Caracterización de portadores de mutaciones relacionadas ...
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1 Caracterización de portadores de mutaciones relacionadas con la Ataxia de Friedreich y el Albinismo oculocutáneo tipo IA en una población endogámica en Colombia Jenny Andrea Rodríguez Carrillo Directora Helena Groot de Restrepo Codirectora Lilian Torres Tobar Universidad de los Andes Facultad de Ciencias Departamento de Ciencias Biológicas 22 de abril del 2019
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Caracterización de portadores de mutaciones relacionadas con la
Ataxia de Friedreich y el Albinismo oculocutáneo tipo IA en
una población endogámica en Colombia
Jenny Andrea Rodríguez Carrillo
Directora
Helena Groot de Restrepo
Codirectora
Lilian Torres Tobar
Universidad de los Andes
Facultad de Ciencias
Departamento de Ciencias Biológicas
22 de abril del 2019
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Tabla de contenido
Introducción ............................................................................................................................ 3
Metodología: ......................................................................................................................... 10
Resultados. ............................................................................................................................ 14
Discusión .............................................................................................................................. 21
Agradecimientos. .................................................................................................................. 25
Bibliografía ........................................................................................................................... 26
3
Introducción
La población endogámica en donde se desarrolló el trabajo de investigación está localizada
en Junín – Cundinamarca al nororiente de Bogotá. Esta población aislada por la geografía de
la región y la presión de grupos armados tiene la presencia de dos enfermedades: Ataxia de
Friedreich (FRDA) y Albinismo oculocutáneo tipo 1A (OCA-1A). El orden de presentación
de la introducción es en primera instancia, se definen Ataxia de Friedreich (FRDA) y
Albinismo oculocutáneo tipo 1A (OCA-1A) como enfermedades autosómicas recesivas: la
primera, es una enfermedad neurodegenerativa causada en mayor frecuencia por una
mutación de expansión de trinucleótidos GAA en el primer intrón del gen FXN que codifica
para la frataxina, y la segunda, es una patología relacionada con la deficiencia de la síntesis
de la melanina, en este caso, causada por una mutación puntual en el gen TYR que codifica
para la tirosinasa. En segunda instancia, se ofrece el contexto a las enfermedades con los
antecedes de la investigación y la descripción de la familia de interés inicial que consta de 11
hijos con padres consanguíneos, de los cuales seis tienen Ataxia y cuatro presentan albinismo,
uno de ellos tiene las dos enfermedades y hay dos hijos sanos. En tercera instancia, luego de
presentar la justificación, se especifica el objetivo principal de este estudio descriptivo, tipo
serie de casos, es caracterizar molecularmente a los portadores para ambas enfermedades de
la familia extensiva (familiares en primer, segundo y hasta tercer grado de los afectados),
mediante el empleo de técnicas moleculares como TP-PCR para la expansión en el gen de la
frataxina en Ataxia y PCR-Secuenciación para la mutación c. 124 G˃A del gen TYR en
albinismo, cuyos detalles encuentra en la metodología.
Para empezar con el orden propuesto, la Ataxia de Friedreich (FRDA) es la Ataxia
hereditaria más común [1], donde la mayoría de los pacientes están confinados a una silla de
ruedas antes de los 20 años [2][3], y no existe un tratamiento para detener la progresión de la
enfermedad [1]. Es descrita por el portal sobre enfermedades raras y medicamentos huérfanos
ORPHANET como:
“Ataxia progresiva de la marcha, disartria, disfagia, disfunción oculomotora, pérdida
de los reflejos tendinosos profundos, signos de afectación del tracto piramidal,
escoliosis, y en algunos casos, miocardiopatía, diabetes mellitus, pérdida visual y
audición defectuosa” [4].
4
La miocardiopatía hipertrófica se encuentra en casi todos los pacientes [1]. Otros
síntomas son diabetes mellitus e intolerancia a los carbohidratos [1] [5].
La mutación de ADN más común que causa la deficiencia por disminución de la
expresión de la frataxina es la expansión de una tripleta polimórfica GAA, repetida en el
primer intrón del gen FXN [6], que se encuentra en el cromosoma 9q21.1[7]. Según lo
reportado por literatura las repeticiones en tándem de la GAA pueden presentarse en alelos
normales hasta 36 repeticiones estables sin que alteren la producción de la proteína, en el
rango de 36 a 66 se plantea la existencia de un alelo premutante [8], que puede expandirse
diferencialmente en cada meiosis hasta alcanzar valores desde 66 hasta 1500 repeticiones,
reportadas para alelos expandidos o mutantes [5].
En los alelos expandidos, la reducción en la producción de ARN mensajero es explicada
posiblemente por dos teorías que no son mutuamente excluyentes, la primera es la generación
de una estructura secundaria llamada ADN adhesivo o con tres hebras [9], la cual genera una
barrera física a la ARN polimerasa [10] y la segunda, es una compactación excesiva del ADN
sobre el promotor del gen que imposibilita a los factores de trascripción reconocerlo [11],
interfiriendo con la transcripción de la proteína [12].
Para explicar la sintomatología previamente descrita es importante analizar las posibles
funciones de la frataxina; dicha proteína está involucrada en el metabolismo del hierro
mitocondrial, pero existen varias teorías sobre su función específica: i. Podría estar
involucrada en el almacenamiento interno y el transporte de hierro fuera de la mitocondria
[13], [14] ii. Su participación podría ser vital en los ensamblajes de clústeres de hierro y
azufre (ISC) y en la síntesis de proteínas del grupo hierro-azufre (ISP) [15]–[17], y iii. Podría
estar relacionada con la protección contra las agresiones oxidativas que resultan de las
deficiencias en la cadena respiratoria (Fe-SOD) [18]. Los experimentos realizados para
proponer esas funciones teóricas tienen en común que la disminución de la producción de
frataxina causa una acumulación de hierro libre en las mitocondrias [13]–[19]. Esto, primero,
aumenta el estrés oxidativo, posiblemente generando hipertrofia celular [18]; segundo, altera
las funciones mitocondriales, como la síntesis de proteínas del grupo hierro-azufre,
involucradas en la cadena trasportadora de electrones [20], lo cual explica la diabetes y la
intolerancia a carbohidratos como disfunción orgánica [16], y finalmente causa muerte
5
celular y degeneración del tejido (neurodegeneración), esto podría explicar los síntomas de
FRDA ligados a movimiento [19]. Los elementos anteriores demuestran que las teorías no
son mutuamente excluyentes y, tal vez, se esté frente a una proteína que participa en varias
rutas metabólicas del hierro en la mitocondria.
El análisis molecular de Ataxia de Friedreich (FRDA) tradicionalmente es realizado con
PCR convencional (End point), lo que involucra el uso de dos primers que franquean el intrón
1 del gen FXN, seguido por una electroforesis en un gel de agarosa para determinar el tamaño
del producto de amplificación [2][7], esta técnica permite amplificar aproximadamente 100
tripletas GAA pero no es confiable cuando este número aumenta [2] [21], considerando que
para FRDA el alelo afectado puede tener desde 60 a más de 1000 repeticiones [22], esta
técnica solo fue usada en este estudio como amplificación selectiva de alelos sanos [2], y para
los alelos mutados Warner et al [21] se desarrolló un método llamado TP-PCR, para
cuantificar las tripletas sin importar el número.
Por un lado, el ensayo de PCR específica de tripletas (TP-PCR) [21] utiliza un primer
específico de locus FXN fluorescentemente marcado, el cual garantiza la especificidad de la
reacción (P1) y flanquea la repetición junto con primers apareados que se amplifican a partir
de múltiples sitios de unión dentro de la zona de repetición (P3 y P4), lo que produce
fragmentos de múltiples tamaños que son leídos gracias a la fluorescencia del P1 por un
Genetic Analyzer (ABI) que determina su tamaño por capilaridad electroforética y genera un
electroferograma, con el cual se calcula el número de repeticiones [21].
Ambos métodos son usados en este proyecto, la PCR convencional con primers
flanqueantes se plantea como un screening selectivo de alelos sanos y la comprobación de
los resultados se realiza con TP-PCR.
Por otro lado, en la definición de Albinismo es importante tener en cuenta que en
humanos el pigmento responsable por la coloración diferencial en piel, iris y pelo es la
melanina, también es importante en el plexo coroideo, retina, cuerpo ciliar del ojo y en la
sustancia negra del cerebro [23]. Sus principales funciones son, la protección frente a
radiaciones, particularmente radiación ultravioleta cuando se ubica en piel, iris y pelo.
Además, los melanoblastos (células precursoras de los melanocitos), participan en la
6
inducción de la diferenciación de ciertos tipos celulares como neuronas sensoriales y
simpáticas, células cromafines de la médula adrenal, glía y células de Schwann [23].
Como sucede en todos los mamíferos la melanina se produce en vacuolas del retículo
endoplasmático llamadas melanosomas, en células especializadas denominadas melanocitos,
luego de su maduración, los melanosomas migran hacia la capa superior de la piel a través de
alargamientos celulares, al entrar en el citosol de los queratocitos, se ubican sobre la superficie
del núcleo para cumplir su función [24].
La melanina se produce a partir de la tirosina y en el proceso de biosíntesis, la reacción
crítica es la conversión de la tirosina en DOPA (3,4-hidroxifenilalanina) por hidroxilación, paso
que es catalizado por la enzima tirosinasa. Esta reacción es muy lenta o no ocurre en ausencia
de esta enzima codificada por el gen TYR [23] [25].
En el Albinismo oculocutáneo tipo 1A (OCA1A) se han registrado 230 mutaciones, que
pueden afectar ambos alelos del gen TYR [26], ubicado en cromosoma 11q14.3 [25]; y que es
el encargado de la producción de tirosinasa [25]. El daño de esta enzima explica el fenotipo de
la enfermedad, una hipopigmentación general donde hay baja o nula producción de melanina y
como resultado los pacientes presentan una mayor sensibilidad a la radiación UV y una
predisposición al cáncer de piel [26]. La ausencia de pigmento de melanina en el ojo durante el
desarrollo resulta en agudeza visual reducida debido a la hipoplasia asociada con el nistagmo
y un enrutamiento anormal de las fibras nerviosas del ojo al cerebro resultando en estrabismo
y pérdida de visión binocular [27].
Para el análisis molecular de OCA1A se usan las técnicas PCR y secuenciación por
Sanger, la primera permite amplificar solo la región flanqueante de la mutación puntual que se
quiera analizar, luego los fragmentos productos de esa PCR son visualizados en un gel de
agarosa, para comprobar la amplificación (presencia, calidad y tamaño esperado). Los
productos amplificados son enviados a secuenciar y se comparan con la secuencia referencia
del RNA mensajero del gen TYR en cDNA (U01873.1) disponible en GenBank.
7
Ambas enfermedades, anteriormente explicadas, no están ligadas ni correlacionadas. La
razón para que se estudien juntas es que ambas están presentes en la población inicial de estudio
(Torres- Tobar L. et al, comunicación personal), donde en un trabajo colaborativo entre la
Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud y la Universidad de Santiago de Compostela
se realizó el análisis de las mutaciones a 12 personas de una familia, 10 hijos y sus padres
consanguíneos, como se diagrama en la figura 1.
Figura 1. Árbol genealógico de la familia inicial descrita por Torres. Los padres, que son
portadores para ambas enfermedades se ilustran en tono gris, los miembros afectados con
Ataxia de Friedreich se muestran coloreados en negro a la derecha y los afectados con
Albinismo oculocutáneo tipo 1A se muestran coloreados en negro a la izquierda, la flecha
señala un individuo con las dos patologías.
Para estudiar molecularmente la Ataxia de Friedrich en los pacientes y sus familiares
cercanos la búsqueda se centró en mutaciones en el gen FXN. Se analizaron secuencias del
intrón 1 del gen mediante TP-PCR para establecer la presencia de la expansión, se encontró un
promedio de 200 repeticiones GAA en tándem en el primer intrón del gen FXN en homocigosis
para los 6 hijos afectados, los padres, así como tres de sus hijos que son portadores de la
expansión (heterocigotos) y uno de los hijos es homocigoto para las repeticiones del rango
normal (Documento en edición para publicación Torres- Tobar L. et al.).
La autora Torres-Tobar en el estudio del Albinismo utilizó un chip (SEQUENOM®) de
mutaciones o variantes (SNPs) para 14 genes relacionados con albinismo, así se identificó la
presencia de la mutación, c. 124G˃A del gen TYR donde la sustitución de guanina por adenina
se identificó en el nucleótido 124 ubicado en el primer exón, lo que resulta en un cambio en el
aminoácido 42 de ácido aspártico por asparagina (D42N) [25] [28]–[31]. Dicha mutación se
encontró en homocigosis en todos los afectados, en heterocigosis para los padres y también para
8
tres de los hermanos (portadores). (Documento en edición para publicación Torres- Tobar L.
et al.).
La endogamia presente en la familia de estudio podría darse por un contexto social de
violencia desde 1995 con el frente 54 de las FARC-EP (Fuerzas Armadas Revolucionarias de
Colombia-Ejército del Pueblo) [32]; un aislamiento geográfico por ubicarse en la vereda San
Francisco, inspección Sueva, del municipio de Junín, Cundinamarca, donde el municipio
presenta procesos migratorios, en especial rurales, con una tasa de decrecimiento anual
intercensal poblacional de 3.48 personas [33]; y otros factores difíciles de determinar. Esta
consanguinidad podría haber aumentado las probabilidades de presentar las patologías en la
región demarcada, pero ambas enfermedades siguen siendo catalogadas como enfermedades
huérfanas. En Colombia, con la Ley 1392 de 2010 [34] se determina la posición del gobierno
frente a las enfermedades con una incidencia de menos de 1 en 2.000 personas, como lo son la
Ataxia de Friedreich (1 en 70.000 [35]) y el Albinismo oculocutáneo tipo 1A (50.000 [26]), en
los siguientes términos:
“Se debe tener cuidado para garantizar que los pacientes reciban medidas terapéuticas y
rehabilitación específica para su enfermedad. Además, sus familias pueden participar
en programas de prevención dirigidos a la detección temprana de la enfermedad a través
de estudios genéticos y recibir asesoramiento genético sobre la base real de la
enfermedad” [34].
Aun siendo enfermedades huérfanas, la Ataxia de Friedreich (FRDA) y el Albinismo
oculocutáneo tipo 1A (OCA-1A) son el tipo más común dentro de las Ataxias y albinismos
hereditarios en Colombia [36], pero el espectro de manifestaciones fenotípicas de la Ataxia es
amplio y, hasta el momento, en el país el diagnóstico de la enfermedad se confirma con los
resultados de electrocardiogramas, cuantificación de insulina y resonancia magnética cerebral,
y el diagnóstico molecular directo a través de la determinación de las expansiones de GAA[12].
Esta última es una herramienta esencial en la práctica clínica y en el asesoramiento genético de
pacientes y sus familiares [37].
Lo mismo ocurre en el caso del Albinismo, puesto que en el nacimiento donde es
diagnosticado clínicamente es difícil distinguir entre los fenotipos diferenciales de los 4 tipos de
albinismo oculocutáneo y varios síndromes asociados, dado que solo analizando los genes
9
candidatos se llega a la mutación específica causante de la patología [25] [38].
Lo anterior aplica solo para el caso de los afectados, pero cabe resaltar que estas
enfermedades (FRDA, OCA1A) tienen un patrón hereditario conocido como autosómico
recesivo, donde los padres de una persona afectada generalmente son portadores, es decir,
tienen una copia de un gen mutado. Si ambos son padres portadores de mutaciones para el
mismo gen tienen 25% de posibilidades de heredar a cada hijo las copias del gen que tiene la
mutación y así será afectado [39]. La probabilidad de ser heterocigoto en una población
aumenta si los padres son una pareja consanguínea [40], por lo tanto, la identificación de los
portadores debe ser importante para el sistema de salud por que es posible realizar con ellos y
sus parejas una asesoría genética, es una inversión adecuada si se analiza el costo monetario de
mantener psicológica y físicamente estable a los pacientes de dichas enfermedades durante toda
su vida.
Por esta razón, el objetivo principal de este estudio es caracterizar a los portadores de
las mutaciones para FRDA y OCA-1A en la familia extensiva de interés, describiendo la
genealogía ampliada de la familia; por un lado, caracterizando a los portadores de la expansión
de las tripletas GAA en el primer intrón del gen FXN para la Ataxia de Friedreich; y, por otro
lado, caracterizando a los portadores de la mutación, c. 124G˃A del gen TYR para Albinismo
oculocutáneo tipo 1A.
10
Metodología:
1. Población de estudio
Este es un estudio descriptivo, tipo serie de casos, donde los participantes pertenecen a la
población cerrada: familiares en primer, segundo y tercer grado de los afectados de la familia
inicial de estudio de la Vereda San Francisco, municipio de Junín (Cundinamarca).
Método de selección:
Se seleccionaron familiares hasta tercer grado de los afectados de la familia inicial de estudio,
que desearon participar en el estudio. Cada individuo que participó en el proyecto firmó un
consentimiento informado en el que autorizó el uso de su muestra biológica en este estudio, el
cual fue aprobado previamente por el comité de ética de la Universidad de los Andes y el comité
de ética e investigación en seres humanos del Hospital de San José y de la Fundación
Universitaria de Ciencias de la Salud (Anexo 1).
La construcción del pedigrí fue hecha con el programa CeGaT Pedigree Chart Maker
de la compañía CeGaT GmbH en su version libre 2.0.
2. Extracción ADN
Para el análisis molecular de las mutaciones de los genes TYR y FXN, se tomaron por paciente
dos muestras de sangre en tubos EDTA de 3 ml para la extracción de ADN, en el caso de no
poder tomar muestra de sangre se tomó muestra de células epiteliales de la boca. Dichas tomas
se hicieron con ayuda de un profesional de la salud autorizado y previo consentimiento
informado firmado. Todas las muestras que fueron tomadas en el municipio de Junín
(Cundinamarca) y transportadas al Laboratorio de Genética y Biología Molecular de la FUCS
para ser registradas y procesadas. El material biológico fue empacado y sellado con Parafilm y
embalado en nevera para ser transportado, según la guía sobre transporte de sustancias
infecciosas (Infectious Substances Shipping Guidelines, Manual 58th) publicada por la
Asociación de Trasporte Aéreo Internacional (IATA). Una vez en el laboratorio, se
11
realizó un aislamiento de leucocitos o células epiteliales y la posterior obtención del material
genético utilizando el kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega, Madison, WI,
USA), sin modificaciones en el protocolo. La cuantificación de ADN de las muestras fue
realizada usando el equipo Qubit Fluorometric Quantitation (Thermo Fisher Scientific, USA)
con el kit Broad Rage, según protocolo establecido por Thermo Fisher Scientific.
Se mantuvo la confidencialidad de los participantes en el estudio, reemplazando sus
nombres por códigos. Los resultados de este estudio serán publicados en revistas científicas
o actividades académicas, manteniendo su confidencialidad, y los resultados del estudio serán
dados a conocer primero a los participantes, y en los casos de ser necesario se remitirán a los
pacientes a su servicio de salud.
3. Análisis molecular de la Ataxia de Friedreich
Para la determinación de la mutación del gen FXN se realizó una amplificación selectiva de
los alelos sanos utilizando el protocolo propuesto por Filla [2] y colaboradores
[35] en 1996, con la enzima Platinum Taq DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific,
Massachusetts, USA) y los siguientes primers:
ATCF: 5'GGCTTAAACTTCCCACACGTGTT-3'
ATCR: 5'-AGGACCATCATGGCCACACTT-3'.
Tabla 1. Perfil térmico de la PCR corta para análisis molecular de FRDA [2]
No. Ciclos
Proceso
Temperatura (°C)
Duración
1 Desnaturalización 94 4 min
30
Desnaturalización 94 15 seg
Anillamiento 65 30 seg
Extensión 72 40 seg
1 Elongación 72 5 min
12
Los productos amplificados fueron visualizados en un gel de agarosa al 2% y se
resolvieron en cámara de electroforesis horizontal a 50V por hora y media, utilizando
SYBR® safe (Invitrogen, California USA) como agente intercalante de ADN. El gel fue
visualizado con fotodocumentador Molecular Imager® GelDoc™ XR System Biorad. Para
comprobar la amplificación de al menos una banda entre los 500 pb y 600 pb, con un
marcador de peso de 50 bp DNA Ladder (New England biolabs, USA).
Cada banda obtenida fue comparada contra el marcador para calcular su peso aproximado.
Para llegar a la comprobación final del tamaño de tripleta de todos los participantes se
siguió la metodología descrita por Ciotti en el 2004 mediante la técnica TP-PCR [7] [41]
descrita en la Tabla 2. con la enzima Platinum Taq DNA Polymerase (Thermo Fisher
Scientific, Massachusetts, USA) y utilizando el conjunto de primers para el primer intrón del
gen FXN: P1 5'-GCTGGGATTACAGGCGCGCGA-3' Fosforilado con 6-FAM
P3 5'- TACGCATCCCAGTTTGAGACG-3'
P4 5'- TACGCATCCCAGTTTGAGACGGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA-3'.
Tabla 2. Perfil térmico de la TP- PCR para análisis molecular de FRDA [7].
No. Ciclos
Proceso
Temperatura (°C)
Duración
1 Desnaturalización 94 4 min
30
Desnaturalización 94 1 min
Anillamiento 60 1 min
Extensión 72 2 min
1 Elongación 72 10 min
Luego de la amplificación los distintos fragmentos son resueltos por una electroforesis
capilar y leídos usando un secuenciador automático que utiliza rayos láser para reconocer
marcadores de fluorescencia en el DNA, en este caso, todas las amplificaciones están marcadas
en el 5´ con el fluorocromo 6-FAM. El marcador de peso usado fue GeneScan™ 1200 LIZ™
dye Size Standard.
13
La información del secuenciador fue trabajada con en el software Geneious Prime®
2019.1.3 usando el plugin Microsatellites para construir los electroferogramas y determinar
la condición alélica de todos los participantes.
Incluyendo las secuencias de los primers, el tamaño del producto esperado, en los datos
de los electroferogramas de TP-PCR, según literatura, es alrededor de 88bp cuando los alelos
tienen 7 tripletas de GAA en el gen FXN [42].
4. Análisis molecular del Albinismo oculocutáneo tipo 1A
Para la determinación de la mutación del gen TYR se siguió la metodología descrita por
Sanabria y colaboradores en 2012 [25], flanqueando la secuencia de ADN de la mutación c.
124G˃A en el gen TYR con una PCR descrita en la Tabla 3. Utilizando la enzima Platinum
Taq DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) y utilizando el
conjunto de primers para el primer exón:
F- 5'AGTGTTTGATGCTGGAGGTG 3’
R-5'CAAGTGGTGCATTGGACAGA 3'.
Tabla 3. Perfil térmico de la PCR para análisis molecular OCA-1A [25].
No. Ciclos
Proceso
Temperatura (°C)
Duración
1 Desnaturalización 95 5 min
30
Desnaturalización 95 15 seg
Anillamiento 60 30 seg
Extensión 72 30 seg
1 Elongación 72 5 min
14
Los fragmentos productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 2% como
se describe previamente en la metodología, para comprobar la amplificación de 337pb [25]
(presencia, calidad y tamaño esperado). Los productos amplificados fueron secuenciados por
Macrogen Sequencing Service (Macrogen, Korea) y se compararon con la secuencia
referencia del RNA mensajero del gen TYR en cDNA (U01873.1) disponible en GenBank.
El programa con el que se hizo la limpieza de secuencias, los alineamientos y el análisis
fue Benchling, Inc. © 2019. Plataforma online y de licencia libre.
Las personas con Albinismo en la familia inicial fueron usadas como control para la
estandarización de la técnica e identificación de la mutación a nivel bioinformático.
Resultados.
Los datos obtenidos se presentan en el orden establecido por la metodología: primero, la
genealogía ampliada de la familia; segundo, la extracción de ADN; tercero, los datos
moleculares de Ataxia de Friedreich con la técnica de amplificación del primer intrón del gen
FXN con primers flanqueantes o Ataxia corta, y, por último, la caracterización molecular de
los participantes para la mutación, c. 124G˃A del gen TYR en el Albinismo oculocutáneo
tipo 1A.
1. Población de estudio
Árbol genealógico (figura 2.) codificado para 112 personas que cumplen con el criterio de
selección de ser familiares hasta tercer grado de los afectados de la familia inicial descrita
por Torres-Tobar.
Con las 112 personas que cumplen ese criterio se hizo divulgación con cartillas
informativas (Anexo 2) y, hasta el momento, 22 personas han firmado el consentimiento
informado, y se les ha realizado la toma de muestra, 3 de ellas son parte de la familia inicial
y son controles heterocigotos u homocigotos recesivos. Además 4 personas ajenas a la familia
firmaron el consentimiento y se les han tomado las muestras de sangre en las instalaciones
de la FUCS, estas muestras son el control homocigoto dominante para ambas enfermedades.
Una vez obtenidas las muestras de sangre de las 26 personas se inició el procedimiento de
extracción de ADN.
15
A.
9 11
8 10
B.
C.
16
Figura 2: A. Árbol genealógico de la familia extensiva, con la familia inicial en el centro y los
pacientes marcados con color solido negro, todos los miembros de los cuales no tenemos
información genotípica están marcados con un interrogante, el árbol puede dividirse en 11
subfamilias, en cabeza de cada familiar de tercera generación. B. Matrimonio consanguíneo 2,
unión entre las subfamilias 9 y 11, con un descendiente en la quinta generación. C. Matrimonio
consanguíneo 3, unión entre las subfamilias 8 y 10, con un descendiente en la quinta generación.
D. Matrimonio consanguíneo 4, unión entre las subfamilias 1 y 10, con un descendiente en la
quinta generación.
1 10
D.
17
2. Extracción ADN
Para hacer las extracciones de ADN se usó el kit descrito en la previamente en la metodología
sin ninguna modificación al protocolo propuesto por la casa comercial. Se obtuvo un rango
de 150 ug/ul a 500 ug/ul de concentración de ADN (ug/ul), la cual fue apta para todos los
tipos de PCR establecidos en la metodología.
La única excepción a ese rango fue la muestra EBA159, la cual, fue obtenida a partir de
saliva de un bebé usando solución salina como conservante. Para la extracción de ADN se
usó el mismo kit mencionado anteriormente, y la concentración que se obtuvo fue muy baja,
en el orden de 3 ng/ul.
3. Datos moleculares de Ataxia de Friedreich para alelos sanos.
A partir de las muestras de ADN normalizadas se procedió a hacer la amplificación selectiva
de los alelos sanos utilizando el protocolo propuesto por Filla [2], con la modificación de
65°C cómo temperatura de anillaje en la PCR.
Fueron amplificadas 25 muestras, 4 presentan ausencia de banda luego de la PCR, 19
participantes muestran una amplificación de una sola banda a la altura de 550 a 600 pares de
bases y solo 2 participantes mostraron amplificación de dos bandas a la altura de 550 y 570
pb respectivamente. Estos resultados se resumen en la Tabla 4 y la Figura 3.
18
Tabla 4. Datos moleculares de Ataxia de Friedreich para alelos sanos.
Código Muestras y controles
Código dentro
de árbol
genealógico
Datos moleculares para Ataxia de Friedreich
tamaño de las bandas/tripletas aproximadas
DEA13 Control heterocigoto IV.34 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
OLLC1 Control heterocigoto III.8 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
JEAC2 Control heterocigoto III.9 Ausencia de banda
JBLC102 Muestra III.1 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
EMAC103 Muestra III.14 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
DALR104 Muestra V.15 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
MAAG105 Muestra IV.45 Banda 1 (570) 23-24 tripletas
MGLC106 Muestra III.4 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
GLLC107 Muestra III.7 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
SAC151 Muestra III.10 Ausencia de banda
SJAC152 Muestra III.15 Ausencia de banda
GMLC153 Muestra III.3 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
YMLR154 Muestra V.16 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
RMRL155 Muestra IV.11 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
MAAG156 Muestra IV.36 Banda 1 (570) 23-24 tripletas
FXAA157 Muestra V.32 Banda 1 (600) 33-34 tripletas
LRAG158 Muestra IV.47 Banda 1 (570) 23-24 tripletas
EBA159 Muestra V.33 Ausencia de banda
JGBA160 Muestra V.34 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
MGAG161 Muestra IV.51 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
SVIA162 Muestra V.47 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
Banda 2 (570) 23-24 tripletas
MAL163 Muestra III.6 Banda 1 (550) 16-17 tripletas
P1 Control homocigoto
dominante No aplica
Banda 1 (550) 16-17 tripletas
Banda 2 (570) 23-24 tripletas
P2
Control homocigoto
dominante No aplica Banda 1 (550) 16-17 tripletas
P4
Control homocigoto
dominante No aplica Banda 1 (550) 16-17 tripletas
19
Figura 3. Amplificación selectiva de los alelos sanos. Se observa la amplificación de los
fragmentos del gen FXN. Carril 10 muestra el marcador de peso molecular de 50pb. Muestras
SAC151, SJAC152, EBA159 y control negativo muestran ausencia de banda; muestras
MGLC106, GLLC107, GMLC153, YMLR154, RMRL155, JGBA160, MGAG161, MAL163, P2
y P4 muestran una banda a 550 pb; muestras MAAG156 y LRAG158 muestran banda a 570 pb;
muestra FXAA157 muestra una banda a 570 pb; y, muestras SVIA162 y P1 muestran dos bandas
a la altura de 550 pb y 570 pb. En el gel se observa la detección automática de bandas del
fotodocumentador para el cálculo preciso del tamaño.
Para el análisis molecular Ataxia de Friedreich es necesario llegar a la comprobación final del
tamaño de tripleta de todos los participantes, mediante la metodología descrita por Ciotti en
el 2004, usando la técnica TP-PCR [7] [41].
Para ello, fueron amplificadas 29 muestras que fueron clasificadas: 11 como Homocigotos
dominantes (Sano/Sano), incluyendo los 3 controles para ese genotipo; 9 como Heterocigotos
(sano/hiperexpandido), incluyendo los 2 controles; 4 como Heterocigotos
(premutante/hiperexpandido), incluyendo el control; y, 4 controles Homocigotos recesivos
(hiperexpandido /hiperexpandido), los cuales son pacientes de ataxia de Friedreich. Estos
resultados se resumen en la Tabla 5 y la Figura 4.
20
Tabla 5. Datos moleculares de Ataxia de Friedreich con TP-PCR.
Código Muestras y controles
Código dentro
de árbol
genealógico
Datos moleculares para Ataxia de Friedreich
tamaño de las bandas/tripletas aproximadas
DEA13 Control heterocigoto IV.34 Heterocigoto (sano/hiperexpandido)
OLLC1 Control heterocigoto III.8 Heterocigoto (sano/hiperexpandido)
JEAC2 Control heterocigoto III.9 Heterocigoto (premutante/hiperexpandido)
JBLC102 Muestra III.1 Homocigoto dominante (Sano/Sano)
EMAC103 Muestra III.14 Heterocigoto (sano/hiperexpandido)
DALR104 Muestra V.15 Homocigoto dominante (Sano/Sano)
MAAG105 Muestra IV.45 Homocigoto dominante (Sano/Sano)
MGLC106 Muestra III.4 Homocigoto dominante (Sano/Sano)
GLLC107 Muestra III.7 Heterocigoto (sano/hiperexpandido)
SAC151 Muestra III.10 Heterocigoto (premutante/hiperexpandido)
SJAC152 Muestra III.15 Heterocigoto (premutante/hiperexpandido)
GMLC153 Muestra III.3 Heterocigoto (sano/hiperexpandido)
YMLR154 Muestra V.16 Homocigoto dominante (Sano/Sano)
RMRL155 Muestra IV.11 Heterocigoto (sano/hiperexpandido)
MAAG156 Muestra IV.36 Heterocigoto (sano/hiperexpandido)
FXAA157 Muestra V.32 Heterocigoto (premutante/hiperexpandido)
LRAG158 Muestra IV.47 Heterocigoto (sano/hiperexpandido)
EBA159 Muestra V.33 Por comprobar*
JGBA160 Muestra V.34 Homocigoto dominante (Sano/Sano)
MGAG161 Muestra IV.51 Heterocigoto (sano/hiperexpandido)
SVIA162 Muestra V.47 Homocigoto dominante (Sano/Sano)
MAL163 Muestra III.6 Homocigoto dominante (Sano/Sano)
P1 Control homocigoto
dominante No aplica Homocigoto dominante (Sano/Sano)
P2
Control homocigoto
dominante No aplica Homocigoto dominante (Sano/Sano)
P4
Control homocigoto
dominante No aplica Homocigoto dominante (Sano/Sano)
SMA4 Control homocigoto
recesivo IV.25
Homocigoto recesivo
(hiperexpandido /hiperexpandido)
GAA5 Control homocigoto
recesivo IV.26
Homocigoto recesivo
(hiperexpandido /hiperexpandido)
HUAL7 Control homocigoto
recesivo IV.28
Homocigoto recesivo
(hiperexpandido /hiperexpandido)
SMA9 Control homocigoto
recesivo IV.30
Homocigoto recesivo
(hiperexpandido /hiperexpandido)
21
A.
B.
C.
Alelo Premutante
D.
22
Figura 4. Electroferogramas de las amplificaciones múltiples del intrón 1 del gen FXN por
TP-PCR. En todas las imágenes el sombreado gris cubre el área de tamaño de 0 a 80 pb
medidos por el Ladder 1200LIZ. Los diferentes genotipos se presentan en 4 casos: A.
Patrón de picos característico de un paciente homocigoto recesivo, con ambos alelos
hiperexpandidos. B. Picos en la región de 80 a 100pb son indicativos de un genotipo
homocigoto sano C. Los picos de la región 80 a 100 pb, más la región hiperexpandida
son característicos de un genotipo heterocigoto (sano/hiperexpandido) D. Existen tres
regiones de picos en este genotipo, la primera de 80 a 120 pb, la segunda, una
diminución en la frecuencia de picos entre 120 y 140 pb, y la tercera, la región
hiperexpandida, este comportamiento es clasificado como heterocigoto
(premutante/hiperexpandido).
4. Datos moleculares del Albinismo oculocutáneo tipo 1A
A partir de las muestras de ADN normalizadas se procedió a hacer la amplificación del exón
1 con la metodología descrita por Sanabria y colaboradores en 2012 [25] flanqueando la
secuencia de ADN de la mutación c. 124G˃A en el gen TYR.
Fueron amplificadas 26 muestras, todas presentan una banda única a la altura de 350 pb
aproximadamente, como se muestra en la Figura 5. Luego de enviar a secuenciar los
amplificados se analizaron los cromatogramas de las secuencias buscando cuantos picos y
qué bases existen en la posición nucleotídica 124 de los fragmentos comparada contra
secuencia de referencia (U01873.1) para caracterizar el estado alélico.
23
Figura 5. Amplificación del exón 1 del gen TYR. Las muestras DEA13, P1, JEAC2 Y
OLLC1 muestran una banda de 350 pb aproximadamente; el carril MP50 muestra el
marcador de peso de 50 pb y la muestra (-) es el control negativo de la PCR.
En el cromatograma de la secuencia de productos amplificados se encontraron 3 genotipos para
el nucleótido 124 pb: Primero, una lectura que corresponde a Adenina (figura 6a); segundo, dos
lecturas superpuestas, una qué corresponde a de adenina y la otra qué corresponde a guanina
(figura 6b); y, por último, una lectura que corresponde a Guanina (figura 6c).
Figura 6. Secuencia de los cromatogramas correspondiente a los genotipos de los participantes. A.
Se observa la base adenina propia de la mutación c. 124G˃A, indicándolo como un paciente de
albinismo. B. Se observan dos bases adenina y guanina, una por cada tipo de alelo, indicándolo como
participante heterocigoto de la mutación c. 124G˃A. y, por último, C. Se observa la base guanina,
éste es el cromatograma esperado en un alelo normal para la mutación.
Con la categorización descrita anteriormente, se puede caracterizar a los 26
participantes analizados. Se encontraron 16 homocigotos dominantes, 9 heterocigotos y 1
homocigoto recesivo, el cual era el control con Albinismo como se resume en la Tabla 6 y se
diagrama en la Figura 7.
24
Tabla 6. Categoría alélica para Albinismo oculocutáneo tipo 1A para la mutación c. 124G˃A
Código Muestras y controles Código dentro del árbol
genealógico
Datos moleculares para
OCA 1A
DEA13 Control homocigoto
recesivo IV.34 c. 124A/124A
OLLC1 Control heterocigoto III.8 c. 124G/124A
JEAC2 Control heterocigoto III.9 c. 124G/124A
JBLC102 Muestra III.1 c. 124G/124G
EMAC103 Muestra III.14 c. 124G/124G
DALR104 Muestra V.15 c. 124G/124G
MAAG105 Muestra IV.45 c. 124G/124A
MGLC106 Muestra III.4 c. 124G/124A
GLLC107 Muestra III.7 c. 124G/124A
SAC151 Muestra III.10 c. 124G/124G
SJAC152 Muestra III.15 c. 124G/124A
GMLC153 Muestra III.3 c. 124G/124A
YMLR154 Muestra V.16 c. 124G/124G
RMRL155 Muestra IV.11 c. 124G/124A
MAAG156 Muestra IV.36 c. 124G/124G
FXAA157 Muestra V.32 c. 124G/124G
LRAG158 Muestra IV.47 c. 124G/124G
EBA159 Muestra V.33 c. 124G/124G
JGBA160 Muestra V.34 c. 124G/124G
MGAG161 Muestra IV.51 c. 124G/124G
SVIA162 Muestra V.47 c. 124G/124G
MAL163 Muestra III.6 c. 124G/124A
P1 Control homocigoto
dominante No aplica c. 124G/124G
P2 Control homocigoto
dominante No aplica c. 124G/124G
P3 Control homocigoto
dominante No aplica c. 124G/124G
P4 Control homocigoto
dominante No aplica c. 124G/124G
25
Figura 7. Árbol genealógico de la familia extensiva, con la familia inicial descrita por
Torres-Tobar en el centro y los pacientes con Albinismo marcados con color negro sólido,
los portadores de la mutación c. 124G˃A. se presentan con un punto negro dentro de su
símbolo y los homocigotos dominantes no tienen ninguna marcación. Los demás miembros
que no han sido evaluados aún presentan un interrogante.
Discusión.
Se realizó un análisis molecular de algunos miembros de la familia extensiva de interés
dando alta prioridad a la tercera generación del pedigrí, por ser la más antigua viva, todos los
miembros de esa generación dan información relevante sobre como estudiar a los miembros
de sus subfamilias de la cuarta y quinta generación.
Para detallar esta explicación, se puede asumir que los miembros de la generación tres
no se han casado con familiares lejanos, y su caracterización sería decisiva, por ejemplo, el
individuo JBLC102 es homocigoto dominante para Albinismo oculocutáneo tipo 1A y para
Ataxia de Friedreich, lo que significa que no es necesario estudiar a toda su subfamilia y es
posible asumir que todos son, al igual que él, homocigotos dominantes para ambas
enfermedades.
Al construir el árbol se encontraron dos matrimonios consanguíneos en la generación
tres y otros dos en la generación cuatro, esto reafirma la necesitad de caracterizar a todos los
miembros de la familia para brindarles información que les permita acceder a consejería
genética y reproductiva en sus EPS.
A partir del análisis molecular de las tripletas para Ataxia de Friedreich, en este estudio
se encontraron 16 miembros de la familia extensiva que tienen al menos un alelo en el rango
normal (36 tripletas), 2 miembros no presentaron amplificación, pero han pasado la edad de
26
diagnóstico (20 años [3]) y solo EBA159 no tiene amplificación y está por debajo de esa
edad. Estos datos preliminares fueron obtenidos usando la técnica de PCR con primers
específicos flanqueantes de la secuencia como screening antes de implementar la técnica de
TP-PCR [2].
Lo anterior se logró estandarizando la técnica propuesta por Filla en 1996 [2], sin
embargo, para este estudio se hizo necesario una modificación al protocolo original, la cual
fue probar variaciones en la temperatura de anillaje del perfil térmico, de 60°C a 70°C, donde
se pudo observar que 65°C es la máxima temperatura de amplificación selectiva, por lo cual,
fue elegida para restringir la amplificación a fragmentos entre 500 pb y 600 pb, estudios
reportan que aumentan la temperatura de anillaje [43] con el fin de evitar inespecificidades
o hiper expansiones producidas por artefactos de la PCR [44]. La amplificación de
fragmentos no deseados se soluciona dando a la PCR el tiempo para que amplifique 1 kb y
restringiendo la temperatura para que solo se amplifique una banda por alelo, evitando
estructuras secundarias de las tripletas [9] en el anillaje. Varios fragmentos obtenidos
mediante esta técnica fueron secuenciados para comprobar que la única diferencia entre
amplicones es la cantidad de tripletas de los alelos.
El rango de 500 pb y 600 pb permite la amplificación selectiva del alelo sano porque
los primers flanquean una región de 500 pb en el caso de no haber presencia de tripletas [2]
[3], y para los fragmentos de mayor tamaño, por ejemplo 550 pb, la diferencia solo son
producto de las repeticiones, entonces se puede saber el número de tripletas responsables
dividendo por 3 la diferencia [3], siguiendo con el ejemplo, 550 pb serían entre 16 a 17
tripletas.
La muestra FXAA157 permite estudiar el rango más alto (600 pb), en el que se
observan 33 - 34 tripletas aproximadamente, número umbral teórico de tripletas para
categorizarlo como alelo normal [8][2], sin embargo al comprobarlo por TP-PCR, el análisis
del electroferograma clasifica la muestra como heterocigoto (premutante/hiperexpandido),
lo cual, nos indica que en ese rango de tamaño de banda, podría amplificarse un alelo con
premutanción corta de un numero cercano a 35 tripletas, aun así, se puede afirmar que la
categoría premutante con la técnica de amplificación selectiva no sería detectable [8].
27
Siguiendo con el análisis de la técnica de PCR con primers específicos, cuando no se
observa amplificación en un participante que ha superado la edad de diagnóstico [3], como
ejemplo SAC151 y SJAC152, se podría asumir heterocigosis (premutante / hiper expandido)
u homocigosis premutante [7], en la comprobación por TP-PCR de dichas muestras se
clasificaron como heterocigotos (premutante / hiper expandido), aunque no se observó la
categoría de homocigosis premutante el empleo de ésta técnica podría evaluarlos.
En el caso de no observar amplificación en un paciente que no haya pasado la edad de
diagnóstico [3], como EBA159, se debe comprobar la calidad y cantidad de ADN antes
incluir en las asunciones anteriores, la homocigosis recesiva. El análisis por TP-PCR se
vuelve prioridad para un posible diagnóstico en este último caso.
Otra situación por analizar es la presencia de una sola banda en la PCR con primers
específicos, que fue la amplificación más frecuentemente obtenida en este estudio (Tabla 4),
lo cual puede indicar dos cosas [7]:
1. Solo hay un alelo en el rango de 500 – 600 pb (0 – 34 tripletas), esto podría
clasificar al paciente como heterocigoto.
2. Ambos alelos normales tienen el mismo tamaño y en este caso sería una
homocigosis de alelos normales.
Estas dos situaciones son indistinguibles por la técnica de amplificación selectiva del
alelo sano [7] y, para dilucidar el resultado correcto se analizó las muestras por TP- PCR.
De las 17 muestras que presentaban una solo banda, 9 fueron clasificadas como
heterocigotos (sano/hiperexpandido) y 7 como homocigotos dominantes (Sano/Sano) por la
técnica TP-PCR, y solo la muestra FXAA157 no fue clasificada correctamente por la técnica
PCR con primers específicos, debido a que es heterocigoto (premutante/hiperexpandido)
como fue previamente mencionado.
Mediante el empleo de la técnica de amplificación selectiva del alelo sano, solo es
posible categorizar correctamente a los pacientes homocigotos dominantes (sano/sano)
cuando sus dos alelos difieren en al menos 10 pb y se observan dos bandas [7], como es el
caso de P1 y SVIA162, datos que fueron comprobados por TP-PCR.
28
Por las anteriores razones, la PCR con primers específicos propuesta por Filla [2] y
modificada en este trabajo, se considera screening de alelos sanos previo a la técnica TP-
PCR [7], dando información sobre si hay al menos un alelo en el rango de 7 a 35 tripletas
antes de pasar a la construcción de los electroferogramas, además fue posible discriminar el
5.5% de las muestras correctamente como homocigotos dominantes (sano/sano) antes de
analizarlas por TP-PCR. Cabe resaltar que no se observaron falsos positivos.
En estudios poblaciones este screening para tripletas del intrón 1 de gel FXN,
permitirían descartar inicialmente a los homocigotos dominantes (sano/sano) cuando sus dos
alelos difieren en al menos 10 pb y reduciría los costos de estudiarlos por TP-PCR.
En el análisis molecular del Albinismo oculocutáneo tipo 1A solo se encontró la
mutación c. 124G˃A en el gen TYR, que daña por completo la función de la tirosinasa [29].
Esto se explica por un posible cambio del dominio topológico de interacción con el
melanosoma [30] según el programa mutationtaster2 [31].
Dicha mutación fue reportada por primera vez en Colombia por Sanabria y
colaboradores en un hombre con Albinismo oculocutáneo tipo 1A, en estado de heterocigosis
compuesta con la mutación G47D ubicada también en el primer exón del gen [25] [45] y a
nivel mundial por M, Chaki entre los años 2005 y 2006 en una familia perteneciente al grupo
étnico Garai de India [46], [47], este último es el primer reporte sobre la mutación encontrado
en HGMD human gene mutation database con el código CM063225, donde establecen que
la mutación afecta un residuo conservado entre especies [48].
Aunque en la población se encontró la mutación reportada en homocigosis para el
Albinismo oculocutáneo tipo 1A, también se reporta en literatura la heterocigosis compuesta
para dicha enfermedad [25] [38], [44], donde dos mutaciones diferentes afectan de manera
irreparable a la misma proteína [49], la homocigosis de la mutación c. 124G˃A presente en
la población podría ser causada por la endogamia presente en la región luego de un efecto
fundador del que no tenemos registro.
29
Con este estudio se caracterizó a nivel de alelos a los 26 participantes analizados. Se
encontraron 16 homocigotos dominantes para la mutación c. 124G˃A, los cuales no tienen
riesgo de heredar algún alelo afectado pues no lo portan, 9 heterocigotos para la mutación c.
124G˃A que dependiendo del genotipo de su pareja tienen probabilidad variable de trasmitir
sus alelos, esto muestra la necesidad de dar a conocer esta información a la población, donde
podrían presentarse más pacientes en las siguientes generaciones.
Finalmente, para la paciente homocigota recesiva, la cual era el control positivo de
Albinismo oculocutáneo tipo 1A dentro del estudio, la probabilidad de heredar a cada hijo el
alelo afectado es del 100%, es decir, todos sus hijos van a ser portadores de la mutación c.
124G˃A.
Todas estas probabilidades deben ser consideradas en una consejería genética en cada
concepción que deseen tener los miembros de la población, porque estas enfermedades de
origen genético en la actualidad no tienen cura y, sin embargo, el conocimiento molecular de
los portadores permite diseñar estrategias de asesoría genética, además el diagnóstico
temprano permite tratamientos oportunos para los miembros que padecen alguna de las dos
enfermedades o ambas.
Todos los resultados de este estudio se ilustran en la Figura 8 donde es posible distinguir
el genotipo de todos los participantes, se encontraron 4 participantes que son heterocigotos
para ambas enfermedades.
Figura 8. Árbol genealógico de la familia extensiva, con la familia inicial descrita por
Torres-Tobar en el centro y todos los genotipos encontrados en los participantes, siendo
un circulo interno el símbolo para portador de: en verde Ataxia de Friedreich, y rojo
Albinismo oculocutáneo tipo 1A. El símbolo para paciente de dichas enfermedades es
el diagrama completamente lleno con el color correspondiente.
30
Este tipo de estudio se hace necesario para el desarrollo e implementación de políticas
públicas en salud, especialmente a nivel rural, para el manejo de enfermedades recesivas
huérfanas en el territorio colombiano. Además, su divulgación, no solo en el ámbito
científico si no social, cultural y gubernamental, representa una mejora en la calidad de vida
de los participantes y sus familias al recibir apoyo médico interdisciplinar y donaciones.
Agradecimientos.
Este proyecto hubiera sido imposible sin el apoyo de todos los miembros del laboratorio de
genética humana de la Universidad de los Andes, del Instituto de ciencias básicas de la
Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud y sin la ayuda de instituciones como
corporación Corpogen, específicamente Dayana Calderón Manrique.
Especiales agradecimientos a la Universidad de los Andes por la aprobación de este
proyecto para su ejecución en la convocatoria para la financiación de proyectos de
Investigación y presentación de resultados en eventos académicos, y, a la Fundación
Universitaria de Ciencias de la Salud por el aval en la convocatoria interna para el fomento de
la investigación FUCS 2018, Modalidad 2: “Consolidación e Innovación”. Juntas dieron los
recursos necesarios para la financiación del proyecto.
31
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Anexo 1
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
La Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud y la Universidad de los Andes lo están invitando a participar como voluntario en un estudio que busca caracterizar los portadores de una población humana para Ataxia de Friedrich y Albinismooculocutáneo tipo I, los cuales no presentan ninguna sintomatología, pero podrían heredar esta característica a su descendencia. Este documento de consentimiento informado le proporcionará la información necesaria para ayudarle a decidir sobre su participación en el estudio. Por favor lea atentamente la información. Si cualquier parte de este documento no le resulta claro, si tiene alguna pregunta o desea solicitar información adicional, no dude en pedirla en cualquier momento a alguno de los miembros del equipo de estudio, quienes se mencionan al final de este documento.
NATURALEZA Y PROPÓSITO DEL ESTUDIO
Se realizará un análisis genético de dos enfermedades relacionadas encontradas en la misma población, conocidas como Ataxia de Friedrich y Albinismooculocutáneo tipo IA. Para ello, se van a buscar alteraciones en los genes, en pacientes de una familia de Cundinamarca, Colombia. Actualmente, las pruebas que existen para diagnosticar estas enfermedades, si no se apoyan en varios estudios, pueden llevar a un diagnóstico incompleto o a confundir una enfermedad con otra. El estudio genético reforzará el diagnóstico de estas enfermedades. Adicionalmente, dicho diagnóstico genético facilitará la detección de portadores de las enfermedades, los cuales podrían acceder a consejería genética temprana.
DURACION ESPERADA DE LOS PARTICIPANTES DEL ESTUDIO
La duración del estudio es de un año. Tenga en cuenta que su participación dentro del proyecto es voluntaria y consiste en donar sangre en una única ocasión.
PROCEDIMIENTOS DEL ESTUDIO
Las muestras de sangre serán tomadas durante en la zona de residencia de la familia con la ayuda de personal especializado. Estas muestras serán empleadas para hacer los análisis genéticos correspondientes. Se tomarán dos muestras de sangre de 5 ml cada una. Se mantendrá la confidencialidad de los participantes en el estudio, reemplazando sus nombres por códigos. Los resultados de este estudio serán publicados en revistas científicas o actividades académicas, manteniendo su confidencialidad y serán dados a conocer primero a los participantes, para que puedan acceder a una consejería genética temprana con su pareja, por parte de un médico genetista asignado por su entidad promotora de salud.
MANEJO DE MUESTRAS DE OBTENIDAS
TÍTULO: Caracterización de portadores de las mutaciones de ataxia de Friedreich y de albinismo
oculocutáneo tipo IA en una población humana bajo condiciones de endogamia
PATROCINADOR: Fundación universitaria de ciencias de la salud
DIRECCIÓN DEL PATROCINADOR: Cr. 54 #67a80, Bogotá, Colombia.
INVESTIGADORES PRINCIPALES:
Msc. Lilian Torres Tobar- Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud
Dra. Helena Groot de Restrepo – Universidad de Los Andes
COINVESTIGADORES: Ing. Andrea Rodríguez Carrillo- Universidad de los Andes
DIRECCION Y TELEFONO DE INVESTIGADORES:
Msc. Torres: Cr. 54 #67a80, Bogotá, Colombia, 3123518376
Dra. Groot: Cra. 1 # 18a-12, M1 Segundo piso, Bogotá, Colombia, Tel: 3394949 ext. 2790/2847
SITIO DE INVESTIGACIÓN: Instituto de Genética Humana, Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud
DIRECCION DEL SITIO DE INVESTIGACIÓN: Cr. 54 #67a80, Bogotá, Colombia.
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Sus muestras serán tomadas por un profesional en enfermería o bacteriología, con experiencia; en la residencia familiar en Cundinamarca, Colombia. Las muestras serán embaladas y enviadas al Laboratorio de Genética y Biología Molecular de la FUCS para ser registradas. Su muestra será utilizada para este estudio, y en caso de que usted lo autorice, será almacenada para estudios posteriores relacionados con el tema, únicamente para propósitos investigativos, que contribuirán significativamente en el avance de la ciencia en Colombia. En caso de no autorizarlo, el material será DESCARTADO al concluir los experimentos y no se almacenará ningún tipo de información personal o identificadora de las muestras. Con base en lo anterior, ¿está usted de acuerdo en que se almacene el material extraído para estudios posteriores relacionados con el tema? (marque con una X su respuesta) SI NO
RIESGOS Y BENEFICIOS
Personalmente el beneficio que podrá recibir al participar en este estudio es la caracterización de su información genética respecto a ambas enfermedades, la cual le será dada a conocer por un médico especialista. Del mismo modo, su médico tratante le orientará para buscar apoyo y asesoría en su EPS correspondiente. La información que se derive de estos estudios permitirá avanzar en el estudio de la Ataxia de Friedreich y el Albinismooculocutáneo tipo IA.
POSIBLES EFECTOS COLATERALES
La toma de sangre representará riesgo mínimo para su integridad física. El único efecto colateral podría ser una leve molestia, hematoma (morado), o inflamación, que cederá rápidamente, en caso contrario, llame a su entidad promotora de salud.
COMPENSACIÓN
No habrá ninguna compensación económica por su participación en este estudio. Se entregaran los resultados de los hallazgos genéticos estudiados solo si los participantes así lo solicitan.
QUE MÁS NECESITA SABER ANTES DE DECIDIR PARTICIPAR EN EL ESTUDIO
Usted recibirá una copia de este formato de Consentimiento Informado, consérvela en un lugar seguro y utilícela como información y referencia durante todo el desarrollo del estudio. Esta investigación se llevará acabo de acuerdo con la resolución 8430 de 1993 del Ministerio de Salud. Este documento fue revisado y aprobado por el Comité Corporativo de Ética en Investigación del Hospital de San José y la Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud y la Universidad de Los Andes, y cumple con todos los requerimientos metodológicos y éticos para ser desarrollado.
QUE OCURRIRÁ SI DECIDE NO PARTICIPAR O SI CAMBIA DE IDEA DESPUÉS DE HABER ACEPTADO.
La participación en este estudio es totalmente voluntaria, usted no está obligado a participar, puede retirarse en cualquier momento sin justificar su decisión, sin sufrir ninguna sanción o detrimento en la atención por parte de su médico ni de la Institución. “Para cualquier aclaración sobre sus derechos como participante en este estudio o crea que los mismos han sido vulnerados, puede comunicarse con el Comité Corporativo de Ética en Investigación, en una carta dirigida al Presidente del Comité – teléfono 3394949 Ext. 5339/3211 o al Correo electrónico:comite-etica-
QUIÉNES PUEDEN CONTESTAR SUS PREGUNTAS
Lilian Torres Msc.
Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud
Ciencias Básicas en Salud
Tel: 3123518376
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Helena Groot de Restrepo Ph.D. Andrea Rodríguez Carrillo
Laboratorio de Genética Humana Laboratorio de Genética Humana
[email protected] [email protected]
Tel: 3394949 Ext. 2759/2755 Tel: 3394949 Ext. 2847
DECLARACIÓN DE CONSENTIMIENTO INFORMADO
Al firmar este formulario, certifico todos los puntos siguientes:
He leído (o me han leído) este formulario de consentimiento informado en su totalidad y he recibido explicaciones sobre lo que me van a hacer y lo que se me pide que haga. He tenido la oportunidad de hacer preguntas y entiendo que puedo hacer otras preguntas sobre este estudio en cualquier momento. He recibido una copia de este formulario de Informe de Consentimiento que puedo guardar como referencia. Acepto que mi información personal confidencial esté disponible para que la revisen: los investigadores o si corresponde, por el Comité de Revisión Institucional o el Comité de Ética. Entiendo que tengo la libertad de retirarme del estudio en cualquier momento, sin justificar mi decisión y sin afectar la atención médica que reciba. Entiendo que los resultados cualesquiera que sean serán publicados por los investigadores. Acepto voluntariamente participar en este estudio o a permitir que la persona de la que soy tutor legal participe.
FIRMAS
Nombre completo de la persona que realiza el procedimiento del consentimiento informado
Firma y Fecha
Teléfono de contacto del participante:
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Anexo 2
