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EVALUACIÒN DEL ANTAGONISMO Y SINERGISMO EN AISLADOS MICROBIANOS OBTENIDOS DE Plukenetia Volúbilis L PARA LA CONFORMACIÒN DE UN CONSORCIO MICROBIANO EN CONDICIONES IN VITRO. CINDY PAOLA MORENO RIAÑO UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BUCARAMANGA 2017
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EVALUACIÒN DEL ANTAGONISMO Y SINERGISMO EN AISLADOS
MICROBIANOS OBTENIDOS DE Plukenetia Volúbilis L PARA LA CONFORMACIÒN
DE UN CONSORCIO MICROBIANO EN CONDICIONES IN VITRO.
CINDY PAOLA MORENO RIAÑO
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2017
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EVALUACIÒN DEL ANTAGONISMO Y SINERGISMO DE AISLADOS DE Plukenetia
Volúbilis L PARA EL ESTABLECIMIENTO DE UN CONSORCIO MICROBIANO EN
CONDICIONES IN VITRO.
CINDY PAOLA MORENO RIAÑO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito Para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
Director
Bayron Enrique Agualimpia Valderrama
M.Sc Química Ambiental
Codirector
Carlos Augusto Acevedo Isidro
M.Sc Fito protección
Asesor
Wolfang Osma Castellanos
Esp. Estadística
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2017
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iv
Agradecimientos
A Dios por haberme permitido avanzar en este punto de mi carrera y darme la fuerza para no
desistir en los días difíciles.
A mi madre, hermanos, amigos y demás familiares, por el apoyo incondicional y ofrecerme la
oportunidad de culminar este largo proceso; por creer en mí y recibir todo el amor y comprensión,
por haber estado conmigo siempre, muchas gracias.
A la Doctora Fabiola Aguilar, por creer en mí, por sus consejos y paciencia a lo largo de mi carrera.
A mi director Bayron Agua limpia y codirector Carlos Acevedo, por las enseñanzas brindadas,
apoyo, paciencia, exigencia, confianza, y esmero, por ser pilares en el proceso de cada línea de
este libro. A cada profesor que hizo posible mi formación profesional aportando conocimientos y
valores que están atados en mi mente y corazón.
Al personal del laboratorio (Esmeralda, Julián Navas, Martha,) por cada favor y facilidad que me
brindaron oportunamente en el desarrollo de esta investigación. A la Universidad de Santander de
Bucaramanga y la Facultad de Microbiología Industrial por darme la oportunidad de aprendizaje
y por el apoyo financiero.
Gracias a todos ustedes por hacer posible uno de mis triunfos como es obtener mi título de
Microbióloga industrial.
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Dedicatoria
Dedico este trabajo de grado a mi padre Dios, quien me dio la salud, la fortaleza, la fe y la esperanza
día a día para finalizar esta tesis. Por bendecirme en todo tiempo y ver su fidelidad cada mañana.
A mi madre Stella Riaño Yepes; quien me dio la vida, el apoyo constante y está conmigo en todo
tiempo, por su infinito amor, cariño y comprensión. Por acompañarme en los buenos y malos
momentos en todo mi año. Por ayudarme a que este momento se hiciera una realidad.
A mi hijo Christian José Moreno y hermanito Carlos Andrés Riaño, quienes son el motor de mi
vida y mi felicidad, por su comprensión y amor, por ser mi fuente de motivación e inspiración para
llevar a cabo cada propósito.
A mi hermano Cristian Hernando Moreno por su apoyo incondicional, por creer en mí y por ser el
cimiente para que esta etapa de mi vida se cumpliera, por ser mi figura paterna y estar presente en
todo tiempo.
A mi Amor Erik Guaqueta quien con su esfuerzo y amor estuvo en este proceso llenándome de
esfuerzos y motivaciones para finalizar y continuar en pie de lucha, junto a su papá milciades
Guaqueta.
A mi abuela Rosario Yepes, por sus oraciones y confianza, por su amor y cada palabra sabia de fe
que cautivaba mis ojos, dándome valor para seguir.
A mis tíos Mauricio Riaño y Martha Riaño, quienes estuvieron constantes en este proceso llenando
mis días de ánimos y por cada oración que fortalecieron cada situación vivida.
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Contenido
Pág.
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 5 2. MARCO TEÓRICO.................................................................................................................... 7
2.1.2 Propiedades de la planta. .................................................................................................... 8 2.1.3 Usos y pontecial agroindustrial. ......................................................................................... 9 2.2 MICOORGANISMOS CON PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO VEGETAL PGPR .... 11
2.2.1 Micoorganismos pgpr productores de sustancias indólicas. ............................................ 11
2.2.2 Micoorganismos biosolubilizadores de fosfatos. ............................................................. 13 2.3 CONSORCIOS MICROBIANOS ......................................................................................... 15
2.4 ANTAGONISMO Y SINERGISMO MICROBIANO .......................................................... 16
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 18 3.1 GENERAL .......................................................................................................................... 18
3.2 ESPECÍFICOS .................................................................................................................... 18 4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 19
4.3. EVALUACIÓN DEL ANTAGONISMO ENTRE AISLADOS ....................................... 20
4.3.1. Inhibición de crecimiento entre Bacterias....................................................................... 20 4.3.2 Inhibición de crecimiento entre hongos. .......................................................................... 21
4.3.3 Inhibición de crecimiento de Hongos hacia las bacterias. ............................................... 22 4.3.4 Inhibición de crecimiento de Bacterias hacia los hongos. ............................................... 23
4.4 DETERMINACIÓN DEL SINERGISMO ENTRE AISLADOS MICROBIANOS ............. 24
4.4.1 Crecimiento en medio NBRIP. ........................................................................................ 25
4.4.2 Detección y cuantificación de fósforo solubilizado in vitro. ........................................... 25 4.4.3 Producción de Ácido Indol Acético (AIA). ..................................................................... 26
4.5. MÉTODOS UTILIZADOS. .................................................................................................. 26
4.5.1 Fósforo, Reactivo (Molybdovanadate Rapid Liquid Method) 31. ................................... 26 4.5.2 Salkowski. ........................................................................................................................ 27
4.6 ANALISIS ESTADÍSTICO.................................................................................................... 27 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................................. 28
5.1.1 EVALUACIÓN GENERAL DEL ANTAGONISMO ENTRE LOS AISLADOS ....... 28 5.1.2 Inhibición entre Bacterias. ............................................................................................... 28 5.1.3 Inhibición entre Hongos. .................................................................................................. 30
5.1.4 Inhibición de crecimiento de Hongos hacia las bacterias. ............................................... 32
5.1.5 Inhibición de crecimiento de las Bacterias hacia los Hongos. ......................................... 33
5.1.6 Evaluacion general del antagonismo de los aislados. ...................................................... 34 6 ENSAYO DE SINERGISMO A LOS CONSORCIOS MICROBIANOS ESTABLECIDOS . 36
6.1. Solubilización de fosfatos .................................................................................................. 36 6.1.1 Produccion de sustancias acido indol acético. ................................................................. 40
CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 45 Anexos .......................................................................................................................................... 46 Bibliografía ................................................................................................................................... 48
vii
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1 Sacha Inchi ......................................................................................................................... 8
Tabla 2 Aislados obtenidos de sacha inchi, seleccionados para la combinación microbiana. ...... 19
Tabla 3 Resultados de inhibición de crecimiento bacterias vs bacterias. ..................................... 28 Tabla 4 Resultados de enfrentamiento de los hongos hacia las cepas bacterianas. ...................... 32
Tabla 5 Resultados de inhibición de crecimiento de las bacterias hacia los hongos. ................... 34
Tabla 6 Resultados de la evaluación de inhibición del conglomerado de las 11 cepas. ............... 35 Tabla 7 Microorganismos con actividad promotoras de crecimiento vegetal individual ............. 46
Tabla 8 Conformación de 32 consorcios de acuerdo con ensayos de antagonismo. .................... 46
viii Lista de Figuras
Pág.
Figura 1 Siembra masiva de la bacteria a ensayar (fondo oscuro) y bacterias adyacentes a la caja
de Petri. (Bauer et al.1966). .................................................................................................. 21 Figura 2 Enfrentamiento de los hongos a ensayar de acuerdo con el método Plato dual propuesta
por Cundom, et al., 2003. ...................................................................................................... 22 Figura 3 Esquema de la inoculación del hongo (centro) y siembra de las bacterias por estría
desde el micelio del hongo hasta el borde de la caja (Zafra G, et al.2016). ......................... 23
Figura 4 Siembra al tiempo del hongo (centro) y cepas bacterias (periferia) Zafra et al.2016. ... 24
Figura 5 Promedio en milímetros del halo de inhibición y su porcentaje de frecuencia. ............. 30 Figura 6 Compatibilidad entre los hongos de ensayo TSEHH03-01 - TSEHR01-04................... 31
Figura 7 Inhibición hongos hacia bacterias, A) Hongo TSEHR01-04 inhibiendo a las cepas
TSEBT04-03 y TSEBFL01-01 B) Hongo TSEHH03-01 inhibiendo a la cepa TSEBFL01-
01........................................................................................................................................... 33
Figura 8 Evaluación de las actividades que presentaron las mezclas con respecto a la actividad
promedio individual. ............................................................................................................. 36 Figura 9 Diagrama de caja de las diferencias de solubilización de fosfatos en mezcla con
respecto al promedio de la solubilización individual. ........................................................... 38 Figura 10 Evaluación de las actividades que presentaron las mezclas con respecto a la actividad
promedio individual. ............................................................................................................. 40 Figura 11 Diagrama de caja de las diferencias de producción de sustancias indólicas (AIA) en
consorcios con respecto al promedio de la producción individual. ...................................... 42
Figura 12 Concentración de solubilización de fosfato (PO4 mg/L) en los consorcios
conformados. ......................................................................................................................... 47 Figura 13 Concentración de producción ácido indol acético (AIA mg/L) en los consorcios
conformados. ......................................................................................................................... 47
1
Resumen
TITULO: EVALUACIÒN DEL ANTAGONISMO Y SINERGISMO EN AISLADOS
MICROBIANOS OBTENIDOS DE Plukenetia Volúbilis L PARA LA
CONFORMACIÒN DE UN CONSORCIO MICROBIANO EN CONDICIONES IN
VITRO.
AUTOR: CINDY PAOLA MORENO RIAÑO
PALABRAS CLAVES: Sacha inchi, PGPR, consorcios, solubilización fosfatos,
producción AIA.
DESCRIPCIÓN:
El propósito de este trabajo fue determinar la compatibilidad de un grupo de
microorganismos que fueron aislados de diferentes órganos de la planta sacha inchi
(Plukenetia volúbilis Linneo) que presentaron actividad PGPR, estudiados en fases
anteriores del macroproyecto de aspecto institucional, con el fin de establecer
combinaciones microbianas que potencialicen las actividades de interés como
solubilizacion de fosfatos y producción de sustancias indolicas; para ello inicialmente
se evaluó el antagonismo mediante ensayos de inhibición de crecimiento utilizando
pruebas de botón en césped y plato dual.Los microorganismos que no presentaron
antagonismo se les evaluó el sinergismo por la tasa de variación de su actividad
mediante técnicas colorimétricas de salkowski y moliddovanadato fosfórico, y
2
finalmente se seleccionaron los microorganismos correlacionando las pruebas de
antagonismo y sinergismo mediante el análisis estadístico.
Se logró determinar que el 81% de los microorganismos no presentaron antagonismo,
destacándose la cepa bacteria TSEBT04-03 quien no inhibió el crecimiento en el
enfrentamiento bacteriano y que el asilado microbiano TSEBR01-01 presentó mayor
inhibición (36,4%) en los enfrentamientos y su frecuencia represento en más del 50%
en los ensayos.
Finalmente se pudo establecer que el 35,93% de los microorganismos fueron
compatibles, al no presentar antagonismo y aumentar su actividad al ser evaluados en
conjunto, encontrándose que los consorcios significativos en el aumento para ambas
actividades de interés fueron los consorcios C2, C6, C21 Y C31 de las 32
combinaciones evaluadas. Este trabajo permitió el establecimiento de un consorcio
conformado por tres (3) microorganismos, que presenta menor capacidad antagónica y
mayor sinergismo para las actividades PGPR evaluadas.
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Abstract
TITLE: EVALUATION OF ANTAGONISM AND SYNERGISM IN MICROBIAL
ISOLATES OBTAINED FROM PLUQUENETIA VOLÚBILIS FOR THE
CONFORMATION OF THE MICROBIAN CONSORTIUM IN THE IN VITRO
CONDITIONS.
AUTHOR: CINDY PAOLA MORENO RIAÑO
KEY WORDS: Sacha inchi, PGPR, consortiums, phosphate solubilization, AIA
production.
DESCRIPTION:
Sacha inchi (Plukenetia volúbilis Linneo) that belongs PGPR activity, studied in the
previous phases of the macroproject of institutional aspect, with the purpose of a microbial
combinations that potentiate the activities of interest as solubilization of phosphates and
production of indole substances; To this end, the antagonism is evaluated by growth
inhibition tests using button tests on turf and dual plate. The microorganisms do not present
antagonism synergism is evaluated by the rate of change of their activity by colorimetric
techniques of salkowski and phosphoric moliddovanadato, and finally the microorganisms
were selected by correlating the tests of antagonism and synergism through statistical
analysis.
4
It was determined that 81% of the microorganisms did not present antagonism, highlighting
the strain of the TSEBT04-03 bacteria that did not inhibit the growth in the bacterial
confrontation and the microbial asylee TSEBR01-01 showed the greatest inhibition
(36.4%) in the confrontations and their frequency represents more than 50% in the trials.
Finally, it could be established that 35.93% of the microorganisms were compatible, there
was no antagonism and increase their activity when evaluated as a whole, with the
consortiums in the increase for both activities of interest were the consortiums C2, C6, C21
And C31 of the 32 combinations evaluated. This is the work of a consortium made up of
three (3) microorganisms, which presents less antagonistic capacity and greater synergy
for PGPR activities evaluated.
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INTRODUCCIÓN
Es habitual que los microorganismos del suelo desarrollen actividades en conjunto
relacionadas con la mineralización de complejos orgánicos y translocación de bioproductos
y elementos minerales que conllevan al desplazamiento de nutrientes en el ecosistema
suelo-planta (Vessey, 2003). Sin embargo, la conformación de consorcios microbianos que
sean eficientes y efectivos, requieren de la realización de meticulosos estudios para
determinar la compatibilidad y efectos sinérgicos sobre las variables agronómicamente
importantes de los cultivos, en campo o invernadero (Aguado, 2012). Estas interacciones
antagónicas y sinérgicas entre los microorganismos del suelo no han sido muy
documentadas; sin embargo, crece el interés de utilizar morfotipos de microorganismos,
con el objetivo de proporcionarle a la planta protección contra fitopatógenos y, al mismo
tiempo, promover el crecimiento vegetal, (Cano, 2011).
Varios estudios previos han adoptado la utilización de inoculantes microbianos en procesos
agrícolas como producción de trigo (Botella, A et al., 2002) elaboración de bioabonos
(Soria, M.j et al., 2001), y remediación de suelos contaminados (Mendoza C, 1999),
demostrando que estos microorganismos en conjunto tienen un efecto favorable sobre la
producción agrícola en especial en suelos libres o con muy bajas concentraciones de
insumos agrícolas de síntesis química, puesto que muchas de los micoorganismos poseen
la capacidad para manifestar más de un mecanismo de acción, como la fijación biológica
de nitrógeno, la disolución de fosfatos inorgánicos (Reyes et al., 2006) y la producción de
ácido indol acético (Meunchang et al., 2006).
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Es en este contexto se pretende avanzar en la búsqueda de microorganismos que tengan
potencial de interés para el establecimiento de una oleoginosa como sacha inchi (Plukenetia
volúbilis) al ser una planta con posibilidad agroindustrial debido a su valor nutricional y
valor alimenticio de aproximadamente 90,34% de ácidos grasos insaturados, es una planta
que se puede posicionar en diversos segmentos del mercado como son los suplementos
dietéticos, los alimentos funcionales, productos cosméticos y de cuidado personal y el de
mercados sostenibles (Ayala G, 2016),(Hughes, 2009). Debido a las características antes
mencionadas de sacha inchi la Universidad de Santander ha adelantado estudios donde se
aislaron y evaluaron microorganismos con actividades de interés para el establecimiento
de este cultivo. Sin embargo, estos microorganismos no han sido evaluados en sus
activididades y comportamiento o la interacción en conjunto. Teniendo en cuenta que
algunas investigaciones reportan que cuando los microorganismos con potencial agrícola
que son evaluados a nivel intro y luego llevados a campo disminuyen su potencial, es así
como el propósito de este trabajo fue avanzar en el estudio para determinar y establecer
cuales de estos microorganismos presentan antagonismo o interacciones negativas que
puedan disminuir esta actividad, y cuales de estos en conjunto potencializan las mismas.
Los resultados obtenidos de esta investigacion se conviernten en base fundamental para
estudios posteriores con el fin de seleccionar las mejores cepas con criterios en aumento
de actividad y menor antagonismo, para posteriormente desarrollar bioinoculantes como
una alternativa sostenible, y a su vez permitiendo reintegrar la dinámica microbiológica en
los suelos de los cultivos de interés, para el establecimiento del cultivo de sacha inchi en
Santander.
7
2. MARCO TEÓRICO
2.1 GENERALIDADES DE SACHA INCHI
Sacha inchi fue descrita por primera vez como especie en el año 1753 por el naturalista
Linneo, de ahí su nombre científico Plukenetia volúbilis Linneo (Galeón, 2008) pero
conocida por los nativos desde hace miles de años, y conocida en otros lugares con los
siguientes nombres, sacha inchik, amui, sacha yuchi, sacha yuchiqui, sampannankii,
suwaa, maní del monte, sacha maní, maní del inca, maní jibaro o inca peanuts es una planta
que pertenece a la familia de la Euphorbiaceae, originaria de la Amazonía, (Álvarez &
Ríos, 2007; Perúbiodiverso, 2009). Sacha inchi es una planta trepadora, semileñosa y
voluble, con una altura indeterminada, presenta hojas alternas, de color verdoso, elípticas,
aserradas y pinninervadas, de 9 a 16 cm de largo y de 6 a 10 cm de ancho (Manco E, 2003).
En cuanto a su fruto, forma un contorno similar a una estrella, con variabilidad en el número
de sus lóbulos que van de cuatro hasta ocho, se dividen y se diferencian sólo cuando hay
maduración, endureciendo sus paredes. Cuando el fruto se encuentra maduro, se hallan
dentro de ellas las semillas que son de color marrón oscuro, venadas y corrugadas, de forma
lenticular y con 1.5 a 2 cm de diámetro (Gómez, 2004).
8
2.1.1 Taxonomia.
De acuerdo con lo establecido por Mostacero et al, 2002 el sacha inchi se clasifica de la siguiente forma:
Tabla 1 Sacha Inchi
Reino Plantae
Subreino Fanerogamas
División Angiospermae
Clase Dicotyledoneae
Subclase Archichlamydeae
Orden Generiales
Familia Euphorbiaceae
Genero Plukenetia
Especie Plukenetia Volubilis L
Fuente: (Mostacero, 2002)
2.1.2 Propiedades de la planta.
Las semillas de sacha inchi (Plukenetia volubilis L.) posee características nutritivas que
realza su interés y que se caracteriza principalmente por su alto contenido de proteína que
oscila entre 25 y 28%, siendo los aminoácidos esenciales más relevantes, entre los cuales
se encuentran de mayor a menor aportando las sieguinetes cantidades; leucina (79 mg/g),
lisina (72mg/g), fenilalanina más tirosina (67 mg/g), valina (62 mg/g), tirosina (58 mg/g),
treonina (57 mg/g), metionina más cisteína (57 mg/g), isoleucina (50 mg/g), (Gutiérrez et
al., 2011; Sathe et al., 2002; citado por Ramos, 2014).
Estudios nutricionales de sacha inchi en Arkansas (USA) señalan que su aceite posee baja
saturación, mejorando la calidad del aceite, puesto que puede llegar hasta el 93,6% entre
los cuales el promedio de estos ácidos grasos se fragmenta en alfa linoleico (omega 3) con
9
un 48,60 %, el linoleico (omega 6) con un 36,80% y el oleico (omega 9), 8,28% (Ayala
martinez, 2016). La almendra concentrada como alimento, contiene un alto contenido de
grasa, más que la crema de leche, mayores calorías que el azúcar y más vitaminas,
minerales y proteínas que la carne de res, además el aceite tiene alto contenido de vitamina
A, 680 ug de retinol en 100 ml de aceite y se mantiene en 466 ug después de ser usado en
frituras, y por ser un aceite vegetal, no contiene colesterol (Hammaker, 1992). El aceite de
sacha inchi además de contar con altas propiedades de interés, también es rica tocoferoles
(Follegatti-Romero et al., 2009) componente que actúan como antioxidantes por la
capacidad de secuestrar los radicales de piróxilo de moléculas de lípidos insaturados, de
esta forma evita la propagación de la peroxidación de lípidos, principalmente en los ácidos
grasos poli-insaturados (Morales et al., 2012)
2.1.3 Usos y pontecial agroindustrial.
Los usos de sacha inchi (Plukenetia volúbilis Linneo) son variables, y se extienden desde
su aplicación industrial hasta usos domésticos.
Medicinal: El aceite de sacha inchi contiene altos niveles de omega 3, y al ser consumido
disminuye la carga de triglicéridos en la sangre, además reduce los casos de enfermedades
cardiovasculares, al ser influyente en el flujo sanguíneo y la coagulación. También se ha
reportado que su utilidad para el tratamiento de problemas reumáticos y dolores
musculares; se utiliza también en el tratamiento de la artritis, debido a su influencia positiva
sobre el metabolismo de las prostaglandinas, los componentes de ácidos grasos insaturados
10
se pueden utilizar para tratar la artritis porque las prostaglandinas inflamatorias se producen
en menores cantidades (Hanssen y Schmitz (2011).
Suplemento Nutricional: La semilla se sacha inchi contiene altos niveles proteicos
(aproximadamente 33%) lo cual se ajusta a lo sugerido por la FAO y la OMS como
nutriente para adultos, ya que está constituida la proteína albumina, la cual es soluble y de
almacenamiento proteico, constituye alrededor de un tercio del contenido total de proteína,
compuesta de dos polipéptidos glicosilados (32,8 y 34,8 kDa), con un ideal perfil de
aminoácidos; además encontraron que el compuesto presenta un inusual alto contenido de
triptófano (44 mg/g de proteína) (Gutiérrez et al., 2011; Sathe et al., 2002).
Domestico: El aceite de sacha inchi es altamente nutritivo debido a sus propiedades y
cantidades de proteínas que posee y su alto índice de ácidos grasos omega 3, entre otros,
características que lo convierten en el mejor aceite para el consumo humano doméstico.
En cuanto al potencial agroindustrial en Colombia se conservan gran variedad
agroclimáticas que fomentan el establecimiento de especies con potencial oleaginoso para
implementar el proceso de siembra. En este orden el sacha inchi (Plukenetia volubilis) al
ser una planta con potencial agroindustrial debido a sus características nutricionales al
contener omega 3, 6 y 9 y un valor alimenticio de aproximadamente 90,34% de ácidos
grasos insaturados, es una planta que se puede posicionar en múltiples segmentos del
mercado como son los alimentos funcionales, suplementos dietéticos, productos
cosméticos y de cuidado personal y el de mercados sostenibles (Hughes, 2009).
11
2.2 MICOORGANISMOS CON PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO VEGETAL
PGPR
Los grupos de bacterias relacionadas con la rizófora, son aquellos que tienen la capacidad
de colonizar la raíz de la planta generando efectos benéficos sobre el crecimiento y
desarrollo de la planta, actuando específicamente en el ciclo de nutrientes y como agentes
de control biológico (Madhaiyan et al., 2009, Boiero, et al., 2007). Estos microorganismos
se caracterizan por exhibir propiedades importantes como: la colonización de la raíz,
sobrevivencia y multiplicación en la rizófora y promoción del crecimiento de las plantas.
De acuerdo a las cualidades mencionadas, este conjunto microbianas se ha denominado
PGPR (acrónimo del inglés Plant Growth Promoting Rhizobacteria) Rizobacterias
promotoras del crecimiento vegetal (Barea et al. 2005; Yao et al., 2010; Glick et al., 2007;
El-Tarabily, 2006; El-Tarabily, 2008).mejoran el crecimiento de las plantas por sus
procesos microbianos tales como solubilización de fosfato, nitrógeno, movilización de
potasio, la solubilización de zinc, la movilización de micronutrientes, y también la
secreción de fitohormonas (auxina, citoquininas, giberelinas), deseables para el
crecimiento y el desarrollo de plantas de un cultivo (Akhtar & Siddiqui, 2008).
2.2.1 Micoorganismos pgpr productores de sustancias indólicas.
De acuerdo a estudios realizados por diferentes autores, señalan que la fitoestimulacion
realizada por las bacterias PGPR es uno de los mecanismos más investigados (Lugtemberg
& Kamilova 2009), algunas sustancias volátiles y las fitohormonas son los causantes del
12
mecanismo promotor de crecimiento, y está relacionada con la capacidad que poseen los
algunos micoorganismos (PGPR) en producirla, aumentando el sistema radicular de la
planta y el follaje (Bal et al., 2012). Las fitohormonas son moléculas orgánicas que regulan
la expresión de genes implicados en el crecimiento y desarrollo vegetal. Estas moléculas
realizan efectos específicos sobre la fisiología vegetal, incrementando el volumen
radicular, aumentando la tasa de respiración de la raíz de la planta hospedera y el flujo de
protones en la membrana de la raíz; en consecuencia, se aumenta la absorción de nutrientes
y minerales solubles (Fibach-Paldi et al., 2012).
Dentro de las auxinas se encuentra El ácido-indol-3-acético (IAA) es la auxina más
estudiada, y se asocia con el crecimiento y morfología de la raíz, acelerando el proceso de
división celular, aumentando el tamaño de frutos y hojas (Franco-Correa, 2009). El ácido
indol acético se ha reportado reguladora de procesos celulares como división celular,
elongación, diferenciación, e interviene en el desarrollo del embrión, del fruto,
diferenciación del tejido vascular y el crecimiento. Pero destacan que la producción masiva
de esta fitohormona (AIA) detiene el crecimiento de la raíz en lugar de promoverlo (Zhao,
2010; Shrivastava, 2008). El ácido-indol-3-acético (IAA) es sintetizado por varias vías
metabólicas en función de la bacteria implicada a partir del aminoácido esencial triptófano
que también se encuentra en los exudados de las raíces (Camelo et al., 2011). Las rutas
metabólicas bacterianas asociadas para la biosíntesis de (AIA) se encuentran la vía del
ácido indol-3-pirúvico (IPyA), la indol 3-acetonitrilo (IAN), la triptamina (TAM) y la del
indol-3-acetamida (IAM). En cuanto para vegetales existe una ruta independiente de
triptófano que aún no se ha descrito en bacterias (Aguilar-Piedras et al., 2008). Dentro del
13
grupo de bacterias con potencial PGPR reportadas con capacidad de producir sustancias
indólicas se ubican a G. Diazotrophicus (Ramírez et al., 1993), Aeromonas veronii,
Alcaligenes piechaudii, A. brasilense, Comamonas acidovorans; Enterobacter cloacae,
Rhizobium leguminosarum y Bradyrhizobium sp. (Malik & Sindhu, 2011)
2.2.2 Micoorganismos biosolubilizadores de fosfatos.
Uno de los nutrientes primordiales que influyen en el crecimiento vegetal es el fósforo (P);
y aunque se encuentre en cantidades elevadas en el suelo, solo puede ser soluble en las
formas monobásicas H2PO-14 y dibásica HPO-24 (ortofosfatos) los cuales son los
compuestos asimilables a la planta, pero su disposición en el suelo es limitada y en
concentraciones bajas (Castagno et al., 2011). Estudios señalan que los microorganismos
con capacidad solubilizadores de fósforos constituyen en un 40% de la microbiota del suelo
y una concentración significativa de ellos es aislada de la rizósfera (Kucey, R. M. N. 1983).
Algunas bacterias de tipo PGPR presentan la capacidad de mineralizar fosfatos a partir de
la liberación de ácidos orgánicos, fosfatasas y quelación, los cuales son liberadas y
excretadas al suelo (Singh y Satyanarayana, 2012) mecanismo utilizado para la obtención
de este nutriente, ya que al producir ácidos orgánicos son capaces de quelar el fósforo
biodisponible en el suelo utilizando sus radicales hidroxilo y carboxilo (Vyas & Gulati
2009). Algunos autores mencionan géneros y especies de bacterias de tipo PGPR con
capacidad de solubilizar fosfatos que están dentro de los géneros Achromobacter sp.,
Acinetobacter sp., Azospirillum sp., Burkholderia sp., Flavobacterium sp., Microccocus
sp., Microbacterium sp., Serratia, Beijerinckia sp., así como las especies: Azotobacter
14
chroococcum, Bacillus circulans, Cladosporium harbarum, Bradyrhizobium japonicum,
Enterobacter agglomerans, Pseudomonas putida, Pseudomonas chlororaphis, Rhizobium
leguminosarum (Rodríguez & Fraga 2006).
2.2.3 Mecanismo de fitoestimulación del microorganismo pgpr.
Una forma de clasificar los microorganismos con potencial PGPR es a partir del tipo de
mecanismo directo o indirecto que ejercen en la planta hospedadora; cuando estas bacterias
ejercen una actividad de mecanismo directo es porque actúan en función de control
biológico, cuyo fin es limitar la tasa de crecimiento de patógenos que se encuentran
afectando a la planta, mediante la producción de antibióticos o la biosíntesis de sustancias
como catecolaminas y bacteriocinas. Este mecanismo también es denominado por su
propiedad y efecto benéfico como fitoestimulador (Cassan et al., 2009; Chaves et al., 2009,
Anandham, et al., 2007). En cuanto al mecanismo directo, hace referencia a la contribución
de nutrientes a la planta cuando actúan en función de fijación de nitrógeno, solubilización
de fosfato y hierro, biosíntesis de aminoácidos, producción y liberación de moléculas como
ácido indol acético (AIA), zeatina, ácido giberélico y ácido abscísico, sustancias que
estimulan los procesos fisiológicos en la planta, que relacionado con el crecimiento y
desarrollo vegetal y denominados como potencial biofertilizantes (Cassan et al., 2009;
Anandham et al., 2007).
15
2.3 CONSORCIOS MICROBIANOS
Un Consorcio microbiano es la asociación natural de dos o más poblaciones de
microorganismos, de diferentes especies, que conjuntamente actúan y funcionan como una
comunidad en un sistema complejo, donde cada integrante se beneficia de las actividades
de los demás. Este tipo de asociación refleja estilos de vida sinérgicos o sintróficos (que
significa “comiendo juntos”) en el que el crecimiento y el flujo continuo de nutrientes se
conduce más efectiva y eficientemente que en poblaciones individuales (López,
Domínguez & García, 2007). Funcionalmente, un consorcio microbiano aumenta la suma
de sus partes; sus miembros mantienen la compatibilidad metabólica y ecológica siempre
y cuando las transformaciones ambientales que se generan permitan que ellos coexistan
cercanamente. La ventaja de los consorcios microbianos es que pueden desempeñar
funciones complicadas que poblaciones individuales no podrían; además, la vida en
asociación puede generar mayor resistencia a las fluctuaciones del ambiente y favorecer la
estabilidad de los miembros, en el tiempo (Ochoa, D. & Montoya, A. 2010)
Estos rasgos distintivos dependen de dos características, primero, los miembros de un
consorcio se comunican el uno con el otro, ya sea por el intercambio de sustancias o por
señales moleculares, cada población detecta y responde a la presencia de otras dentro del
consorcio, ejerciendo sobre ellas un control positivo o negativo en su crecimiento y/o
metabolismo, por tanto esta comunicación facilita una segunda característica importante,
como es la division del trabajo (Ochoa, D. & Montoya, A. 2010)
Las poblaciones mixtas pueden desarrollar funciones que son difíciles o incluso imposibles
para las diferentes cepas; como, por ejemplo, es ciertamente difícil que para una única
16
célula existan rutas metabólicas eficientes e independientes que le permitan consumir entre
cinco y seis átomos de carbono. Sin embargo, en un consorcio estas actividades se pueden
dividir en otras de tal forma que se optimice las poblaciones individualmente, ya que tienen
la capacidad de efectuar funciones que requieren diferentes pasos, lo cual sería posible
cuando estos se han completado por diferentes tipos de células (Salazar, Y. & sanchez,
E.2011).
La producción total de un consorcio depende de la combinación de funciones
desempeñadas por los constituyentes individuales, es decir, por las poblaciones
microbianas involucradas. Otra importante característica de los consorcios es su habilidad
para desempeñar funciones actividades que requieren múltiples pasos, que son posibles
cuando los diferentes pasos se completan, mediante especies microbianas especializadas
(Brener, You & Arnold, 2008).
2.4 ANTAGONISMO Y SINERGISMO MICROBIANO
En los ecosistemas coexisten una variedad de interrelaciones entre microorganismos de
diferentes especies, estas relaciones reciben el nombre de sinergismo y antagonismos, de
competencia física y bioquímica, moduladas por múltiples y complejos factores bióticos y
abióticos. Estas interacciones se dan principalmente es la rizósfera, ya que es el sitio donde
estas comunidades se presentan específicamente funcionales, como promotores del
crecimiento vegetal, biocontroladores y especies patogénicas, que normalmente compiten
por espacio y por nutrientes. Esta afinidad entre microorganismos incide en la interacción
17
suelo-planta-microorganismos-ambiente, influyendo en el crecimiento y en el desarrollo
de las especies vegetales. (Cano, 2011).
Entonces, y de acuerdo con lo anterior el antagonismo microbiano está dado por la
inhibición, deterioro o muerte de alguna especie de microorganismos por la acción de otra;
o una relación entre dos poblaciones en la cual una de ellas causa efectos deletéreos o
negativos a la otra; mientras que el sinergismo conlleva a la protocoperacion entre especies
o dos poblaciones microbianas, indicando que ambas se benefician de la relación.
18
3. OBJETIVOS
3.1 GENERAL
Evaluar en condiciones in vitro el antagonismo y sinergismo en aislados microbianos
asociados a plantas de sacha inchi (plukenetia volúbilis L) para la conformación de un
consorcio microbiano.
3.2 ESPECÍFICOS
Determinar el antagonismo entre los aislados mediante pruebas de inhibición de
crecimiento.
Estimar el sinergismo a los microorganismos no antagónicos mediante la tasa de variación
de las actividades.
Seleccionar los microorganismos con potencial de co-inoculación correlacionando el
antagonismo y sinergismo.
19
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 UBICACIÓN
El estudio se realizó en el Laboratorio Agroecología de la Universidad de Santander
(UDES), Bucaramanga, Colombia.
4.2 COMPONENTE BIOLÓGICO
Los microrganismos para el estudio provienen del cerapio de la universidad de Santander
aislados de diferentes órganos de la planta de sacha inchi y evaluados en la fase anterior
del macroproyecto, de los cuales se evaluaron 9 bacterias y 2 hongos (Tabla 2) que
presentaron actividad PGPR.
Tabla 2 Aislados obtenidos de sacha inchi, seleccionados para la combinación microbiana.
MICROORGANISMOS
Bacterias
TSPBT07-01
TSEBT04-03
TSPBT01-02
TSPBT02-01
TSPBT02-04
TSEBT01-03
TSEBH01-01
TSEBR01-01
TSEBFL01-01
Hongos TSEHH03-01
TSEHR01-04
Fuente: Santos D & Hernández A, 2016.
20
4.3. EVALUACIÓN DEL ANTAGONISMO ENTRE AISLADOS
La evaluación in vitro del antagonismo entre los microorganismos se realizó mediante la
determinación de inhibición de crecimiento entre estos, adoptando las pruebas de plato dual
propuesta por (Cundom, et al. 2003), botón en césped de (Bauer et al.1966), y la
metodología de (Zafra G, et al.2016). Todas las pruebas se realizaron por duplicado. Las
concentraciones requeridas para cada microorganismo fueron estandarizadas por
espectrofotometría, teniendo en cuenta los resultados de las curvas de crecimiento de la
fase anterior del macroproyecto.
4.3.1. Inhibición de crecimiento entre Bacterias.
La determinación de inhibición entre las bacterias se realizó por duplicado y mediante el
método de “botón en césped” de (Bauer et al.1966), sustituyendo el agar Muller Hinton por
agar NBY, inoculando 0,1 ml con una concentración 108 UFC/ml la cual se extendió
masivamente sobre la superficie del medio, y en discos inoculados con 10 µl de
concentraciones de 108 UFC/ml de las demás bacterias a evaluar, dispensadas sobre la
superficie del agar, posterior se incubaron a 30°C hasta observar crecimiento y halos de
inhibición. La interpretación de los resultados se tuvo en cuenta la presencia o ausencia de
halos de inhibición reportados en milímetros (mm).
21
Figura 1 Siembra masiva de la bacteria a ensayar (fondo oscuro) y bacterias adyacentes a la caja de Petri.
(Bauer et al.1966).
4.3.2 Inhibición de crecimiento entre hongos.
El enfrentamiento entre hongos se realizó por duplicado y utilizando la técnica de “plato
dual”, propuesta por (Cundom, et al., 2003), el cual consiste en colocar en cada extremo
de la caja Petri un disco de 6 mm de diámetro inoculado con las cepas a enfrentar en una
concentración de 106, sustituyendo el medio PDA por medio NBY, se incubo a temperatura
ambiente hasta observar crecimiento de estos y determinar la presencia de inhibición de
crecimiento o efectos antagonistas entre sí. Como control se utilizó el crecimiento libre de
cada hongo colocando el disco colonizado en el centro de la caja registrando el crecimiento
radial durante nueve días. Los resultados están dados mediante el criterio de inhibición de
crecimiento y se mide en porcentaje (%) de inhibición del crecimiento radial mediante la
ecuación (PICR) utilizada por Suárez et al. 2008.
Bacteria
masiva Bacterias
22
Donde R1 es el radio mayor (radio Hongo-testigo) y R2 es el radio menor (radio del Hongo
en cultivo dual).
Figura 2 Enfrentamiento de los hongos a ensayar de acuerdo con el método Plato dual propuesta por
Cundom, et al., 2003.
4.3.3 Inhibición de crecimiento de Hongos hacia las bacterias.
Para detectar cualquier actividad inhibitoria de los hongos hacia el crecimiento de las
bacterias, se realizó la inoculación centrada de un disco de 6mm, el cual contenía 10 µl a
una concentración de 106 esporas fúngicas, se incubó a temperatura ambiente. Después de
observar crecimiento hasta fase de esporulación (indicativo metabolismo secundario), 10
µl de concentraciones de 108 UFC/ml de cada cepa bacteriana fue sembrada radialmente
Hongos
23
adyacente de la colonia del hongo, se incubo a 30°C hasta observar crecimiento bacteriano
y si la cepa fúngica, inhibe el crecimiento de las bacterias. (Zafra G, et al.2016). La
actividad inhibitoria por parte del hongo se consideró positiva cuando se verificó el
crecimiento limitado o inexistente de la bacteria ensayada, reportando resultados en
milímetros (mm)
Figura 3 Esquema de la inoculación del hongo (centro) y siembra de las bacterias por estría desde el
micelio del hongo hasta el borde de la caja (Zafra G, et al.2016).
4.3.4 Inhibición de crecimiento de Bacterias hacia los hongos.
En la determinación de la inhibición de las bacterias hacia los hongos se realizó la
inoculación de discos de 6mm con 10 µl de suspensiones bacterianas a concentración 108
UFC/ml sobre la periferia del medio y la inoculación centrada de un disco de 6mm con
10µl concentración 106 esporas fúngicas, siembras que a diferencia del ensayo anterior, se
realizan al mismo tiempo y posteriormente, se incubaron a 30 ° C, se observan cada 24
horas, hasta observar la existencia de inhibición por parte de las bacterias hacia el
A B
Hongo
Bacterias
24
crecimiento radial del hongo, ( Zafra G, et al.2016). Como control se utilizó el crecimiento
libre del hongo colocando el disco colonizado en el centro de la caja registrando el
crecimiento radial. La interpretación de los resultados se tuvo en cuenta la presencia o
ausencia de inhibición de crecimientos reportados en milímetros (mm).
Figura 4 Siembra al tiempo del hongo (centro) y cepas bacterias (periferia) Zafra et al.2016.
4.4 DETERMINACIÓN DEL SINERGISMO ENTRE AISLADOS
MICROBIANOS
La determinación del sinergismo se estimó mediante la tasa de variación de la actividad de
los microorganismos que no presentaron antagonismo, para esto se conformaron
combinaciones con respecto a los valores de actividad reportados por individual.
Se utilizó como inóculo, una mezcla liquida conformada por los microorganismos que
presentaron actividades de interés como solubilizarían de fosfato y producción de
sustancias indólicas. Se obtuvieron, concentraciones celulares en agua des-ionizada estéril,
del orden de 108 UFC/ml para bacterias y 106 esporas, para las cepas fúngicas, las
Hongo
Bacterias
25
concentraciones fueron determinadas por espectrofotometría. Posteriormente se realizó la
mezcla en volúmenes iguales de cada suspensión, hasta formar un volumen final de 30ml,
constituyendo así el inóculo de trabajo.
4.4.1 Crecimiento en medio NBRIP.
Para poder realizar la cuantificación del fosforo solubilizado por los inóculos mixtos, se
llevó a cabo en frascos Scott, 27 ml caldo NBRIP (National Botanical Research Institute's
phosphate) utilizando fosfato tricálcico (Ca3 (PO4)2) como fuente de fosforo, según
metodología utilizada por Nautiyal, 1999. Los cuales fueron inoculados con 3ml de las
mezclas de microorganismos (inóculos mixtos) e incubados a 30ºC en agitación constante
150rpm, por 96 horas. (Alikhani et al., 2007).
4.4.2 Detección y cuantificación de fósforo solubilizado in vitro.
La determinación y cuantificación de fosforo solubilizado in vitro se realizó por el método
de molibdatovanadato fosfórico (Hach Company, 2007) Para ello, se tomaron 3ml de
muestra (crecimiento en caldo NBRIP) sometido a centrifugación por un tiempo de 15
minutos a 5000 rpm, tomando 500 µl de sobrenadante, al cual se le adiciono 2ml del
reactivo, después de siete (7) minutos y se realizó la lectura por espectrofotometría, en una
longitud de onda de 430nm (Hach DR2800).
26
4.4.3 Producción de Ácido Indol Acético (AIA).
Para la verificación de la producción de ácido indol acético (AIA) promotor de crecimiento
vegetal en las mezclas microbianas, se tomaron 3 ml de la mezcla o combinación
microbiana, inoculado en 27 ml de medio TSB (Tripticasa Soya Broth), se incubo a 30°C
y en agitación constante de 150 rpm, la confirmación de la producción del AIA se llevó a
cabo por método colorimétrico reactivo de Salkowsky (Rahman et al; 2010).
Posteriormente se realizó la lectura en el espectrofotómetro con una longitud de onda de
430nm (Hach DR2800).
4.5. MÉTODOS UTILIZADOS.
4.5.1 Fósforo, Reactivo (Molybdovanadate Rapid Liquid Method) 31.
En el método del molibdovanadato, el ortofosfato reacciona con molibdato en un medio
ácido para producir un complejo fosfomolibdato. En presencia de vanadio, se forma ácido
vanadomolibdofosfórico amarillo. La intensidad del color amarillo es proporcional a la
concentración de fosfato. Los resultados de la prueba se miden a 430 nm en el
espectrofotómetro Hach DR 2800. Se utiliza el reactivo a una relación 1:25 con la muestra
con un tiempo de reacción de 7 minutos a 30°C. Todo el material de vidrio a utilizar se
debe lavar con detergente libre de fosfatos y posteriormente con ácido clorhídrico (HCl) a
una concentración de 2,5% y enjuagarse con agua, con el fin de eliminar posible
contaminación con fósforo y demás interferencias (© Hach Company, 2007).
27
4.5.2 Salkowski.
El reactivo de salkowski oxida el ácido indolacético formando un quelato con hierro a pH
ácido y para así medir la formación de un compuesto de oxidación coloreado de ácido
indolacético formado a pH muy ácido, en presencia de cloruro férrico, que se determina a
una longitud de onda de 530nm en este caso en espectrofotómetro Hach DR 2800. Se utilizó
un volumen de 3mL de sobrenadante y 2mL de reactivo, la reacción tiene una duración de
30 minutos a una temperatura de 30 °C, donde el desarrollo de una coloración roja-rosada
indicó la presencia de ácido indolacético (Spaepen, Vanderleyden, & Remans, 2007;
Sarwar, Arshad, Martens, & Frankenberger, 1992).
4.6 ANALISIS ESTADÍSTICO
Para la determinación del antagonismo microbiano se empleó un diseño estadístico por
bloques, completamente al azar. Donde el bloque es la bacteria que se siembra masiva y el
factor es el microorganismo sembrado en el sensi-disco (individual) y la variable de estudio
fue la capacidad de producir el halo de inhibición.
En cuanto a la evaluación del sinergismo de los consorcios se empleó análisis estadístico
descriptivo basado en tablas de resumen y diagramas de barras medidas de variación
descrita mediante diagrama de cajas, utilizando el paquete estadístico SPSS y Excel 2016.
28
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1.1 EVALUACIÓN GENERAL DEL ANTAGONISMO ENTRE LOS
AISLADOS
5.1.2 Inhibición entre Bacterias.
La evaluacion de inhibición entre bacterias se realizo ediante la prueba de “botón en
césped” de (Bauer et al., 1966), evidenciando que el (80,8%) promedio de los
enfrentamientos no presentó inhibición de crecimiento bacteriano, destacándose la cepa
TSEBT 04-03 quien no presento antagonismo o inhibición frente a las 8 cepas de ensayo.;
Y solo el (19,2%) promedio presento halos de inhibición de crecimiento entre las bacterias
de evaluadas, señalando a la cepa TSEBR 01-01 quien presento mayor antagonismo.
Tabla 3 Resultados de inhibición de crecimiento bacterias vs bacterias.
Fuente: Autor Actividad inhibidora: (+) Sin inhibición y (-) Con inhibición.
INHIBICIÓN
CEPAS TSPBT07-01 TSEBT04-03 TSPBT01-02 TSPBT02-01 TSPBT02-04 TSEBT01-03 TSEBH01-01 TSEBR01-01 TSEBFL01-01
TSPBT
07-01 + + - - + + + +
TSEBT 04-03
+ + + + + + + +
TSPBT
01-02 + + - + + - - +
TSPBT 02-01
- + + + + + + +
TSPBT
02-04 - + + + + + - +
TSEBT 01-03
+ + + + + + - +
TSEBH
01-01 + + + + + + + +
TSEBR 01-01
+ + - + - - + -
TSEBFL
01-01 + + + + + + + -
29
Los resultados reportados en este estudio concuerdan con lo reportado por (Hernández A,
2016) en su estudio de compatibilidad de microorganismos aislados de sacha inchi, donde
indica que ningúno de los microorganismos evaluados in vitro son compatbibles en la
totalidad de los enfrentamientos, y difiere de otros autores, los cuales indican es sus
investigaciones de antagonismo que los microorganismos aislados de un mismo
microhábitat (planta) no presentan antagonismo, a diferencia que los microorhganismos de
ensayo a pesar de que provienen de una misma planta, fueron aislados de diferentes
órganos de la planta sacha inchi, dado a que la función primordial de muchos metabolitos
secundarios (antibacteriana, antifúngica, inhibición de germinación de esporas)
producidos, varía según su localización en los tejidos de las plantas (Jorge M, e et al;
2005). Sin embargo, solo una cepa (TSEBT 04-03) del presente estudio tuvo la capacidad
de interactuar positivamente en todos los enfrentamientos realizados, esto debido que
ciertos genes en algunas bacterias les confieren un incremento en la resistencia a péptidos
antimicrobianos producidos por otras (Joerger, 2002). Las demás cepas evaluadas
presentaron antagonismo e inhibición en los ensayos, debido a los mecanismos de acción
que involucran la producción de enzimas líticas, antibiosis, entre otros, destacando que en
general más de un mecanismo puede estar implicado en el efecto del crecimiento
(Janisiewicz y Korsten, 2002).
Los resultados de las pruebas al ser estudiado por el tamaño de sus halos y las frecuencias
inhibición evidenciaron que la bacteria TSEBT04-03 presento 0% en frecuencia al ser
compatible con las demás cepas de estudio, y la cepa TSEBR01-01 presentó el mayor halo
de inhibición en comparación de las demás (Figura 5).
30
Figura 5 Promedio en milímetros del halo de inhibición y su porcentaje de frecuencia.
La cepa TSEBT04-03 se perfiló en la selección para las combinaciones; seguida las cepa
TSEBFL01-01 y TSEBT01-03 quienes presentaron halos de inhibición entre 2,5 y 4 mm
(Figura 5), hacia una bacteria, en cuanto a la cepa TSPBT 01-02 quien presento inhibición
frente a tres bacterias entre 1-2mm (Tabla3), (Figura 5), y con una frecuencia del 37%
(Figura 5), y la cepa TSEBR01-01 la cual presentó mayor inhibición frente a cuatro cepas
(2-4 mm) y su frecuencia estuvo en el 50% de los ensayos realizados (Figura 5), lo que
indica que la actividad inhibitoria de estas dos cepas las hace menos selectivos para las
combinaciones. Todos los halos inhibiciones fueron menor a 5mm, siendo un criterio para
no eliminar cepas mayores a esta medida, como lo sugiere, (Barragán, 2003).
5.1.3 Inhibición entre Hongos.
El ensayo de antagonismo entre los hongos (TSEHH03-01 - TSEHR01-04) no se evidenció
ninguna inhibición del crecimiento radial (Figura 6), Los valores del PICR en el tiempo de
1,25 0 2,65 1 2,65 3,9 2,1 3,4 2,9
25
0
3725 25
12,5 12,5
50
12,5
TSPBT 07-01
TSEBT 04-03
TSPBT 01-02
TSPBT 02-01
TSPBT 02-04
TSEBT 01-03
TSEBH 01-01
TSEBR 01-01
TSEBFL 01-01
Bacterias
Halo de inhibición y porcentaje de frecuencia
Promedio en milimetros del halo de inhibici´n Porcentaje de frecuencia
31
evaluación fue del 100% en el crecimiento de las dos cepas fúngicas. Dándose una
interacción positiva.
Fuente: Autor observacion del acercamiento y crecimiento de los hongos mostrando interacción positiva in vitro.
Figura 6 Compatibilidad entre los hongos de ensayo TSEHH03-01 - TSEHR01-04.
Estos resultados obtenidos contrastan con los reportes de (Carvajal, E et al.2012), en el estudio antagonico
de H6 frente a M. roreri señala que la esporulación de este último fue considerablemente superior en un
97% lo cual coincide con lo reportado en la literatura según (Melnick et al. 2008) donde menciona que
podría existir la posibilidad que determinados aislamientos microbianos, produzcan metabolitos
secundarios que en lugar de restringir estimulan la esporulación entre ellos, desarrollaron sin inhibir el
crecimiento entre ellos.
Lo anterior indica que no existe ningún tipo de antibiosis, competencia por espacio o por
nutrientes, interacciones directas (Lisis enzimática) que impidan el libre desarrollo de
ambas cepas.
32
5.1.4 Inhibición de crecimiento de Hongos hacia las bacterias.
A partir de la evaluación del enfrentamiento entre las cepas fúngicas y las bacterias (Tabla
4) se evidenció que el que el 72,7% de las cepas no presentaron inhibición de crecimiento.
Para el csaso específico de destacón la cepa fúngica TSEHH03-01 que inhibió el
crecimiento de la bacteria TSEBFL01-01 y la cepa TSEHR01-04 frente a las cepas
bacterianas TSEBT04-03 y TSEBFL01-01 se vieron afectadas en su crecimiento expresado
en halos de inhibición.
Tabla 4 Resultados de enfrentamiento de los hongos hacia las cepas bacterianas.
Fuente: Autor Actividad inhibidora: (+) Sin inhibición y (-) Con inhibición.
Los resultados obtenidos en este ensayo contrastan con los resultados obtenidos por (Cano,
A, 2011) en donde demostró en su estudio de interaccion benéfica de Micorrizas,
Trichoderma spp. Y Pseudomonas, resaltando que estos microorganismos normalmente
mantienen relaciones antagónicas o sinérgicas en cuanto al establecimiento, adaptación y
proliferación de las especies en la rizósfera, mediado o modulado por la producción de
sustancias antibióticos por parte de los microorganismos. Por ejemplo, Trichoderma
produce compuestos antifúngicos, que deprimen la colonización radicular por parte de los
formadores de micorriza arbuscular y, por el contrario, exudados del micelio de estos,
INHIBICIÓN
CEPAS TSPBT07-
01
TSEBT04-
03
TSPBT01-
02
TSPBT02-
01
TSPBT02-
04
TSEBT01-
03
TSEBH01-
01
TSEBR01-
01
TSEBFL01-
01
TSEHH
03-01
+ + + + + + + + -
TSEHR
01-04
+ - + + + + + + -
33
pueden estimular la presencia de bacterias, como Pseudomonas, en la rizósfera (Cano, A,
2011).
Figura 7 Inhibición hongos hacia bacterias, A) Hongo TSEHR01-04 inhibiendo a las cepas TSEBT04-03 y
TSEBFL01-01 B) Hongo TSEHH03-01 inhibiendo a la cepa TSEBFL01-01.
Fuente: Autor observaciòn de halos de inhibición de bacterias frente a los hongos ensayados.
La inhibición de las cepas TSEBFL01-01 y TSEBT04-03 pudeo deberse a que, al sembrar
primero la cepa fúngica, y en su fase de esporulación donde activamente exuda en el medio
los metabolitos secundarios como por ejemplo antibióticos o sustancias inhibidoras; luego
de esto y siguiendo la metodología de Zafra et al.2016. Se realiza la siembra de las bacterias
a ensayar, estas resultan de acuerdo con el grado de sensibilidad afectadas en su
crecimiento manifestado en halos de inhibición (Figura 7).
5.1.5 Inhibición de crecimiento de las Bacterias hacia los Hongos.
La inhibición in vitro entre las cepas bacterianas y hongos se aprecia, (Tabla 5)
observándose que no existen diferencias en la inhibición del crecimiento radial fúngico
entre las cepas analizadas con respecto al ensayo anterior, donde se evidencio que los
hongos inhibieron a las bacterias (TSEBT04-03 y TSEBFL01-01).
TSEBT04-03
TSEBFL01-01 TSEBT04-03
A B
34
Tabla 5 Resultados de inhibición de crecimiento de las bacterias hacia los hongos.
Fuente: Autor Actividad inhibidora: (+) Sin inhibición y (-) Con inhibición.
La capacidad de inhibición de las bacterias hacia los hongos incide con el estudio in vitro
realizado por Orietta y Larrea (2001), en donde señalo que la cepa bacteriana de estudio
posiblemente su mecanismo ejercido por la bacteria B3 hacia el hongo H20, fue el de
antibiosis, debido a la producción de metabolitos secundarios, los cuales pueden ser
volátiles o difusibles, pero que, en cualquiera de los casos, sin entrar en contacto físico con
el patógeno, pueden inhibir o restringir su crecimiento.
Los resultados del ensayo de inhibición de las bacterias hacia los hongos, es asociado con
la disminución de la producción de metabolitos antifúngica por parte de estos aislados
Bacterianos o con la producción de compuestos por parte del hongo que inhiban el
crecimiento bacteriano.
5.1.6 Evaluacion general del antagonismo de los aislados.
De las 11 cepas (bacterias y hongos) ensayadas se evidenció que el (81,8 %) de los
enfrentamientos no presento inhibición de crecimiento, miestras que el (18,2%) presentó
inhibición de crecimiento frente a las demás cepas (ver Tabla 6).
INHIBICIÓN
CEPAS TSEHH 03-01 TSEHR 01-04
TSPBT07-01 + +
TSEBT04-03 + -
TSPBT01-02 + +
TSPBT02-01 + +
TSPBT02-04 + +
TSEBT01-03 + +
TSEBH01-01 + +
TSEBR01-01 + +
TSEBFL01-01 - -
35
Tabla 6 Resultados de la evaluación de inhibición del conglomerado de las 11 cepas.
Fuente: Autor Actividad inhibidora: (+) Sin inhibición y (-) Con inhibición.
Los resultados en este estudio indican que hay antagonismo entre las cepas mediante
mecanismos de inhibición por medio de sustancias o competencia por sustratos, pero
también se presentó interacciones positivas; estos datos son pioneros dado aque no se
reportan investigaciones de microorganismos aislados de la oleoginosa de sacha inchi y
que se hace importante destacar que a pesar que los enfrentamientos fueron in vitro, cabe
la pososibilidad que el comportamiento en campo cambie totalmente, puesto que los
factores abióticos alteran negativa o positivamente las interacciones, por eso se hace
necesario seguir evaluando estos micooranismos en un posterior estudio in situ.
INHIBICIÓN
CEPAS TSPBT07-01
TSEBT04-03
TSPBT01-02
TSPBT02-01
TSPBT02-04
TSEBT01-03
TSEBH01-01
TSEBR01-01
TSEBFL01-01
TSEHH03-01
TSEHR01-04
TSPBT 07-01
+ + - - + + + + + +
TSEBT 04-03
+ + + + + + + + + +
TSPBT 01-02
+ + - + + - - + + +
TSPBT
02-01 - + + + + + + + + +
TSPBT 02-04
- + + + + + - + + +
TSEBT 01-03
+ + + + + + - + + +
TSEBH 01-01
+ + + + + + + + + +
TSEBR 01-01
+ + - + - - + - + +
TSEBFL 01-01
+ + + + + + + - - -
TSEHH 03-01
+ + + + + + + + - +
TSEHR 01-04
+ - + + + + + + - +
36
6 ENSAYO DE SINERGISMO A LOS CONSORCIOS MICROBIANOS
ESTABLECIDOS
6.1. Solubilización de fosfatos
La evaluación de sinergimo a partir de solubilización de fosfatos permitió evidenciar que
las combinaciones presentaron el 34,37% de sinergismo dando como resultado la
potencialización de las actividades de estos microorganismos al encontrarse en conjunto,
el 43,75% corresponde a los consorcios que disminuyeron su actividad y el 21,8%
mantuvieron el rango promedio de la actividad individual con respecto en consorcio.
Figura 8 Evaluación de las actividades que presentaron las mezclas con respecto a la actividad promedio
individual.
37
Las mezclas que presentaron mayor actividad de destacan C2, C6, C11 demostrando un
aumento en sus actividades con respecto a lo realizado por individual representando el
37,34% de aumento y los consorcios que disminuyeron su actividad corresponden a las
mezclas C1, C8, C9, C10, C12, C13, C14, C17, C18, C20, C23, C24, C25 Y C30, los
demás estuvieron en promedio con respecto a su promedio individual. Los resultados
evidenciados en esta investigación se asimilan a la investigación realizada por (Mantilla C
y Negrete P, 2015) en la evaluación de consorcios con efecto bioinoculantes, en donde
señala que los resultados de la prueba demostraron que los índices de solubilización de
fosfato de algunos consorcios fueron mayores en comparación con las cepas individuales,
demostrándose un efecto sinérgico favorable.
El sinergismo positivo entre las cepas de este estudio fue dado por el aumento de la
solubilización trabajado en conjunto y se debe a que comparten una compatibilidad
metabolica en conjunto, donde se benefician de las actividades de los demás, reflejando
intyeracciones sintróficas en el que el crecimiento y el flujo continuo de nutrientes se
conduce más efectiva y eficientemente que en las poblaciones individuales (López, T et
al., 2007)
El análisis de la evaluación de la actividad de cada uno de los microorganismos de ensayo
en las diferentes mezclas con respecto a la actividad individual para la solubilizacios de
fosfatos mostros que el 72.72% mostro variación en dicha actividad, se resalta que el 45%
aumento los ctividad al ser evaluados en mezcla con las otras cepas y en contraste el 39%
disminuyo su actividad. Las cepas TSPBT01-02, TSPBT02-04 y TSEHH03-01 fueron las
que mostraron el mayor aumento de la actividad.
38
Figura 9 Diagrama de caja de las diferencias de solubilización de fosfatos en mezcla con respecto al
promedio de la solubilización individual.
Los microorganismos que potencializaron esta actividad y que de acuerdo al análisis
estadístico (Figura 9), fueron las bacterias TSPBT01-02, TSPBT02-04, TSEBT01-03, y el
hongo TSEHH03-01, los cuales presentan un aumento significativo en las mezclan donde
participaron, como los consorcios C2, C3, C4, C6, C7, C11, C15, C16, C21, C26, C31
(Figura 8), se resalta que el hongo TSEHH03-01 tuvo sinergismo con las bacterias puesto
que potencio las actividades en las combinaciones realizadas, quien estuvo integrando en
7 combinaciones de los 11 consorcios con mayor solubilización, y el hongo TSEHR01-04
estuvo en 5 combinaciones de los 11 consorcios significativos, los hongos TSEHH03-01 y
TSEHR01-04 junto con las cepas bacterianas aumentaron las actividades solubilizadora de
39
fosfatos en más del 40% de las combinaciones (Figura 8). Los anteriores resultados
concuerdan con los datos encontrados por Hernández A, (2016) en el cual realizó la
evaluación de cepas aisladas de sacha inchi donde puntualiza que la acción de dos o más
microorganismos que actuaron en conjunto, registraron una respuesta mayor a la suma de
los efectos que expresan por separado, los de más consorcios efectuaron una solubilización
de fosfatos menor del 41 mg/L. no discriminando su efecto en consorcio, puesto que su
actividad aumentó considerable en relación de la actividad independiente, y en algunos
casos manteniendo o disminuyendo el potencial de interés; siendo esto similar a lo
reportado por (Subba, 1992) donde la solubilización de fosforo en cepas de Rhizopus spp
y Penicillium spp fue de 47 y 79 ppm. Y estudios de investigación como los de (Bobadilla
C, Rincón S; 2008) donde observaron que el fosforo disponible en la hora 0 fue de 5 ppm
, en la hora 8 de 9.6 ppm y en la hora 14 determinaron 24,7 ppm de fosforo disponible el
cual dedujeron como el punto más alto porque existe mayor actividad de las enzimas
fosfatasas que está directamente relacionado con el crecimiento bacteriano, y a las 24 horas
disminuye a 17,8 ppm debido a la disminución de la carga bacteriana y por ende las
fosfatasa. Pero autores como (Zeroual et al, 2012) obtienen datos similares al desarrollado,
ya que en la solubilización de fosfato las variaciones oscilaron entre 55,1 hasta 302,8 mg/g
siendo, 30,8 mg/g la solubilización más baja, en diferentes cepas de Aspergillus niguer.
Los microorganismos en consorcios presentaron mayor actividad solubilizadora de fosfato
en relación cuando se encontraban por individual dado a que los consorcios microbianos
en muchos casos interactúan de manera sinérgica estimulando algunas actividades físicas
o bioquímicas de las cepas involucradas en combinación; el aporte en la solubilización de
40
los hongos fue significativo debido a la producción de enzimas fosfatasas y la interacción
simultanea junto al principal mecanismo microbiológico por el cual los compuestos
fosfatados son solubilizados es la disminución del pH del medio extracelular hasta valores
aproximados a 2, 0 que son necesarios para que se pueda llevar a cabo la solubilización.
Este fenómeno se origina debido a la liberación de ácidos orgánicos de bajo peso molecular
por parte de los microorganismos, cuyas propiedades quelantes favorecen la formación de
complejos insolubles con metales, con la consecuente liberación del fosfato (Beltrán,
2014).
6.1.1 Produccion de sustancias acido indol acético.
En el presente estudio se evaluó la biosíntesis de ácido indol acético (AIA) a 32
conformaciones microbianas, mediante la reacción colorimétrica de Salkowsky, y el indice
de variación de la actividad, encontrándose rangos de concentraciones de 7, 0 a 34,0mg/L
(Figura 10).
Figura 10 Evaluación de las actividades que presentaron las mezclas con respecto a la actividad promedio
individual.
41
Los resultados mostraron que las combinaciones presentaron el 34,38% de sinergismo
dando como resultado la potencialización de las actividades de estos microorganismos al
encontrarse en conjunto, el 37,5% corresponde a las mezclas que mantuvieron el rango
promedio de su actividad y el 28,13% disminuyó la actividad en la mezcla con respecto a
producción promedio individual. Los consorcios significativos en la producción sustancias
indólicas se destacaron los siguientes: C2, C5, C6, C8, C19, C20, C21, C22, C24, C31 Y
C32 (Figura 10). La producción máxima en el consorcio 20 reportando 34,05 mg/L y el
consorcio 19 dando concentraciones de 31,25 mg/L, el consorcio con menor producción
de AIA fue el C17, en donde mantuvo el rango de la actividad inicial (Figura 10).
Los microorganismos que tuvieron significancia en el aumento de la actividad productora
de (AIA) Fueron TSPBT07-01, TSEBT04-03, TSPBT02-04, TSEBT01-03 y los hongos
TSEHH03-01 y TSEHR01-04 participando cada uno de por lo menos en 5 y 7
combinaciones.
El análisis de la evaluación de la actividad de cada uno de los microorganismos de estudio
en las diferentes mezclas con respecto a la actividad individual para la producción de acido
indol acético (AIA) mostro que el 81% mostro variación en dicha actividad, se resalta que
el 63% aumento las actividades al ser evaluados en mezcla con las otras cepas y en
contraste el 18% disminuyo su actividad. Las cepas TSPBT07-01, TSEBT04-03,
TSPBT02-04, TSEHH03-01, y TSEHR01-04 fueron las que mostraron el mayor aumento
de la actividad.
42
Figura 11 Diagrama de caja de las diferencias de producción de sustancias indólicas (AIA) en consorcios
con respecto al promedio de la producción individual.
La cepa bacteriana TSPBT02-04 estuvo presente en 7 combinaciones y de acuerdo con el
diagrama de caja estaditico (Figura 11) esta cepa aumento la actividad en los consorcios
que aumentaron aumentraon significativamente la actividad (Figura 13).
Los hongos a pesar de que por individual no producían (AIA) resultados contrastados con
el estudio de (Soler, J, et al, 2012) en donde señalo que 28 colonias de hongos realizaron
producción de índoles. Se determinó que los microorganismos evaluados en conjunto
aumentaron la producción (34,38%) que lo que sintetizaban por individual (ver tabla 8);
siendo esto una interacción positiva de sinergismo o protocooperación; sin embargo es
importante mencionar, que aunque las estudios sobre evaluación de la producción de
Ácido indol acético obtengan valores altos o bajos si se comparan entre sí, está comprobado
que bajas concentraciones de fitohormona son capaces de estimular el desarrollo vegetal y
43
altas concentraciones inhiben y reducen la zona de alargamiento en la planta (Rodríguez et
al., 2005; Hernández, 2002). El ácido indol acético (AIA) es la auxina más ampliamente
distribuida en las plantas; los efectos demostrados en investigaciones llevadas a cabo
contemplan, entre otras, la elongación, aumento en la respiración celular, promoción del
crecimiento en raíces o incremento en la división celular, factores que favorecen el
desarrollo vegetal. Las aplicaciones de inoculantes microbianos (biofertilizantes), en los
cultivos cada día van en aumento debido a que sustituya en parte o totalmente la utilización
de fertilizantes para disminuir los problemas ambientales y aprovechar los productos que
conserven los ecosistemas naturales. La utilización de microorganismos con potencial
biofertilizante productores de AIA ha demostrado ser eficientes gracias a que pueden
aumentar los rendimientos y la calidad de las cosechas; así lo han demostrados los trabajos
en campo realizado en Colombia (Moreno et al., 2006; Montoya, 2004).
Tal como se demostró en los resultados de los ensayos de sinergismo muestran índices de
variación de actividad significativos de acuerdo con los resultados de la actividad por
individual de solubilización de fosfatos y producción de sustancias indólicas de cada cepa
de ensayo reportado por (Santos D, 2016). A partir de las pruebas de antagonismo se
conformaron 32 mezclas.
Correlacionando el estudio del antagonismo y sinergismo, se seleccionó las cepas
bacterianas TSPBT07-01, TSPBT02-04, TSEBT01-03 y las cepas fúngicas TSEHH03-01,
TSEHR01-04 con potencial para la conformación de consorcios, esto determinado por no
presentar antagonismo y aumentar las actividades en conjunto.
44
Dichos resultados son pioneros en la medida que se muestra que un grupo de
microorganismos aislados de la oleoginosa sacha inchi potencializaron sus actividades
benéficas con el fin de desarrollar bioinoculantes que puedean utilizarse para la promoción
de cultivos de sacha inchi de manera sostenible, con dicho estudio se confirma que la
potencialización de las actividades de interés de estos microorganismos sucede cuando se
encuentran en conjunto que de manera individual, debido a que todas las actividades son
desarrolladas de manera efectiva y eficiente.
45
CONCLUSIONES
Se evidencio que en promedio el 18,2 % de los microorganismos evaluados presentan
actividad antagonica y que el 81% promedio son compatibles.
Se determinó mediante pruebas de antagonismo y bajo el criterio de inhibición de
crecimiento que el asilado microbiano TSEBR01-01 presento mayor inhibición
(36,4%) en los enfrentamientos y su frecuencia represento en más del 50%.
Se determinó el sinergismo entre los aislados de sacha inchi mediante el aumento de
las actividades o tasa de variación de la actividad de interés como la solubilización de
fosforo y producción de sustancias indólicas en los consorcios C2, C6, C21 Y C31.
Se determino que las combinaciones realizadas presentaron un 35,98% de sinergismo
aumentando la actividad, el 35,94% de las combinaciones disminuyeron sus
actividades y solo el el 26,65% mantuvieron el promedio de las actividades frente al
pronmedio individual.
Se estableció los microrganismos con potencial de inoculación según los resultados de
antagonismo y sinergismo, destacando la cepa TSPBT02-04 en producción de AIA y
la cepa TSEBT04-03 en solubilización de PO4.
46
Anexos
Tabla 7 Microorganismos con actividad promotoras de crecimiento vegetal individual
Fuente: Santos D, 2016
Tabla 8 Conformación de 32 consorcios de acuerdo con ensayos de antagonismo.
Fuente: Autor
PRODUCCIÓN [AIA]mg/L SOLUBILIZACIÓN [PO4]mg/L
TSPBT07-01 7,51 31,88
TSEBT04-03 X 39,3
TSPBT01-02 18,29 X
TSPBT02-01 9,9 X
TSPBT02-04 3,37 46,48
TSEBT01-03 X 38,38
TSEBH01-01 X 42,98
TSEBR01-01 10,42 X
TSEBFL01-01 13,74 X
TSEHH03-01 X 18,74
TSEHR01-04 X 24,94
MICROORGANISMO
BACTERIAS
HONGOS
CONSORCIO
1 TSEBT04-03 TSPBT01-02 TSEHH03-01
2 TSEBT04-03 TSPBT02-04 TSEHH03-01
3 TSPBT01-02 TSEBT01-03 TSEHH03-01
4 TSPBT01-02 TSEBT01-03 TSEHR01-04
5 TSPBT07-01 TSPBT01-02 TSEHH03-01
6 TSPBT07-01 TSPBT01-02 TSEHR01-04
7 TSEBT04-03 TSEBR01-01 TSEHH03-01
8 TSEBT04-03 TSEBR01-01 TSEHR01-04
9 TSEBH01-01 TSEBFL01-01 x
10 TSEBH01-01 TSEBR01-01 TSEHH03-01
11 TSEBH01-01 TSEBR01-01 TSEHR01-04
12 TSEBH01-01 TSEBT01-03 TSEHH03-01
13 TSEBH01-01 TSEBT01-03 TSEHR01-04
14 TSPBT02-01 TSEBH01-01 TSEHH03-01
15 TSPBT02-01 TSEBH01-01 TSEHR01-04
16 TSPBT01-02 TSEHH03-01 TSEHR01-04
17 TSPBT07-01 TSEBH01-01 TSEHH03-01
18 TSPBT07-01 TSEBH01-01 TSEHR01-04
19 TSPBT01-02 TSPBT02-04 TSEHH03-01
20 TSPBT01-02 TSPBT02-04 TSEHR01-04
21 TSPBT02-04 TSEBT01-03 TSEHH03-01
22 TSPBT02-04 TSEBT01-03 TSEHR01-04
23 TSEBT04-03 TSPBT02-04 TSEBFL01-01
28 TSEBT04-03 TSPBT02-01 TSEBFL01-01
25 TSEBT04-03 TSPBT02-01 TSEHH03-01
26 TSPBT02-01 TSEBT01-03 TSEHH03-01
27 TSPBT02-01 TSEBT01-03 TSEHR01-04
24 TSPBT07-01 TSEBH01-01 TSEBFL01-01
29 TSPBT02-04 TSEBH01-01 TSEHH03-01
30 TSPBT02-04 TSEBH01-01 TSEHR01-04
31 TSPBT07-01 TSPBT02-04 TSEHH03-01
32 TSPBT07-01 TSPBT02-04 TSEHR01-04
CEPAS
47
Figura 12 Concentración de solubilización de fosfato (PO4 mg/L) en los consorcios conformados.
Figura 13 Concentración de producción ácido indol acético (AIA mg/L) en los consorcios conformados.
48
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