FUNDAMENTOS EN CROMATOGRAFÍA DE GASES Y GASES DE MASAS

Manuel Gayo González

Responsable de Ventas Universidad

Consultor LCMSQQQ&GCQQQ

Universidad Europea de Madrid, 15 Octubre 2010

Introducción a la cromatografía de gases

La cromatografía es un método de separación físico.

En cromatografía de gases, los componentes a separar se distribuyen entre dos fases: una fase estacionaria y una fase móvil .

Los componentes se separan debido a la diferencia de afinidad con la faseestacionaria.

La fase móvil introduce los analitos en la columna y a través del sistema.

Como fáse móvil se utilizan gases inertes (gas portador).

Definición de Cromatografía de gases

Esquema típico de un sistema de GC

Componentes

Gases Sistema para introducción de la muestra Columna Detector Adquisición de datos

Componentes

GasesGas portador:

- transporta la muestra a través del sistema.- Su selección y velocidad influye en la eficiencia y el tiempo de retención.

Gases del detector: Soporte para ciertos detectores, ej. FID.

Componentes

Sistema de introducción de la muestra:Introducción de la muestra en la corriente del gas portador con mínimas variacionesen la corriente de gas.

-Rápido-Reproducible-Sin pérdida de eficacia.-Muestra representativa

Componentes

Columna: Logra la separación de los componentes de la muestra.

Detector:Reconoce y responde a alguna propiedad de los componentes de la muestra a medidaque eluyen de la columna.

Adquisición de datos: Convierte la señal del detector en un cromatograma y permite la determinación manual o automatizada de la identidad y cantidades de los componentesde la muestra.

AIR

CA

RR

IER

GA

S

HY

DR

OG

EN

MOL-SIEVE

TRAPS

FIXED

RESTRICTORS

FLOW

CONTROLLER

INJECTION

PORTREGULATORS

DETECTOR

ELECTROMETER

RECORDER/

INTEGRATOR

COLUMN

Cromatógrafo de gases típico

Consideraciones generales en GC

• Temperatura: Implica un peso molecular límite

CarrierGas Column

Data

System

Heated to VaporizeSample

Heated toKeep Clean

Heated toControl Separation

Integrator

Column

Detector

InjectionPort

• Instrumento presurizado: Las fugas son problemáticas.

Consideraciones generales de los tipos de muestra

Requirimientos de la muestra en cromatografía de gases

•Suficiente Volatilidad: Las macro moléculas generalmente no tienensuficiente volatilidad (no pasan a fase gas en las condiciones instrumentales).

•Libre de residuos: Esta es una extensión del primer requerimiento. Las impurezas no volátiles en la matriz de la muestra puede derivar en contaminación del inyector y columna que degradará rápidamente la cromatografía.

•Estabilidad térmica: Los compuestos de interés no se deben degradarcuando se introducen en el inyector a alta temperatura (por encima de 300°C) o en la columna (por encima de 350°C).

El 10-20% de todos los compuestos son adecuados para análisis por GC

Papel de la muestra

Tipo de gas portador Tipo de inyector de la muestra Tipo de columna Tipo de detector

La muestra determina la configuración del instrumento, es decir:

Tipos de columnas

Longitud (metros)

D.I. (mm)

0.5-10

2-4

5-100

0.53

5-100

0.1-0.25

EMPAQUETADA SERIES 530 NARROW BORE

Empaquetadas Capilares

Tubo abierto

con

recubrimiento

Columnas capilares

Comparación de los tipos de columna

124

56

8

9

10

11&12

7

12

456

9

10117&8

12

Columna empaquetada:

Semi-Capilar

Capilar

5% OV101

sobre 80/100 Chromosorb

30m X 0.53mm X .88

30m X 0.32mm X .25

Muestra para evaluación de columna

Modelo del proceso cromatográfico

B

Separación de compuestos

Flujo

A

C

D

Tiempo de retención

tr: Tiempo de retención. Tiempo que tarda un analito en salir de la columna

tr’: Tiempo de retención relativo. Tiempo que un analito pasa en la fase estacionaria

tm: Tiempo muerto ( se conoce también como tiempo de retención de un compuesto no

retenido). Tiempo que tarda en salir de la columna un compuesto no retenido.

Resolución

• Depende de tres parámetros:

– Factor de Retención (k)

– Selectividad ( )

– Eficacia (N)

• Si los tres son correctos tendremos separación en línea base.

• Los tres parámetros son independientes entre sí y se pueden ajustar.

Factor de retención (k)tr(B)

Soluto A Soluto B

tt‘r(A) = tr(A) – tm

k(A) = t'r(A) / tm

t = tr(B) - tr(A)

Time

Inyección

tr(A)

t’r(B)

t’r(A)

tm

Retention Time of

Unretained

Compound

k es inversamente proporcional a la temperatura de la columna

Selectividad

Inyección

Soluto A Soluto B

TIME > 1.05 son deseables para Columnas Capilares> 1.2 son deseables para Columnas empaquetadas

=t’r(B)

t’r(A)

k(B)

k(A)

=

tm

t’r(B)

t’r(A)

depende de la fase estacionaria

Eficiencia

Inyección

W h

Wb

Número de platos teóricos (N)

Altura equivalente de plato teórico (HETP)

HETP HLc

N

N 16tR

wb

2

5.545tR

wh

2

tm

tr

t’r

Es deseable el mayor valor N posible

t

Wb(1) Wb(2)

RS

t

12

Wb(1) Wb(2)

RS = 1.17 x [ t / (Wh1 + Wh2)]

Wh1Wh2

Resolución (Ecuación gráfica):Función del factor de retención, selectividad y eficiencia.

• La resolución depende de tres factores: k, , & N.

• Todos estos factores son necesarios para conseguir buena separación en línea base.

Factor de retención

(Temperatura)

Selectividad

(fase estacionaria)

Eficiencia

(Lc, Dc,

4

1

1

N

k

kRs

Resolución: Resumen

Simetría de pico

Gases portadores y de soporte del detector

Los gases deben:

o Elegirse considerando el tipo de detector utilizadoo Ser inerteso Secoso Puros

Para la utilización del gas comprimidocon seguridad:

Seguir las normas de seguridad del Dpto. de seguridad de la empresa o

las suministrada por el proveedor local

Los gases portadores más comunes son N2, He, H2.

Gases portadores

Su selección y velocidad influye en la eficiencia y el tiempo de retención.

Curvas de Van Demmter

Tipos de inyectores en GC.

Sistemas de inyección

Permiten introducir la muestra en el cromatógrafo de manerarepetitiva y reproducible. La muestra debe ser representativa y debe inyectarse sin que haya cambios químicos.

Tipos de inyectores:•Split/Splitless - EPC y no EPC•Empaquetadas con purga (Purged Packed) -EPC y no EPC•Refrigeración en columna (Cool on-column) - EPC•Vaporización a temperatura programada PTV y MMI - EPC

Inyector “Split/Splitless” (con/sin división)

Modo “Split” Análisis de comp. principales

Modo “Splitless” Análisis de trazas de comp.

“Split” a pulsos Permite un volúmen de inyección mayor

“Splitless” a pulsos Permite un volúmen de inyección mayor

Diagrama de flujo “Split” (con división): Pre-Inyección

SELLO

(ENTRADA)

(SEPTUM)

SALIDA DE SPLIT

FLUJO TOTAL

COLUMNA

SEPTUM

GAS PORTADOR

ALINEADOR

50 ml/min

2 ml/min

0.6 ml/min

48 ml/min

47.4 ml/min

SALIDA DE PURGA

VALVULA DE PURGA

Diagrama de flujo “Split”: Inyección de muestra

(ENTRADA)

(SEPTUM)

SALIDA DE SPLIT

FLUJO TOTAL

COLUMNA

= GAS PORTADOR

VALVULA DE PURGA

SALIDA DE PURGA

REL. SPLIT = FLUJO EN COLUMNA + SALIDA SPLIT

FLUJO EN COLUMNA

= MOLECULAS DE MUESTRA LÍQUIDA

Diagrama de flujo “split”: Vaporización de la muestra

(ENTRADA)

(SEPTUM)

SALIDA DE SPLIT

FLUJO TOTAL

COLUMNA

= GAS PORTADOR

= MOLECULAS DE MUESTRA

= MOLECULAS DISOLVENTE

SALIDA DE PURGA

VALVULA DE PURGA

La vaporización tiene lugar cuando se

transfiere suficiente energía térmica a la

muestra. Esto puede ocurrir en el gas

portador, pero es más probable durante

el contacto con una superficie sólida,

como el alineador o el medio de mezcla.

Típicamente los inlets se mantienen a temperaturas elevadas (>175°C hasta350°C dependiendo de la temperatura de vaporización de la muestras

Diagrama de flujo “split”: Mezcla Muestra/Gas

(ENTRADA) VALVULA DE PURGA

(SEPTUM) VALVULA DE PURGA

VALVULA DE SPLIT

FLUJO TOTAL

COLUMNA

Para que el concepto de SPLIT RATIO (Relación de Split) sea válido, la muestra (disolvente + analito) debe mezclarse con el gas portador y generar una mezcla homogénea.

Al fondo del puerto de inyección, una pequeña parte de esta mezcla se transferirá a la columna, mientras el exceso de la mezcla salga del cromatógrafo por la Salida de “SPLIT”

= GAS PORTADOR

= MOLECULAS DE MUESTRA

= MOLECULAS DE

DISOLVENTE

Diagrama de flujo en el Splitless•La vávula de purga está cerrada durante la inyección (no hay flujo en la válvula de split)•En un tiempo específico después de la inyección, la válvula de purgase abre para eliminar vapores remanentes en el inlet.

Injection Solvent Effect:Initial oven temperature is maintained below the boiling point of the solvent causing the solvent to condense at the head of the column "swelling" the stationary phase and trapping the analyte.

SOLVENT BOILING POINT INITIAL OVEN TEMP

( ºC) ( C)o

DICHLOROMETHANE

CHLOROFORM

CARBON DISULFIDE

DIETHYL ETHERPENTANEHEXANE

ISO-OCTANE

40

61

46

35

36

69

99

10-30

25-50

10-35

10-25

10-25

40-60

70-90

S

SS

SS S

S S SS

S S

SS

S SS S

S

S

S

S

S

S SS

SS

S

S

S

SS

SS

S S SS

S

SSS

S

S

S

S

S

S

S

S SS

S SS

S

S

SS

S

AA

A AA

A

A

A AAA

A

A

AA

A = ANALYTE

S = SOLVENT

Los liners más utilizados

@Consultar el catálogo de Columnas y Consumibles de Agilent Technologies:

4-mm di 1000-ul volumen

nominal, vidrio

borosilica- to (no tratado),

tapón de lana de vidrio

silanizada

Modos Split y splitless,

especialmente

recomendados para

inyecciones rápidas con el

Inyector Automatico 7673

19251-60540Split/Splitless

Alineadores: No tratados

Configuración

Uso recomendado

HP Ref.Tipo

4-mm di, volúmen

nominal 900 ul, vidrio

borosilicato (desacti-

vado), lana de vidrio

silanizada (desactivada)

Modos Split y splitless.

Puede estar medio

empaquetada.

5062-3587Empaquetada

Alineadores: Desactivados

Lana vidrio grado pesticidas5181-8818

4-mm di, volúmen

nominal 900 ul,

vidrio de borosili-

cato (desactivado)

5181-3316No empaquetada, Modos Split y splitless.

Puede estar medio

empaquetada.

cónica

cónica

http://www.chem.agilent.com/en-US/Search/Library/_layouts/Agilent/PublicationSummary.aspx?whid=57180&liid=56

Expansión de disolventes comunes

Cálculo del volumen de expansión

Solvent Vapor Volume Calculator

http://www.chem.agilent.com/en-US/Support/Downloads/Utilities/Pages/GcPressureFlow.aspx

- Capacidad de programación de temperatura

- Flexibilidad en los volúmenes de inyecciónAnálisis de muestras termolábiles y mínima discriminación en la inyección

para compuestos con alto peso molecular

- Mayor sensibilidad en inyecciones de gran volumen

- Disminuye pasos de preparación de muestraMayor productividad

Nuevo Inyector Multimodo para

muestras con alto contenido en matriz

Inyección cold Splitless 4 µL

Temperatura de la fuente 350⁰ C

Inyección Solvent Vent 5 µL

Temperatura de la fuente 350⁰ C

Inyección Splitlless 250⁰C 3µL

Temperatura de la fuente 280⁰ C

Patrón directo compuesto por 56 compuestos:

17 Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (PAHs)

23 Pesticidas Organoclorados (POCs)

6 Pesticidas Nitrogenados, Triazinas

10 Hidrocarburos Clorados

MMI en la práctica

INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFÍA DE GASES MASAS

ACOPLAMIENTO GC/MS

La espectrometría de masas es una técnica analítica muy potente utilizada para: Identificar compuestos desconocidos. Cuantificar compuestos conocidos. “Elucidar la estructura química de las moléculas”.

220 Trampa de Iones

240 Trampa de Iones

Comparación Detectores de Cromatografía de Gases

El Detector Selectivo de

Masas (MSD) es a la vez:

Universal (trabajando con

barridos completos - modo SCAN)

Específico y muy sensible

(trabajando con iones selectivos -

modo SIM)

FPD(S)

NPD(P)

NPD(N)

ECD

FID

TCD

MSD

(SIM) (SCAN)

10-15

fg

10-12

pg

10-9

ng

10-6

µg

10-3

mg

1ppb = 1 pg / µl 1ppm = 1 ng / µl

Proceso de Ionización por Impacto Electrónico (EI)

m/z

C

AAC

AB

ABC+

+

++

+

Abundancia

Señal.

Espectro de Masas

0 10 70 100

eV

Energía de los electrones

#ABC del producto (ABC)

La curva depende

+.

Ionización:

ABC+.

ABC

Molécula Neutra Ión Molecular Excitado

- 2e -+ +e

Fragmentación:

(pérdida de un neutro)

AB.

+ C (reordenamiento)

A+ABC +. +C

+ BC .

etc.

+.AB

+

+ B+AC.

Diagrama de un Espectrómetro de Masas

Fuente de Iones Analizador Detector

de Iones

Sistema de Datos

Espectro de Masas

Sistema en Vacío

Inyector

Introducción de la Muestra:

GC/MS - LC/MS - Directa

Componentes Fuente de Iones

Foco de

electronesLentes de

entrada

Lentes "Draw-Out"

Lentes de

focalización de

iones

"Target"

"Repeler"

Línea de

transferencia de

columna

Filamento

" Magnet"

(imán

colimador)

*-->

Cuadruplo

"Empuja" los electrones hacia

fuente de iones

Target: "Atrae" los electrones ionizantes hacia la fuente

Filamento: Proporciona electrones para la ionización

Foco de electrones:

Magnet: Controla la forma del haz de electrones

ionizantes

Repeller: "Empuja" los iones formados fuera de la fuente

Lentes "Draw-Out": "Arrastra" a los iones fuera de la

fuente

Actua como apertura de entrada

al juego de lentes de focalización

Lentes de focalización

de iones:Focaliza los iones hacia las lentes

de entrada

Lentes de entrada Focaliza los iones hacia el campo

del cuadrupolo

Analizador-Filtro de Masas

AMPLITUD AMPLITUD RF

ELECTRODOS NEGATIVOS

-DC

-

0

+

( + )

FILTR0

MASAS

BAJAS

( -

) F

ILT

RO

MA

SA

S

ALTA

S Los voltajes aplicados en ambos pares de

electrodos son iguales en magnitud pero de

signo opuesto. La magnitud del potencial DC

controla la masa seleccionada

ELECTRODOS POSITIVOS

-

0

+

AMPLITUD RF

AMPLITUD

+DC

FRECUENCIA

RF

2 pares de electrodos Hiperbólicos

("rods") a los que se aplica una

componente de corriente alterna y otra de

continua de igual magnitud pero de signo

opuesto

Barrido de Masas (modo "SCAN") con Cuadrupolo

Para barrer un rango de masas, los potenciales de DC y RF aplicados al cuadrupolo han de ser

variados, para variar las masas que son filtradas. La relación entre los potenciales RF y DC es la

llamada LINEA DE BARRIDO.

La magnitud del potencial DC controla la masa seleccionada,

LINEA DE

BARRIDO

BARRIDO- ELECTRODOS POSITIVOS

+

0

-

AMPLITUD

DC

TRABAJO EN MODO SCAN

AMPLITUD

RF

Amplitud RF/ DF = cte.

Detector de Iones:Electromultiplicador

(-1200V TO -3000V)

+ + ++

SEÑAL

E.M. VOLTS (CDEM)

QUADS

+

+

+

Los multiplicadores son capaces de aumentar la corriente por un factor de 1,000,000 pero el rango

de trabajo típico es de 100,000.

El tamaño de la señal (y ruido) es función del voltaje del EM, cuanto mayor es el voltaje mayor

es la señal.

El EM tiene un tiempo de vida finito. Este tiempo de vida es función de la corriente de salida,

cuanto mayor es ésta, menor es el tiempo de vida del EM.

Espectro de Masas

20 40 60 80 100 120 140 160 180

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Abundance

29

43

55

57

71

85

98 113128 141 159

170

m/z->

Average spectrum of dodecane from EVALDEMO.D

M

<--[C H ] +

+.13

<--[C H ]11

<--[C H ]4

+

+(Base peak)

(Parent)

9

5

6

Dodecano : C12H26 (M=170)

Ión Molecular (M +): pérdida de un electrón

Pico Base: ión más abundante del espectro

Sintonizado con PFTBA

Espectro Perfluorotributylamine (PFTBA)

650

Scan: 10.00 - 650.00 Samples: 16 Thresh: 500117 peaks Base: 69.00 Abundance: 1974784

Mass Abund Rel Abund Iso Mass Iso Abund Iso Ratio

69.00 1974784 100.00 70.00 20344 1.03

219.00 1161216 58.80 219.95 45968 3.96

502.00 56648 2.87 503.00 5690 10.04

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600

0

50

100

131

219

264

69

414 (GCD)502

614

N CF2 - CF2 - CF2 - CF3

..

F3 C - F2C - F2C - F2 C

F3 C - F2C - F2C - F2 C

Metil estearato (C H O ) M = 298

Ión M+1 = 299

Contribución isotópica del carbono:

C19 x 1.1% de C = 20.9%

Contribución isotópica del deuterio:

H38 x 0.015% de D = 0.6%

Los espectros clásicos de EI deben

proporcionar picos isotópicos con relaciones

respecto al ion molecular muy cercanas a los

valores teóricos.

298 299

M

M +1 = 21.5%

+

+

13

¿Qué es un espectro EI clásico?

+38 219

+

Contribución isotópica total = 21.5%

Laboratorio Aplicaciones Agilent-BCN

Ionización Química Positiva (PCI)

Forma iones a partir del “gas reactivo” por bombardeo con electrones.

Los iones del gas reactivo sufren reacciones con moléculas de la muestra produciéndose

iones de la misma.

La ionización química (CI) es mucho más suave que la ionización por impacto

electrónico (EI), por lo que se produce menos fragmentación.

El gas reactivo más común es el metano, que produce iones con prácticamente cualquier

molécula de muestra.

Otros gases reactivos (isobutano, amoniaco) son más selectivos y producen incluso menos

fragmentación.

Presión de la fuente ~ 0.2 Torr.

Es el método más frecuentemente utilizado para determinar pesos moleculares de

compuestos.

Con metano se forma: M+1, M+29; M+41. Muy útil para asegurar M.

Con amoníaco se suele formar el M+1 y el M+18. Es muy selectivo (aminas).

Con isobutano sólo suele obtenerse el M+1.

M + CH CH + [M-H]

M + C H [M-C H ]

M + C H [M-C H ]

¿Qué es un Espectro CI clásico?

Transferencia de Protones+5 4

+

Adición Alquílica

22 5 5

3 5 3 5

++

+ +

Ionización del fenobarbital [M/z-232] empleando CH4 como gas reactante Formación Iones Reactivos

Las moléculas neutras de muestras reaccionan con iones

secundarios del gas reactante para formar aductos

Reacciones Analito-Gas Reactivo

+

CH +e CH +2e

CH +e CH +e +H

+Primaria

Secundaria CH +CH CH +CH

CH +CH C H [29] +H

C H +CH C H [41] + 2H

4 5+

34+

3+

5

+4

4

2 5+5+

3

2 2

2

4-

-4

+3

-

-+4

m/z = M + 1m/z = M + 29m/z = M + 41

233 261

[M+1]

[M+29]+

[M+41]+

273

+

100 pg de BenzofenonaPCI en Modo SCAN

M+1M+29 M+41

La PCI facilita la detección del ión molecular

Ionización Química Negativa (NCI)

“Ionización química negativa por captura electrónica”.

Primero se forma una nube de electrones con poco exceso de energía

(“electrones térmicos”).

Los “electrones térmicos” son capturados por moléculas de muestra.

Es necesario un gas amortiguador (que retira energía de los

electrones/iones). El metano es el más utilizado.

Presión de la fuente ~ 0.4 Torr (mayor que en PCI).

Sólamente ciertos tipos de moléculas son capaces de capturar electrones

térmicos (selectividad).

Extremadamente eficiente para algunas moléculas (sensibilidad).

Los límites de detección son generalmente muy bajos debido a la falta de

respuesta de los contaminantes o de la matriz.

Usado frecuentemente para análisis selectivos y de alta sensibilidad de

compuestos electrofílicos.

Suele proporcionar el M(-).

Beneficios:

Voltaje de Ionización Variable (5-240 eV)

Los voltajes pequeños proporcionan

una menor fragmentación general y

por otro lado incrementan el ion

molecular en relación a la ionización

estándar a 70eV.

Los voltajes pequeños proporcionan

ionización selectiva [ej..: aromáticos

en alcanos].

Los voltajes altos con CI son también

posibles y proporcionan una mayor

sensibilidad.

60 100 140 180 220 260 300 340 380

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

m/z-->

AbundanceScan 619 (7.531 min.): 2.D (-)

394

71

99127

169 210 309337225 253

365

12 eV

C28H58

60 100 140 180 220 260 300 340 380

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

m/z-->

AbundanceScan 617 (7.515 min.): GLUC.D (-)

57

85

113

141 394183168 211 295238 337268 365

70 eV M+

Obtención de información

• El proceso para conseguir el password es el siguiente:

1. Acuda a la página de Agilent. (www.chem.agilent.com)

2. Pinche en el botón de Register

3. Siga los pasos que le indique el navegador

4. Finalmente adquiera su clave de acceso (password)

5. Una vez tenga la clave de acceso:

6. Acuda a www.chem.agilent.com

• Luego:

1. Haga clic en Login

2. Introduzca su nombre y password

3. De nuevo en la pagina inicial entre en Literature Library – Online Literature

4. Una vez en Library introduzca un keyword (por ejemplo: PAH)

5. Introduzca un tipo de publicación (por ejemplo: Application)

6. Rellene el resto de campos si lo considera necesario

7. Haga clic en Search

RESUMEN: Ventajas del acoplamiento GCMS

1971

• Operación robusta

• Identificación y confirmación

• Sensibilidad y Especificidad

• Facilidad de Uso

• Tecnología asequible

5975 GCMS7000B GCMSMS

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