Efecto hipoglucmico de Phellinus linteus...

Aislamiento, Purificacin, y los Rasgos Estructurales de un Polisacrido de Phellinus linteus y Su Efecto Hipoglucmico en Ratones Diabticos Inducidos por AloxanoChao Zhao, Zunsheng Liao, Xiaoqi Wu, Yanling Liu, Xiaoyan Liu, Zhanxi Lin, Yifan Huang, y Bin Liu

Resumen: Phellinus linteus es una seta medicinal que ha sido usada en pases Orientales durante siglos para su anti-tumor, antioxidante, immunomodulador, y la actividad biolgica sobre hiperglucemia. Un polisacrido soluble en agua ordinario fue extrado usando el agua caliente de micelio de P. linteus cultivado bajo la cultura sumergida. Un experimento ortogonal fue usado optimizar las condiciones de extraccin de micelio P. linteus polisacridos (PLP). El polisacrido ordinario fue purificado usando DEAE Sephadex A-50 y la Sephadex G-200 cromatografa. Fourier transforman infrarrojo (FT-IR) la espectroscopia y la resonancia magntica nuclear (1H NMR) la espectroscopia fue usada para investigar la estructura del polisacrido P. linteus purificado (PLP-I), revelando que esto era principalmente un bifurcado tipo glicano con ambos enlaces y y una conformacin piranoidal de anillo de azcar. PLP oralmente administrado en 100 mg/kg de peso corporal/d considerablemente podra reducir el nivel de glucosa de sangre por 35.60 % en ratones diabticos inducidos por aloxano. Los resultados de una prueba oral de tolerancia de glucosa (OGTT) revelaron que PLP tena un efecto sobre la disposicin de glucosa despus de 28 d de tratamiento. El resultado revel que PLP de una cultura sumergida de micelio de P. linteus posey propiedades potentes hipoglucmicas. El polisacrido puede ser til como un aditivo alimenticio funcional y un agente hipoglucmico.Palabras clave: propiedades qumicas, hipoglucmico, fermentacin de micelio, Phellinus linteus, polisacrido

IntroduccinDurante siglos, los hongos han sido valoradas como recursos de alimentos y medicinales y usadas en la medicina tradicional Oriental para prevenir y curar varias enfermedades (Chang 1996; Ulziijargal y otros 2013). Los hongos han probado ser el alimento ideal para la prevencin diabtica de hiperglucemia debido a su alta fibra y el contenido de protena y su contenido bajo en grasas (Yuan y otros 1998; Sonawane y otros 2013). Los polisacridos son polmeros comunes en hongos y han recibido la atencin considerable en los ltimos aos debido a sus actividades hipoglucmicas.

Phellinus linteus (Berk. y Curt. M.A.) Teng (PL), que pertenece a la familia de Hymenochaetaceae, es usado como medicina herbaria as como un aditivo alimenticio tradicional en Amrica tropical, frica, y Asia de Este (en particular, China, Japn, y Corea) (Zhu y otros 2008; Sliva 2010). Estudios recientes sobre esta seta han revelado muchas actividades biolgicas interesantes (Hsieh y otros 2013). Los frutos de los cuerpos de PL recientemente como se ha reportado, contenan varios compuestos de bioactivos y exponen numerosas actividades biolgicas, incluyendo el antitumor (Bae y otros 2011), antioxidante (Song y otros 2003), antiinflamatorio (Kim y otros 2007), antiangiognica (Lee y otros 2010), antibacteriano (Hur y otros 2004), antimutagnesis (Kimura y otros 1995), antidiabtico (Kim y otros 2010), y efectos de antihepatotoxina (Kim y otros 2004).SRA. 20131491 Enviado 10/19/2013, Aceptado 2/8/2014. Autores Zhao, Liao, Wu, X. Liu, Huang, y B. Liu son con el Colegio de Ciencia De alimentos, Fujian la Agricultura y la Silvicultura Univ., Fuzhou, Fujian 350002, China. Autores Zhao, Y. Liu, Lin, Huang, y B. Liu son con Natl. Tramando Centro de investigacin de Juncao, Fuzhou, Fujian 350002, China. El autor Huang es tambin con el Colegio de Ciencia De animal, Fujian la Agricultura y la Silvicultura Univ., Fuzhou, Fujian 350002, China. Autores Y. Liu y Lin son tambin con el Colegio de Ciencia de Vida, Fujian la Agricultura y la SilviculturaUniv., Fuzhou, Fujian 350002, China. Preguntas directas a autores B. Liu (Correo electrnico: Binliu618@163.com) y Y. Huang (Correo electrnico: zjhyfang@163.com).Varios compuestos aromticos tambin han sido aislados de micelio de PL cultivado, incluyendo sesquiterpeno (Huang y otros 2013), phellinstatin (Cho y otros 2011), polifenol (Jung y otros 2008), hispoln (Chen y otros 2006), hispidina (Jang y otros 2010), e inotilone (Huang y otros 2012). En una tentativa de integrar PL en terapias Occidentales aceptadas, muchos investigadores han investigado los efectos de los extractos de los cuerpos frutales o micelio de PL en actividades in vitro e in vivo. PL ha atrado una atencin sustancial debido a su efecto de antitumor y otros valores medicinales (Zhu y otros 2008; Sliva 2010). En la dcada pasada, PL ha sido investigado extensivamente para su capacidad extraordinaria para suprimir el cncer o realzar la inmunidad del cuerpo, que hizo del PL un candidato por desarrollar compuestos de anticncer nuevos de recursos naturales. El inters creciente en PL era tambin debido a su capacidad de potenciar la eficacia de anticncer existente medicinas quimioteraputicas. Sin embargo, la mayor parte de la investigacin est enfocado en proteoglicanos (PGs) aislados de PL (Kim y otros 2003). Aunque algunas setas comestibles, como se haya relatado, mostraban un efecto hipoglucmico sobre ratas diabticas o ratones (Cho y otros 2002), la actividad hipoglucmica de micelio de PL raras veces era investigado.

Como el PL es muy raro en la naturaleza, la cantidad de setas salvajes disponible no es suficiente para la explotacin comercial (Hong-Kong y otros 2002). Para establecer un procedimiento simple y econmico para producir este polisacrido de seta con la produccin ms alta, los experimentos de un solo factor (la proporcin de micelio para agua, extrayendo la temperatura, extrayendo el tiempo, y la concentracin final de etanol) y experimentos ortogonales fueron conducidos para optimizar las condiciones de produccin de polisacridos de micelio de PL (PLP). Por lo tanto, en este papel, las condiciones extradas fueron optimizadas para la produccin de polisacridos de PL, y una investigacin detallada fue realizada para examinar las actividades antidiabticas de los polisacridos de micelio producidos de la cultura sumergida de PL en ratones diabticos inducidos por aloxano.

Materiales y Mtodos

Tensin y produccin de micelioEl cultivo de P. linteus fue obtenida del Centro de Investigacin Fungal de Fujian Agricultura y la Univ. Forestal (Fuzhou, China). El cultivo de siembra fue cultivada en un frasco de 250 mL que contiene 100 mL de caldo de dextrosa de patatas (pH 6.0) e incubada sobre una agitador rotatoria (150 rpm) a 25 C por aproximadamente 4 d. Una muestra del medio con sedimentos miceliales (100 mL) fue homogeneizada aspticamente en un omni-mezclador Sorvall durante 3 min en un bao de hielo e inoculada en los medios lquidos a una concentracin del 2 % (v/v) para la cultivacin sumergida. El P. linteus completa el medio (PCM) fue usado para realizar un cultivo sumergido para la produccin de micelio. La composicin del PCM es as (g/L): harina de soja (20), harina de grano (30), salvado de trigo (5), extracto de levadura (5), KH2PO4 (0.2), ZnSO47H2O (0.2), y VB1 (0.01). El pH fue ajustado a 6.0 antes de la esterilizacin. Los cultivos de micelios sumergidos fueron realizados en un frasco 250 mL que contiene 100 mL del medio sobre un agitador rotatorio (130 rpm, pH 6.0) a 28 C por 8 d. El caldo de cultivo fue cosechado por centrifugacin (10000 g durante 20 min), y el precipitado fue lavado 3 veces con agua destilada y secado a 70 C.AnimalesLos ratones macho Kunming (20.0 a 24.0 g) fueron obtenidos del Centro Slaccas Laboratorio Animal (Shanghai, China). Todos los procedimientos experimentales fueron conducidos conforme a directrices institucionales para el cuidado y el empleo de animales de laboratorio y conformados al Natl. Inst. De Gua de Salud para Cuidado y Empleo de Animales De Laboratorio. Antes del experimento, todos los ratones fueron guardados en jaulas inoxidables en condiciones controladas (temperatura 24.0 0.5 C, humedad 55.0 5.0 %, el 12 h ciclo claro/oscuro) y fueron alimentados con una dieta comercial granulada a lo largo del perodo experimental. Ellos fueron mantenidos segn la Gua para el Cuidado y el Empleo de Animales de Laboratorio y fueron aclimatados durante una semana con accesos libres para alimento y agua.Diseo experimental ortogonal Un diseo ortogonal experimental es un mtodo de optimizacin para investigar mltiples factores y niveles. Esto utiliza una mesa ortogonal para arreglar el experimento cientficamente y evaluar mltiples factores (Hedayat y otros 1999). Segn la ortogonalidad, las pruebas representativas escogidas de entre las pruebas totales pueden ser usadas para encontrar el esquema ptimo y proporcionar informacin importante. Un experimento de un solo factor fue conducido para optimizar las condiciones extradas por polisacridos de cultivo de micelio de PL. Cuatro factores individuales fueron optimizados: extrayendo temperatura (60, 70, 80, 90, o 100 C), la proporcin de micelio para agua (1:20, 1:30, 1:40, 1:50, o 1:60), extrayendo tiempo (1.0, 1.5, 2.0, 2.5, o 3.0 h), y la concentracin final de etanol (65 %, 70 %, 75 %, 80 %, o 85 %). Basado en los resultados de los experimentos de un solo factor, el experimento ortogonal fue aplicado a la optimizacin siguiente. La mesa ortogonal L9(34) fue usada para arreglar los experimentos. Cuatro factores fueron evaluados cada vez, y cada factor tom 3 niveles. Los procedimientos para la produccin del polisacrido eran los mismos como en la Seccin "Extraccin y fraccionamiento de PLP. "Extraccin y fraccionamiento de PLPEl micelio de PL fue secado a 70 C y tierra para pasar por un tamiz de malla 60. Los polvos fueron extrados con agua caliente 90 C durante 90 min y filtrados. La suspensin resultada pas por una centrifuga a 3500 rpm por 10 min. El sobrenadante fue mezclado con 3 volmenes de etanol absoluto, revuelto enrgicamente, y se dejo durante la noche a 4 C. El PLP precipitado se centrifug a 10000 g por 20 min, y el sobrenadante se desech. Los precipitados de PLP crudo fueron liofilizados, y el peso fue estimado.El PLP crudo fue disuelto con agua destilada y decolorado con resina AB-8 macroporosa adsorbente. Despus, las protenas fueron removidas por el mtodo Sevag (Xie y otros 2011). Los componentes del PLP crudo fueron liofilizados para producir PLP despus de 48 h de dilisis con agua destilada. Las muestras entonces fueron aplicadas a una columna (1.6 cm 50 cm) de DEAE Sephadex A-50 (Beijing Solarbio Ciencia y Tecnologa Co., Ltd., China) pre-equilibrada con agua destilada. Las fracciones se recogieron por elucin gradual con NaCl de aumentar la fuerza inica (0, 0.1, 0.3, y 0.5 mol/L) a un caudal de 0.5 mL/min y determinadas por el mtodo fenol cido sulfrico usando la glucosa como patrn (Dubois y otros 1956). La fraccin principal obtenida fue concentrada, se dializ frente a agua destilada con un tubo de dilisis (corte de peso molecular: 14 kDa), y luego liofilizado. La fraccin principal obtenida fue disuelta en 0.5 mL de agua destilada para la cromatografa con una columna Sephadex G-200 (2.5 cm 60 cm) con agua destilada como el eluente en un caudal de 0.5 mL/min. Las muestras en parte fueron recogidas, con cada tubo que contiene 5 mL. Despus, la deteccin de rastro fue conducida con el mtodo fenol cido sulfrico para medir los valores de absorbancia en una longitud de onda de 490 nm. Una curva de elucin fue creada por el trazo de absorbancia en comparacin con el nmero de tubo. La solucin resultante fue concentrada y luego liofilizada para dar el polisacrido puro de PL, cifrado como PLP-I.Dispersin de luz lser multingulo (MALLS)El peso molecular del PLP-I fue estimado por la cromatografa de permeacin de gel (GPC) acoplado con el sistema de MALLS (Wyatt Tecnologa, Santa Babara, Calif., EE.UU.). El sistema cromatogrfico consisti en un desgasificador, una bomba de alto rendimiento, una vlvula de inyeccin equipada con un bucle de 1 mL, y la columna GPC (Shodex OHpak SB-806 HQ, Showa Denko, Tokio, Japn) fue conectada en serie. La muestra de polisacrido (500 g/mL) fue disuelta en el portador filtrado (0.1 mol/L NaCl y agua del sistema de reactivo de agua de Milli-Q) y filtrada (0.22-m tipo de membrana, Millipore). Los anlisis fueron realizados con la solucin buffer como la fase mvil, con un caudal de 0.5 mL/min, con el volumen de inyeccin de la muestra de 1 mL. El promedio total de dn/dc era 0.135 mL/g. Los datos fueron registrados y analizados con el software de Astra V (Wyatt Tecnologa Corp.).Fourier transforman infrarrojo (FT-IR) anlisis de PLP-I Los espectros IR de PLP-I fueron registrados con un espectrofotmetro de FT-IR (Nicolet Instrumentos Corp., Madison, Wis., EE.UU.) con un alcance de deteccin de 4000 a 400 cm-1. La concentracin de PLP-I en KBR era aproximadamente 2.4 %. Los picos principales (la intensidad y nmero de onda) fueron identificados usando el software EZOM-NIC, versin 6.0 (Nicolet, EE.UU.).

Nivel de factor / Nmero de lnea

Secuencia Extraccin deProporcin de micelioExtraccin de Concentracin Produccin

y anlisistemperatura / C (A)para beber (B)tiempo/h (C)de etanol/% (D)de PLP (%)

11 (80)1 (1:40)1 (1.0)1 (70)11.232

212 (1:50)2 (1.5)2 (75)7.446

313 (1:60)3 (2.0)3 (80)9.318

42 (90)12312.056

5223111.414

623128.546

73 (100)13210.972

8321310.006

933218.438

K19.33211.4209.92810.361

K210.6729.6629.3138.988

K39.8058.76710.56810.460

R1.3402.6531.2551.472

Nivel ptimoA2B1C2D3

Tabla 1-Diseo experimental y resultados de experimento ortogonal L9 (34).

El espectro del polisacrido tambin fue calculado usando EZOMNIC.1H resonancia nuclear magntica (NMR) y 13 C NMR anlisis de espectroscopia de PLP-I Los protones cambiables fueron substituidos con deuterio por suspensin de una muestra en CD3OD y liofilizando 3 veces. Despus, 1H NMR espectro fue registrado sobre 600 MHz Bruker INNOVA 600 NB NMR espectrmetro (Bruker, Rheinstetten, Alemania). El retraso de relajacin por el experimento NMR era 1.0 s. El potencial de ionizacin era 70 eV, y la temperatura de la fuente de ion era 220 C. Los experimentos 1H NMR fueron conducidos a 30 C en CD3OD (Liu y otros 2007). Dieron a cambios qumicos en ppm.El espectro 13C NMR de PLP-I fue registrado sobre 500 MHz Bruker NMR espectrmetro (Bruker) en 25 C, 2048 acumulaciones, pulso 9 s, tiempo de adquisicin 1.1 s, y retraso por relajacin 2 s. La anchura espectral era 200 ppm. El PLP-I fue disuelto en D2O para obtener una concentracin de 100 mg/mL. Los cambios qumicos carbn 13C fueron calculados por MestReNova 8.0 software (Mestrelab Investigacin, Escondido, California, U.S.A.).Determinacin de actividad hipoglucmica de PLPLos ratones masculinos (20.0 a 24.0 g) fueron guardados para la adaptacin ambiental por l sem. Despus de la pesada y ayuno por 24 h (excepto por agua), los ratones eran intraperitonealmente inyectados con 5 % de Aloxano (200 mg/kg) (Sonawane y otros 2013). La sangre orbital fue tomada por la determinacin de glucosa en la sangre en ayunas con un medidor de glucosa en la sangre (Beijing Yicheng Bioelectrnicos Tecnologa Co. Ltd., China). Los ratones con valores de glucosa de sangre en el rango de 10 a 28 mmol/L fueron considerados como modelos diabticos. Los ratones modelos manifestaron una disminucin en la actividad, rarefaccin y sin brillo de pelo, y el aumento de la ingesta de agua y alimentos, indicando que el modelo fue exitoso.Sesenta ratones diabticos aloxanos fueron divididos al azar en 6 grupos de 10 ratones cada uno: un grupo de clorhidrato de metformina (control positivo), 3 grupos PLP, y un grupo de control diabtico. Adems, 10 ratones normales servidos como un grupo de control no diabtico. La dosificacin de administracin de clorhidrato de metformina era 200 mg/kg; las dosificaciones dadas de PLP eran 100, 200, y 400 mg/kg para los 3 grupos. Un volumen igual de 0.9 % solucin salina normal fue dada para el grupo de control diabtico y el grupo de control no diabtico. La administracin intragstrica fue conducida en 8:00 cada maana para 28 d. Durante el experimento, los animales recibieron accesos libres al alimento y el agua. El peso de cuerpo fue medido cada 4 d. La ltima administracin intragstrica fue realizada despus de 5 h de ayuno. La sangre fue recogida de la rbita de los ratones para detectar la concentracin de glucosa en sangre con un medidor de glucosa en sangre.El efecto de PLP sobre los niveles de glucosa en sangre en ratones diabticos (prueba oral de tolerancia de glucosa [OGTT])Cuarenta ratones fueron divididos en 4 grupos de 10 animales cada uno. Todos los animales recibieron una dosis oral diaria por 28 d. El grupo 1 recibi una solucin salina normal destilada (2.0 mL/kg peso corporal) como un control; los grupos 2, 3, y 4 recibieron 100, 200, y 400 mg/kg peso corporal de PLP, respectivamente. Las muestras de sangre fueron extradas de la cola de los animales antes de la 1ra administracin y 0.5 y 2.0 h despus de la ltima administracin de PLP. Los niveles de glucosa fueron determinados por el mtodo descrito encima.Anlisis estadsticoLos resultados obtenidos para cada grupo de ratones probados fueron expresados como la media SD (n = 10), y las diferencias entre grupos fueron evaluadas por un anlisis de variacin (ANOVA) usando tanto pruebas-t de hiptesis direccionales como no direccionales. Las diferencias, como se consideraba, eran estadsticamente significativas si P