Universidad Nacional de San Martín Instituto de Investigaciones Biotecnológicas

GENÉTICA GENERAL GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

1º CUATRIMESTRE 2010

DOCENTES: Dr. Carlos Buscaglia Lic. María Paula Zappia Lic. María Ziliani Lic. Cintia Sánchez AUTOR: Lic. María Paula Zappia

Genética General 2010

ÍNDICE

! Objetivos generales

! Programa de prácticas

! Régimen de aprobación de la materia

! Práctica 1. Introducción a la biología y a la genética de Drosophila.

Reconocimiento de mutantes morfológicas e identificación de características

sexuales.

! Práctica 2. Mapeos mediante cruzamientos genéticamente controlados en la

mosca de la fruta.

! Práctica 3. Búsqueda de información sobre genes y mapeo citogenético

mediante herramientas bioinformáticas utilizando FLYBASE.

! Práctica 4. Análisis de la progenie de los cruzamientos. Discusión de los

resultados.

! Bibliografía

! Agradecimientos

OBJETIVOS GENERALES

El programa de prácticas, de los seminarios y problemas del curso de Genética,

pretende conseguir los siguientes objetivos:

1) Reforzar parte del cuerpo de conocimientos teóricos que han adquirido en la

asignatura.

2) Familiarizar al alumno con algunas de las técnicas y metodologías utilizadas en la

experimentación genética aplicando conceptos básicos de genética en un modelo

biológico de facil manipuleo y mantenimiento como Drosophila.

3) Analizar y mapear mutaciones aplicando los principios de herencia genética de los

marcadores fenotípicos

PROGRAMA DE PRÁCTICAS Se llevará a cabo 1 bloque de prácticas centrados en algunos de los aspectos básicos de la Genética Mendeliana. Este bloque se desarrollará en un total de cuatro clases, de unas 4 horas cada una. En la primera de ellas, se familiarizarán con uno de los organismos más utilizados tradicionalmente en Genética, la especie Drosophila

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melanogaster, observando una variedad de fenotipos de mutaciones morfológicas y analizando el tipo de mutación del cual se trata según el genotipo que presenta. En la siguiente clase, realizarán cruzamientos controlados con moscas provenientes de líneas que poseen un elemento P insertado al azar en algún lugar del genoma. Estas moscas fueron generadas en el marco de un rastreo genético (a partir de una colección de mutantes insercionales) y el objetivo es establecer un mapeo cromosómico para cada una de estas líneas. A continuación se determinará el mapa genético entre dos genes ligados en el mismo cromosoma en base al análisis de la frecuencia de individuos recombinantes para estos genes con el objetivo de estimar la distancia genética entre estos dos marcadores. Por último, se buscará información sobre las mutaciones analizadas en la base de datos de Drosophila (flybase) y se utilizarán las herramientas bioinformáticas para contrastar los resultados observados. Estas prácticas, en su conjunto, son el reflejo en el laboratorio de las clases teóricas de Genética Mendeliana y constituyen una introducción insustituible a los procedimientos de estudio de la Genética clásica.

RÉGIMEN DE APROBACIÓN DE LOS TP Como ya se mencionó, la materia consta de clases teóricas, de laboratorio y de discusión de problemas y seminario. Las clases de laboratorio y problemas/seminarios son obligatorias. Durante el cuatrimestre los alumnos serán evaluados en: (1) 2 parciales integradores que incluirán conceptos vistos en las clases teóricas, prácticas, de seminarios y problemas, (2) Un parcialito antes de cada práctico y (3) Un informe final del TP donde se explique el trabajo realizado y los resultados obtenidos con el fin de integrar todos los prácticos y demostrar comprensión de la estrategia global. El mismo deberá tener formato de manuscrito científico (Título, Resumen, Introducción, Métodos, Resultados y Discusión) y no deberá exceder de 10 páginas tamaño A4 escritas con letra Times New Roman 12 pts a simple espacio. Condiciones para aprobar los trabajos prácticos:

- Haber asistido al 80% de las clases de seminarios y laboratorios. Dos

asistencias computadas como TARDE equivalen a un AUSENTE.

- Aprobar el informe final de laboratorio con nota ! 5. De ser desaprobado este

informe podrá ser presentado por segunda vez.

- Aprobación del 66% de los parcialitos. Estos parcialitos no pueden ser

recuperados.

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PRÁCTICA 1. INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA Y A LA GENÉTICA DE DROSOPHILA.

Objetivo El objetivo principal de esta primera práctica es el de familiarizarse con el modelo

Drosophila melanogaster. Los conocimientos adquiridos en esta práctica son

fundamentales para el desarrollo del resto de las prácticas donde se utiliza este

modelo biológico. Los objetivos específicos son:

-Conocer el ciclo de vida y la morfología de las diferentes fases del desarrollo de

Drosophila.

-Identificar los marcadores fenotípicos que presenta el adulto y analizar el

correspondiente genotipo para deducir el tipo de mutación.

-Distinguir las diferencias morfológicas entre el macho y la hembra.

Introducción En esta práctica se utilizarán individuos que pertenecen a la especie Drosophila

melanogaster, y se estudiará el ciclo de vida, las características del dimorfismo sexual,

la genética y los fenotipos/genotipos de diferentes mutantes.

Drosophila melanogaster, conocida vulgarmente como la mosca del vinagre o de la

fruta, es un excelente material de laboratorio y, por ello, ha jugado un papel muy

importante en el desarrollo de la Genética. Entre las múltiples ventajas que ofrece,

destacan su mantenimiento sencillo y económico, que permite conservar un gran

número de líneas interesantes por sus características genéticas de una forma rutinaria,

la capacidad de producir, en un espacio reducido, un número de descendientes muy

elevado en una sola generación y la gran variedad de mutantes fenotípicos que se

conocen.

Los científicos estudian modelos biológicos simples con el objetivo de comprender los

principios que se pueden aplicar a sistemas más complejos. Muchas de las

investigaciones están basadas en el estudio de los genes homólogos de Drosophila,

es decir genes con estructura y función similares a otros animales, incluyendo los

vertebrados. Esta universalidad permite comprender la complejidad de los sistemas

biológicos.

Brevemente, algunas de las ventajas de D. melanogaster como organismo modelo

son:

! Método sencillo y poco costoso de crianza.

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! Ciclo de vida corto (10 a 14 días dependiendo de la temperatura).

! Muy prolífica (cada hembra puede generar de 300 a 500 individuos).

! Genoma secuenciado y anotado.

! Gran cantidad de mutaciones espontáneas o inducidas que han permitido

hacer un mapa genético y citológico completo.

! Presencia de cromosomas politénicos en las glándulas salivales de las larvas

de tercer estadío

! Color transparente de la larva, por lo que es de gran utilidad para

inmunohistoquímica.

! Organismo eucariota, con sistema nervioso relativamente complejo.

! Pequeño tamaño del genoma, con reducido número de cromosomas (n=4,

2n=8) con un par sexual XY en el macho y XX en la hembra y 3 pares de

autosomas (el cromosoma 4 es muy pequeño con muy pocos genes

funcionales).

Se puede considerar a Drosophila como cosmopolita, aunque es más abundante en

las estaciones cálidas en sitios donde se fermentan frutas como los plátanos, las uvas,

etc., por lo que es común encontrarla en los mercados y alrededor de los depósitos de

basura en las casas. Con el objeto de utilizar Drosophila en forma adecuada para los

estudios en laboratorio, es preciso conocer los diversos estados de su desarrollo y

diferenciar los sexos con toda claridad.

Las larvas de Drosophila, como las de otros dípteros, tienen en sus glándulas salivares

cromosomas politénicos. Estos cromosomas gigantes permiten realizar estudios

citogenéticos muy precisos. Los cromosomas politénicos poseen miles de copias de

cada cromosomas alineados entre si. Las alternadas áreas de bandeos oscuros y

claros contienen concentraciones variables de ADN y proteína en la cromatina. Estos

pueden ser observados a muy bajo aumento, con una magnificación del 450x en el

microscopio. Las glándulas salivales son importantes para las moscas en la

producción del material con el cual hacen la pupa. A cada banda del cromosoma

politénico se le asignó un número para construir un mapa citogenético.

El ciclo de vida de Drosophila Las moscas Drosophila son dípteros holometábolos que durante su desarrollo pasan

por las fases de huevo, larva, pupa y, finalmente, insecto adulto (Figura 1). La duración

de su ciclo de vida depende de varios factores ambientales, tales como la temperatura

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y la humedad. A una temperatura de 25ºC y una humedad relativa del 60%, el ciclo de

D. melanogaster desde huevo a adulto es de unos 10 días, mientras que a 20ºC son

necesarios 15 días para ello. La tabla 1 muestra una cronología aproximada del

desarrollo de D. melanogaster que nos servirá para entender la planificación de

nuestros experimentos con esta especie.

Figura 1. Ciclo de vida de Drosophila melanogaster

El cortejo constituye un ritual en el cual el macho presenta un comportamiento

estereotipado realizando una serie de círculos alrededor de la hembra. El

apareamiento consiste en la deposición del esperma en el receptáculo seminal y el

posterior almacenamiento en la espermateca a nivel del útero de la hembra. Los

huevos son fertilizados dentro del útero y a continuación son depositados (u

ovoposición). Al cabo de unas horas, se desarrolla la embriogénesis en la que tiene

lugar una gran proliferación y reorganización celular, del huevo eclosiona una larva

pequeña y blanca, muy activa y voraz. El crecimiento rápido de la larva le produce dos

mudas sucesivas, al final de las cuales se obtienen las llamadas larvas de tercer

estadio. Estas larvas pierden movilidad de forma progresiva y, finalmente, se fijan al

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sustrato y comienzan a transformarse en insectos adultos: es la pupación. Las pupas

se distinguen porque la cubierta externa de la larva se va endureciendo y

oscureciendo progresivamente, hasta adquirir una tonalidad amarillenta o anaranjada.

Una vez que ha terminado la metamorfosis que consiste en la degradación y

reabsorción de los tejidos de la larva y la producción de nuevos órganos a partir de

unas agrupaciones celulares larvarias llamadas discos imaginales, el insecto adulto

rompe la cubierta de la pupa y emerge. Inmediatamente después de la emergencia,

los insectos adultos se reconocen fácilmente porque no están completamente

pigmentados. Se ven pálidos e hinchados y sus alas aún no se han desplegado.

Cuando se realizan cruzamientos de moscas con genotipos diferentes, es crucial usar

hembras vírgenes para poder predecir y controlar el genotipo de la progenie. Es

importante reconocer moscas recién eclosionadas ya que esto garantiza que sean

vírgenes.

Horas Días Estadío del desarrollo

0 0 fecundación: embrión

22 1 eclosión: primer estadio larvario

47 2 primera muda: segundo estadio

70 3 segunda muda: tercer estadio

118 5 Formación del puparium

119 5 puparium amarillo

120 5 puparium pigmentado

122 5 muda prepupal

130 5,5 formación de la cabeza, alas y patas

167 7 pigmentación de los ojos

184 7,5 pigmentación de las quetas

214 9 emergencia: adulto con alas plegadas

Tabla 1. Cronología del desarrollo de D. melanogaster a 25"C

Características del insecto adulto. Identificación de los sexos. Para poder realizar los cruzamientos en condiciones controladas se deben reconocer

inequívocamente los sexos y conocer el tiempo a partir del cual los individuos

emergidos son capaces de aparearse. Los adultos pueden aparearse a las pocas

horas de la eclosión y las hembras comienzan a poner huevos poco después. La

capacidad reproductora se conserva a lo largo de toda la vida, si bien la tasa de

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Genética General 2010

ovoposición desciende a partir del décimo día. La longevidad depende en gran parte

de la disponibilidad de alimento y de la temperatura, y pueden llegar a alcanzar hasta

los tres meses de vida.

Se pueden señalar diferentes características morfológicas que permiten distinguir

fácilmente los machos de las hembras de la especie D. melanogaster (aunque algunas

de estas características no son comunes a todas las especies del género). El sexo de

los adultos es más fácil de distinguir en esta especie (Figura 2).

Figura2. Dimorfismo sexual en Drosophila melanogaster. A) Visión dorsal de los

insectos adultos de ambos sexos. B) Visión ventral de las estructuras de las placas

genitales del macho y de la hembra adultos. C) Detalle de la pata anterior de los

adultos. Los machos presentan el peine sexual (sex combs).

Para distinguir los dos sexos hay que tener en cuenta diferentes características. En

primer lugar, en los machos se observa el peine sexual que consiste en diez cerdas

gruesas en la superficie de una de las partes de las patas anteriores (Figura 2). En

segundo lugar, la pigmentación de la zona dorsal del extremo del abdomen es

diferente en machos y hembras: en los machos forma una mancha negra continua

sobre los segmentos terminales del abdomen (de ahí le viene el nombre de

"melanogaster": extremo del abdomen oscuro). Además, el abdomen de los machos

es redondeado y presenta sólo 5 segmentos, mientras que el de las hembras es más

puntiagudo y presenta 7 segmentos. Finalmente, los machos son algo más pequeños.

Empleando la lupa, se observan otras características: si apretamos los individuos

sobre su dorso, aparecen los aparatos genitales. En las hembras podemos ver una

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Genética General 2010

placa genital de color claro, mientras que los machos tienen una estructura oscura

llamada arco genital (Figura 2).

Después de haber practicado la identificación de los sexos en los individuos adultos, el

reconocimiento es muy fácil y se puede realizar a simple vista. Sólo en caso de duda

es necesario utilizar la lupa (por ejemplo, los individuos que acaban de emerger

pueden ser más difíciles de reconocer).

Manipulación de los adultos Para sexar los individuos, evaluar los marcadores genéticos que presentan y realizar

los cruzamientos es necesario anestesiar a las moscas para poder observarlas

cuidadosamente, y para ello se emplean vapores de éter. Como esta sustancia es muy

inflamable, se debe tener la precaución de no usarla cuando se tiene alguna flama

cerca o existe poca ventilación en el laboratorio.

El "eterizador" se hace usando un frasco igual a los de cultivo; un buen "eterizador"

debe cerrarse con un tapón de algodón y gasa al que se le agregan unas gotas de

éter. Los vapores de éter anestesian a las moscas, pero el contacto con el éter líquido

las mata. Para hacerlo funcionar, se coloca el eterizador sobre el frasco de cultivo, en

unos cuantos segundos se inmovilizan las moscas, que en esta forma pueden ser

examinadas, sacándolas del frasco y colocándolas en la caja de Petri ó cartulina

blanca para observarlas bajo lupa. Debe tenerse cuidado de no sobrepasar la

exposición al éter, porque al hacerlo mueren las moscas y extienden las alas

verticalmente hacia el dorso. Para manipularlas sin dañarlas, se emplean los pinceles

y las agujas de disección; si durante la observación las moscas comienzan a

despertar, se debe volver a exponerlas al anestésico una segunda vez. Debe tener

precaución con este procedimiento ya que el uso del éter en gran cantidad mata a las

moscas.

Al terminar las observaciones se colocarán las moscas en sus viales. Tenga cuidado

en que las moscas anestesiadas no se peguen a la comida del vial. Mantenga el vial

horizontal hasta que se despierten. Las moscas que hayan muerto se deberán

descartar en una botella con alcohol al 70%.

Los adultos se mantienen en viales ó botellas con comida para que depositen sus

huevos. Luego el vial es mantenido durante todo el desarrollo hasta que emergen los

adultos de las pupas y el ciclo vuelve a empezar.

La comida de Drosophila se prepara con:

polenta 66.5 g

levadura 20 g

nipagen 6.5 ml de solución 185 g en 1000 ml EtOH 100%

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ac. Propiónico 4 ml

agar: 10 g

sacarosa: 40 g

Esto es para 1 litro de comida

Dotación cromosómica D. melanogaster tiene cuatro pares de cromosomas homólogos (2n = 8): un par de

heterocromosomas o cromosomas sexuales (XX en las hembras y XY en los machos)

y tres pares de autosomas (II, III y IV; figura 3). El cromosoma IV es muy pequeño

("dot" o cromosoma puntiforme). Todo el genoma de Drosophila se divide en unidades

físicas (visualizadas en los cromosomas politénicos mencionados anteriormente). El

cromosoma X contiene las unidades 1-20. El cromosoma II se divide en el lado

izquierdo y el derecho, siendo 2L con unidades 21-40 y 2R de 41-60. El cromosoma III

tiene las unidades 61-80 en el lado 3L, y 81-100 en el 3R. El cromosoma IV es muy

chico y solo contiene pocos genes y posee las unidades 101-104. Cada región

numerada se divide en 5 subregiones denominadas A, B, C, D y E, y a su vez cada

una de estas se divide en bandas numeradas (la cantidad depende de la topografía de

la región en cuestión) El patrón de bandeo de los cromosomas politénicos tiene alta

resolución. Prontamente, estos cromosomas permitieron correlacionar la posición de

los genes en el mapa cromosómico con las características físicas del cromosoma y así

determinar la localización de puntos de quiebre en los rearreglos cromosómico. En el

área molecular, mediante técnicas de hibridizaciones in situ, los cromosomas

politénicos permitieron mapear la localización física dentro del cromosoma en

cuestión de las secuencias de ADN clonadas.

Figura 3: Drosophila posee cuatro pares de cromosomas, representados con líneas

para los brazos y con círculos para los centrómeros. “L” se refiere al brazo izquierdo

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Genética General 2010

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del cromosoma y “R” al derecho. Los cromosomas X y 4 tienen diminutos brazos

derecho. El cromosoma 4 es solo 1/5 en largo con respecto al X, 2L, 2R, 3Ly 3R.

Mutantes fenotípicos En D. melanogaster se dispone de distintos tipos de mutantes fenotípicos que pueden

tener afectados la morfología del ala, el color del cuerpo, el tamaño, forma o color de

los ojos o de las quetas, etc. En estas prácticas se utilizarán mutantes de identificación

sencilla.

Desarrollo de la Práctica 1

a) Los docentes entregarán a los alumnos el material que será examinado bajo la

lupa para lograr el reconocimiento del sexo en las moscas adultas de D.

melanogaster. En la tabla 2 se detallan las características distintivas de ambos

sexos.

Características HEMBRA MACHO Terminación del abdomen Alargada Redondeada Número de segmentos abdominales Siete Cinco Setas en metatarso del primer par de patas (peine sexual)

Ausentes Presentes

Coloración último segmento abdominal semejante a los demás más oscuros

Tabla 2: Comparación de las características morfológicas sexuales

Observar las moscas al microscopio, al voltearlas, comparar por su lado ventral los

genitales externos y clasificarlas según el sexo.

b) Los docentes entregarán distintos tipos de mutantes de D. melanogaster para

su reconocimiento bajo lupa.

Observar:

-el color y la forma de los ojos

-el color del cuerpo

-la estructura de las alas

-la estructura de las quetas dorsales

Comparar las distintas líneas de moscas mutantes con la línea wild type

Genética General 2010

Deducir de qué mutación se trata para cada caso basándose en el listado de

mutantes detallado a continuación

Tipos de mutantes Las mutaciones que pueden encontrarse en D. melanogaster están ordenadas por

grupos de acuerdo a las característica fenotípicas que afectan.

1- setas, cerdas o quetas

forked: setas acortadas, nudosas, bifurcadas o retorcidas.

shaven: setas afeitadas.

singed: todas las setas muy rizadas, u onduladas como chamuscadas.

spineless: setas débiles.

Stubble: setas disminuidas y en forma de maza.

2- color del cuerpo

black: cuerpo, tarso de las patas y venas de las alas de color negro.

ebony: cuerpo de color negro brillante. Es el tipo oscuro que se ha descrito.

sable: cuerpo marrón oscuro.

tan: cuerpo tostado.

yellow: cuerpo de color amarillo, pelos y setas con las puntas amarillas. Las partes

bucales de las larvas varían de amarillo a pardo.

3- antenas

Aristapedia: desarrollo de patas en lugar de antenas.

4- color de los ojos

brown: ojos oscuros de color vino que se tornan a púrpura con la edad. Además los

testículos del adulto son incoloros y los tubos de Malpighi amarillentos en las larvas.

purple: ojos color rubí que se oscurece con la edad hasta llegar a un púrpura rubí.

sepia: ojos color marrón-rojizo en el imago, luego se oscurece a sepia y finalmente se

vuelve negro en el adulto.

white: la característica fundamental es la presencia de ojos blancos, pero presentan

además ocelos, tubos de Malpighi y cubierta testicular no coloreada. Tiene varios

alelos: white apricot, white eosine, etc.

5- forma de los ojos

Bar: mutación debida a una duplicación. Produce reducción del tamaño del ojo que

toma forma de barra vertical en las hembras homocigotas y en los machos. En las

hembras hetertocigotas es arriñonado.

eyeless: tamaño del ojo variable desde sin ojos hasta casi tipo salvaje, generalmente

reducidos a la mitad. Influenciado por la temperatura.

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Genética General 2010

Lobe: ojos lobulados.

Star: ojos de forma estrellada.

6- tamaño de las alas

apterous: sin alas.

miniature: alas pequeñas que no sobresalen del abdomen.

vestigial: alas uniformemente reducidas a pequeñas escamas en la región basal,

muestran nervaduras pero carecen del área marginal. Balancines también reducidos.

7- forma de las alas

Curly: mutación asociada con una inversión. Produce alas fuertemente curvadas hacia

arriba y lados.

curved: alas divergentes y curvadas hacia abajo.

dumpy: alas truncadas y reducidas a dos tercios de su longitud.

scalloped: alas festoneadas.

8- venación de las alas

crossveinless: no hay venas transversales o solamente se observan trazas.

incomplete: alas con nervadura radial incompleta. (autosómico).

9- inclinación de las alas

Dichaete: mutación asociada a una inversión. Produce la separación de las alas en

ángulo de 45º del eje del cuerpo y de 30º hacia arriba.

Se buscará información (secuencia, tipo de mutación, banda, cromosoma, referencias)

en flybase (http://flybase.bio.indiana.edu/) sobre el gen responsable de cada uno de

los fenotipos mutantes observados, aprendiendo a utilizar la base de datos del

genoma secuenciado y anotado de D. melanogaster (práctica 3).

Muchos genes solo presentan el fenotipo cuando ambos genes de los cromosomas

homólogos están afectados. Esto son las mutaciones recesivas. Las mutaciones

dominantes se indican con Mayúscula y las recesivas con minúsculas. Un ejemplo de

mutaciones recesivas letales es: wingless (wg), localizado en el cromosoma 2,

posición 30.0. Ejemplos de mutaciones dominantes son: Curly Wings (Cy), localizado

en el cromosoma 2, posición 6.1; Stuble Bristles (Sb), localizado en el cromosoma 3,

posición 58,2. Algunas mutaciones no letales recesivas son: purple eye (pr),

cromosoma 2, posición 54,5; ebony body (eb), cromosoma 3, posición 70,7.

Las mutaciones ligadas al sexo están localizadas en el crosmoma X (ó 1). Como

ejemplo, white eyes (w) en la posición 1.5; miniature wings (m) en posición 36,1.

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Genética General 2010

c) Los docentes informarán acerca de los genotipos de las moscas en

observación. En base a estos datos y la observación del fenotipo, determinar

de qué tipo de mutación se trata (dominante/recesiva).

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Genética General 2010

Práctico 2. MAPEOS MEDIANTE CRUZAMIENTOS GENÉTICAMENTE CONTROLADOS EN LA

MOSCA DE LA FRUTA

Objetivo El objetivo de esta práctica es que el alumno se familiarice con los principios de

herencia genética llevando a cabo experimentos genéticos. En este caso se llevarán a

cabo cruzamientos controlados de Drosophila empleando moscas con genotipos

conocidos tal que pueda predecir los genotipos de la progenie. Para realizar este

análisis deberá basarse en los principios de Mendel de segregación de alelos.

Esta práctica consta de dos secciones y cada una tiene un objetivo específico:

! A) Deducir el cromosoma en el cual está insertado el elemento P en una línea

de la colección de mutantes insercionales en base a la evaluación de la

segregación de marcadores ligados a cada uno de los cromosomas con

respecto al marcador del transposón

! B) Establecer la distancia genética entre dos marcadores del mismo

cromosoma en base a la frecuencia de recombinantes observada en la

progenie. Comprender el razonamiento lógico de cómo se construye un mapa

genético.

Introducción La posición relativa de muchos genes en los cromosomas de Drosophila han sido

identificados y mapeados basándose en la frecuencia de recombinación con los genes

vecinos. Esto se denomina ligamiento ó mapa genético. El mapa genético se establece

definiendo el orden y las distancias relativas entre genes situados en un mismo

cromosoma basándose en la frecuencia de crossing-over entre los genes de

cromátidas hermanas (tabla 3).

Cromosoma 1 Cromosoma 2 Cromosoma 3 Cromosoma 4

1.5—white eyes, w 0.0— aristaless antennae, al 19.2—javelin bristles, jv —grooveless

scutellum, gvl 3.0—facet eyes, fa 1.3—Star eyes, S* 26.0—sepia eyes, se —bent wings, bt

5.5—echinus eyes, ec 4.0—held-out wings, ho 26.5—hairy body, h 2.0—eyeless, ey

7.5—ruby eyes, rb 6.1—Curly wings, Cy* 35.5—eye gone, eyg 13.7—crossveinless wings, cv

13.0—dumpy wings, dp

41.0—Dichaete wings/bristles, D*

20.0—cut wings, ct 16.5—clot eyes, cl 44.0—scarlet eyes, st 21.0—singed bristles, 21.9—spade wings, 47.5—Antennapedia,

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Genética General 2010

sn spd Antp* 27.5—tan body, t 31.0—dachs tarsi, d 48.0—pink eyes, p 33.0—vermillion eyes, v

41.5—daughterless, da 50.0—curled wings, cu

36.1—miniature wings, m 48.5-black body, b 58.2—Stubble bristles,

Sb*

43.0—sable body, s 51.2—reduced bristles, rd 58.5—spineless, ss

44.0—garnet eyes, g 54.5—purple eyes, pr 58.7—bithorax body, bx 51.5—scalloped wings, sd 55.9—light eyes, lt 62.0—stripe body, sr

56.7—forked bristles, f 57.5—cinnabar eyes, c 63.1—glass eyes, gl

57.0—Bar eyes, B 67.0—vestigial wings, vg 66.2—Delta veins, Dl

59.5—fused veins, fu 72.0—Lobe eyes, L 69.5—Hairless, H 62.5—carnation eyes, car

75.5—Curved wings, C 70.7—ebony body, e

66.0—bobbed bristles, bb

91.5—smooth abdomen, sm 74.7—cardinal eyes, cd

104.5—brown eyes, bw

88.0—mahogany eyes, mah

107.0—speck body, sp 106.2—Minute bristles, M

Tabla 3: Mapa genético abreviado de Drosophila melanogaster, presentando alguno

de los genes que han sido mapeados hasta la fecha. Las mutaciones dominantes se

escriben en mayúscula, y las letales están marcadas con *. La unidad de distancia en

un mapa genético es denominada unidad de mapa (um), siendo 1um equivalente a 1%

de recombinación.

Mapeo genético Durante la meiosis, cada par de cromosoma homólogo se junta formando una tétrada

(dos pares de cromátidas hermanas). Durante la profase I, los cromosomas

homólogos se entrecruzan y se enrollan. Las cromátidas no hermanas pueden

intercambiar fragmentos de material genético. Es el denominado proceso de

recombinación ó crossing-over. En Drosophila, el crossing-over ocurre solamente en

las hembras.

El mapeo de posiciones relativas, establece el orden de los genes ligados en un

determinado cromosoma. Esto se construye basándose en la frecuencia de crossing-

over entre pares de genes. Cuanto más cercanos están dos genes uno del otro, es

menos probable que ocurran eventos de recombinación entre estos dos.

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Genética General 2010

Inversamente, cuanto mayor es la distancia entre dos genes, la probabilidad de que

ocurra crossing-over entre estos dos marcadores es mayor. La probabilidad de

recombinación puede expresarse como distancia ó valor (% de crossing-over entre dos

puntos del cromosoma). Una unidad de mapa (um) es la distancia entre dos genes

ligados en el espacio donde ocurren eventos de recombinación con una frecuencia de

1%, ó es la distancia entre dos genes para los cuales se obtuvo un 1 recombinante en

meiosis de 100 casos analizados. Una unidad de mapa es también denominado

centimorgan cM en honor a Thomas Hunt Morgan. La posición en el mapa en la cual

se localiza el gen es también llamada locus.

En el cromosoma X de Drosophila, por ejemplo, el locus de cross-veinless wings (cv)

es 13,7. El locus de cut wings (ct) es 20,0 (tabla 3); entonces la distancia entre cv y ct

es 6,3 um. Si la frecuencia de recombinación entre cv y ct es 6,3; y la de ct y vermillion

eyes (v) es 13, entonces el orden en el cromosoma podría ser cv-ct-v ó ct-cv-v. Para

determinar cual de estas dos posibilidades es la correcta, hay que medir la frecuencia

de recombinación entre cv y v. Si cv y v recombinan con una frecuencia de 19,3,

entonces se deduce que ct se localiza entre estos dos marcadores (tabla 3).

Cromosomas balanceadores: Los cromosomas balanceadores consisten en una herramienta ampliamente usada en

el seguimiento de mutaciones y en el mapeo cromosómico en Drosophila. Son

cromosomas especiales que contienen múltiples rearreglos cromosómicos,

comunmente inversiones inducidas por radiación. Esta propiedad los hace incapaces

de aparearse y recombinar con el correspondiente homólogo normal durante la

profase meiótica. Los cromosomas balanceadores poseen mutaciones dominantes

como marcadores que facilitan su reconocimiento. Generalmente estos marcadores

son recesivos letales. Estas dos propiedades, la supresión de la recombinación entre

cromosomas homólogos y la presencia/ausencia del marcador, son una gran ventaja

en el momento de analizar la segregación de los cromosomas y la deducción de los

genotipos de la progenie. Una de las grandes aplicaciones que presentan los

balanceadores es la de simplificar el planteo del esquema de los cruzamientos. Esto

se explica por la herencia de estos cromosomas que puede ser fácilmente rastreada

ya que bloquea eficientemente toda recombinación con el cromosoma homólogo

correspondiente, y análogamente también se puede rastrear en la progenie de manera

inequívoca el cromosoma homólogo. Entonces si la progenie no posee el marcador del

cromosoma balanceador, se concluye que heredó el homólogo. Este es un principio

importante en el esquema de los cruzamientos genéticos de Drosophila.

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Genética General 2010

La mayoría de los balanceadores que existen corresponden a los cromosomas X, 2 y

3. No son necesarios para el cromosoma 4 ya que no existe intercambio de material

genético en ese cromosoma (crossing over).

Marcadores genéticos

Las mutaciones marcadoras son claves para descifrar genotipos. Generalmente se

usan para marcar cromosomas que se siguen de manera específica, pero también

para marcar cromosomas que se quieren perder. Existe una amplia variedad de

mutaciones que afectan, por ejemplo, el color del ojo, las formas del ojo, del ala, de las

quetas, la pigmentación de la cutícula. Estos permiten etiquetar los cromosomas. En el

momento de usar los marcadores de estos balanceadores, por ejemplo durante la

elección de los balanceadores para un cruzamiento determinado, se debe tener en

cuenta la penetrancia (la probabilidad que una mosca mutante presente el fenotipo

correspondiente) y la expresividad (cuanto abarca del rango del fenotipo en cuestión)

de estos marcadores para disminuir la probabilidad de cometer errores en la

deducción de los genotipos. Además si se usan varios marcadores, hay que

considerar la interacción entre estos, es decir el fenotipo que presente cuando los dos

están presentes y afectan el mismo rasgo (por ejemplo, el color de ojos ó la forma de

las quetas).

Elemento P Los transposones son elementos genéticos capaces de movilizarse de un lugar a otro

del genoma de un organismo. La mayoría de los organismos, desde bacteria a

humanos, poseen transposones. La mayoría de los tranposones cargan un gen que

codifica para la enzima transposasa que cataliza la escisión y la reinserción del

transposón dentro del genoma. Si bien a muchos transposones les falta el gen de la

transposasa, pueden usar la enzima producida por otro transposón para poder

transponer. En condiciones en las cuales no hay una fuente externa de transposasa, el

transposón permanece fijo en su sitio y es genéticamente estable. Mediante la adición

y remoción de una transposasa, es posible controlar exactamente los eventos de

transposición.

El genoma de Drosophila contiene varias familias de elementos transponibles. Los

elementos P son uno de los primeros transposones descubiertos en Drosophila y los

más estudiados. Son relativamente nuevos en la escala evolutiva de Drosophila, y se

piensa que estos fueron adquiridos por transferencia horizontal hace menos de 200

años. Se ha desarrollado una amplia gama de aplicaciones técnicas empleando al

elemento P como herramienta genética en la manipulación del genoma de Drosophila.

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Genética General 2010

La estructura del elemento P se presenta en la figura 4. En cada extremo del elemento

P se sitúan repeticiones invertidas que son necesarias para la transposición. El

elemento P ha sido modificado genéticamente removiendo el gen de la transposasa y

reemplazándolo por una copia wild-type del gen white+. Esto constituye un marcador

del elemento P, es decir que la presencia del elemento P se denota por el color de

ojos rojos. Cabe aclarar que el transposón que se insertó en una mosca con un

background genético white (mutante de ojos blancos). El color rojo conferido por el

marcador white+ del elemento P, en la mayoría de los casos es mas claro que el wild-

type (que posee un color rojo furioso mientras que el marcador del P tiene un color que

varía en la gama de naranja debido a que no posee el gen completo de white, si no

que se clonó una mini-versión correspondiente solamente a la secuencia codificante.

El color de ojo conferido por el mini-white (marcador del P) puede variar en su

tonalidad entre el amarillo y el rojo dependiendo del lugar en el cual se insertó el

elemento P dentro del genoma (presencia de regiones regulatorias de la expresión

génica).

Figura 4: Anatomía del elemento P (modificación de Lindsley and Zimm 1992) con

algunas características y mapa de restricción.

Aislamiento de nuevos mutantes mediante rastreo genético de una colección de mutantes insercionales El sulfonato de etilmetano (EMS) se emplea como mutágenos químicos para inducir

mutaciones puntuales en el genoma de Drosophila. También se realizan radiaciones

con rayos-X ó gama para inducir rearreglos cromosómicos (translocación, deleción,

transposiciones e inversiones) por roturas de cromosomas. Pero una limitación de

estas ténicas consiste en la identificación mediante un método sencillo del gen mutado

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Genética General 2010

en el genoma de Drosophila en base al fenotipo de la mutación. Esto se solucionó con

el desarrollo de las herramientas genéticas basadas en el elemento P, promoviendo

así la mutagénesis insercional. El principio de esta estrategia consiste en la disrupción

de genes por la inserción del elemento P.

Colección de mutantes insercionales

En la investigación, se ha empleado como estrategia genética para generar mutantes,

la diseminación de copias del elemento P por todo el genoma de Drosophila mediante

el agregado y la remoción, genéticamente controlada, de la fuente de transposasa. El

elemento P se transpone de manera no replicativa y puede insertarse en un sitio en el

cual interfiera la función de algún gen. Estos casos son denominados mutantes

insercionales (transposon insertion mutants). Existen varias maneras de interferir la

función de gen, por ejemplo, que el elemento P esté interrumpiendo la secuencia

codificante ó la secuencia regulatoria de la expresión.

Empleando la enzima transposasa de manera controlada, se generan colecciones de

moscas en las cuales cada una de las líneas posee el elemento P insertado en algún

lugar al azar dentro del genoma de Drosophila. Una vez generada la colección por

transposición del P, el siguiente paso consiste en localizar cada P para poder plantear

de manera correcta el esquema de los cruzamientos a seguir antes de realizar los

experimentos del screen genético. Esto se realiza balanceando los cromosomas 2 y 3

de Drosophila y evaluando la segregación de los marcadores dominantes de los

balanceadores con respecto al del elemento P (etiquetado con white+) en la progenie

en cruzamientos genéticamente controlados. Así se deduce en qué cromosoma se

localiza el elemento P.

En la práctica determinarán que cromosoma alberga el elemento P para un subgrupo

de líneas de moscas de la colección de mutantes insercionales que fue generada en el

laboratorio de la Dra. M Fernanda Ceriani (Fundación Instituto Leloir) y que

gentilmente nos donó. Cada grupo recibirá una línea mutante insercional, recuerde

anotar el número de stock, observar el color de ojos y compararlo con las líneas wild-

type de Drosophila.

Nota: cabe aclarar que el elemento P de las líneas de moscas de la colección de

mutantes insercionales ya no transpone porque la fuente de transposasa fue removida

en el momento en que se generó cada una de las líneas.

Una gran ventaja de esta estrategia es la fácil identificación del gen interrumpido por el

elemento P ya que la región quedó etiquetada por el mismo P permitiendo recuperar la

secuencia de ADN ubicada a ambos lados del transposón por métodos moleculares.

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Genética General 2010

Localización del elemento P en moscas mutantes insercionales

El objetivo es localizar el elemento P para evaluar qué gen (es) está siendo alterado

por la inserción del transposón. Una vez que se determinó en qué cromosoma se

encuentra el P mediante cruzamientos controlados (como los que se realizarán en la

práctica), se procede a continuación a mapear genéticamente la región de inserción

empleando cromosomas especiales que contienen una serie de mutaciones recesivas

diseminadas por todo el cromosoma (http://flystocks.bio.indiana.edu/Browse/misc-

browse/mapping.htm). El procedimiento sigue la misma lógica que el mapeo genético

por recombinación que se realizará en la práctica para calcular la distancia entre white

y yellow, pero el análisis es más complejo ya que se usan varios marcadores y se

calcula la distancia del P (marcado con white+-ojos rojos) con respecto a cada

marcador. En paralelo es posible determinar la posición del P en el mapa citológico de

los cromosomas politénicos mediante la técnica de hibridación in situ. Se visualización

en que banda se localiza. Finalmente, para completar este mapeo, se puede llevar a

cabo un abordaje de genética molecular secuenciando las regions de ADN localizadas

en los extremos del elemento P empleando oligonucleótidos específicos del P

(previamente se realiza un rescate plasmídico ó PCR inversa para recuperar las

secuencias que flanquean el P). Con las secuencias obtenidas, se hace una búsqueda

bioinformática para localizar el sitio exacto en el genoma de Drosophila donde se

insertó el P. Así se identifica el gen que fue interrumpido por la inserción del P, y se

determina de qué potencial mutante se trata. Aún quedaría por evaluar si la inserción

del P afecta efectivamente la función del gen y si lo hace, de qué manera.

Elemento P como herramienta molecular Los elementos P se han empleando como poderosas herramientas de biología

molecular para identificar genes de interés, clonarlos e insertándolo en el genoma

como transgen. El uso de los elementos P tiene una amplia gama de aplicaciones

técnicas según qué construcción genética posee. Algunas de ellas son la generación

de:

- Colecciones de mutantes insercionales: cada línea afecta la función de algún

gen por la inserción del P (Figura 5)

- Colecciones de ‘enhancer trapping’: cada línea reporta la actividad

transcripcional de la región del genoma donde se insertó el P. Contiene un gen

reportero como #-galactosidasa (LacZ) ó GFP.

- Líneas transgénica: el elemento contiene el gen de interés clonado y lo

sobreexpresa en determinado tejido

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Genética General 2010

Figura 5: Las líneas que se van a observar y mapear poseen este elemento P,

denominado EP, insertado en el genoma de Drosophila. Los extremos triangulares

representan las repeticiones invertidas y también se indica el gen white+ que confiere

el color de ojos rojos como marcador del elemento P. Esta estrategia permite seguir el

elemento P en la progenie, es decir seleccionar los individuos que heredaron el

transposón por el fenotipo que presentan.

Obtención de hembras vírgenes Para poder controlar el cruzamiento y predecir los genotipos de la progenie hay que

evitar que las hembras que deben utilizarse para el cruzamiento sean fecundadas por

machos no deseados. Esto es importante ya que la hembra de Drosophila puede

almacenar el esperma de una sola copula por un largo período de tiempo en la

espermateca. Hay que asegurarse de colectar hembras vírgenes para realizar el

cruzamiento de interés. Como las moscas adultas no se aparean hasta 8hs despues

de emergidos de la pupa, la recolección de moscas jóvenes (recién eclosionadas)

garantiza que sean vírgenes. El procedimiento más común para lograrlo es eliminar

con mucho cuidado los adultos presentes en la botella de cultivo cada cierto tiempo

(para D. melanogaster, cada seis horas) de forma que podamos estar seguros de que

todos los individuos nacidos en el botella después de la última eliminación sean

vírgenes. Después de clasificarlos, los individuos se mantendrán separados por sexos.

También es posible seleccionar individuos vírgenes si sólo se recogen aquellos que

vemos que acaban de emerger y presentan las siguientes características:

-alas sin desarrollar

-cuerpo poco pigmentado e hinchado

-mancha oscura en el abdomen translúcido que revela la presencia del meconio

(vestigios del intestino de larva)

Se debe tener precaución en no colectar junto a las hembras vírgenes, los machos

recién emergidos que presentan las mismas características.

Las hembras así colectadas pueden ir almacenándose 3-4 días hasta tener una

cantidad suficiente para el experimento. La fertilidad femenina tiene un pico entre los

4-10 días de edad.

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Genética General 2010

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- ¿Cómo podría afectar los resultados si se seleccionan hembras no vírgenes por

error?

Analizar en que casos es necesario o no colectar hembras vírgenes para realizar los

cruzamientos

Sistema P$hs-hid%Y para colectar hembras vírgenes

Como se requiere de mucho tiempo y habilidad para colectar hembras vírgenes se

desarrolló una herramienta genética muy útil que consiste en erradicar los machos del

vial de manera que todas las hembras que eclosionen permanezcan vírgenes debido a

la ausencia de los machos. Este sistema consiste en un elemento P insertado en el

cromosoma Y (solo lo llevan los machos), que posee un promotor (heat shock-hs)

inducible por shock térmico que controla la expresión de un gen proapoptótico (hid).

Entonces al activar esta construcción por shock térmico (2hs a 37°C) en los estadíos

larvales, se expresa el transgen hid solamente en los machos, eliminándolos antes de

la eclosión. Las hembras emergen del pupario en ausencia de los machos y se

mantienen vírgenes. Las hembras no se ven afectadas porque no llevan esta

construcción en el genoma

Desarrollo de la Práctica 2.

Cada grupo llevará a cabo un cruzamiento por duplicado para cada una de las

secciones planteadas anteriormente

-Cada grupo recibirá una de las líneas de la colección de mutantes insercionales.

Cada una de estas líneas posee el mismo elemento P (EP) insertado en distintas

regiones del genoma. Observe y compare el color de ojos. A qué se deben estas

diferencias?

Para cada uno de los cruzamientos a realizar:

-Complete el esquema de la serie de cruzamientos

Cruzamiento -#1 (realizado por los docentes):

Parentales: línea x línea

Progenie: hembras

machos

Cruzamiento -#2 (a realizar en el TP- es el cruzamiento de prueba)

Genética General 2010

Parentales: línea x línea

Progenie: hembras

machos

-Observar los marcadores (color de los ojos, forma del ala, quetas en el dorso, color

del cuerpo), sexar y separar los parentales a usar en el cruzamiento-#2. En base al

fenotipo y determinar el genotipo.

-Realizar el cruzamiento correspondiente colocando 4-8 hembras vírgenes con unos 3-

4 machos en un vial. Tener precaución al manipulear las moscas (no las aplaste, ni las

mate con el anestésico) ya que estas deben permanecer viables y fértiles para el

cruzamiento. Es conveniente proceder rápido.

-Rotular cada vial con el cruzamiento hecho, la fecha y el grupo

-Analizar las posibles gametas generadas por cada uno de los parentales

-Establecer las posibles combinaciones de gametas y determinar los genotipos

esperados y las frecuencias relativas para la progenie

Nota: asumir que durante la meiosis los pares de cromosomas homólogos se aparean

y segregan de manera independiente. Todas las posibles combinaciones de gametas

se producen con igual frecuencia durante la meiosis y además todas las posibles

combinaciones de genotipos de la progenie se producen con igual frecuencia durante

la fertilización. La viabilidad de todas estas combinaciones es otra cuestión, se verá

cada caso en particular. Es recomendable realizar el análisis mediante un cuadro de

Punnett. Es importante evaluar si todos los genotipos que se generan en la progenie

son fácilmente distinguibles uno de otro fenotípicamente y sin ambigüedades, siendo

esto clave para la genética de moscas.

-¿Qué es un cruzamiento de prueba?

Considerar un caso diferente en el cual el objetivo sea deducir el genotipo de una

mosca adulta con un fenotipo dominante. En otras palabras, si es homocigota ó

heterocigota. ¿Cómo plantearía los cruzamientos para descifrar esto en base a la

proporción de los fenotipos de la progenie? Plantear suponiendo que se trata de un

marcador autosómico (i) y uno ligado al sexo (ii).

Se requiere de 10-14 días, dependiendo de la temperatura, para que el huevo de

Drosophila se desarrolle hasta el adulto. Es conveniente realizar un seguimiento de los

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Genética General 2010

viales y tomar notas de las observaciones hechas (estado del vial, estadio del

desarrollo, etc.) durante el transcurso del desarrollo.

Se dejará que los adultos depositen los huevos por 3 días y luego se realizará un

subcultivo pasando los parentales a viales nuevos para incrementar el número de la

progenie. Los parentales a su vez serán eliminados del vial para que no se mezclen

con la progenie y generen confusión en el desciframiento de los genotipos. Los viales

serán mantenidos a 20-23°C para que el desarrollo de la progenie se lleve a cabo en

14 días (hasta la práctica 4).

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Genética General 2010

Práctica 3. BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN SOBRE GENES DE DROSOPHILA Y MAPEO CITOGENÉTICO MEDIANTE HERRAMIENTAS BIOINFOMÁTICA UTILIZANDO FLYBASE Objetivo El objetivo de la práctica es en primer lugar que el alumno se familiarice con la base de

datos de Drosophila mediante búsquedas referidas a los genes afectados en los

mutantes ya observados. En segundo lugar, determinar la distancia génica entre los

marcadores usados en el cruzamiento del TP2 (yellow y white) mediante un abordaje

bioinformático basado en el mapeo citogenético de los cromosomas politénicos.

Introducción La bioinfomática permite buscar, compilar, ensamblar y analizar datos que ya se

encuentran disponibles en bases de datos de manera rápida y eficiente, inclusive

acceder a muchos proyectos de genoma que han sido secuenciados en los últimos

años

Base de datos de Drosophila “Flybase” es una base de datos computarizada que contiene información sobre la

biología molecular y genética de Drosophila. El sitio web es http://flybase.org . La

información se encuentra actualizada y disponible. Comprende genes, alelos, clones

genómicos, secuencias (nucleicas y proteicas), mapeo molecular, transposones,

aberraciones cromosómicas, mapeo genético, etc. También incluye un directorio con

investigadores, reuniones científicas, técnicas, imágenes, bibliografías, referencias y

un listado de líneas stocks de moscas. Compila información de los centros de bases

de datos como Berkeley Drosophila Genome Project Data (http://fruitfly.org), European

Drosophila Genome Data (http://www.ebi.ac.uk), y de centros de stocks de líneas de

moscas como Bloomington Drosophila Stock Center (http://flystocks.bio.indiana.edu/),

Drosophila Genetic Resource Center (DGRC, Kyoto Stock Center, Japan)

(http://www.dgrc.kit.ac.jp/en/index.html), información acerca de líneas con inserciones

de transposones del projecto Gene Disruption Project (GDP)

(http://flypush.imgen.bcm.tmc.edu/pscreen/), líneas transgénicas para ARN de

interferencia del Vienna Drosophila RNAi Center Stocks (en el IMP, Austria)

(http://stockcenter.vdrc.at/control/main), colecciones de stocks de Drosophila que

poseen un transposón que permite etiquetar un gen y reportar su expresión, es decir

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Genética General 2010

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deducir el patrón de expresión génico como FlyTrap Stock Collection (GFP protein trap

http://flytrap.med.yale.edu/ ), FlyView Stock Collection (Enhancer trap lines

http://flyview.uni-muenster.de/), y stocks de líneas de Drosophila de distintas especies

en UC San Diego Drosophila Stock Center

(https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php).

Mapa citogenético Como ya se mencionó anteriormente, los cromosomas politénicos de las glándulas

salivares de la larva de Drosophila (figura 6) fueron importante en el establecimiento

de un mapa citogenético.

.

Figura 6: Esquema detallado del conjunto de cromosomas politénicos en célula de

glándulas salivares de Drosophila. Los cromosomas tienen un patrón de bandeo

diferencial. Las bandas corresponden a regiones con elevada concentración de

cromatina. Cada par de cromosomas homólogos se encuentra apareados, tal como

sucede en meiosis. Los centrómeros de los cromosomas se agregan y conforman el

cromocentro. Notar la comparación de escalas con los cromosomas normales en fase

mitótica. A la derecha se ilustra una porción de un cromosoma politénicos visualizados

en el microscopio

Desarrollo de la Práctica 3.

Genética General 2010

-Entrar a la página correspondiente a la base de datos de Drosophila: http://flybase.org

-En la sección de búsqueda, entrar el nombre del gen afectado en alguna de las

mutantes de Drosophila que hayan observado en la práctica.

-Analizar toda la información disponible concerniente al gen en cuestión:

! posición en el genoma (cromosoma, ubicación, genes vecinos)

! banda citogenética (mapeos)

! secuencias de genoma, de mensajero, de proteína

! todos los transcriptos y las proteínas que se expresan

! posiciones de las inserciones de los transposones en las distintas líneas mutantes

insercionales existentes hasta el momento

! patrón de expresión (órganos/estadios del desarrollo)

! fenotipo que presentan las líneas mutantes (notar la amplia gama de mutaciones

que hay para un mismo gen (alelos) y consecuentemente la variedad de mutantes)

! función del gen

! aspecto evolutivo (genes ortólogos)

! stocks de moscas mutantes para ese gen

! referencias

- Entrar en el link de “Flybase Gbrowse”

- Ir al “switch to Chromosome Map”

- Visualizar los cromosomas politénicos, y la posición de cada uno de los genes en

este mapa de bandas citogenéticas.

- Los íconos Dmel-A ó Dmel-B permiten ir de un cromosoma ó brazo de cromosoma a

otro.

- Determinar la distancia que existe entre los genes yellow y white en base a la

información disponible en el Flybase

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Genética General 2010

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Práctica 4. ANÁLISIS DE LA PROGENIE DE LOS CRUZAMIENTOS- DICUSIÓN DE LOS RESULTADOS

El objetivo de esta práctica es en primer que el alumno extraiga los resultados del

experimento realizado y los analice en base a las herramientas genéticas aprendidas

en el curso. Y en segundo lugar, que discuta con otros grupos para contrastar estos

resultados.

Desarrollo de la Práctica 4. - Observar el estado del vial y determinar cada uno de los estadios de desarrollo de

Drosophila. En el caso en que no haya prosperado el cruzamiento, pensar posibles

causas.

- Colectar los individuos de la progenie de los cruzamientos realizados en la práctica 2

- Clasificarlos en base al fenotipo y al sexo

- Cuantificar la proporción relativa de cada una de estas categorías. Es decir calcular

el número total de moscas de una categoría (fenotipo/sexo) con respecto al total.

Es conveniente cuantificar cada vial por separado ya que si hubo contaminación en

algún vial, éste simplemente se descarta. Por contaminación nos referimos a que se

encontraron con fenotipos que no eran los esperados. ¿Cuál puede ser la causa de

esta contaminación?

- Determinar el genotipo en base al fenotipo.

Con respecto al cruzamiento para realizar el mapeo genético entre white y yellow,

recordar que el macho usado como parental provee cromosomas con alelos recesivos

solamente. Entonces el fenotipo que se ve en la progenie se corresponde con la

contribución de las gametas maternas porque la masculina no altera el fenotipo, se

trata de un cruzamiento de prueba.

Evaluar si los fenotipos de la progenie varían según el sexo, y plantear el esquema del

cruzamiento inverso para ese marcador. ¿Está ligado al cromosoma X? ¿Por qué?

- Calcular la distancia genética entre los marcadores white y yellow. Considerar el

conjunto de los datos de todos los grupos y compararlo con los calculados en el TP3.

¿Hay diferencia al considerar los datos de cada grupo por separado con respecto al

global? ¿Cómo influye?

- Determinar en qué cromosoma del genoma de Drosophila se localiza el elemento P

de cada una de las líneas de la colección de mutantes insercionales. Todos los grupos

analizan todas las líneas.

Genética General 2010

- ¿Cómo haría para mapear la ubicación del elemento P dentro del correspondiente

cromosoma?

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Genética General 2010

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BIBLIOGRAFÍA

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Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. (Contains 137 Laboratory

protocols for Drosophila study, ranging from salivary gland chromosome staining, to

karyotypping tissue-culture cells. )

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teachers. It covers DNA, chromosomes, mutations, recombinant technology,

population genetics, and developmental genetics, all with a focus on landmark

experiments and analysis.)

! Lindsley,Dan, The Genome of Drosophila melanogaster, Academic Press Inc, San

Diego, California, 1992. (The bible/dictionary of Drosophila genetic elements, a.k.a.

“The Red Book”, contains an alphabetized list of all mutants, alleles, and loci

current up to the end of 1989. Also contains detailed genetic and chromosomal

maps.)

! Greenspan, Ralph, Fly Pushing, The theory and Practice of Drosophila Genetics,

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1997.

! Venema, Dennis R., Enhancing Undergraduate Teaching and Research with a

Drosophila Virginizing System, CBE-Life Sciences Education, Vol. 5, 353–360,

2006.

AGRADECIMIENTO Dra. Fernanda Ceriani – Laboratorio Genética del comportamiento, Fundación Instituto

Leloir- Buenos Aires- por suministrar las líneas de Drosophila y el equipamiento

necesario para llevar a cabo el práctico