ESTUDIO DE ANTAGONISMO SOBRE PENICILLIUM SP.

Ariadna Caro García1

Mónica Varela Gallego2

RESUMEN

Muchos microrganismo generan toxinas que inhiben o detienen la respuestas biológicas de un receptor, en la práctica de laboratorio se determinó el antagonismo que produce el Bacillus sp hacia el moho Penicillium sp disminuyendo o deteniendo totalmente su crecimiento; esto se realizó sembrando la bacteria y el moho en dos agares diferentes los cuales fuero el Nutritivo y Ogy este último es selectivo para mohos y levaduras, en el primer agar se sembró el bacilo mediante la técnica de rejilla por todo el medio y posterior mente se inocularon en tres partes del medio el Penicillium sp para luego ser incubados a 37° por 24 horas, en el segundo se sembró en el centro por agotamiento el bacilo y en la parte externa de la caja el Penicilum sp este se dejó a temperatura ambiente. En el agar nutritivo se encontró que el moho no creció mientras que en el agar OGY el moho se expandió hasta la mitad sin ocupar totalmente el espacio donde se encontraba el bacilo.

Palabras claves: Antagonismo, Bacillus sp, Penicillium sp.

ABSTRACT

Many microorganism produce toxins that inhibit or stop the biological responses of the recipients of the UN, in the Lab antagonism They produce the Bacillus sp Towards the mold Penicillium sp totally do slowing or stopping growth was determined; This was done planting the bacteria and mold in two different agars which the Nutritive and OGY agar this is selective molds and yeasts in the primer bacillus seeded agar grid technique Through All for the middle and posterior mind is I inoculated in three contradictory environmental Penicillium sp then To be incubated at 37 ° for 24 hours in , the second was planted in the center of exhaustion bacillus and the outside of the box the Penicilum sp esta itself left a room temperature . In the nutrient agar it was found that the mold without grew as the OGY agar mold to spread the sin Half fill the space where the bacillus totally was.

Keywords : Antagonism , Bacillus sp , Penicillium sp.

INTRODUCCIÓN

1 Estudiante Ingeniería ambiental. Núcleo temático biotecnología ambiental. Universidad de Cundinamarca, Extensión Facatativá. Código: 4632121072 Estudiante Ingeniería ambiental. Núcleo temático biotecnología ambiental. Universidad de Cundinamarca, Extensión Facatativá. Código: 463212139

En la actualidad el control de plagas en cultivos ha sido una estrategia para disminuir las pérdidas económicas por cosechas en mal estado; a pesar de la eficacia de las medidas preventivas de limpieza y desinfección de equipos e instalaciones en la reducción de la población patógena, es la propia fruta la que generalmente llega contaminada del campo3, por lo que se hace necesario realizar tratamientos dirigidos a controlar de forma activa las podredumbres mediante productos químicos, los cuales producen efectos secundarios al medio ambiente como perdida de la fertilidad del suelo ente otras4, es por esto se hace necesario encontrar nuevas alternativas biotecnologícas que permitan su control de las plagas de tal manera que el impacto sea mínimo.

Un método para esto es el biológico mediante el uso de organismos antagonistas utilizados para control de enfermedades los cuales son generalmente saprófitos, debido a su facilidad de adaptación al medio y a su alta capacidad de

competencia por nutrientes frente a otros organismos, a su versatilidad y fácil manipulación5.

Uno de los productos más afectados por plagas son la manzana y la naranja por el crecimiento del Penicillium expansum que es capaz de desarrollarse por debajo de 0 °C, produciendo pérdidas de hasta un 80% en poscosecha, por la podredumbre azul que produce debido a la micotoxina Patulina que puede tener una alta toxicidad y crónica que puede producir cáncer o mutaciones6. Una de las alternativas para su control es mediante el uso de Bacillus sp por su producción de antibióticos (iturina, surfactina y fengycin)7.

El objetivo del presente trabajo fue identificar esta acción antagonica entre el Bacillus sp hacia el Penicillium sp (debido a que por falta de recursos no se puedo identificar el género del moho) y así poder determinar diferentes métodos biotecnológicos para el control de plagas, presentes en los cultivos.

3 Escartin E., Castillo Tovar J., Martinez Paniche F., Sanches Ventura S. Antagonism of native yeasts against blue mould (penicillium expansum link) in apple fruits.

4 El sol de Puebla,Impacto Negativo provoca el uso de agroquímicos en el suelo, 30 de julio del 2013.

METODOLOGÍA

Obtención de Penicillium sp.

La cepa del hongo Penicillium sp. se selecciona por su virulencia sobre manzanas y la posibilidad de su obtención.

Se colectan en plazas de mercado manzana sanas, y con síntomas leves de presencia del Penicillium sp. que estén localizadas dentro de los manchones característicos de la enfermedad.

Aislamiento microbiológicoObtención de la cepa de Penicillium sp.

Si se observa crecimiento del Penicillium sp. se toma la muestra de la parte afectada en la fruta.

Se siembra la muestra en cajas de agar OGY.

Se incuba por 7 días a 25ºC. Se realiza una observación

macroscópica y microscópica para la selección del morfotipo.

La cepa se mantiene en agar OGY.

Selección e identificación de antagonistas

Se aíslan las cepas de levaduras de interés antagónico, mediante cultivos sobre PDA para seleccionar los antagonistas con habilidad de inhibir in

vitro el crecimiento micelial de Penicillium sp.

Además de las levaduras presentes en la manzana, se realizan pruebas con Bacillus sp. en medio de cultivo agar nutritivo.

Aislamiento de C. Laurentii (como levadura antagonista presente en la manzana)

5 muestras de manzana.

Procesamiento de las Muestras

Las muestras de manzana se cortan usando instrumentos estériles y colocándolas en placas de Petri igualmente estériles.

Posteriormente sembrar los trozos de manzana en medio de cultivo PDA, que permite la visualización de las colonias de levaduras sospechosas de Cryptococcus Laurentii por el pigmento marrón que ellas toman.

Las placas sembradas se dejan a temperatura ambiente.

Las colonias levaduriformes que tomen el pigmento marrón son repicadas a un nuevo medio PDA.

Se procede a realizar la identificación de las levaduras con pruebas bioquímicas ya que C.

5 Hoyos Carvajal V. Antagonismo in vitro de Trichoderma spp. sobre aislamientos de Sclerotinia spp. y Rhizoctonia spp.

6 Avalos Rivera S., Alvar R., Modos de acción de cuatro cepas de levaduras antagónicas contra Penicillium expansum Link en manzana.

7 Zikovic S., Gavrilovick V., Control of penicillium expansum by combining bacillus subtilis and sodium bicarbonate.

Laurentii no es fermentadora de azucares y es ureasa positivo.

Evaluación de los antagonistas

Se coloca en dos extremos de una caja Petri con PDA al antagonista a evaluar, haciendo un rayado con un asa bacteriológica y  el hongo fitopatógeno Penicillium sp.  con crecimiento activo de micelio, en el centro.

Se incuban los ensayos a temperatura ambiente.

Lectura del crecimiento fúngico al segundo y sexto día.8

Lectura de resultados

La tasa de crecimiento micelial del patógeno se da en cm/día, se determina teniendo en cuenta el radio de crecimiento micelial de la colonia fúngica calculando su magnitud mediante la expresión sugerida por Mead en 1993.

T.C= (Cf - Ci) / (Tf –Ti)

Dónde:

Cf: es el crecimiento final expresado en cm.Ci: es el crecimiento inicial expresado en cm. Tf: es el tiempo final (días). Ti: es el tiempo inicial (días).

El comportamiento de inhibición se puede agrupar de la siguiente manera:

Negativo: ausencia de zona de inhibición o un porcentaje menor de 10% y crecimiento normal de la colonia fúngica, de forma similar al testigo.

Baja: ausencia de zona de inhibición o con un porcentaje entre 10–39% y con disminución en el crecimiento de la colonia fúngica.

Media: ausencia de zona de inhibición o un porcentaje entre de 40–69% y con disminución en el crecimiento de la colonia fúngica

Positivo: presencia de zona de inhibición definida o en un porcentaje entre 70–100% respecto al testigo.9

RESULTADOS

Se esperaba obtener el Penicillium sp. directamente de la manzana, sin embargo se obtuvo una cepa pura en el laboratorio de la universidad, lo que facilitó el estudio.

8 Sánchez S. ANTAGONISM OF NATIVE YEASTS AGAINST BLUE MOULD (Penicillium expansum Link) IN APPLE FRUITS. Revista Fitotecnia Mexicana. 2008.

9 Hernández A. Uso de Microorganismos Antagonistas en el Control de Enfermedades Postcosecha en Frutos. Universidad de la Habana. 2007.

Imagen 1. Frutas para obtener Penicillium sp.

Cepa pura de Penicillium sp. obtenida en el laboratorio. Crecimiento normal 2,5 cm.

Imagen 2. Crecimiento normal de Penicillium sp. (Testigo para el estudio de antagonismo)

En el aislamiento de C. Laurentii de la manzana no se obtuvieron levaduras de ningún tipo, se presentó crecimiento de un moho verde, a este se le realizó tinción con azul de lactofenol y se observó en el microscopio objetivo 40X, donde no mostró ninguna estructura especializada que permitiera asociarlo a un género.

Imagen 3. Resultados del aislamiento de levaduras de la manzana.

Se realizó la siembra de Bacillus sp. y Penicillium sp. de 3 maneras diferentes:

Nº Siembra Observación Imagen

1

Agar nutritivo, Siembra en rejilla del Bacillus sp. en la mitad de la caja de

Petri, siembra de fracciones de

Penicillium sp. en la otra mitad.

Condiciones: Incubación 24 horas a 37ºC,

posteriormente se dejó a temperatura ambiente.

Día 2: Crecimiento de Bacillus sp. Sin

crecimiento de Penicillium sp.

Día 6: Crecimiento de Bacillus sp. Sin

crecimiento de Penicillium sp.

2

Agar OGY, Siembra del Bacillus sp. en una sola línea en el centro de la

caja de Petri, siembra de Penicillium sp. a los

extremos.

Condiciones: Se dejó a temperatura ambiente.

Día 2: Sin crecimiento de Bacillus sp. sin crecimiento de Penicillium sp.

Día 6: Crecimiento de Bacillus sp. con crecimiento normal de Penicillium sp.

3 Agar nutritivo, Siembra en rejilla de Bacillus sp. en toda la caja de Petri, siembra de fracciones

de Penicillium sp. en los extremos de la caja.

Condiciones: Incubación 24 horas a 37ºC,

posteriormente se dejó en la nevera.

Día 2: Crecimiento de Bacillus sp. sin

crecimiento de Penicillium sp.

Día 6: Crecimiento de Bacillus sp. sin

crecimiento de Penicillium sp.

Tabla 1. Resultados obtenidos en el laboratorio.

Medición (cm) Tasa de crecimiento micelial (cm/día)

Comportamiento de inhibición (con

referencia al testigo de antagonismo)Inicial Final

0,2 cm 0,2cm TC= (0,2−0,2)

(6−2)=0 Positivo

0,3 cm 2 cm TC= (2−0,3)(6−2)

=0,425 Negativo

0,3 cm 0,3 cm TC= (0,3−0,3)

(6−2)=0 Positivo

Tabla 2. Resultados de inhibición según T.C.

ANÁLISIS

En las manzanas abundan gérmenes diversos, principalmente hongos unicelulares y bacterias, entre los hongos pueden distinguirse las levaduras y los mohos. El comportamiento de cada

una de ellos es muy variable en función de diferentes circunstancias:

Cantidad de oxígeno disponible.

Temperatura. Presión.

Iluminación.

Las concentraciones entre 0,2 y 1,5% de azúcar son ideales para las bacterias lácticas, sin embargo a las levaduras les resulta indiferente. En concentraciones de 15 y 20% las levaduras presentan tolerancia, siendo letal si se llega a concentraciones del 35%. Las sustancias de deshecho de metabolismo de los microorganismos, es decir, el alcohol, son perjudiciales para los microorganismo, hay levaduras oxidativas y levaduras salvajes como las que están presentes en la piel de la manzana que disminuyen su actividad cuando la concentración alcohólica alcanza el 4%, situación que viene agravada con la insuficiencia de oxígeno.

Sobre las frutas también pueden crecer mohos, levaduras y bacterias. Sin embargo el pH de las frutas es demasiado bajo, en general, para que pueda haber crecimiento bacteriano y elimina estos microorganismos del deterioro incipiente de frutas, que es llevado a cabo por hongos y levaduras10. Debido a que en la práctica de laboratorio no creció ninguna levadura sobre la manzana se piensa que el crecimiento del moho en la superficie de los trozos de la fruta que se pusieron el medio de cultivo (PDA) no permitió el crecimiento de otro tipo de microorganismos debido a que ocuparon toda la superficie de la misma, por lo que el antagonismo solo se pudo evaluar entre el Bacillus sp. y Penicillium sp.

Se han descrito varios mecanismos de acción de los antagonistas para controlar el desarrollo de patógenos. Algunos de estos son antibiosis, competencia por espacio o por nutrientes, interacciones directas con el patógeno (micoparasitismo y lisis enzimática) e inducción de resistencia.

En general, los antagonistas no tienen un único modo de acción y la multiplicidad de éstos es una característica importante para su selección como agentes de control biológico. Si el antagonista posee varios modos de acción reduce los riesgos de desarrollo de resistencia en el patógeno. Este también se reduce mediante el uso de combinaciones de antagonistas con diferente modo de acción. 11

Entre los agentes de control biológico más estudiados se encuentran los microorganismos pertenecientes a los géneros Streptomyces, Pseudomonas, Agrobacterium, Trichoderma y Bacillus. Estos últimos están considerados como excelentes candidatos para el desarrollo de bioproductos aplicables en el campo para el control de enfermedades de origen fúngico. 12

La acción biocontroladora de Bacillus sp. está mediada generalmente por la producción de metabolitos antibióticos capaces de actuar sobre microorganismos de origen diverso. Los péptidos que produce y que tienen esta acción son variados y representan un grupo de metabolitos activos que

10 Garmendia J. Microorganismos de a manzana. 2000.11 Layton C. Bacillus spp.; perspectiva de su efecto biocontrolador mediante antibiosis en cultivos afectados por fitopatógenos. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 2011 12 Rojas M. Aislamiento y caracterización de cepas de Bacillus asociadas al cultivo del arroz (Oryza sativa L.). Universidad de la Habana. 2011

afectan directamente a algunos fitopatógenos. Se ha reportado que Bacillus sp. produce gramicidina.13

Bacillus sp. para las muestras 1 y 3 presentó un desempeño positivo en el antagonismo contra Penicillium sp. probablemente por la capacidad de secretar lipopéptidos antibióticos del grupo Iturin cuyo mecanismo de acción va dirigida sobre la permeabilidad de la membrana y la composición lipídica de la célula fúngica, de tal forma que inhibe el crecimiento micelial y la esporulación del hongo, la producción de los lipopéptidos antibióticos y la actividad de control biológico están directamente relacionados con la capacidad de Bacillus sp. de formar biofilms. Sin embargo, este microorganismo posee otro tipo de características que probablemente determinan su eficacia relacionada con el amplio espectro de acción y la resistencia a la hidrólisis, de igual forma presenta resistencia a altas temperaturas y a una amplia gama de pH. 14

El Penicillium sp. no creció cuando se incubó a 37ºC, al realizar esto las esporas del patógeno con la cepa Bacillus sp., su germinación se detuvo un 100% por lo que se obtuvo un alto comportamiento inhibitorio, a pesar de que pasadas las 24 horas de incubación se dejaran las cajas de Petri a temperatura ambiente o en la nevera, se piensa que esto se pudo dar por la temperatura óptima de crecimiento del Penicillium sp. que

es de 22-30ºC.15 ya que en la muestra número 2 donde se le dieron estas condiciones ambientales y nutricionales (agar OGY) al fitopatógeno el antagonismo resulto ser negativo, con un crecimiento micelial igual al del testigo.En el caso donde estuvieron en contacto célula-célula con el patógeno (muestra número 3), la germinación del Penicillium sp. se inhibió en 100% con relación al testigo, ya que esta muestra fue incubada a 37ºC, también se debe tener en cuenta que se dejó en la nevera y las bajas temperaturas actúan como un agente bacteriostático, y se pudo inhibir el crecimiento inmediato de los dos microorganismos, se puede decir que; el método de acción del Bacillus sp y del Penicillum sp es de competencia por nutrientes, este tipo de competencia es la más común dada por los componentes esenciales para el desarrollo de las funciones microbianas vitales; reproducción, nutrición, respiración y/o metabolismo, de esta manera se delimita la colonización de otras especies.16 De este modo se explica porque al darle primero las condiciones óptimas en agar nutritivo al Bacillus sp. cuya temperatura de crecimiento se ubica entre los 10 - 48ºC, siendo su temperatura óptima entre 28 - 37ºC, se presenta una inhibición total del Penicillium sp. de este modo el antagonista acapara los nutrientes del medio de cultivo y no permite que se presente el crecimiento del moho, además de las sustancias

13 Layton C. Bacillus spp.; perspectiva de su efecto biocontrolador mediante antibiosis en cultivos afectados por fitopatógenos. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 2011.14 Corrales L. Evaluación del efecto biocontrolador de Bacillus spp., frente a Fusarium spp., bajo condiciones de invernadero en Rosmarinus officinalis L. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 2011. 15 Huerta F. Penicillium. Universidad Veracruzana. 2009.16 Layton C. Bacillus spp.; perspectiva de su efecto biocontrolador mediante antibiosis en cultivos afectados por fitopatógenos. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 2011.

antibióticas que produce naturalmente el Bacillus y que terminan de inhibir por completo su crecimiento, del mismo modo al dar las condiciones favorables para el desarrollo de los dos microorganismos (temperatura ambiente) en el agar OGY el Penicillium sp. se hallará en su rango de temperatura óptimacon requerimientos nutricionales específicos para hongos mientras que el Bacillus sp. crecerá pero no en las condiciones óptimas lo que le dará un rendimiento mucho menor.

CONCLUSIONES El conocimiento del modo de

acción de los microorganismos antagonistas sobre los patógenos es fundamental para la optimización de los métodos y el momento de su aplicación.

Es necesario tener en cuenta las condiciones de crecimiento de cada microorganismo al evaluar un caso de antagonismo, ya que según estas se pueden dar

variaciones en los resultados obtenidos.

Bacillus sp. resulta ser un antagonista muy efectivo para el Penicillium sp. con una inhibición del 100% del crecimiento micelial, únicamente cuando se le brindan las condiciones óptimas para su desarrollo, pues acapara los nutrientes y no permite el crecimiento del moho.

Cuando se dan las condiciones óptimas para el crecimiento del Penicillium sp. por encima de las condiciones del Bacillus sp. este crece de igual manera que el testigo puro, por lo que se da un antagonismo negativo.

El uso de Bacillus sp. como antagonista del Penicillium sp. (causante de enfermedades pos-cultivo de frutas) es solamente viable en condiciones in vitro donde se puedan controlar los requerimientos del mismo.

BIBLIOGRAFÌA

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mediante antibiosis en cultivos afectados por fitopatógenos. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 2011

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Huerta F. Penicillium. Universidad Veracruzana. 2009.