades genéticas están hoy en estudio experimental de terapia génica.

Biotecnología: Diversas compañías de biotecnología han utilizado las técnicas de ADN recombinante, para desarrollar a escala industrial productos como hormonas, factores de coagulación, plantas resistentes a herbicidas, tomates mejorados en su sabor y aspecto, animales transgénicos que engordan más rápido y producen más carne. Actualmente se trabaja en vacunas, que a diferencia de las ya existentes (con virus muertos o atenuados), pueden ingerirse en vez de

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inyectarse. Serían baratas y se facilitaría su uso en países en vía de desarrollo. Son las denominadas vacunas de subunidad. Consisten en una o más proteínas de virus o de bacterias. La vacuna de la hepatitis B se basa en este modelo.

Medicina Forense: En los EE UU, las huellas moleculares del ADN se han utilizado desde 1988 con fines jurídicos. La técnica se basa en el análisis de las bandas producidas en un gel tras cortar el ADN de una muestra encontrada en el lugar del crimen (cabello, semen, tejido cutáneo o sangre) con una enzima de restricción. Se compara el patrón de bandas de esa muestra con el producido por la víctima y los posibles sospechosos. Si hay coincidencia, el asesino ha sido detectado. La probabilidad de que dos individuos escogidos al azar tengan el mismo patrón de bandas para un corte enzimático dado es menor de 1/1011.

Modelos animales de enfermedades genéticas humanas: La creación de ratones knock-out (“fuera de combate”, es decir sin función del gen deseado) se debe también a la tecnología de ADN recombinante. Gracias a estos ratones se puede estudiar cual es la función de un gen en condiciones normales, ya que en los ratones knock-out ese gen pierde su función y produce un fenotipo distinto en el ratón. La técnica de producción de knock outs es compleja y resulta de una combinación de la tecnología de ADN recombinante, de cultivos celulares y de manipulaciones de embriones.

8.2 Usos del ADN recombinante

Sector agrario: Por medio de la técnica del ADN recombinante, se tiene resistencia a herbicidas, ésta técnica esta basada en la transferencia de genes de resistencia a partir de bacterias y algunas especies vegetales, como la petunia. Así se ha conseguido que plantas sean resistentes al glusofinato, al glifosato, como la soja y a bromoxinilen en el algodón. De esta forma se simplifica el control de malas hierbas, resistencia a plagas y enfermedades, obtenida con genes de resistencia incorporados a la planta. Entre otras aplicaciones esta el obtener variedades coloreadas imposibles de obtener mediante cruzamiento o hibridación, como es el caso de rosas azules. También se ha conseguido mejorar la fijación de nitrógeno por parte de las bacterias fijadoras que viven en simbiosis con las leguminosas. Finalmente se producen plantas transgénicas productoras de vacunas, malaria en plantas de banano, mango, lechuga, etc.…

Biotecnología vinícola: La producción del vino se puede optimizar, enfocándose en el proceso de fermentación de las levaduras. Ya se esta trabajando en mejoras del proceso, tratando de crear por ingeniería genética, levaduras con un mayor aprovechamiento del azúcar para producir etanol. Con esta misma metodología se esta consiguiendo Mayor grado alcohólico. Se desea eliminar el problema de la quiebra proteica en vinos blancos mediante el uso de proteasas específicas y levaduras transgénicas que expresen los genes que las codifican, como también se

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están identificando los promotores de genes de levaduras industriales, con expresión diferencial a lo largo de la fermentación vínica.

Biotecnología agraria en el mundo: Países como USA, Argentina, Canadá y los de la comunidad europea, se encuentran muy avanzados en cuanto a biotecnología agraria. Canadá cuenta con la mayor empresa de biotecnología vegetal, Monsanto que entre sus logros tiene las patentes del vector más utilizado para transferencia génica en plantas. Argentina tiene un gran porcentaje de hectáreas cultivadas con soja transgénica, a la cual se le ha incorporado el gen Bt que le confiere resistencia a insectos. España realizó 39 ensayos de biotecnología con aplicación agraria. China dedicó 1.2 millones de hectáreas al cultivo de transgénicos en el año 2004, en el año 2002 se presentó el arroz dorado, que es una variedad genéticamente modificada para producir provitamina A. La FAO no se queda atrás en el tema de la biotecnología, reconoció que la ingeniería genética contribuye a elevar la producción y productividad en la agricultura, también muestra preocupación por los riesgos potenciales que presentan algunos aspectos de la biotecnología y con el fin de prevenir riesgos, apoya un sistema de evaluación de base científica que determine objetivamente los beneficios y riesgos de cada organismo modificado genéticamente.

Biotecnología Animal y en salud humana: Las biotecnologías proporcionan un amplio rango de usos potenciales en animales y humanos. El desarrollo de técnicas para el diagnóstico de enfermedades infecciosas o de desordenes genéticos, es una de las aplicaciones de mayor impacto de la tecnología del ADN. La tuberculosis, el SIDA, los papilomavirus y muchas otras enfermedades infecciosas, adicionalmente a los desordenes heredados como la fibrosis quística o la anemia falciforme, son diagnosticadas en pocas horas utilizando la técnica de PCR en lugar de varios días o semanas por los métodos tradicionales. Existen 3 áreas diferentes en las cuales la biotecnología puede influir sobre la producción animal: el uso de nuevas tecnologías reproductivas, nuevas vacunas y nuevas bacterias como cultivos celulares que producen hormonas. En animales existen ejemplos de modelos desarrollados para evaluar enfermedades genéticas humanas, el uso de animales para la producción de drogas y como fuente donante de células y órganos, por ejemplo el uso de animales para la producción de proteínas sanguíneas humanas o anticuerpos. La inseminación artificial de bovinos ha estado disponible por muchos años y en los últimos veinte años, los científicos han desarrollado técnicas que permiten la transferencia de embriones sin cirugía. Para las enfermedades animales, la biotecnología provee de numerosas oportunidades para combatirlas y están siendo desarrolladas vacunas contra muchas enfermedades bovinas y porcinas. Las nuevas vacunas recombinantes tienen mayor protección, son más estables y más fáciles de producir.

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Biotecnología industrial: Las tecnologías del ADN ofrecen muchas posibilidades en el uso industrial de los microorganismos con aplicaciones que van desde producción (a través de procesos industriales y agro procesos) de vacunas recombinantes y medicinas tales como insulina, hormonas de crecimiento e interferón, enzimas y producción de proteínas especiales. Las vacunas recombinantes tienen gran aplicación, no solo pueden ser producidas en forma a menor costo, sino que ofrecen ventajas de seguridad y especificidad, permiten fácilmente distinguir entre animales vacunados y naturalmente infectados. La manipulación genética de vías metabólicas de los microorganismos, hace posible convertir eficientemente forrajes pobres en productos de gran valor como aminoácidos, proteínas y químicos especiales.

Biotecnología vegetal: Con las técnicas de la biotecnología moderna, es posible producir (más rápidamente que antes) nuevas variedades de plantas con características mejoradas, que puedan ser propagadas con mayor éxito. Aún ciertas plantas sexualmente incompatibles pueden ahora ser tratados hibridizadas y el potencial de nuevas variedades es inmenso. Problemas de enfermedades y control de malezas, ahora pueden ser tratados genéticamente en lugar de químicos. El desarrollo más crucial para la biotecnología fue el descubrimiento de que una secuencia de ADN (gen) insertado en una bacteria, induce la producción de la proteína adecuada. Las técnicas de ADN recombinante, son utilizadas para la producción de individuos transgénicos, e incluyen aislamiento, clonación, recombinación y reinserción de material genético por varios métodos. Hay muchas aplicaciones agrícolas importantes para la identificación de patógenos de plantas y animales, con implicaciones económicas en el monitoreo y control de plagas.

9. VIRUS Y SU APLICABILIDAD EN LA ELABORACIÓN DE FÁRMACOS Y VACUNAS

9.1 Virus: Del latín “veneno”. Entidades orgánicas compuestas tan solo de material genético, rodeado por una envuelta protectora, son agentes causantes de enfermedades más pequeños que las bacterias, carecen de vida independiente, pero se pueden replicar en el interior de las células vivas, perjudicando en muchos casos a su huésped en este proceso.Los cientos de virus conocidos, son causa de muchas enfermedades distintas en los seres humanos, animales, bacterias y plantas.El único medio efectivo para prevenir las infecciones virales es la utilización de las vacunas.

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Figura 13. Bacteriófago T típico

Cuadro 1. Virus animales. Fuente: Biología de Villee, 1996

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9.2 Virus y su aplicabilidad en la elaboración de vacunas

Edward Jenner fue el pionero del uso de las vacunas, practicó la medicina en la campiña inglesa en una época en que la viruela era una de las enfermedades más frecuentes y temidas. Con los años, notó que las mujeres que atendían a las vacas no sufrían los síntomas de la enfermedad. Jenner concluyo que de alguna manera, las lecheras eran “inmunes” a la viruela por que se infectaban a una edad temprana con “vacuna”, una enfermedad innocua que contraían las vacas.La vacuna produce vesículas que se parecen a las vesículas llenas de pus de la viruela, pero las vesículas de la vacuna, eran localizadas y desaparecían sin causar nada más que una cicatriz en el sitio de la infección.En 1796, Jenner realizó uno de los experimentos médicos más famosos de todos los tiempos. Primero, infectó a un niño de 8 años de edad con vacuna y le dio tiempo para recuperarse. Seis semanas más tarde, Jenner infectó de manera intencional al niño con viruela, mediante la inyección de pus proveniente de una lesión variolosa justo bajo la piel del niño. El niño no mostró signos de la mortal enfermedad. En unos cuantos años, miles de personas se habían vuelto inmunes a la viruela, mediante la infección intencional con vacuna. Este procedimiento se llamó VACUNACIÓN, por el término latín VACCA.

Las vacunas contienen partes no infecciosas de las bacterias, virus o microorganismos completos que han sido alterados para que no provoquen infección. El organismo responde a una vacuna creando defensas inmunitarias como pueden ser los glóbulos blancos y anticuerpos.La mayoría de las vacunas modernas contiene patógenos atenuados, que son capaces de estimular la inmunidad, pero que se “incapacitaron” por medios genéticos para producir la enfermedad.

9.3 Tipos de vacunas

Virus vivos y atenuados (debilitados) se usan en la vacuna de la polio oral y en la vacuna triple vírica (sarampión, rubéola, paperas).

Virus o bacterias muertos (inactivados) se usa en la vacuna de la tos ferina. Vacunas toxoides. Contienen una toxina producida por bacterias o virus y

se usa en vacunas como el tétanos y la difteria. Vacunas biosintéticas, están hechas basándose en sustancias sintéticas

que contienen dos antígenos que incitan al sistema inmune a producir anticuerpos efectivos contra la enfermedad influenza tipo B.

Una forma de obtener vacunas eficaces es utilizar en la inmunización virus o bacterias atenuados, es decir incapaces de producir la enfermedad, pero que conserven su inmunogenicidad. Pasteur descubrió que algunas bacterias cuando son cultivadas en el laboratorio o cuando se inoculan en un huésped no natural, pierden su virulencia pero conservan su inmunigenicidad, lo mismo ocurre con algunos virus.

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Figura 14. Manipulación genética de virus

Estos patógenos atenuados son excelentes para ser usados como vacunas, ya que conservan cierta capacidad de infección y activan los sistemas de alarma inmunológica induciendo una fuerte respuesta con memoria inmunológica.Una alternativa al uso de microorganismos viables es utilizar virus o bacterias inactivados o “muertos” por ejemplo por tratamiento térmico o químico en el laboratorio. Estas vacunas son muy estables y en ellas el riesgo de contaminaciones es prácticamente nulo, a pesar de eso estas vacunas también tienen sus limitaciones ya que son caras, se necesitan inocular grandes cantidades del microorganismo, lo que a veces resulta en reacciones adversas serias y por lo general no son capaces de inducir la respuesta inmunológica adecuada o duradera.

Recientemente se han desarrollado vacunas basadas en subunidades o “trozos” de virus o bacterias producidas en forma sintética en el laboratorio, es el ejemplo del uso de toxoides, que son toxinas secretadas por algunas bacterias pero alteradas con tratamientos químicos. Los toxoides son una especie de toxinas atenuadas por que conservan su inmunogenicidad e inducen una respuesta inmunológica que bloquea las toxinas bacterianas.

Todavía quedan muchas enfermedades infecciosas para las cuales no existen vacunas efectivas, como es el caso del VIH o las enfermedades parasitarias; esto ha llevado a los investigadores a buscar nuevas vías para el diseño de vacunas que se están probando en muchos laboratorios. Entre estas se puede citar el uso de péptidos sintéticos de proteínas inmunogénicas, el uso de vectores (virus o bacterias) alterados genéticamente o incluso las vacunas basadas en inmunización con ADN “desnudo”, que se inyecta para que el huésped produzca proteínas de microorganismo “in vivo” que serán después reconocidas por su propio sistema inmune.

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9.4 Cultivo de virus

Dado que los virus sólo pueden multiplicarse cuando han infectado células vivas, no pueden cultivarse en medios inanimados. Uno de los primeros métodos para cultivar virus animales, todavía muy útil consiste en inyectarlos en embriones de pollo en desarrollo. Se elimina un pequeño fragmento de cascarón una o dos semanas después de la fecundación del huevo y el material que contiene el virus se inyecta a través de la abertura. El virus se inyecta en el embrión mismo o en una de las membranas que lo rodean: por ejemplo el saco vitelino, que contiene alimento para el embrión, o el saco amniótico, que es el saco lleno de líquido en que se desarrolla el embrión.

Figura 15. Cultivo de virus en embrión de pollo

La abertura en el cascarón se sella con parafina y el huevo se incuba a 36ºC. El virus se multiplica en las células vivas del huésped y más tarde puede separarse de ellas por centrifugación.El cultivo de virus en embriones de pollo en desarrollo, se ha utilizado con objeto de producir virus para diversas vacunas, como las usadas contra la viruela, influenza y fiebre amarilla.

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El método más ampliamente usado para cultivar virus animales, es el cultivo de tejidos, proporcionando un modelo importante para estudiar infecciones virales y sus efectos en las células.En la actualidad, algunas vacunas se elaboran a partir de virus obtenidos en cultivos de tejidos. Esto es ventajoso para personas alérgicas al huevo, de modo que en este sentido tales vacunas resultan superiores a las elaboradas con virus obtenidos en embriones de pollo.

9.5 Ejemplos de algunas vacunas elaboradas con virus

Vacuna antigripal: Contiene 3 cepas de virus de la gripe: Dos del tipo A y una del tipo B.

Vacuna antihepatitis A: En 1976 fue aislada en Australia, una cepa del virus de hepatitis A, que condujo a la vacuna. En 1988, comenzaron los ensayos clínicos y su uso formal se inicio en 1991. Es una vacuna que contiene virus inactivados. Tiene un grado de antigenicidad cercano al 100%, inmunidad duradera y eficacia protectora.

Vacuna antiparotiditis: En 1967 se licenció en EE UU la vacuna usada actualmente, elaborada con virus vivos atenuados, conteniendo la cepa Jeryl Linn, cultivada en embrión de pollo.

Vacuna antipoliomielítica: Es una suspensión acuosa de virus vivos atenuados te tipo I, II y III, cultivados en células de riñón de mono o diploides humanas.

Vacuna antirrábica: Las vacunas antirrábicas de uso humano, emplean como agente inmunizante el virus de la rabia inactivado. Todas las vacunas emplean un descendiente del virus original producido en el laboratorio por Pasteur.

Vacuna contra rotavirus: Vacuna oral a virus vivos atenuados que previene la gastroenteritis más común de la infancia, causada por el rotavirus (RV).

Vacuna antirrubeólica: A virus vivos atenuados, se presenta en forma aislada o combinada con antiparotiditis y antisarampionosa. (Triple viral).

Vacuna antisarampionosa: Es una vacuna a virus vivos atenuados. Se presenta sola o combinada con antirrubeólica y antiparotiditis (Triple viral). La presentación combinada solo con antirrubeólica se denomina doble viral.

Vacuna antivaricelosa: Vacuna a virus vivos atenuados, elaborada con una cepa atenuada (OKA) y cultivados en células diploides humanas MRC-5 y Wi-38.

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9.6 Utilización de virus en la terapia antitumoral

Una de las características de los virus es su capacidad para unirse e infectar un tipo determinado de células. Esta selectividad parece residir fundamentalmente en la interacción específica entre proteínas de la partícula viral y determinados receptores de la célula atacada. Ciertos virus humanos atacan predominantemente a células hepáticas, mientras que otros se introducen de manera preferente en las neuronas, provocando en uno y otro caso la destrucción específica de las células infectadas, como consecuencia de la multiplicación viral, sin alterar en absoluto otras células del organismo.Este principio podría ser de gran utilidad si se generaran virus que atacasen de manera específica células tumorales y que consiguiesen la eliminación de dichas células alteradas; aunque en el siglo pasado se tuvieron evidencias de que determinadas infecciones virales propiciaban la regresión de determinados tipos de tumores, hasta finales del siglo XX el concepto de viroterapia antitumoral empezó a considerarse como un abordaje experimental muy prometedor, ya que se constató que el efecto antitumoral no era el resultado de la potenciación del sistema inmunológico.Mediante la terapia antitumoral, se pretende dirigir virus poco peligrosos, como los adenovirus responsables del resfriado común, hacia células tumorales, mediante el uso de diferentes modificaciones genéticas del virus.En el abordaje traduccional, se trata de alterar los genes responsables del reconocimiento de sus células diana, de tal manera que originen proteínas en el virus que reconozcan determinados antígenos tumorales, lo que posibilitaría la fijación en introducción específica del virus en las células tumorales, donde su multiplicación podría causar la destrucción, mediante lisis de las mismas. En el abordaje transcripcional, se intenta asociar los genes virales a promotores que sean muy potentes en células tumorales y no en células sanas, lo que propiciaría la expresión de las proteínas virales y la multiplicación del virus sólo en las células tumorales, donde el promotor es funcional.

Por ejemplo, la incorporación de promotores de las enzimas que participan en la síntesis de la melanina, expresada fundamentalmente en melanocitos, favorecería la multiplicación de los virus en las células de los melanocitos malignos que constituyen el melanoma, un tumor de la piel muy agresivo y su consiguiente destrucción, ya que en estas células se encuentran los factores de transcripción que activan este promotor, no así en otros tipos de células normales.

También se puede intentar dotar a estos virus terapéuticos con genes que permitan aumentar la sensibilidad de las células tumorales infectadas a la quimioterapia. Estas técnicas necesitan ser perfeccionadas para evitar reacciones indeseables, en la actualidad se viven realizando diferentes ensayos clínicos con adenovirus y otros virus humanos, esperándose que la viroterapia antitumoral pueda ser una realidad terapéutica para la medicina del futuro.

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9.7 Modificación de virus para su uso en terapia génica

La capacidad infectiva de determinados virus animales, se puede aprovechar para utilizarlos como vectores, con el fin de introducir genes de interés terapéutico en células genéticamente defectuosas, en experimentos de terapia génica.Los retrovirus y los adenovirus son los que más se utilizan en este tipo de experimentos. Sin embargo, la aplicación de estos virus requiere una serie de manipulaciones, con el fin de eliminar los aspectos negativos de los mismos y de potenciar o crear acciones beneficiosas, haciéndolos más eficaces y seguros.

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10. CONCLUSIONES

Los programas de investigación basados en la biotecnología, pueden ser considerados como una prolongación más precisa de los métodos convencionales.

La electroforesis permite separar ácidos nucleicos, proteínas y otras macromoléculas.

La mayoría de los métodos de extracción del ADN, se realizan por electroforesis.

La electroforesis en gel de agarosa, es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de diferentes procedencias.

En la actualidad, solo se utiliza la electroforesis de zona, empleando un soporte y en donde los componentes de la muestra migran en pequeñas bandas o zonas.

Los geles de poliacrilamida, constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas, por su transparencia, elasticidad y porosidad controlable.

Además de los métodos de diagnóstico precoz de enfermedades genéticas, la ingeniería estudia la terapia, aunque la investigación esta en sus comienzos y las dificultades son muchas.

La PCR es un método rápido, de bajo costo y sencillo, para copiar fragmentos específicos de ADN a partir de cantidades mínimas de ADN original.

La técnica de la PCR, presenta una alta probabilidad de obtener falsos positivos por contaminación.

Entre las aplicaciones médicas de la PCR, se destaca su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico.

La técnica de la PCR, permite detectar agentes infecciosos como los virus de la hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

La sensibilidad de la técnica PCR, permite detectar poblaciones de células cancerosas en pacientes sometidos a quimioterapia.

El uso de la PCR, puede llegar a cambiar aspectos de la vida del hombre, como la planificación del sexo de los hijos.

La PCR es una técnica muy sensible para la detección de alimentos transgénicos, ya que puede localizar específicamente cualquier gen del que se conozca su secuencia.

El diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas, la terapia génica y la medicina forense, son algunas de las aplicaciones del ADN recombinante.

El ADN recombinante es la tecnología que ofrece expectativas para la obtención de plantas con las características deseadas.

Los virus representan un reto importante para la ciencia médica en su combate contra las enfermedades infecciosas.

Las vacunas recombinantes, ofrecen diversas ventajas respecto de las convencionales en cuanto a seguridad, especificidad y estabilidad.

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Las vacunas recombinantes acompañadas de las pruebas de diagnóstico adecuadas, permiten distinguir entre animales vacunados e infectados por causas naturales.

La utilización de vacunas y los fármacos antivirales, son las herramientas disponibles en la terapia antivírica.

Los virus animales son responsables de numerosas enfermedades, por lo que el conocimiento de los mecanismos de infección y estrategias de multiplicación, son de gran interés en medicina.

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11. RECOMENDACIONES

Dada la necesidad de adquirir conocimientos en biotecnología, se hace indispensable y urgente, que las universidades de nuestro país sean dotadas con el personal y el andamiaje tecnológico necesario para impartir tales conocimientos a los futuros profesionales.

Debe crearse una normatividad que establezca delimitaciones de orden ético para la investigación biotecnológica.

En la investigación y los procesos que involucran ingeniería genética, se debe siempre tener en cuenta la protección de la biodiversidad.

En lo puramente logístico del trabajo de laboratorio, se deben observar siempre prácticas adecuadas en cuanto a bioseguridad, para minimizar los riesgos tanto personales como biológicos, derivados de los procesos de investigación.

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