Asignatura: Microbiología de los alimentos

Docente: Dr. César Julio Cáceda Quiroz

Alumnos: José Sandoval Niebles

Franco Liñan Vigo

Códigos: -

- 2011-118 007

EL RECUENTO AERÓBICO EN PLACA

Autores: Larry Maturin y James T. Peeler

EL RECUENTO AERÓBICO EN PLACA

El recuento aeróbico en placa (APC) está destinado para indicar el nivel de

microrganismos en un producto. Procedimientos detallados para la determinación

de APC en comidas han sido desarrollados por la Asociación de Química Analítica

Oficial (AOAC) (3) y la Asociación Americana para la Salud Pública (APHA) (1). El

método convencional del recuento en placa para examinar alimentos congelados,

refrigerados, precocinados o preparados que se describen a continuación,están de

acuerdo a los Métodos de Análisis Oficial de la AOAC, sec. 966.23, con un cambio

de procedimiento (966.23C). El rango adecuado de recuento de colonias (10) es

25-250. El método de recuento en placa espiral automatizado para el examen de

los alimentos y cosméticos (5), que se describe a continuación, de acuerdo a los

Métodos de Análisis Oficial, sec. 977.27. Para más detalles de procedimiento del

recuento en placa estándar, ver la ref. 2.

Las pautas para calcular y reportar el conteo de placas se han cambiado para

ajustarse a los cambios previstos en la 16ª edición de los Métodos estándar para

el examen de los productos lácteos (2) y los procedimientos de la Federación de

Lácteos Internacional (IDF) (6).

Método Convencional de Recuento en Placa

A. Equipos y materiales

1. Área de trabajo, una mesa nivelada con una amplia superficie en una

habitación que esté limpia, bien iluminada y bien ventilada, razonablemente

libre de polvo y de corrientes de aire. La densidad microbiana del aire del

área de trabajo, medida en precipitados vertidos en placas tomada durante

el plaqueo, no deberá exceder de 15 colonias / placa durante 15 minutos de

exposición.

2. El área de almacenamiento, libre de polvo e insectos y adecuada para la

protección de equipos y suministros

3. Placas Petri, de vidrio o plástico (al menos 15x90mm)

4. Pipetas con bombilla (no pipetear con la boca) o pipeteadores de 1,5, y 10

ml graduado en 0.1 ml

5. Botellas de dilución, de 160 ml, vidrio de borosilicato resistente, con

tapones de goma o tapas rosca de plástico.

6. Contenedores para pipetas y placas Petri, adecuadas para la protección.

7. Baño de agua circulante, para el temperado del agar, controlada

termostáticamente a 45°C + 1°C.

8. Incubadora, 35 + 1°C; leche, 32 ± 1°C

9. Contador de colonias de campo oscuro, Quebec, o equivalente, con fuente

de luz adecuada y placa de rejilla.

10.Registro del recuento

11.Blanco de dilución, 90 ± 1 ml de agua de dilución de fosfato tamponado

Butterfield (R11); leche, 99 ± 2 ml

12.Agar para recuento en placa (métodos estándar) (M124)

13.Frigorífico, para enfriar y mantener las muestras a 0-5 ° C; leche, 0-4,4 ° C

14.Congelador, para mantener las muestras congeladas -15 a -20 ° C

15.Termómetros (de mercurio) de rango adecuado; la exactitud comprobada

con un termómetro certificado por el Instituto Nacional de Estándares y

Tecnología (NIST)

B. Procedimiento para el análisis de alimentos refrigerados,

congelados, precocinados elaborados

Utilizar pipetas estériles separadas, preparar diluciones decimales de 10-2, 10-3,

10-4, y otras si es necesario, del homogeneizado del alimento (véase el

Capítulo 1 para la preparación de muestras) mediante la transferencia de 10 ml

de la dilución anterior a 90 ml de diluyente. Evitar la espuma de muestreo.

Agitar todas las diluciones 25 veces en un arco de 30 cm (1 pie) por 7 s.

Pipetear 1 ml de cada dilución en las placas Petri separadas y por duplicado,

apropiadamente marcadas. Volver a agitar la botella de dilución 25 veces en un

arco de 30 cm durante 7 segundos si esta estuvo en reposo por más de 3

minutos antes de que esta sea pipeteada en la placa de Petri. Añadir 12-15 ml

de Agar de Recuento en Placa (enfriado a 45 ± 1 ° C) a cada placa dentro de

15 min de la dilución inicial. Para las muestras de leche, verter un control de

agar, verter un control de agua de dilución y pipetear el agua para un control de

pipeta. Añadir agar para las últimas dos series de muestras. Añadir agar

inmediatamente a las placas Petri cuando el diluyente de la muestra contenga

materias higroscópicas, p.e., harina y almidón. Verter al azar el agua de

dilución de las placas control para cada una de las series de las muestras.

Inmediatamente mezcle las diluciones de la muestra y el medio de agar por

completo y uniformemente por rotación alternada y movimiento de atrás y hacia

delante de las placas sobre una superficie en plano horizontal. Deje que el agar

solidifique. Invierta las placas de Petri solidificadas, e incube inmediatamente

por 48 ± 2 h a 35°C. No apilar las placas cuando vierta el agar o cuando el agar

esté solidificando.

C. Pautas para calcular y reportar APCs de casos no comunes

Los Métodos Oficiales de Análisis (3) no provee pautas para el conteo y

reporte de los recuentos en placa, mientras que los Métodos Estándar para la

Examinación de Productos Lácteos, 16va ed. (2) presenta indicaciones

detalladas, por uniformidad, por lo tanto, utilizar la guía del APHA como se

modificó (6,8). Reportar todos los recuentos aeróbicos en placa (2) calculados

de placas por duplicado. Para muestras de leche, reporte todos recuentos

aeróbicos en placa (2) calculados de placas por duplicado que contienen

menos de 25 colonias como un recuento estimado de menos de 25. Reportar

todos los recuentos aeróbicos en placa (2) calculados de placas por duplicado

que contienen más de 250 colonias como recuentos estimados. Los recuentos

fuera del rango normal de 25-250 pueden dar indicaciones erróneas de la

actual composición bacteriana de la muestra. Los factores de dilución pueden

exagerar recuentos bajos (menos de 25), y las placas llenas (mayores de 250)

pueden dificultar el recuento o inhibir el crecimiento de alguna bacteria,

resultando en un recuento bajo. Reportar los recuentos menores de 25 o de

más de 250 colonias como recuentos aeróbicos estimados en placa (EAPC).

Utilizar la siguiente guía:

Placas normales (25-250):

Seleccione placa(s) libre de esparcimiento. Cuente todas las unidades

formadoras de colonia (UFC), incluyendo aquellas del tamaño de la

punta de un alfiler, sobre las placa(s) seleccionada(s). Registre la

dilución(s) utilizada y la cantidad total de colonias contadas.

Placas con más de 250 colonias:

Cuando la cantidad de UFC por placa excede a 250, para todas las

diluciones, registre los recuentos como demasiado numeroso para el

conteo (TNTC) para todas pero para la placa más cercana a 250, y el

recuento de UFC en estas porciones de las placa que son

representativas de la distribución de la colonia. Vea la ref. 2 para

indicaciones detalladas. Señalar el calculó de APC como EAPC para

denotar que fue estimado los recuentos fuera del rango de 25-250 por

placa (vea 4-3).

Esparcimientos (Crecimiento difusivo en superficie):

Las colonias que se esparcen usualmente son de 3 tipos distintos: 1)

una cadena de colonias, no lo suficientemente distanciadas para

diferenciarlas, que parecen ser causadas por la desintegración de un

grupo bacteriano; 2) una que se desarrolla en una película de agua

entre el agar y el fondo de la placa; y 3) una que se forma en una

película de agua en el borde o en la superficie del agar.

Si las placas preparadas de la muestra tienen un excesivo crecimiento

esparcido tanto que (a) un área es cubierta por los esparcimientos,

incluyendo el área total del crecimiento reprimido, que excede el 50%

del área de la placa, o (b) el área del crecimiento reprimido excede el

25% del área de la placa, reportar las placas como esparcidas. Cuando

sea necesario el recuento de las placas que contengan propagaciones

no eliminadas por (a) o por (b) mencionado, cuente cada uno de los 3

tipos distintos de esparcimiento como una fuente. Para el primer tipo, si

solo existe una cadena, contarlo como una colonia simple. Si aparecen

una o más cadenas que se originan de fuentes separadas, contar cada

fuente como una colonia separada. Los tipos 2 y 3 usualmente resultan

en colonias distintas y son contadas como tales. Combine el recuento

de propagación y el recuento de la colonia para calcular el APC.

Placas sin UFC:

Cuando las placas de todas las diluciones no tienen colonias, reportar

el APC como menos de 1 vez la correspondiente dilución más baja

utilizada. Marcar el cálculo del APC con asterisco para denotar que fue

estimado de los recuentos fuera del rango de 25-250 por placa. Cuando

se sabe que la placa(s) de una muestra está contaminadas o presenta

otra irregularidad, registrar el resultado(s) como accidente de

laboratorio (AL).

D. Cálculo y registro de los recuentos (vea refs. 6, 8)

Para evitar crear una impresión ficticia de la precisión y exactitud cuándo se

calcula el APC, reportar solo los dos primeros dígitos significantes.

Redondear a dos cifras significativas únicamente en el momento de la

conversión a SPC. Para muestras de leche, cuando las placas para todas las

diluciones no tienen colonias, reportar el APC como un recuento estimado con

menos de 25 colonias. Redondear subiendo el segundo dígito hasta el

siguiente número más alto cuando el tercer dígito sea 6, 7, 8, 9 y use ceros

para cada dígito sucesivo hacia la derecha del segundo dígito. Redondee

hacia abajo cuando el tercer dígito sea 1, 2, 3, ó 4. Cuando el tercer dígito sea

5, redondee hacia arriba cuando el segundo dígito sea impar y redondee hacia

abajo si fuera par.

Ejemplos:

Calculo del Recuento

APC

12,700 13,00012,400 12,00015,500 16,00014,500 14,000

1. Placas con 25-250 UFC

a) Calcular el APC como sigue:

(31+31 ) colonias0.0015ml

=4.1 x104

Donde:N= Número de colonias por ml o g de producto∑C= Sumatoria de todas las colonias en todas las placas contadasn1=Número de placas en la primera dilución contadan2= Número de placas en la segunda dilución contadad= Dilución de la cual los primeros conteos fueron obtenidos

Ejemplo

1:100 1:1000

232, 244 33, 28

N=¿¿

=537÷0.022

=24,409

≈24,000

b) Cuando el conteo de las placas duplicadas caen dentro y fuera del

rango de 25-250 colonias, utilizar sólo aquellos recuentos que caen

dentro de este rango.

2. Todas las placas con menos de 25 UFC. Cuando las placas de ambas diluciones produzcan menos de 25 UFC cada una, registrar el recuento actual de la placa pero registre el conteo como menos de 25 x 1/d cuando d sea el factor de dilución para la dilución de la cual los primeros recuentos fueron obtenidos.

Ejemplo

Colonias1:100 1:1000 EAPC/ml (g)

18 2 <2,5000 0 <2,500

3. Todas las placas con más de 250 UFC. Cuando las placas de las 2 diluciones producen más de 250 UFC cada una (pero menos de 100/cm2), estimar los recuentos aerobios de las placas (EAPC) más cercanas a 250 y multiplíquela por la dilución.

Ejemplo

Colonias1:100 1:1000 EAPC/ml (g)

TNTC 640 640,000

TNTC (DNPC): demasiadas numerosas para contarEAPC (RAPE): Recuento aerobio de placas estimado

4. Todas las placas con esparcimientos y/o accidente de laboratorio. Reportar respectivamente como Esparcidas (SPR), o Accidente de Laboratorio (AL).

5. Todas las placas con más de un promedio de 100 UFC por cm2. Estimar el APC como mayor de 100 veces la dilución plaqueada más alta, veces del área de la placa. Los ejemplos de abajo tienen un promedio de recuento de 110 por cm2.

Colonias/Dilución

1:100 1:1000 EAPC/ml (g)

TNTC 7,150(a) >6,500,000 EAPC(b)

TNTC 6,490 >5,900,000 EAPC

(a) Basado en un área de placa de 65 cm2

(b) EAPC, APC estimado(c) Basado en un área de placa de 59 cm2

Método de la Placa en Espiral

El método de recuento en placa en espiral (SPLC) para los microorganismos en la

leche, alimentos y cosméticos es un método oficial de la APHA (2) y la AOAC (3).

En este método, un Plaqueador mecánico inocula en una placa de agar que rota

con muestra líquida. El volumen de la muestra dispensada disminuye como los de

la aguja de dispensación se mueve desde el centro hasta el borde de la placa

giratoria. La concentración microbiana se determina contando las colonias en una

parte de la placa de Petri donde sea fácilmente contable y dividiendo este

recuento por el volumen apropiado. Una inoculación determina densidades

microbianas entre 500 y 500 000 microorganismos / ml. Diluciones adicionales

deben ser hechas para concentraciones microbianas altas sospechosas.

A. Equipos y materiales:

1. Plaqueador espiral (Spiral Sistemas Instruments, Inc., 7830 Old

Georgetown Road, Bethesda, MD 20814)

2. Contador de colonias Espiral (Spiral Systems) con rejilla especial para

relacionar volúmenes de muestras depositadas a partes específicas de

placas de Petri

3. Trampa de vacío para la eliminación de líquidos (botella de vacío de 2-4

litros para actuar como depósito de vacío y la fuente de vacío de 50 a 60 cm

de Hg)

4. Micro vasos de precipitado disponibles, 5 ml

5. Placas de Petri de plástico o de vidrio, 150 x 15 mm o 100 x 15 mm

6. Agar para recuento en placa (métodos estándar) (M124)

7. Calculadora (opcional), se recomienda una calculadora de mano electrónico

de bajo costo

8. Bolsas de polietileno para el almacenamiento de placas preparados

9. Solución de hipoclorito de sodio comercial, cerca del 5% NaOCl (lejía)

10.Agua de dilución estéril

11.Jeringa, con punta Luer para obstrucciones en aguja; capacidad no crítico

12.El área de trabajo, espacio de almacenamiento, nevera, termómetros,

contador, incubadora, como se describe para el método convencional de

recuento en placa, mencionada arriba.

13.Solución de hipoclorito de sodio (5,25%). Comercialmente disponible.

B. Preparación de las placas de agar.

Se recomienda dispensador automático con sistema de entrega estéril para

preparar placas de agar. Volumen dispensado de agar en placas es

reproducible y la tasa de contaminación es baja en comparación con el vertido

a mano de agar en laboratorio abierto. Cuando sea posible, utilice campana de

flujo laminar junto con dispensador automatizado. Vierta la misma cantidad de

agar en todas las placas de manera que la misma altura de agar se presentará

a la punta del Plaqueador espiral para mantener el ángulo de contacto. Las

placas de agar deben estar al mismo nivel durante el enfriamiento.

El siguiente método se sugiere para el pre-vertido de placas de agar: Usar el

dispensador automático o verter cantidad constante (alrededor de 15 ml / 100

mm placa; 50 ml / 150 mm plato) de agar estéril a 60-70 ° C en cada placa de

Petri. Deje solidificar el agar en una superficie plana con las placas vertidas en

pilas de no más de 10 placas. Coloque las placas de agar solidificado en

bolsas de polietileno, cierre con lazos o calor sellador y almacenar invertidas a

0-4.4 ° C. Llevar las placas previamente vertidas a temperatura ambiente

antes de la inoculación.

C. Preparación de las muestras.

Como se describe en el capítulo 1, seleccione esa parte de la muestra con

menor cantidad de tejido conectivo o glóbulos de grasa.

D. Descripción del Plaqueador en espiral.

El Plaquador en espiral inocula la superficie de agar preparada en placa para

permitir la enumeración de microorganismos en soluciones que contienen

entre 500 y 500 000 microorganismos por ml. Operador con formación mínima

puede inocular 50 placas por hora. Dentro del rango indicado, no se requieren

botellas de dilución o pipetas y otros equipos auxiliares. El espacio en

laboratorio requerido es mínimo, y el tiempo para comprobar la alineación del

instrumento es de menos de 2 min. El Plaqueador deposita una cantidad

decreciente de muestra en una espiral de Arquímedes en la superficie del agar

previamente vertido. Se conoce el volumen de la muestra en cualquier parte

de la placa. Después de la incubación, las colonias aparecen a lo largo de la

línea de la espiral. Si colonias en una porción de la placa están

suficientemente separadas entre sí, contarlos en la rejilla especial que asocia

un volumen calibrado con cada área. Estimar el número de microorganismos

en la muestra dividiendo el número de colonias en un área definida por el

volumen contenido en la misma área. Los estudios han demostrado que el

método es eficiente no sólo con leche (4), sino también con otros alimentos

(7,10).

E. Procedimiento de Plaqueado

Comprobar el ángulo de punta de la aguja diariamente y ajustar si es

necesario. (Use vacío para evitar que el cobertor del microscopio resbale en

contra de la cara de la punta de la aguja; si el cobertor de la vía de acceso

está en paralelo de alrededor de 1 mm de la superficie de la plataforma, la

punta es orientada apropiadamente). Los líquidos se mueven a través del

sistema de vacío. Limpiar la punta de la aguja enjuagando durante 1 s con una

solución de hipoclorito de sodio seguido de la dilución con agua estéril para 1

s antes de la introducción de la muestra. Este procedimiento de enjuague

entre el procesamiento de cada muestra minimiza la contaminación cruzada.

Después del enjuague, la muestra arrastrada en la punta del tubo de Teflón de

vacío aplicado a una válvula de 2 maneras. Cuando el tubo y la jeringa se

llenan de muestra, cierre la válvula unida a la jeringa. Coloque la placa de agar

en la plataforma, coloque la punta de la aguja sobre la superficie de agar, y

arrancar el motor. Durante la inoculación, etiquetar la tapa de la placa petri.

Después de que el agar ha sido inoculado, la punta se levanta de la superficie

de agar y dispensador en espiral se detiene automáticamente. Retire la placa

inoculada de plataforma y cubrirla. Mueva la aguja a la posición inicial.

Sistema de vacío-enjuague con hipoclorito y agua, y luego introducir nueva

muestra. Invertir las placas y con prontitud los colocar en la incubadora

durante 48 ± 3 horas a 35 ± 1 ° C.

F. Controles de esterilidad

Comprobar la esterilidad del plaqueador en espiral para cada serie de

muestras plaqueando una dilución estéril de agua.

PRECAUCIÓN: Placas pre-vertidas no deben estar contaminados en la

superficie por una colonia o estar por debajo de la temperatura ambiente

(agua puede liberarse a partir de agar). No deben estar excesivamente secas,

como se indica por las grandes arrugas o apariencia vidriada. No deben tener

gotas de agua sobre la superficie de agar o diferencias en la profundidad del

agar de más de 2 mm, y no deben ser almacenados a 0-4,4 ° C durante más

de 1 mes. El índice de flujo reducido a través del tubo indica obstrucciones o

material en el sistema. Para limpiar las obstrucciones, remover la válvula de la

jeringa, inserte la jeringa manualmente con el Luer restante que contiene

agua, y aplique presión. Usar enjuague de alcohol para remover el material

residual que se adhiere a las paredes del sistema. Disuelva el residuo

acumulado con ácido crómico. Enjuagar bien después de la limpieza.

G. Rejilla de recuento

1. Descripción. Utilizar la misma rejilla de recuento para ambos, placas de

petri de 100 y 150 mm. Una máscara se suministra para su uso con placas

de 100 mm. Rejilla de recuento se divide en 8 trozos iguales; cada cuña se

divide por 4 arcos etiquetados 1, 2, 3, y 4 del borde de la rejilla exterior. Se

añaden otras líneas dentro de estos arcos para facilitar el recuento. Un

segmento es el área entre 2 líneas de arco dentro de una cuña. Número de

áreas contados (por ejemplo, 3) significa el número de segmentos contados

dentro de una cuña. El plaqueador espiral deposita la muestra en la placa

de agar de la misma manera cada vez. La rejilla relaciona las colonias en la

placa espiral con el volumen en el que estaban contenidas. Cuando se

cuentan las colonias con rejilla, el volumen de la muestra es mayor a

medida conteo comienza en el borde exterior de la placa y procede hacia el

centro del esta.

2. Calibración. El volumen de la muestra representada por varias partes de la

rejilla de recuento se muestra en el manual del operador que acompaña al

plaqueador espiral. El área de la rejilla debe ser comprobado por el

fabricante y ser exactas. Para comprobar estos valores, preparar 11

concentraciones de bacterias en el rango de 106 a 103 células / ml haciendo

diluciones 1:1 de suspensión bacteriana (utilizar un esparcidor). Incubar

ambos sets de placas por 48 ± 3 h a 35 ± 1 ° C. Calcular las

concentraciones para cada dilución. Contar las placas en espiral sobre la

superficie de la rejilla, utilizando la regla de recuento de 20 (descrito en el

punto H, a continuación), y registrar el número de colonias contadas y área

de la rejilla sobre la que se contaron. Cada recuento de colonias en espiral

para cada área de la cuadrícula en particular, dividido por el recuento

aeróbico/ml para las correspondientes concentraciones bacterianas de

placa en espiral, indica que el volumen depositado en esa área de la

cuadrícula en particular. Usar la siguiente fórmula:

Volumen (ml ) parael area derejilla=Colonias enespiral contadas enel áreaConteo bacteriano /ml(APC )

Volumen (ml )=31+30colonias

4.1 x104 /ml=0.0015

Para comprobar volumen total dispensado por el plaqueador en espiral, pesar la cantidad dispensada desde la punta de la aguja. Recoger en 5 ml vaso de plástico de 5ml tarados y pesarlos en balanza de precisión (± 0,2 mg).

Figura 1. Placa de 10 cm, área (3b)

(30+31 ) colonias0.0015ml

=4.1x 104

H. El examen y la presentación de informes de los recuentos de placas en espiral.Recuento en regla de 20. Después de la incubación, ajuste el centro de la placa en espiral sobre la cuadricula logrando armar la vista. Elija cualquier cuña y comenzar a contar las colonias desde el borde exterior del primer segmento hacia el centro hasta que se hayan contado 20 colonias. Completar el conteo de las colonias restantes en el segmento donde se produce 20va colonia. En este procedimiento de conteo, los números como 3b, 4c (Fig. 1) se refieren a segmentos de área desde el borde exterior de la cuña hacia línea del arco designado. Cualquier irregularidad de recuento en la composición de la muestra se controla mediante el recuento de los mismos segmentos en la

cuña opuesta y registrando resultados. Ejemplo de placa inoculada en espiral (Fig. 1) demuestra el método para determinar el recuento microbiano. Dos segmentos de cada cuña se contaron en lados opuestos de la placa con 31 y 30 colonias, respectivamente. El volumen de la muestra contenida en los segmentos oscuros es 0,0015 ml. Para estimar el número de microorganismos, dividir el conteo de las colinas entre el volumen contenido en todos los segmentos contados. Ver ejemplo bajo la figura. 1. Si 20 UFC no están dentro de los 4 segmentos de la cuña, cuente UFC en la placa entera. Si el número de colonias supera 75 en el segundo, tercero, cuarto segmento, que también contiene el 20va colonia, el número estimado de microorganismos generalmente será bajo debido a la coincidencia de error relacionado con la aglomeración de las colonias. En este caso, contar cada segmento circunferencial adyacente en todas las 8 cuñas, contando al menos 50 colonias, por ejemplo, si los primeros 2 segmentos de una cuña contienen 19 colonias y el tercer segmento contiene el 20va y 76va (o más), contar las colonias en todos los segmentos, primero y segundo circunferencialmente adyacentes en todos los 8 cuñas. Calcular el volumen contenido en los segmentos contadas de cuñas y dividir entre el número de colonias.

Cuando menos de 20 colonias se cuentan en el total de la placa, reportar resultados como "menos de 500 SPLC por ml. estimado" Si el recuento de colonias es superior a 75 en el primer segmento de cuña, reportar resultados como "mayor que 500.000 SPLC por ml. estimado " No cuente placas espirales con distribución irregular de colonias causadas por errores en la dispensación. Informar los resultados de las placas como accidente de laboratorio (LA). Si la distribución esparcida cubre placa entera, deseche la placa. Si la mitad esta esparcida en el área de la placa, contar sólo aquellas colonias que están bien distribuidos y libre de esparcimiento.Calcule los SPLC a menos que se restrinja por detección de sustancias inhibitorias de sustancias en una muestra, el excesivo crecimiento esparcido o accidentes de Laboratorio. Presente los recuentos como se describe en 4. Reporte los recuento como SPLC o SPLC estimado por ml.Traducido de: FDA, 2001. Bacteriological Analytical Manual, Chapter 3 Aerobic Plate Count.