HEMOFILIA

HEMOFILIAHEMOFILIAENFERMEDAD DEENFERMEDAD DE

VON WILLEBRANDVON WILLEBRAND

PREVALENCIAPREVALENCIA

- Hemofilia AHemofilia A 1/50001/5000

- Hemofilia B- Hemofilia B 1/25000 1/25000

- VWD- VWD 3% poblaci3% poblaciónón

protómeroprotómero

dominios dominios funcionalesfuncionalesligandosligandos

Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos

D1 D2 D’ D3 A1A2A3 D4BC1C2

D’ D3 A1A2A3 D4BC1C2

1 2050

S IS

S I

IS

RGDRGD

Factor von WillebrandFactor von WillebrandPropéptido Subunidad

Madura

GOLGIGOLGI

RETICULO ENDOPLASMICORETICULO ENDOPLASMICO

Furina

Sadler JE, 2005Sadler JE, 2005

vWFvWFEnsamble Ensamble MultMultímerosímeros

Sadler JE, 2005Sadler JE, 2005

vWFvWFEnsamble y Ensamble y CatabolismoCatabolismo

Proteolisis aumentada (vWD2A)

Depuración aumentada (vWD1 Vicenza)

PlasmaInicial kproteolisis

kdepuración

ADAMTS-13

ksecreción

IIaIIa

A1A1 A2A2 B B A3 C1 C2 A3 C1 C2

200kD200kD 80kD 80kD

90kD90kD HRG HRG 80kD 80kD

50kD50kD 43kD 43kD 73kD 73kD

45kD45kD 67kD 67kD

FACTOR VIIIFACTOR VIIINH NH 22

SecreciónSecreción

PreactivaciónPreactivación

ActivaciónActivación

InactivaciónInactivación

IIaIIa IIaIIa

APC IIa XaAPC IIa Xa Xa Xa

16481648

740740

372372

336336

16891689

17211721

Lollar P & Parker CG, 1989Lollar P & Parker CG, 1989

FVIII-VWFFVIII-VWF

S-SS-S S-SS-S

VWFVWF

FVIIIFVIII

FVIIIaFVIIIa

IIa, FXaIIa, FXa

A1 A2A1 A2

C2 C1 A3C2 C1 A3

N NN N C CC C16891689

740740

372372

A1A1

A2A2

A3A3C1C1

C2C2

BB

Vlot et al., 1998Vlot et al., 1998

FVIII/VWF - FVIII/VWF - PropiedadesPropiedades

FVIIIFVIII VWF VWFClínicaClínica HemofiliaHemofilia vWD vWDProducciónProducción S. HepáticosS. Hepáticos C. Endoteliales C. Endoteliales

MegacariocitosMegacariocitosGenGen Cromosoma XCromosoma X Cromosoma 12 Cromosoma 12MoléculaMolécula HeterodímeroHeterodímero Multímero MultímeroFunciónFunción CoagulaciónCoagulación

ProcofactorProcofactor AdhesiónAdhesión Endotelio/SubEndotelio/Sub Transporta FVIIITransporta FVIII

FVIII/VWF - FVIII/VWF - NomenclaturaNomenclaturaFactor VIIIFactor VIII AntAntígenoígeno FVIII:AgFVIII:Ag

FunciFunciónón FVIIIFVIII

Factor von Factor von WillebrandWillebrand

ProteProteína Maduraína Madura VWFVWFAntAntígenoígeno VWF:AgVWF:AgCofactor RistocetinaCofactor Ristocetina VWF:RCoVWF:RCoUniUnión al Colágenoón al Colágeno VWF:CBVWF:CBUniUnión al Factor VIIIón al Factor VIII VWF:FVIIIBVWF:FVIIIB

ISTHISTH

RecesivaRecesivaLigada al sexo (gen FVIIILigada al sexo (gen FVIIICr X)Cr X)

PORTADORAPORTADORA

HEMOFILIA AHEMOFILIA A

HEMOFILICOHEMOFILICO

HEMOFILIAHEMOFILIAModo de HerenciaModo de Herencia

Hemofilia A severa

8%14%

15%4%

17%

42% inversiones

grandes deleciones

mutaciones sin sentido

corrimiento de la lectura

cambio de sentido

desconocida

Hemofila A moderada

86%

2%10%

2%cambio de sentido

splicing

corrimiento de la lectura

desconocida

HEMOFILIAHEMOFILIADiagnóstico “sencillo”Diagnóstico “sencillo”

- APTT prolongado- APTT prolongado

- FVIII disminuido- FVIII disminuido

HEMOFILIA - ClasificaciónHEMOFILIA - Clasificación

SeveraSevera < 1% VIII< 1% VIIIModeradaModerada 1-5% VIII1-5% VIIILeveLeve >5% VIII>5% VIII

HEMOFILIAHEMOFILIA

Diagnóstico de PortadorasDiagnóstico de Portadoras

Padre hemofílicoPadre hemofílicoHijo hemofílico y antecedentesHijo hemofílico y antecedentes

(vía materna)(vía materna)2 o más hijos, sin 2 o más hijos, sin

antecedentes familiaresantecedentes familiares

PORTADORA OBLIGADAPORTADORA OBLIGADA

No requiere estudioNo requiere estudio

Hijo hemofílico, sin Hijo hemofílico, sin antecedentes familiaresantecedentes familiares

Sin hijos y con antecedentes Sin hijos y con antecedentes (vía materna)(vía materna)

Dificultad diagnDificultad diagnósticaóstica

PORTADORA POTENCIALPORTADORA POTENCIAL

PORTADORASPORTADORAS LyonizaciónLyonización

XXMM XXPP

XXPPXXMMXXMM

XXPP

XXMMXXPP XXMM

XXPP XXPPXXMM XXPP

XXMM

Ovulo FertilizadoOvulo FertilizadoHeterocigotaHeterocigota

ClonesClones

PORTADORAS HEMOFILIA PORTADORAS HEMOFILIA Factor VIIIFactor VIII

PortadorasPortadoras Normales Normales

prob

abili

dad

prob

abili

dad

FVIIIFVIII50 10050 100

BioensayosBioensayos

DESVENTAJASDESVENTAJAS

ProbabilidadProbabilidadError por lyonización extremaError por lyonización extrema

VENTAJASVENTAJAS

CertezaCertezaIndependiente de lyonizaciónIndependiente de lyonización

Análisis de ADNAnálisis de ADN

Alteración heterogéneaAlteración heterogéneaAfecta Afecta diferentesdiferentes regionesregiones

del gendel gen No aplicable a todos los No aplicable a todos los

casoscasos

AnAnálisis deálisis de ADN ADNComplejoComplejo

Análisis de segregación de RFLPAnálisis de segregación de RFLP

??

-/+-/+ --

-- -/- -/-PORTADORAPORTADORA

(-) asociado al defecto(-) asociado al defecto

IDENTIFICACION IDENTIFICACION INDIRECTAINDIRECTA No CertezaNo Certeza

Inversión del intrón 22Inversión del intrón 22↓↓

50% hemofílicos severos50% hemofílicos severos

IDENTIFIACION DIDENTIFIACION DIRECTAIRECTACertezaCerteza

InversionesInversionesDelecionesDelecionesInsercionesInsercionesMutaciones “sin sentido”Mutaciones “sin sentido”Mutaciones “sentido falso”Mutaciones “sentido falso”

IDENTIFIACION DIDENTIFIACION DIRECTAIRECTA

RecesivaRecesivaLigada al sexo (gen FIXLigada al sexo (gen FIXCr X)Cr X)

PORTADORAPORTADORA

HEMOFILIA BHEMOFILIA B

HEMOFILICOHEMOFILICO

HEMOFILIA - ClasificaciónHEMOFILIA - Clasificación

SeveraSevera < 1% IX< 1% IXModeradaModerada 1-5% IX1-5% IXLeveLeve >5% IX>5% IX

HEMOFILIA BHEMOFILIA BDiagnóstico “sencillo”Diagnóstico “sencillo”

- APTT prolongado- APTT prolongado

- FIX disminuido- FIX disminuido






1 2050

S IS

S I

IS

RGDRGD


Madura

VWDVWDClasificación RevisadaClasificación Revisada

Sadler E, 1994Sadler E, 1994

Tipo 1Tipo 1 Deficiencia cuantitativaDeficiencia cuantitativaparcialparcial

Tipo 2Tipo 2 Alteración cualitativaAlteración cualitativaTipo 3Tipo 3 “Ausencia”de VWF“Ausencia”de VWF

VWDVWDGenéticaGenética

VWFVWF Cromosoma 12Cromosoma 12 (12p12(12p1212pter)12pter)

VWD – TIPOSVWD – TIPOSFrecuencia Frecuencia (%)(%)

TIPO 1TIPO 1 TIPO 2TIPO 2 TIPO 3TIPO 3Tuddenham (134)Tuddenham (134) 7575 1919 66Lenk (111)Lenk (111) 7676 1212 1212Nilson (106f)Nilson (106f) 7070 1010 2020Hoyer (116)Hoyer (116) 7171 2323 66Awidi (65)Awidi (65) 5959 29,529,5 11,511,5Berliner (60)Berliner (60) 6262 99 2929

Castaman G, 2003Castaman G, 2003

VWDVWDSerie Serie 1885 Pacientes1885 Pacientes

(Tipo I(Tipo I 91% 91% ))

FVIII FVIII 61,6%61,6% VWF:AgVWF:Ag 62,2%62,2% TS TS 58,4%58,4%

Woods AI, 2001Woods AI, 2001

VWFVWFExpresiExpresión ón VariableVariablePenetrancia IncompletaPenetrancia Incompleta

Chance

Modificadires Ambientales

edad, género, trauma

Enfermedad primariamutación

? Genes modificadores

Ginsburg D, 2001Ginsburg D, 2001 Difícil DiagnósticoDifícil Diagnóstico

Niveles Variables VWFNiveles Variables VWF

IndividualIndividual

FamiliarFamiliar

VWF-VariabilidadVWF-Variabilidad

VWF-VariabilidadVWF-VariabilidadFactoresFactores

40% 40% no genéticosno genéticos

60% 60% genéticosgenéticos

VWF-VariabilidadVWF-VariabilidadFactores no-genéticosFactores no-genéticosEdadEdad

EstrésEstrés

EjercicioEjercicio

H. TiroideasH. Tiroideas

EstrógenosEstrógenos

F.AgudaF.Aguda

VWF-VariabilidadVWF-VariabilidadFactores genéticosFactores genéticosGrupo ABO Grupo ABO 20-30% variabilidad 20-30% variabilidad

Grupo “O”Grupo “O” VWFVWFHipótesisHipótesisGlicosilaciónGlicosilación AlteraciónAlteración

procesamientoprocesamientoestabilidadestabilidadsecreciónsecreción

VWDVWDDistribución según grupo ABODistribución según grupo ABO

““AB” 0,6% AB” 0,6% difícil diagnóstico difícil diagnóstico““O” 70% O” 70% más sintomático más sintomático

> frecuencia de consulta> frecuencia de consulta

Woods AI, 2001Woods AI, 2001

Cuantitativa CualitativaCuantitativa Cualitativa

VWF:AgVWF:Ag SI SI NO NO

VWF:RCoVWF:RCo SI SI SI SI

VWF:CBVWF:CB SI SI SI SI

MultímerosMultímeros SEMI SEMI SI SI

VWFVWFPruebas EspecíficasPruebas Específicas

VWF-ELISAVWF-ELISA

11 22 33 44

1. Anti-VWF inmovilizado1. Anti-VWF inmovilizado

a-vWFa-vWF vWFvWF a-vWF-HRPa-vWF-HRP Color-AbsColor-Abs

2. Incubación con muestra o control2. Incubación con muestra o control3. Incubación con anti-VWF-conjugado3. Incubación con anti-VWF-conjugado4. Incubación con sustrato cromogénico4. Incubación con sustrato cromogénico

VWF:RCoVWF:RCo

Plasma delPlasma delpacientepaciente

PlaquetasPlaquetasnormalesnormales

VWF:RCoVWF:RCoPlaquetasPlaquetasnormalesnormales


RistocetinaRistocetina

Agregación c/RistocetinaAgregación c/Ristocetina

AgregometríaAgregometría




PlaquetasPlaquetasdel paciente del paciente

PlasmaPlasmadel pacientedel paciente



PRPPRP




PlaquetasPlaquetasdel pacientedel paciente

PlasmaPlasmadel pacientedel paciente




AgregometríaAgregometríaPRPPRP

Agregación Agregación c/Ristocetinac/Ristocetina

Kasper C, 2005Kasper C, 2005

NormalNormal

vWD-Tipo 1vWD-Tipo 1

vWD-Tipo 2AvWD-Tipo 2A

vWD-Tipo 3vWD-Tipo 3

VWF:CBVWF:CB Unión ColágenoUnión ColágenoColágenoColágeno

Tipo IIITipo III BSABSAMuestraMuestra

a-a-vWFvWFconejoconejo

IgG F(ab’)IgG F(ab’)22**

CitometríaCitometríade flujode flujo

1. Inmovilización1. Inmovilización

11 2 2

55 66

4433

2. Bloqueo2. Bloqueo3. Colágeno 3. Colágeno VWF VWF4. VWF 4. VWF a-VWF a-VWF5. a-VWF 5. a-VWF IgGF(ab’) IgGF(ab’)2fluoresceína2fluoresceína

6. Adquisición6. Adquisición

EsferasEsferas

poliestirenopoliestireno

Actividad VWF-ELISAActividad VWF-ELISA

11 22 33 44a-vWFa-vWF vWFvWF a-vWF-HRPa-vWF-HRP Color-AbsColor-Abs

1. AcMo a-vWF1. AcMo a-vWFepitope funcionalepitope funcional inmovilizado inmovilizado2. Incubación con muestra o control2. Incubación con muestra o control3. Incubación con anti-vWF-conjugado3. Incubación con anti-vWF-conjugado4. Incubación con sustrato cromogénico4. Incubación con sustrato cromogénico

Agregación Agregación c/Ristocetinac/Ristocetina

Kasper C, 2005Kasper C, 2005

2B Normal 2A

Línea 1 Línea 2 Línea 3

Lane 3>

VWF-Análisis Multiméricograndes intermedios-pequeños (banda 1) (banda 2)

2A2A función plaquetaria función plaquetaria Multímeros APMMultímeros APM

vWD-Tipo 2vWD-Tipo 2Clasificación RevisadaClasificación Revisada

Sadler E, 1994Sadler E, 1994

2B2B afinidad VWF-GPIb-IX afinidad VWF-GPIb-IX 2M2M función plaquetaria función plaquetaria

c/Multímeros APM c/Multímeros APM2N2N afinidad VWF-FVIII* afinidad VWF-FVIII*

**símil Hemofilia A, autosómicasímil Hemofilia A, autosómica






1 2050

S IS

S I

IS

RGDRGD


Madura

X

11 22 33 44

1. Anticuerpo a-vWF inmovilizado1. Anticuerpo a-vWF inmovilizado

a-vWFa-vWF vWFvWF FVIIIFVIII Color-AbsColor-AbsCaClCaCl22 0,4M 0,4M

2. Incubación con2. Incubación con muestramuestra o controlo control3. Incubación3. Incubación FVIIIFVIII purificado/CaClpurificado/CaCl22

4. Incubación con sustrato cromogénico4. Incubación con sustrato cromogénico

VWF:FVIIIBVWF:FVIIIBEnlace FVIII Enlace FVIII VWF VWF

VWF:FVIIIBVWF:FVIIIBEnlace FVIII Enlace FVIII VWF VWF

-3.50 -3.25 -3.00 -2.75 -2.50 -2.25 -2.000.50

0.55

0.60

0.650.65

0.700.70

0.750.75

0.800.80

0.850.85

0.900.90

0.950.95ReferenciaReferenciaPaciente 1Paciente 1Paciente 2Paciente 2

Abs

orba

ncia

Abs

orba

ncia

405n

m40

5nm

2N-Variante Normandy2N-Variante Normandy

Biología MolecularBiología Molecular-- SecuenciaciónSecuenciación-- Enz. restricciónEnz. restricción

VWF- Arg19Trp (C2594T)VWF- Arg19Trp (C2594T)Exón 18Exón 18Enzima BspMIEnzima BspMI

1-244 pb 2-148 pb 3-96 pb1-244 pb 2-148 pb 3-96 pb

Normal 148 pbNormal 148 pb96 pb96 pb

Mutado 244 pbMutado 244 pb

11 22 33

MutaciónMutación

NormalNormal

T. SangríaT. SangríaAPTT (fVIII)APTT (fVIII)AdhesividadAdhesividadTiempo de obstrucción (PFA)Tiempo de obstrucción (PFA)

ScreeningScreening

VWDVWDEstrategia DiagnósticaEstrategia Diagnóstica

**

*no permiten excluir VWD*no permiten excluir VWD

-VWF plasma/plaquetas-VWF plasma/plaquetas

VWDVWDEstrategia DiagnósticaEstrategia DiagnósticaDiagnósticoDiagnóstico

VWF:AgVWF:AgVWF:RCoVWF:RCoVWF:CBVWF:CB

-FVIII en plasma-FVIII en plasma

MultímerosMultímerosRIPARIPAUnión GP plaquetariasUnión GP plaquetariasVWF:FVIIIBVWF:FVIIIBBiología MolecularBiología Molecular

VWDVWDEstrategia DiagnósticaEstrategia DiagnósticaClasificaciónClasificación

vWD- vWD- Importancia Importancia DignDignósticaóstica

VWF:RCoVWF:RCo Prueba mPrueba más sensibleás sensible

VWF:AgVWF:Ag CorrelacionaCorrelacionaVWF:RCoVWF:RCoRatioRatio=1=1Tipo1Tipo1Ratio<1Ratio<1Tipo2Tipo2

FVIIIFVIII Util para el manejo clUtil para el manejo clínicoínico

T. SangrT. Sangríaía CorrelacionaCorrelacionaVWF:RCo (T1)VWF:RCo (T1)Detecta defecto plaquetarioDetecta defecto plaquetario

RIPARIPA Detecta Tipo 2BDetecta Tipo 2BCastaman G, 2003Castaman G, 2003

vWD- vWD- Importancia Importancia DignDignósticaóstica

A.MultiA.Multiméricomérico DiscriminaDiscriminaTipo 2M, 2A, 2BTipo 2M, 2A, 2B

VWFVWFplaquetarioplaquetario Predice respuesta Predice respuesta DDAVPDDAVPTipo 1Tipo 1

VWF:FVIIIBVWF:FVIIIB DetectaDetectaTipo 2NTipo 2N

VWF:CBVWF:CB CorrelacionaCorrelacionaVWF:RCo (T1)VWF:RCo (T1)Sensibilidad Sensibilidad c colágenoolágeno

CT PFA-100CT PFA-100 Especificidad (?)Especificidad (?)

Castaman G, 2003Castaman G, 2003

HEMOFILIAHEMOFILIAVON WILLEBRAND VON WILLEBRAND

Diagnóstico DiferencialDiagnóstico Diferencial

Cofactor de ristocetinaCofactor de ristocetina** Antígeno de factor vW Antígeno de factor vW o N o N Factor VIIIFactor VIII o N o N Tiempo de Sangría Tiempo de Sangría o N o N

*excepto la variante 2N*excepto la variante 2N

Enfermedad deEnfermedad devon Willebrandvon Willebrand

Cofactor de ristocetinaCofactor de ristocetinaNNAntígeno de factor vW Antígeno de factor vW NNFactor VIIIFactor VIII

Tiempo de Sangría Tiempo de Sangría NN

HemofiliaHemofilia

HemofiliaHemofilia VWD2N VWD2N

VWF:RCoVWF:RCo N N N N

Factor VIIIFactor VIII

VWF:FVIIIBVWF:FVIIIB N N

Hemofilia-VWD 2NHemofilia-VWD 2N

DiagnósticoDiagnóstico

Control de terapéuticaControl de terapéutica

VWDVWDLaboratorioLaboratorio

COAGULPATIASCOAGULPATIASOrientaciOrientación Diagnósticaón Diagnóstica

XIIXII XIIaXIIa

XIXI XIaXIa

IXIX IXaIXaVIIIaVIIIaFLFLCaCa2+2+

CaCa2+2+

FCFC

XX

XaXaVaVaFLFLCaCa2+2+

IIaIIaFibrinógenoFibrinógeno

M. FibrinaM. Fibrina

FibrinaFibrina

FTFTVIIaVIIaCaCa2+2+

XIIIaXIIIa

ActivaciónActivación

IIII

V. IN

TRIN

SECA

V. IN

TRIN

SECA

TTPA

TTPA

V. EXTRINSECA

V. EXTRINSECA

TPTP

V. FINALV. FINALTTTT

PRUEBASPRUEBAS

INTERPRETACIONINTERPRETACIONPruebasPruebas DEFECTO (probable)DEFECTO (probable)

TPTPAPTT, TT, TS NormalesAPTT, TT, TS Normales

V. Extrínseca (FVII)V. Extrínseca (FVII)Déficit de factores Vit K Dep.Déficit de factores Vit K Dep.HepatopatHepatopatííaa

TP, APTTTP, APTTTT, TS NormalesTT, TS Normales

V. Común, V. Común, Déficit de factores Vit K Déficit de factores Vit K Dep., HepatopatDep., Hepatopatííaa

TP, APTT, TT, TSTP, APTT, TT, TS HepatopatHepatopatíía, CIDa, CID

↑↑TP, APTT, TTTP, APTT, TTTS NormalTS Normal

V. FinalV. FinalFibrinFibrinóógenogeno

APTTAPTTTP, TT, TS NormalTP, TT, TS Normal

V. IntrV. Intríínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII)nseca (FVIII, FIX, FXI, FXII)Hemofilia, VWDHemofilia, VWD

↑↑APTT, TSAPTT, TSTP, TT NormalesTP, TT Normales

VWDVWD

GraciasGracias

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