EXPERIMENTO 5 ENZIMA CATALAZA ACTIVIDAD ENZIMATICA. FACTORES QUE LA AFECTAN. DETERMINACION DE LA CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN. EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.REQUISITOS Repasar la deduccin de la frmula de Michaelis-Menten, sus premisas y aplicacin. Balance de ecuaciones y titulacin OBJETIVOS Describir algunas caractersticas de las enzimas. Determinar la actividad enzimtica de las catalasas, su Km y el efecto de inhibidores sobre la actividad enzimtica.

1.

FUNDAMENTOS

Las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza proteica. Esto significa que son protenas cuya funcin es acelerar las reacciones bioqumicas. Aunque se trata de protenas muchas requieren, para ser activas, un componente no proteico conocido como coenzima o grupo prosttico, segn se encuentre dbil o firmemente asociado a la matriz proteica. La estructura de este componente no proteico va a variar desde un ion (Ca , Mg , Mn , y otros) hasta molculas complejas como NAD+, NADP+ y FAD. En estos casos la actividad enzimtica va a depender de la presencia simultnea de una porcin proteica (apoenzima) y una porcin no proteica (coenzima) y el conjunto activo apoenzima mas coenzima, se conoce como holoenzima. La actividad enzimtica se estudia en el equilibrio, donde no hay cambio neto en la cantidad de sustrato o de producto. En los sistemas biolgicos, las enzimas abaten la energa de activacin y permiten que se produzcan reacciones, que de otro modo, no ocurriran a velocidades mesurables. Las enzimas no se consumen en el proceso y las reacciones catalizadas no alteran la naturaleza de la reaccin, solo disminuyen la energa de activacin. (Figura 1) 60++ ++ ++

Figura 1

Diagrama de energa para reacciones con G positiva y negativa comparando una

reaccin catalizada contra una no catalizada.

Una consecuencia del hecho de que las reacciones bioqumicas sean catalizadas por enzimas es la especificidad de stas hacia el substrato: una enzima cataliza la transformacin de un solo tipo de molcula o de unos tipos diferentes de molculas estructuralmente muy relacionadas, la especificidad representa una ventaja para la clula. Las enzimas dependiendo de las reacciones que catalizan, se han clasificado por la comisin internacional de enzimas (E.C) en cuatro dgitos que anteceden al nombre recomendado para la enzima, este nombre esta compuesto por uno corto unido al nombre de la reaccin que cataliza, los dgitos son: el primero se refiere a la clase y van del 1 al 6, representan la reaccin general catalizada, el segundo la sub-clase, el tercero la sub-subclase y el cuarto designa a cada enzima especifica. En la tabla a continuacin se muestra la clasificacin solamente del primer dgito:

61

Tabla 1. Clasificacin de las enzimas en su primer dgito.

62

Como protenas que son, las enzimas, son molculas de uso delicado por ser fcilmente desnaturalizables. Debido a esto, deben manipularse bajo condiciones que no favorezcan la desnaturalizacin puesto que sta conduce a la inactivacin. Entre las condiciones que se deben controlar durante la manipulacin de las enzimas, cabe destacar: 1.1 Condiciones a controlar durante la manipulacin de las enzimas: La temperatura: La estructura terciaria de una protena es muy sensible a los cambios de la temperatura ya que, como sabemos, se mantiene gracias a fuerzas no covalentes altamente sensibles al calor. Esto hace que la actividad enzimtica muestre una dependencia de la temperatura como la representamos en la figura. 2. Figura. 2 Influencia del aumento de la temperatura sobre la actividad enzimticaInfluencia del aumento de la temperatura sobre la actividad enzimatica8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Aumento de la temperatura (grados centgrados) Actividad Enzimatica U/L

1.1.1. El pH: Debido a que los cambios de pH modifican las concentraciones de los iones H y OH de la solucin, las interacciones electrostticas intra e intermoleculares as como las interacciones entre las molculas de protenas y la solucin de un valor de pH a otro, modificndose as tambin la estructura tridimensional y la actividad de la protena. La grfica que se obtiene cuando se estudia la actividad enzimtica en funcin del pH se parece a la obtenida en el pargrafo anterior como se puede notar en la siguiente figura.

+

-

63

Figura. 3.

Influencia del aumento del pH sobre la actividad enzimticaInfluencia del aumento del pH sobre la actividad enzimticaActividad Enzimtica U/L 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Aumento del pH

1.1.2. La fuerza inica: Como la fuerza inica esta relacionada con la concentracin de los diferentes iones de una solucin y stos pueden influir sobre la estabilidad y la actividad de una protena debe mantenerse un control sobre este parmetro. 1.1.3. La agitacin: Las soluciones de protenas tienen baja tensin superficial, lo cual determina que cuando estas soluciones se agitan violentamente, se forma espuma. la formacin de espuma es un factor que favorece la desnaturalizacin. 1.2. Determinacin de la actividad enzimtica Cuando en el laboratorio se desea estudiar la actividad de una enzima particular, se comienza por controlar algunos parmetros que van a determinar la reproducibilidad de los ensayos. Entre estos parmetros se pueden destacar: 1.2.1. Mtodos de deteccin: Lo primero de que se debe disponer es de un mtodo que permita detectar y cuantificar el producto formado o el substrato remanente despus de la reaccin. Los mtodos ms usados por su rapidez y sencillez, son los colorimtricos y espectrotofomtricos; luego se encuentran la cromatografa en papel, en capa fina o de gases; titulacin, respirometra, otros. 1.2.2. Tiempo de incubacin: Para determinar una actividad enzimtica es necesario fijar un intervalo de tiempo conveniente durante el cual se consuma una cantidad mensurable de substrato. Debe siempre garantizarse que haya un exceso de sustrato. Para determinar el tiempo de incubacin, se mezclan los reactantes en varios recipientes y se detiene la reaccin a diferentes tiempos. Se consigue que mientras no ha ocurrido la saturacin de la enzima por el substrato, la actividad es proporcional al tiempo de incubacin; la saturacin provoca la prdida de la proporcionalidad; sin 64

embargo, no se debe confundir la situacin en que se alcanza la saturacin con la situacin en que se ha agotado el substrato; por esto el substrato debe estar en exceso. La grfica que debe encontrarse es la que se muestra en la figura 4. Figura 4. Velocidad de reaccin frente concentracin del sustrato (V vs. [ S ])

a

b

Para estudiar la reaccin, se puede elegir cualquier lapso comprendido dentro de la barra a y se debe desechar el lapso representado por b, el tiempo debe ser tal que se pueda hacer una determinacin confiable de la actividad. 1.2.3. Concentracin de la enzima: Determinado el tiempo de incubacin y en la seguridad de que la concentracin de substrato es excesiva se incuban las mezclas de reaccin durante el tiempo predeterminado pero con cantidades diferentes de enzimas; si el substrato se encuentra en exceso, se debe hallar una proporcionalidad directa entre la actividad y la concentracin de enzima (Figura.5).

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Figura 5

Actividad enzimtica frente a la concentracin de la enzima Actividad enzimtica frente a la concentracin de la enzimaActividad enzimtica U/L 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentracin de la enzima g

Se debe elegir una cantidad de enzima que permita una determinacin confiable de la actividad. 1.2.4. Concentracin del substrato: La determinacin de este parmetro es muy importante por dos razones principales: a. b. Permite el clculo de las propiedades cinticas Km y Vmax para ese sustrato. Indica definitivamente qu concentracin de sustrato se puede considerar saturante.

Por lo general, se considera saturante y se emplea rutinariamente una concentracin de sustrato [s] = 10 Km. Diga el estudiante a qu fraccin de Vmax corresponde la actividad enzimtica cuando [s] = 10 Km. Como ya el estudiante debe imaginarse, esta determinacin se realiza empleando una cantidad fija de enzima e incubando durante un mismo lapso de tiempo pero con diferentes concentraciones de sustrato. Al hacer esto hay que tomar en ciertas precauciones prcticas: Debe cuidarse con las concentraciones inferiores que no se agote el sustrato en el lapso de tiempo fijado con la cantidad de enzima usada. Para evitar esto hay varias alternativas: aqu las mencionaremos y el estudiante deber averiguar como se justifican: a. b. c. No hacer ninguna modificacin al tiempo ni a la cantidad de enzima determinados. Reducir la cantidad de enzima e incubar durante el tiempo determinado. Reducir el tiempo de incubacin y mantener fija la cantidad de enzima determinada. 66

d. e.

Reducir el tiempo de incubacin y la cantidad de enzima. No emplear concentraciones de sustrato demasiado bajas.

1.2.5. Temperatura de incubacin: Sabemos que la velocidad de una reaccin qumica aumenta al elevarse la temperatura; esto tambin es cierto para las reacciones enzimticas pero el rango de activacin por la temperatura es limitado, generalmente 0C y 45C; aunque estas cifras no son absolutas, por lo general a menos de 0C la actividad es prcticamente indetectable mientras que a ms de 45C la enzima se inactiva, por las razones expuestas previamente. La temperatura ptima de reaccin se determina incubando bajo condiciones constantes de los parmetros previamente determinados y a temperaturas diferentes; la grfica es la mostrada en la Figura 2. 1.2.6. pH de incubacin: Se procede igual que para determinar la temperatura ptima pero slo se vara el pH de la mezcla de reaccin; la grfica que se obtiene es la mostrada en la Figura 2. 1.3. La determinacin de la constante de Michaelis y el efecto de inhibidores sobre la actividad

enzimtica Partiendo de la hiptesis de la formacin del complejo enzima sustrato de que la velocidad de descomposicin del sustrato es proporcional a la concentracin de la concentracin de sustrato. Esta ecuacin tiene la expresin: V max. [S] v = -----------------Km + [S] o Vmax. v = ---------------------Km + 1 -----------[S] - 1) del complejo intermediario ES, Michaelis y Menten derivaron una ecuacin que indica como vara la velocidad de reaccin en funcin

Km =

V max. [S] ( --------------------V

La constante de Michaelis es un parmetro de gran importancia y al mismo tiempo una caracterstica de cada enzima con un valor constante slo para condiciones definidas del sistema. Si una enzima acta para varios sustratos tendr un KM para cada sustrato. La constante de Michaelis puede definirse como la concentracin del sustrato a la semi velocidad mxima de reaccin; tiene por consiguiente las dimensiones de una concentracin de sustrato en mol/L. 67

V. max. Esta definicin proviene de la frmula de Km puesto que cuando v = ------------2 entonces Km = [S]. 1.3.1 Mtodos para determinar la constante Michaelis-Menten. 1. Si la velocidad inicial de la reaccin se grfica como funcin de las concentraciones del sustrato se puede determinar la velocidad mxima y tambin la concentracin del sustrato a la semi-velocidad mxima de reaccin (Km ). 2. Un procedimiento o mtodo ms empleado es el de Lineweaver y Burk el cual consiste en graficar los recprocos de las velocidades de reaccin contra los recprocos de las concentraciones del sustrato con lo cual se obtiene una lnea recta. Vmax. [S] Tomando la inversa de la ecuacin v = -------------------Km + [S] 1 ---- = v Km + [S] --------------------Vmax. [S] + [S] ------------------V. max. [S] 1 = ---------------V max. + Km ----------------V max. (1)

Se obtiene

1 Km ------- = --------------------v V. max. [S] 1 ------v

[------ ][S]

Esta es la ecuacin de una recta ( y = a + b x ) cuyo coeficiente angular es Km / Vmax. y el valor de la ordenada en el origen es 1/ Vmax. en el eje 1/v. Cuando 1/v = 0, entonces -1 1 ----- = -----Km [S]

De este modo es posible obtener grficamente los valores de Vmax. (en la interseccin de 1/v) y calcular el valor de Km. La siguiente figura representa 68

1.3.2 Inhibicin de la actividad enzimtica. Algunas sustancias actan sobre las enzimas o coenzimas que intervienen en una reaccin enzimtica afectando la Vmax. de reaccin y/o la afinidad de la enzima por el sustrato. El uso de estas sustancias inhibidoras ha permitido conocer la naturaleza de grupos funcionales del centro activo, la especificidad del sustrato, posibles mecanismos de reaccin enzimticos y la participacin de algunos grupos funcionales en el mantenimiento de la conformacin de la enzima especfica para su actividad biolgica. La inhibicin puede ser: reversible o irreversible. En el primer caso es posible eliminado el inhibidor por dilisis recuperar la enzima intacta. En el segundo caso el inhibidor reacciona con la enzima destruyendo uno ms grupos funcionales de la enzima y no puede eliminarse dicho inhibidor por dilisis. En exceso de inhibidor su accin aumenta con el tiempo ya que la formacin del complejo EI es irreversible. Inhibicin reversible: Especifica. El inhibidor se combina con el centro activo de la enzima D con grupos funcionales esenciales para la actividad enzimtica pero que no estn en el centro activo. Este tipo de inhibicin puede ser: Competitivo o no competitivo. Inhibicin competitiva: La enzima puede enlazar en su centro activo una sustancia estructuralmente relacionada a su verdadero sustrato previnindose de esta manera la unin al sustrato; el S y el I compiten por alcanzar el centro activo de la enzima; esta inhibicin se revierte por exceso de sustrato. El valor de la Km cambia pero no Vmax. alcanzada en la reaccin sin inhibidor. Inhibicin no competitiva: Ocurre cuando se produce inhibicin especfica y reversible que depende slo de la concentracin del inhibidor y no se elimina por aumento de la concentracin del sustrato. Esto indica que el I se une a E en un punto esencial para la actividad enzimtica diferente del centro activo. Con el inhibidor no competitivo la Km permanece invariable pero Vmax. alcanzada es menor que la que se logra en ausencia de inhibidor. 1.3.3 Mtodos para determinar el efecto de inhibidores: Las figuras a continuacin (6, 7 y 8), muestran el efecto de los diferentes tipos de inhibicin por los mtodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk

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Figura 6

Inhibidor competitivo (Km alterada y la Vmax. es igual). Por los mtodos de

Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk

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Figura 7

Inhibidor no competitivo (Km inalterada y Vmax. menor en ausencia de inhibidor).

Por los mtodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk

71

Figura 8

Inhibidor irreversible no competitivo (Km y Vmax menor en ausencia de inhibidor).

Por los mtodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk

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2.

MATERIALES EQUIPOS Y REACTIVOS: Embudos Cronmetro (aportados por los alumnos) cido sulfrico 2N Permanganato de potasio 0,1N Papel milimetrado (aportado por los alumnos) Soluciones tampn a diferentes pH

Soportes Universales Pinzas Nueces Buretas de 50 ml Pipetas de 125 y 10 ml Fiolas de 125 ml Agua oxigenada (H2O2) 2.1 Procedimiento: 2.2.1. Preparacin de la enzima:

A un litro de agua destilada enfriada en hielo agregue 1 ml de sangre obtenida por venipuntura y mezcle volteando suavemente el recipiente dos veces. Esta solucin se mantiene siempre en hielo. Puede usarse 1 ml de homogeneizado de hgado o rin de res o ratas. 2.2.2. Deteccin de la actividad enzimtica: Se detectar la actividad enzimtica de la catalasa titulando con permanganato de potasio 0 1N el agua oxigenada presente en cada fiola, despus de agregrsele cido sulfrico 2N. La ecuacin en que se basa el mtodo de deteccin es: MnO4+ H2O2 + H+

O2 + Mn

++

+ H2O

El estudiante debe balancear la ecuacin y analizarla ya que a partir de ella se realizarn los clculos que se van a necesitar durante la prctica. Igualmente el alumno deber repasar lo aprendido en qumica inorgnica sobre titulacin. 2.2.3 Determinacin del volumen de enzima: a. Numere 10 fiolas y siga el esquema de trabajo mostrado a continuacin: Fiola N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H2O2 (ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 H2O (ml) 8.0 8.0 7.5 7.5 6.5 6.5 5.5 5.5 4.5 4.5 H2SO4 (ml) t = min 3 3 3 3 3 73 Enzima (ml) 0.5 0.5 1.0 1.0 2.0 2.0 3.0 3.0 4.0 4.0 H2SO4 2N (ml) t = min. 3 3 3 3 3

b. c d. e. f.

Proceda as: Numere las fiolas, aada H2O2 y H2O. Si se trata de las fiolas 1, 3, 5, 7, 9, adales el H2SO4 al tiempo cero antes de aadir la enzima. En el caso de la otras fiolas aada primero la enzima (no aada el cido) y simultneamente ponga a funcionar el cronmetro mezclando nuevamente. Espere el tiempo indicado (1 min) para aadir el cido. Mezcle y titule con la solucin de

permanganato. Se hace una grfica representativa del nmero de moles de H2O2 descompuestos por minutos en

funcin del volumen de enzima empleado y en base a esa grfica el grupo escoger el volumen de enzima que emplear en las experiencias siguientes. 2.2.4. Determinacin del tiempo de reaccin: a. Realice la siguiente experiencia: Fiola N 1 2 3 4 5 H2O2 (ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 H2O (ml) 8.0 8.5-x 8.5-x 8.5-x 8.5-x enzima (ml) X X X X X t(min) 1 2 4 6 H2SO4 2N(ml) 3 3 3 3 3

Nota: X es el volumen de enzima escogido en la experiencia anterior. b. El cido sulfrico se agrega despus de transcurrido el tiempo prescrito a partir de la adicin de la enzima excepto en fiola 1. c. Titule el H2O2 remanente en cada fiola y haga una grfica que represente la cantidad de moles de H2O2 descompuestos en funcin del tiempo de incubacin y en base a ella elija el tiempo de incubacin que emplear en las experiencias sucesivas. 3. AUTO-EVALUACIN 1. 2. 3. 4. 5. 6. Qu papel (es) juega el cido sulfrico? Qu concluye respecto a los resultados de las fiolas 1, 3, 5, 7 y 9? Por qu puede suceder esto?. La ecuacin siguiente es en la que se basa el mtodo de deteccin, efecte el balance: + ++ MnO4- + H2O2 + H O2 + Mn + H2 O Disear un protocolo que le permitan determinar los siguientes parmetros: a. Temperatura b. pH ptimo, c. Constante de Michaelis (Km) y velocidad mxima (Vmax), d. Efecto de la azida de sodio sobre la actividad enzimtica. Calcule cmo se preparan 250 ml de una solucin de H2SO4 2N a partir de una botella que tiene las siguientes especificaciones: d =1.84 g/ml y pureza 97%. 74

4.

INFORME 6

(CATALASA) Nombres N del mesn N del estudiante Desarrollo Informe Definitiva

Apellidos Grupo de prcticas Fecha Calificaciones Entrada 1.

Disee una tabla en esta hoja para presentar sus resultados.

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2.

Anexe sus grficas realizadas en papel milimetrado, recorte y pegue en el espacio a

continuacin.

3.

Interprete sus resultados experimentales. Sea breve y ordenado

Nota: El informe debe ser entregado al finalizar la prctica, sin anexar hojas.

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