Introducción a la genómica funcional - ujaen.es · Mus musculus 3.2 Gbp (100--15% 5%...

Introducción a la genómicaIntroducción a la genómicafuncionalfuncional

Curso de Genética MolecularCiencias BiológicasUniversidad de Jaén

Antonio Caruz ArcosDpto. Biología Experimental, Área de Genética

Universidad de Jaén

La era de la genómica estructuralLa era de la genómica estructuralLa era de la genómica estructural

EspecieEspecieEspecieNúmero estimado

de genesNúmero estimadoNúmero estimado

de genesde genesTamaño genomaTamaño genomaTamaño genoma

Homo sapiensHomo sapiensHomo sapiens 25,000 - 40,00025,000 25,000 -- 40,00040,0003.2 Gbp3.2 Gbp3.2 Gbp

Mus musculusMus musculusMus musculus 3.2 Gbp 3.2 Gbp 3.2 Gbp (10-15% secuenciado)(10(10--15% 15% secuenciado)secuenciado)

Drosophila melanogasterDrosophila melanogasterDrosophila melanogaster 14,00014,00014,000116 Mbp116 Mbp116 Mbp

Caenorhabditis elegansCaenorhabditis elegansCaenorhabditis elegans 19,00019,00019,00097 Mbp97 Mbp97 Mbp

Arabidopsis thalianaArabidopsis thalianaArabidopsis thaliana 25,50025,50025,500115 Mbp115 Mbp115 Mbp

Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae 6,2006,2006,20012 Mbp12 Mbp12 Mbp

Escherichia coli (K12)Escherichia coli (K12)Escherichia coli (K12) 4,3004,3004,3004.6 Mbp4.6 Mbp4.6 Mbp

Desarrollo tecnológico:sistemas de detección de la expresión génica

Desarrollo tecnológico:Desarrollo tecnológico:sistemas de detección de la expresión génicasistemas de detección de la expresión génica

El pasado: Técnicas tradicionales para medir la expresióngénica, northern, RT-PCR, etc.

El presente: Genómica estructural, mapeo genómico y proyectosa gran escala de secuenciación y anotación génica.

El futuro: Genómica funcional, differencial display, suppressionsustractive hybridization y microarrays de ADN.

La era de la genómica funcionalLa era de la genómica funcionalLa era de la genómica funcional

Definición:DefiniDefiniciónción:: Genómica funcional incluye cualquier aproximación experimental que cuantifica la expresión de cientos/miles de genes al mismo tiempo. (1).

Genómica funcionalGenómica funcional incluye cualquier aproximación incluye cualquier aproximación experimental que cuantifica la expresión de experimental que cuantifica la expresión de cientos/miles de genes al mismo tiempo. cientos/miles de genes al mismo tiempo. (1)(1)..

Objetivo:ObjetivoObjetivo:: Generar un catálogo de todos los genes y de su función. Comprender el comportamiento de los sistemas biológicos y de los algoritmos genéticos que permiten el funcionamiento celular y el desarrollo de los organismos(2).

Generar un catálogo de todos los genes y de su Generar un catálogo de todos los genes y de su función. Comprender el comportamiento de los función. Comprender el comportamiento de los sistemas biológicos y de los algoritmos genéticos sistemas biológicos y de los algoritmos genéticos que permiten el funcionamiento celular y el que permiten el funcionamiento celular y el desarrollo de los organismosdesarrollo de los organismos(2)(2)..

1. Staudt, L.M. and Brown P.O. (�2000) Annu. Rev. Immunol. 18; 829-859.1. Staudt, L.M. and Brown P.O. (�2000) 1. Staudt, L.M. and Brown P.O. (�2000) Annu. Rev. Immunol.Annu. Rev. Immunol. 18;18; 829829--859.859.2. Lockhart, D.J. and Winzeler, E.A. (2000) Nature 405; 827-836.2. Lockhart, D.J. and Winzeler, E.A. (2000) 2. Lockhart, D.J. and Winzeler, E.A. (2000) NatureNature 405;405; 827827--836.836.

PlanteamientoPlanteamientoPlanteamiento

ClásicaClCláásicasica GenomicaGenomicGenomicaa

Dirigida por una hipótesisDirigida por una hipótesisDirigida por una hipótesisLimitada en el número de genes

estudiadosLimitada en el número de genesLimitada en el número de genes

estudiadosestudiadosInformación sobre

miles de genesInformación sobre Información sobre

miles de genesmiles de genes

No hay hipótesis de partidaNo hay hipótesis de partidaNo hay hipótesis de partida


Métodos: Tecnologías de alta procesividadMétodosMétodos:: Tecnologías de alta Tecnologías de alta procesividadprocesividad


-Dependientes de conocimiento previo

Microarrays de ADN

--Dependientes de conocimiento previoDependientes de conocimiento previo

MMicroarraysicroarrays de ADNde ADN

-Independientes de conocimiento previo:

Differential display, SAGE, SSH, Proteómica (geles 2D, Doble híbrido, etc.)

--Independientes de conocimiento Independientes de conocimiento previo: previo:

DifferentialDifferential display, SAGE, SSH, display, SAGE, SSH, Proteómica Proteómica ((geles geles 2D, Doble híbrido, 2D, Doble híbrido, etc.)etc.)

Todo depende de la Extracción de ARNmTodo depende de la Extracción de ARNm

Síntesis de ADNc primera cadena requiere:

• RNAm• dNTPs• primer (oligodT, pDn6 ala azar o específico de un gen)• Transcriptasa reversa

1. rTth (DNA pol Thermus thermophilus recombinante)2. RT AMV (Virus de mieloblastosis de aves)3. RT MMLV (Virus de la leucemia murina de Moloney)

La síntesis de ADNcLa síntesis de La síntesis de ADNcADNc

Oligos para la síntesis de la primera cadenaOligos Oligos para la síntesis de la primera cadenapara la síntesis de la primera cadena

Síntesis de la segunda cadena: autoprimingSíntesis de la segunda cadena: Síntesis de la segunda cadena: autoprimingautopriming

Bloqueo función Bloqueo función

génicagénica

Expresión diferencial II:Expresión diferencial II:con conocimiento previocon conocimiento previo

Microarrays de Microarrays de ADNADN

ProteómicaProteómica

KnockKnock--outsouts

siRNAsiRNA

IVET (in vivo IVET (in vivo expression technologyexpression technology))

STM (STM (signature tagged mutagenesissignature tagged mutagenesis))

SAGESAGE

SSHSSH

DifferentialDifferential displaydisplay

Expresión Expresión diferencial I:diferencial I:

sin conocimientosin conocimientoprevioprevio

Técnicas Técnicas genómicasgenómicas y y

función génicafunción génica

BIOINFORMÁTICA

Doble híbridoDoble híbridoInmunoprecipitaciónInmunoprecipitación

Detección de genes con expresión diferencial:Differential display

Detección de genes con expresión diferencial:Detección de genes con expresión diferencial:Differential Differential displaydisplay

Colección de oligos diferentes (3´)

Colección de oligos aleatorios (5´)

Detección de genes con expresión diferencial:Differential display

Detección de genes con expresión diferencial:Detección de genes con expresión diferencial:Differential Differential displaydisplay

Células control Células

tumorales

La tecnología SAGE (serial analysis gene expression)La tecnología La tecnología SAGESAGE (serial (serial analysis analysis gene gene expressionexpression))

en 1995 por V.E. Velculescu, B. Vogelstein and K.W. Kinzler(1) (Johns Hopkins University, Baltimore, MD. Patentado por Genzyme Corporation®).

enen 1995 1995 porpor V.E. Velculescu, B. Vogelstein and K.W. V.E. Velculescu, B. Vogelstein and K.W. KinzlerKinzler(1)(1) (Johns Hopkins University, Baltimore, MD. (Johns Hopkins University, Baltimore, MD. PatentPatentadoado porpor Genzyme Corporation®).Genzyme Corporation®).

1. Velculescu, V.E. et al., (1995) Science 270; 484-487.1. Velculescu, V.E. 1. Velculescu, V.E. et al.,et al., (1995) (1995) ScienceScience 270;270; 484484--487.487.

Generación de Tags de secuencias (10-14bp).Generación de Generación de Tags Tags de secuenciasde secuencias (10(10--14bp).14bp).

Ligación de los tags para obtener concatémeros que pueden ser clonados y secuenciados.Ligación de los Ligación de los tags tags para obtener para obtener concatémeros concatémeros que que pueden ser clonados y secuenciados.pueden ser clonados y secuenciados.

Comparación de los datos de secuencia para determinar las diferencias en la expresión de los genes.

Comparación de los datos de secuencia para Comparación de los datos de secuencia para determinar las diferencias en la expresión de los determinar las diferencias en la expresión de los genes.genes.

Inventada:InventadaInventada::

Tres principios básicos:Tres principios básicosTres principios básicos::---

---

---

La tecnología SAGE La tecnologíaLa tecnología SAGE SAGE

TTTTTTTTTTTTTTT

Extracción de ARNm

Retrotranscripción hasta ADNc

Utilizando oligodT con biotina

Extracción de Extracción de ARNmARNm

Retrotranscripción Retrotranscripción hasta hasta ADNcADNc

Utilizando Utilizando oligodT oligodT con con biotinabiotina

AAAAAAAAAAAAAAAAEAEAE

AAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTT

AEAEAE

BBB

BBB GATCGATCGATCAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTGATCGATCGATC

SSSCorte con una enzima que

generaextremos cohesivos(AE)

Unión a bolas de estreptavidina

Corte con una enzima que Corte con una enzima que generagenera

extremos cohesivosextremos cohesivos(AE)(AE)Unión a bolas de Unión a bolas de estreptavidinaestreptavidina

Dividir en dos alícuotas y ligarA dos adaptadores A & B

Dividir en dos alícuotas y ligarDividir en dos alícuotas y ligarA dos adaptadores A dos adaptadores A & BA & B

Rotura con otra enzima (etiquetado,TE)

Generación extremosromos

Rotura con otra enzima Rotura con otra enzima (etiquetado,(etiquetado,TE)TE)

Generación extremosGeneración extremosromosromos

CTAGCTAGCTAGGATCGATCGATC


TETETE

AAA

CTAGCTAGCTAGGATCGATCGATC


TETETE

BBB

Ligar y amplificar con oligosA & B

Ligar y amplificar con Ligar y amplificar con oligosoligosA & BA & B

GATCXXXXXXXXXXGATCGATCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCTAGXXXXXXXXXXCTAGCTAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Tag 1Tag 1Tag 1AAA

Tag 2 Tag 2 Tag 2GATCOOOOOOOOOO GATC GATCOOOOOOOOOO OOOOOOOOOO BBBCTAGOOOOOOOOOO CTAG CTAGOOOOOOOOOO OOOOOOOOOO


OOOOOOOOOOGTACOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOGTACGTACOOOOOOOOOOCTAGOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCTAGCTAG

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

WWWWWWWWGTACWWWWWWWWWWWWWWWWGTACGTACWWWWWWWWCTAGWWWWWWWWWWWWWWWWCTAGCTAG

Tag 1Tag 1Tag 1 Tag 2Tag 2Tag 2 Tag 4Tag 4Tag 4Tag 3Tag 3Tag 3-- -- -- -- ---- -- -- -- --

-- -- -- -- ---- -- -- -- --

ClonarSecuenciar

Análisis bioinformático

ClonClonararSeSecuenciarcuenciar

Análisis Análisis bioinformáticobioinformático

Corte con AEAislamiento de ditags y empalme

Corte con AECorte con AEAislamiento de Aislamiento de ditags ditags y empalmey empalme

DitagDiDitagtagGATCXXXXXXXXXXGATCGATCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCTAGXXXXXXXXXXCTAGCTAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

OOOOOOOOOOGTACOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOGTACGTACOOOOOOOOOOCTAGOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCTAGCTAGAAA BBB

La tecnología SAGE La tecnologíaLa tecnología SAGE SAGE

Ligar y amplificar con oligosA & B

Ligar y amplificar con Ligar y amplificar con oligosoligosA & BA & B


Tag 1Tag 1Tag 1AAA

Tag 2 Tag 2 Tag 2GATCOOOOOOOOOO GATC GATCOOOOOOOOOO OOOOOOOOOO BBBCTAGOOOOOOOOOO CTAG CTAGOOOOOOOOOO OOOOOOOOOO

La tecnología SAGE La tecnología La tecnología SAGE SAGE VentajasVentajasVentajas Problemas:ProblemasProblemas::

Determina el nivel de expresión para cada gen.Determina el nivel de expresión Determina el nivel de expresión para cada genpara cada gen..

Problemas técnicos como digestión incompleta con la enzima que genera extremos cohesivos, problemas con la secuenciación masiva

Problemas técnicos como digestión Problemas técnicos como digestión incompleta con la enzima que incompleta con la enzima que genera extremos cohesivos, genera extremos cohesivos, problemas con la secuenciación problemas con la secuenciación masivamasiva

Muy laborioso, laboratorios especializados y complejidad análisis de los datos

Muy laborioso, laboratorios Muy laborioso, laboratorios especializados y complejidad especializados y complejidad análisis de los datosanálisis de los datos

No es bueno para experimentos de dosis respuesta. No se pueden clusterizar los genes

No es bueno para experimentos de No es bueno para experimentos de dosis respuesta. No se pueden dosis respuesta. No se pueden clusterizar clusterizar los geneslos genes

Contribuye al descubrimiento de nuevos genes (proyectos de secuenciación de EST)

Contribuye al descubrimiento de Contribuye al descubrimiento de nuevos genes (proyectos de nuevos genes (proyectos de secuenciación de Esecuenciación de ESTST))

Muy buena correlación con la abundancia de ARNm en la célulaMuy buena correlación con la Muy buena correlación con la abundancia de ARNm en la célulaabundancia de ARNm en la célula

Ligación alícuota 1con adaptador A

ARN totalcélulas control

ARNmcélulas controlSíntesis ADNc

(DRIVER)Ligación alícuota 2con adaptador B

1ª hibridacióndriver+tester

2ª hibridación: mezclar muestras y

añadir DRIVER desnaturalizadofresco

ARN total células tratadasARNm células tratadas

Síntesis ADNc(TESTER)Dividirlo en dos alícuotas

La tecnología SSH (hibridación supresiva sustractiva) ILa tecnología La tecnología SSSH (hibridación SH (hibridación supresiva supresiva sustractiva) Isustractiva) I

Rellenar los extremosañadir oligos y

amplificar por PCR

no amplificación

amplificación lineal

no amplificación amplificación exponencial

La tecnología SSH (hibridación supresiva sustractiva) IILa tecnología La tecnología SSSH (hibridación SH (hibridación supresiva supresiva sustractiva) IIsustractiva) II

ResultadosResultados

Clonación genes

específicos

Microarrays de ADNMMicroarraysicroarrays de ADNde ADN

Sondas:SondasSondas::

Definición:DefDefinicióninición:: Técnica de genómica funcional que permite la medida simultánea de los niveles de expresión de miles de genes (sondas) en un solo experimento de hibridación con una mezcla compleja de ARN o ADN.

Técnica de genómica funcional que permite la Técnica de genómica funcional que permite la medida simultánea de los niveles de expresión medida simultánea de los niveles de expresión de miles de genes (sondas) en un solo de miles de genes (sondas) en un solo experimento de hibridación con una mezcla experimento de hibridación con una mezcla compleja de ARN o ADN.compleja de ARN o ADN.

Secuencias de ADN (oligonucleótidos o productos de PCR) inmobilizadas ordenadamente sobre una superficie sólida

Secuencias de ADN (Secuencias de ADN (oligonucleótidosoligonucleótidos o productos o productos de PCR) de PCR) inmobilizadasinmobilizadas ordenadamente sobre una ordenadamente sobre una superficie sólidasuperficie sólida

Muestra problema:Muestra problemaMuestra problema:: Muestra de ADNc marcada cuya abundancia será determinada por hibridaciónMuestra de Muestra de ADNc ADNc marcada cuya abundancia será marcada cuya abundancia será determinada por hibridacióndeterminada por hibridación

Resultados:ResultadosResultados:: Basados en el concepto de “culpable por asociación”: genes que son co-regulados (patrón similar de comportamiento) es probable que estén funcionalmente relacionados formando parte del mismo proceso biológico.

Basados en el concepto de “culpable por Basados en el concepto de “culpable por asociación”asociación”:: genes que son genes que son coco--regulados (regulados (patrón patrón similar de comportamientosimilar de comportamiento) ) es probable que es probable que estén funcionalmente relacionados formando estén funcionalmente relacionados formando parte del mismo proceso biológicoparte del mismo proceso biológico..

GeneChip®: La tecnología de AffimetrixGeneChip®: GeneChip®: La tecnología de La tecnología de AffimetrixAffimetrixSondas:SondasSondas::

Para cada secuencia existen dos sondas, una de homología perfecta de 25 b y otra con una mutación en la zona central. Para cada secuencia existen dos sondas, una de homología perfectPara cada secuencia existen dos sondas, una de homología perfecta a de 25 b y otra con una mutación en la zona central. de 25 b y otra con una mutación en la zona central.

20 parejas de sondas específicas por cada gen. Sobrerrepresentación extremos 3´de los ARNm y seleccionadas para maximizar las temperaturas de hibridación y la especificidad.

20 20 parejas de sondas específicas por cada gen. parejas de sondas específicas por cada gen. SobrerrepresentaciónSobrerrepresentación extremos 3´de los ARNm y seleccionadas extremos 3´de los ARNm y seleccionadas para maximizar las temperaturas de hibridación y la especificidapara maximizar las temperaturas de hibridación y la especificidad.d.

Por cada sonda hay Por cada sonda hay Por cada sonda hay

107 moléculas 10 1077 molmoléculaséculas

10µm x 10µm1010µµm x 10m x 10µµmm

ChipChipChip

Hasta to 4 x 105

posicionesHasta Hasta to 4 x 10to 4 x 1055

posicionesposiciones1.3cm x 1.3cm1.3cm x 1.3cm1.3cm x 1.3cm

La presencia de numerosos genes de control permite una casi perfecta normalización entre diferentes experimentos.La presencia de numerosos genes de control permite una casi La presencia de numerosos genes de control permite una casi perfecta normalización entre diferentes experimentos.perfecta normalización entre diferentes experimentos.

Síntesis In situ sobre una superficie de cristalSíntesis Síntesis In situIn situ sobre una superficie de cristalsobre una superficie de cristal

GeneChip®: La tecnología AffimetrixGeneChip®: GeneChip®: La tecnología La tecnología AffimetrixAffimetrix

Síntesis In situ mediante fotolitografía(1)Síntesis Síntesis In situIn situ mediante fotolitografíamediante fotolitografía(1)(1)

1. Caviani Pease, A. et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91; 5022-5026.1. Caviani Pease, A. 1. Caviani Pease, A. et al.,et al., (1994) (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USAProc. Natl. Acad. Sci. USA 91;91; 50225022--5026.5026.

Superficie de cristal tratada con un grupo protector

fotolábil

Superficie de cristal tratada Superficie de cristal tratada con un grupo protector con un grupo protector

fotolábilfotolábil

Desprotección por iluminación a través de la

fotomáscara

Desprotección por Desprotección por iluminación a través de la iluminación a través de la

fotomáscarafotomáscara

Acoplamientoquímico

AcoplamientoAcoplamientoquímicoquímico

LavadoLavadoLavadoAdición de una

sopa de un nucleótido específico

Adición de una Adición de una sopa de un sopa de un nucleótido nucleótido específicoespecífico

2525cciiclclooss

Sondas:SondasSondas::

Fotomáscara

Imagen de intensidad de FluorescenciaImagen de intensidad de FluorescenciaImagen de intensidad de Fluorescencia

Probe PairProbe PairProbe Pair No hibridaciónNo hibridaciónNo hibridaciónHibridación correctaHibridación correctaHibridación correcta

Oligo hibridación perfectaOligo Oligo hibridación perfectahibridación perfectaOligo con mutación en la mitadOligo Oligo con mutación en la mitadcon mutación en la mitad

1 Gene1 Gene1 Gene

Vista magnificada de un GeneChipde ratón con 6,000 genes

Vista magnificada de unVista magnificada de un GeneChipGeneChipde ratón con de ratón con 6,000 genes6,000 genes

Secuencia de referenciaSecuencia de referenciaSecuencia de referencia


1. Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) Methods 10; 283-288.1. Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) 1. Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) MethodsMethods 10;10; 283283--288.288.

Dianas:DianasDianas:: ARNc fragmentados y biotinilados complementarios aislados después de amplificación

lineal

ARNc ARNc fragmentados y fragmentados y biotinilados biotinilados complementarios aislados después de amplificación complementarios aislados después de amplificación

lineal lineal

HibridaciónHHibridaciónibridaciónTTTTTnTTTTTTTTTTnnAAAAAnAAAAAAAAAAnn

T7T7T7


AAAAAAAAAAAAAAAARNm (0.2-1µg)ARNmARNm (0.2(0.2--11µµg)g) 5’- TTTTTn-3’5’5’-- TTTTTTTTTTnn--3’3’T7T7T7

Síntesis de la cadena + del ADNcSíntesis de la cadena + del Síntesis de la cadena + del ADNcADNcUsandoUsandoUsando

Síntesis de la segunda cadena del ADNcSíntesis de la segunda cadena del Síntesis de la segunda cadena del ADNcADNc

T7T7T7AAAAAAAAAAAAAAATTTTTnTTTTTTTTTTnn

Transcripción In Vitro utilizando T7 ARN polimerasa y Biotin -UTP & -

CTP (amplificación x20-50)

Transcripción Transcripción In Vitro In Vitro utilizandoutilizando T7 T7 ARN ARN polimerasapolimerasa yy Biotin Biotin --UTP & UTP & --

CTPCTP (amplifica(amplificacciióón x20n x20--50)50)

UUUUUnUUUUUUUUUUnnUUUUUnUUUUUUUUUUnnUUUUUnUUUUUUUUUUnnUUUUUnUUUUUUUUUUnn

Fragmentación de los ARNcFragmentación de los Fragmentación de los ARNcARNc

UUUU

U n

UUU

UUUU

UUUnnUU

UUUn

UUUUUUUU

UUnn

Hibridación 16hrs a 40-45°CHibridaciónHibridación 16hrs a 4016hrs a 40--45°C45°C

15µg de ARNc fragmentado1515µµg g de de ARNc ARNc fragmentadofragmentado

Cocktail de ARN controlCCocktailocktail de ARN controlde ARN control(Estándares)((EstándaresEstándares))

GeneChip fluidicsGeneChip fluidicsGeneChip fluidics

Procedimiento automatizado de lavado y marcaje

Procedimiento automatizado de Procedimiento automatizado de lavado y marcajelavado y marcaje

Station 400Station 400Station 400

Amplificación con oligos biotinilados y captura con

estreptavidina-Ficoeritrina

AmplificaAmplificación ción con con oligos oligos biotinilados biotinilados y captura con y captura con

estreptavidinaestreptavidina--FicoeritrinaFicoeritrina

EscánerEscánerEscánerHP GeneArrayHP GeneArrayHP GeneArrayscannerscannerscanner

Análisis de datosAnálisis de datosAnálisis de datos

GeneChip SoftwareGeneChip SoftwareGeneChip Software

Cuantificación de los datosCuantificación de los datosCuantificación de los datos

Normalización de los ChipsNormalización de los Normalización de los ChipsChipsCon estándaresCon estándaresCon estándares


VentajasVentajasVentajas Problemas:ProblemasProblemas::Diseño rígido (fotomascaras)Diseño rígidoDiseño rígido ((fofotomastomascaras)caras)

Sondas diseñadas sólo para genes conocidos o ESTs.Sondas diseñadas sólo para genes Sondas diseñadas sólo para genes conocidos o conocidos o ESTsESTs..

Pocos tipos de arrays en el mercadoPocos tipos de Pocos tipos de arrays arrays en el mercadoen el mercado

Detalles importanes no accesibles al usuario (normalización steps, secuencias de los oligos)

Detalles Detalles importanes importanes no accesibles al no accesibles al usuariousuario (normaliza(normalizacciióón stepn steps, s, secuencias de los secuencias de los oligosoligos))

Carísimo (GeneChips®, equipo: fluidics station, escáner, etc...)CarísimoCarísimo (GeneChips®, (GeneChips®, equipoequipo: : fluidics station, fluidics station, escánerescáner, etc...), etc...)

Las sondas permiten una hibridación específica (discriminación entre miembros de una misma familia, variantes de splicing, mutantes, etc.)

Las sondas permiten una hibridación Las sondas permiten una hibridación específica (discriminación entre específica (discriminación entre miembros de una misma familia, miembros de una misma familia, variantes de variantes de splicingsplicing, mutantes, etc.), mutantes, etc.)

Perfecto para caracterización a gran escala de Polimorfismos Simples de Nucleótido (SNP)

Perfecto para caracterización a gran Perfecto para caracterización a gran escala de Polimorfismos Simples de escala de Polimorfismos Simples de Nucleótido (SNP)Nucleótido (SNP)

La fabricación mediante fotolitografía elimina la contaminación y minimiza la variabilidad entre lotes.

La fabricación mediante fotolitografía La fabricación mediante fotolitografía elimina la contaminación y minimiza la elimina la contaminación y minimiza la variabilidad entre lotes. variabilidad entre lotes.

Perfecto para genomas completamente secuenciados (ex.: E. coli, S. Cerevisiae, H.sapiens)

Perfecto para genomas Perfecto para genomas completamente secuenciadoscompletamente secuenciados (ex.: (ex.: E. E. colicoli, , S. CerevisiaeS. Cerevisiae, H., H.sapienssapiens))

Sensibilidad reducida debido al tamaño de los oligosSensibilidad reducida debido al Sensibilidad reducida debido al tamaño de los tamaño de los oligosoligos


Microarrays de ADNcMicroarrays de Microarrays de ADNcADNc

Microarrays de ADNc (1)Microarrays de ADNc Microarrays de ADNc (1)(1)

Control de calidadControl de calidadControl de calidad

Análisis datosAnálisis datosAnálisis datos

Amplificación por PCRAmplificación por PCRAmplificación por PCRGenoteca de ADNcGenoteca de ADNcGenoteca de ADNc

ScanningScanningScanning

↖↖↖

Toma de datosToma de datosToma de datosCy5Cy5Cy5

Cy3Cy3Cy3 Combinación De datos

CoCombinación mbinación De datosDe datos

Impresión robotizadaImpresión robotizadaImpresión robotizada

1. Schena, M. et al., (1995) Science 270; 467-470. 1. Schena, M. 1. Schena, M. et al.,et al., (1995) (1995) ScienceScience 270;270; 467467--470. 470.

HibridaciónHHibridaciónibridación

DianasDiDianasanas

InterpretaciónInterpretaciónInterpretación


Tecnologías de impresión de ADNTecnologías de impresiónTecnologías de impresión de ADNde ADN

Efecto piezoeléctricoEfecto piezoeléctricoEfecto piezoeléctrico

CapilaridadCapilaridadCapilaridad

Tecnologías de impresión de ADNTecnologías de impresiónTecnologías de impresión de ADNde ADN MecánicasMecánicasMecánicas

Ink-jetInkInk--jetjetEfecto piezoeléctricoEfecto piezoeléctricoEfecto piezoeléctrico

Agilent Technologies®Agilent Technologies®

Pin and RingPin and RingPin and Ring

GeneticMicrosystems®

GeneticGeneticMicrosystems®Microsystems®

Telechem International®Telechem International®Telechem International®

CapilaridadCapilaridadCapilaridad


Tamaño del lunarTamaño del lunarTamaño del lunar Ink-jet: 250-1000 lunares/cm2InkInk--jet: jet: 250250--1000 1000 lunareslunares/cm/cm22

Mechanical: >2500 lunares/cm2Mechanical: Mechanical: >2500 >2500 lunareslunares/cm/cm22Ø: 100 - 300 µmØ: 100 Ø: 100 -- 300 300 µµmm

150 - 300 µm150 150 -- 300 300 µµmm

Cantidad ADN:Cantidad ADN: <10pg de ADN (<100pl)<10pg <10pg de ADNde ADN (<100pl)(<100pl)

Marcaje:Marcaje: Fluorescencia Fluorescencia Fluorescencia Radioactividad(1)RadioactiviRadioactividaddad(1)(1)

Cy3 vs Cy5Cy3 vs Cy5Cy3 vs Cy5 3H vs 35S or 33P or 14C33H vs H vs 3535S or S or 3333P or P or 1414CC

1. Salin H. et al., (2000) J. Histochem Cytochem. 48; 1587-1592.1. 1. Salin H. Salin H. et al.,et al., (2000) (2000) J. Histochem Cytochem.J. Histochem Cytochem. 48;48; 15871587--1592.1592.

Estreptavidina, etc...EEsstreptavidina, etc...treptavidina, etc...

Tipo de sustratoTipo de sustrato PolyLisinaPolPolyyLLiisinsinaaSilanoSilSilanoanoSuperaldehidoSuperaldehidSuperaldehidoo Portas recubiertosPortas rPortas recubiertosecubiertos

Membrana de Nylon Membrana de Nylon Membrana de Nylon


EspaciadoEspaciadoEspaciado

Marcaje directo de los ARNMarcaje directo de los ARNMarcaje directo de los ARN

Muestra 1MuestraMuestra 11 Muestra 2MuestraMuestra 22

Extracción ARN totalExtracción ARN totalExtracción ARN total

Purificación ARNmPPurificación ARNmurificación ARNm

Retrotranscripcióny marcaje

ReRetrotranscripcióntrotranscripcióny marcajey marcaje

Opcional

Opcional

OpcionalCy3-dU

TP

Cy5Cy5 -- dU

TPdU

TP

vice-versavicevice--versaversayyy

Microarrays de ADNc: estrategiasMicroarrays de ADNcMicroarrays de ADNc: estrategias: estrategias

Etiquetado químicoEtiquetado químicoEtiquetado químico

Marcaje indirecto de los ARNMarcaje indiMarcaje indirecto de los ARNrecto de los ARN

Muestra 3MuestraMuestra 33 Muestra 4Muestra 4Muestra 4

RetrotranscripciónRetrotranscripciónRetrotranscripción

Optional

Optional

Optional aa-dUTPaaaa--dUTPdUTP

Purificación ADN marcadoPurificación ADN marcadoPurificación ADN marcadoNHS-Cy3NHSNHS--Cy3Cy3NHS-Cy5NHSNHS--Cy5Cy5

NHS-Cy3NHSNHS--Cy3Cy3NHS-Cy5NHSNHS--Cy5Cy5

Extracción ARN totalExtracción ARN totalExtracción ARN total

Purificación ARNmPPurificación ARNmurificación ARNmHibridaciónHHibridaciónibridación

LavadoLavadoLavado

LecturaLecturaLectura

PurificaciónPurPurificaciónificación

Microarrays de ADNc: Ejemplo respuesta

celular a mitogénicos

Microarrays de ADNc: Ejemplo respuesta

celular a mitogénicos

Respuesta transcripcional al sueroexperimentos por triplicado:identificación de patrones comunesde comportamiento:DIME CON QUIÉN VAS Y TE DIRÉ QUIEN ERES!!

Alg

orit

mo

gené

tico

Microarrays de ADNc: último paso!!CLUSTERING DE LOS DATOS

Microarrays de ADNcMicroarrays de ADNc: último paso!!: último paso!!CLUSTERING DE LOS DATOSCLUSTERING DE LOS DATOS

Uso de oligos específicos de cada gen (uno al menos)Uso de oligos específicos de cada gen (uno al Uso de oligos específicos de cada gen (uno al menos)menos)

Contaminación de las sondasContaminación de las sondas

1. Halgren, R.G. et al., (2001) Nucleic Acids Res. 29; 582-588.1. 1. Halgren, R.G. Halgren, R.G. et al.,et al., (2001) (2001) Nucleic Acids Res.Nucleic Acids Res. 29;29; 582582--588.588.

Las genotecas de ADNc comerciales están contaminadas (ex.: I.M.A.G.E. Consortium(1))Las genotecas de ADNc comerciales están Las genotecas de ADNc comerciales están contaminadas contaminadas (ex.: I.M.A.G.E. Consortium(ex.: I.M.A.G.E. Consortium(1)(1)))

Amplificación con una sola pareja de oligosAmplificación con una sola pareja de oligosAmplificación con una sola pareja de oligosNecesidad de verificar por secuenciaciónNecesidad de verificar por secuenciaciónNecesidad de verificar por secuenciación

Inserto de ADNcInserto de ADNcInserto de ADNcPlasmidoPlasPlasmidomido PlásmidoPlásmPlásmidoidoHHH

111AAA

121212

Microarrays de ADNc: problemasMicroarrays de ADNcMicroarrays de ADNc: problemas: problemas

Placa de 96 pocillos

Impresión robotizada

Diferentes tecnologíasDisparidad entre las

puntas

IImpresión mpresión robotizadarobotizada

DifDiferentes tecnologíaserentes tecnologíasDiDisparidad entre las sparidad entre las

puntaspuntas

Diferente eficiencia en la incorporación de Cy-dUTP Diferente eficiencia en la Diferente eficiencia en la incorporación de Cyincorporación de Cy--dUTP dUTP Diferentes propiedades

espectralesDifDiferentes propiedades erentes propiedades

espectralesespectrales

¡Variabilidad entre arrays!¡¡VariaVariabilidad entre arrays!bilidad entre arrays!

Hibridación de muestra control y problema sobre el mismo arrayHibridación de Hibridación de muestra control y problema sobre el mismo arraymuestra control y problema sobre el mismo arrayUso de dos fluorocromos diferentes(Cy3 and Cy5)UsUso de dos fluorocromos diferenteso de dos fluorocromos diferentes(Cy3 and Cy5)(Cy3 and Cy5)

↖↖↖↖↖↖

Marcaje indirecto(fluorocromos con aminoallyl-

dUTP y NHS-Cy)

Marcaje indirecto(fluorocromos con aminoallyl-

dUTP y NHS-Cy) Intercambiar muestras y

fluorocromosIntercambiar muestras y

fluorocromos

Problemas: Variabilidad en el sustratoProblemas: Variabilidad en el sustratoPortas

Diferentes tipos de sustratos

Variabilidad entre portas preparados a

la vez

PortasPortasDifDiferentes tipos de erentes tipos de

sustratossustratosVariaVariabilidad entre bilidad entre

portas preparados a portas preparados a la vezla vez


HibridaciónHibridación

SensibilidadSensibilidad

2. Matz, M. et al., (1999) Nucleic Acids Res. 27; 1558-1560.2. 2. Matz, M. Matz, M. et al.,et al., (1999) (1999) Nucleic Acids Res.Nucleic Acids Res. 27;27; 15581558--1560.1560.

AAAAAAAAAAAAAAAARNm (1-2µg)ARNm ARNm (1(1--22µµg)g)

UUUUUnUUUUUUUUUUnnCCCCCCCCCUUUUUnUUUUUUUUUUnnCCCCCCCCC

UUUUUnUUUUUUUUUUnnCCCCCCCCCUUUUUnUUUUUUUUUUnnCCCCCCCCC

Transcripción in vitro(T7 ARNpolimerasa) (x20-50)

Transcripción in vitroTranscripción in vitro(T7 (T7 ARNARNpolpolimerasaimerasa)) (x20(x20--50) 50)

&&&

1. Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) Methods 10; 283-288.1. 1. Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) MethodsMethods 10;10; 283283--288.288.

5’- TTTTTn-3’5’5’-- TTTTTTTTTTnn--3’3’Síntesis ADNcSíntesis ADNcSíntesis ADNc

usandouusandosandoyyy

T7T7T7

5’- GGG-3’5’5’-- GGGGGG--3’3’TSTSTS

T7T7T7AAAAAAAAAAAAAAA

CCCCCCCCC

TTTTTnTTTTTTTTTTnn

EfectoTemplate-Switching(2)EfectoTemplate-Switching(2)

T7T7T7AAAAAAAAAAAAAAATTTTTnTTTTTTTTTTnnCCCCCCCCC

GGGGGGGGGTSTSTS

T7T7T7TTTTTnTTTTTTTTTTnnCCCCCCCCCGGGGGGGGGTSTSTS AAAAAnAAAAAAAAAAnn

Síntesis de la segunda cadena del ADNc con TAQ polimerasaSíntesis Síntesis de la segunda cadena del ADNc con TAQ polimerasade la segunda cadena del ADNc con TAQ polimerasa

UUUUUnUUUUUUUUUUnnCCCCCCCCCTranscripción usando hexameros

aleatorios & aa-dUTP TranscriTranscripción usando pción usando hexameroshexameros

aleatoriosaleatorios & aa& aa--dUTP dUTP

Purificación y etiquetado químico Cy3 & Cy5

Purificación y etiquetado Purificación y etiquetado químico químico Cy3 & Cy5Cy3 & Cy5

Amplificación de dianas(1)Amplificación de dianas(1)


Transcriptoma:(Sin hipótesis)TranscriptomTranscriptomaa::(Sin hipótesis)(Sin hipótesis)

Perfil de expresión global del genomaIyer, V.R. et al., (1999) Science 283; 83-87. Hughes, T.R. et al., (2000) Cell 102; 109-126.

PerfPerfil de expresión global del genomail de expresión global del genomaIyer, V.R. et al., (1999) Science 283; 83-87. Hughes, T.R. et al., (2000) Cell 102; 109-126.

Microarrays de ADNc: aplicacionesMicroarrays de ADNcMicroarrays de ADNc: aplicaciones: aplicaciones

Expediciones de Expediciones de pesca:pesca:(Con hip(Con hipótesisótesis))

BBúsqueda de genes implicados en procesos úsqueda de genes implicados en procesos biológicos o condiciones experimentales de biológicos o condiciones experimentales de interés (pe. tratamiento hormonal, tumores, interés (pe. tratamiento hormonal, tumores, factores de crecimiento, etc.factores de crecimiento, etc.))Ren, B. et al., (2000) Science 290; 2306-2309.Pollack, J.R. et al., (1999) Nature Genet. 23; 41-46.

Drug-discoveryDrugDrug--discoverydiscovery

Scherf, U. et al., (2000) Nature Genet. 24; 236-244.

Identificación dianas terIdentificación dianas terapéuticas, apéuticas, farmacogenéticafarmacogenética, etc..., etc...

Aplicaciones Microarrays de ADNAplicaciones Microarrays de ADNAplicaciones Microarrays de ADN

Entradas

Tejidos normalesTejidos normalesTejidos enfermosTejidos enfermos

Compuestos a evaluarCompuestos a evaluar

Medidaexpresión génicacon Microarrays

SalidasPrognosisPrognosisDiagnosisDiagnosisPatologíaPatologíaDianas drogasDianas drogasEficacia drogasEficacia drogasToxicologíaToxicologíaDetección Detección mutacionesmutaciones

Introducción a la genómica funcional - ujaen.es · Mus musculus 3.2 Gbp (100--15% 5%...

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