“Estudio de modelos animales de artrosis para evaluar la ...

“Estudio de modelos animales de artrosis

para evaluar la progresión de la enfermedad

y nuevas posibles estrategias terapéuticas”

Tesis presentada por:

Aitana Braza Boïls

Valencia, Enero de 2010.

Índice

I

1. INTRODUCCIÓN

1.1 ARTROSIS

1.1.1 Patología humana 1

1.1.2 Anatomía de la articulación 5

1.1.2.1 Articulación sana 6

1.1.2.2 Articulación artrósica 11

1.1.3 El cartílago articular 15

1.1.3.1 Propiedades biomecánicas de la articulación 21

1.1.3.2 Biomarcadores 22

1.1.3.3 Inflamación en la artrosis 26

1.1.4 Tratamientos actuales de la artrosis 28

1.2 MODELOS ANIMALES 32

1.2.1 Modelos animales de artrosis 35

1.2.2 Modelos estudiados 37

1.2.2.1 Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular en ratón

Balb/c 37

1.2.2.2 Modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratón

STR/ort 39

1.2.2.3 Modelo de artrosis provocada por la transección del ligamento

cruzado anterior en rata Wistar 42

1.3 FÁRMACOS ENSAYADOS 43

1.3.1 Estaño protoporfirina IX (SnPP) 43

1.3.2 BIS069 44

2. OBJETIVOS 47

3. MATERIAL Y MÉTODOS 49 3.1. MATERIALES Y REACTIVOS 49

3.1.1 Material y productos para microcirugía 49

3.1.2 Productos para histología e inmunohistoquímica 49

Índice

II

3.1.3 Productos para Western blot 49

3.1.4 Productos para radioinmunoensayo (RIA) 50

3.1.5 ELISA empleados 50

3.1.6 Anticuerpos 50

3.1.7 Tampones empleados 51

3.2 MODELOS ANIMALES DE ARTROSIS EMPLEADOS 52

3.2.1 Modelo de artrosis inducida por la inyección intraarticular de 52

colagenasa en ratón balb/c

3.2.1.1 Diseño experimental 53

3.2.2 Modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratón STR/ort 53


3.2.2.2 Estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX

(SnPP) y BIS069 en el modelo de artrosis espontánea en ratón STR/ort 55

3.2.3 Modelo de artrosis provocada por la transección del ligamento cruzado

anterior en rata Wistar 58


3.2.3.2 Estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX

(SnPP) y BIS069 en el modelo de artrosis provocada por la transección

del ligamento cruzado anterior en rata Wistar 62

3.3 PROCESADO DE MUESTRAS 63

3.3.1 Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular en ratón Balb/c.

Estudio de la progresión de la artrosis. 63

3.3.2 Modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratón STR/ort. 64

3.3.2.1 Estudio de la evolución de la artrosis 64

3.3.2.2 Efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 65

3.3.3 Modelo de artrosis por transección del ligamento cruzado anterior en

rata Wistar 65

3.3.3.1 Estudio de la evolución de la artrosis 65

3.3.3.2 Efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 66

Índice

III

3.4 TÉCNICAS EMPLEADAS 67

3.4.1 Estudio radiológico 67

3.4.2 Estudio histológico 68

3.4.2.1 Inclusión de las articulaciones en parafina 71

3.4.2.2 Tinciones químicas 72

3.4.2.2.1 Eosina/hematoxilina 72

3.4.2.2.2 O-safranina 73

3.4.2.3 Inmunohistoquímica 73

3.4.3 Estudio de mediadores 74

3.4.3.1 Homogenización de rodillas de animales de experimentación 75

3.4.3.1.1 Rodillas de ratones STR/ort y ratones balb/c 75

3.4.3.1.2 Rodillas de rata Wistar 77

3.4.3.2 Obtención de suero 78

3.4.4 Técnicas bioquímicas 78

3.4.4.1 Radioinmunoensayo (RIA) 78

3.4.4.2 Inmunodetección por Western blot 80

3.4.4.3 Enzyme Immuno Sorbent Assay (ELISA) 81

3.4.4.4 Inmunoensayo de biomarcadores por la técnica de Multiplex

de Luminex 82

3.4.4.4.1 Fundamento de la técnica 82

3.4.4.4.2 Protocolo 82

4. RESULTADOS 85

4.1 MODELO DE ARTROSIS INDUCIDA POR COLAGENASA INTRAARTICULAR 86

4.1.1 Degradación articular 86

4.1.1.1 Estudio histológico 86

4.1.1.2 Estudio de biomarcadores 90

Índice

IV

4.2 MODELO DE ARTROSIS ESPONTÁNEA EN RATONES STR/ort 92



4.2.1.1.1 Articulaciones interfalángicas 93

4.2.1.1.2 Articulación del tobillo 96

4.2.1.1.3 Articulación de la rodilla 98

4.2.1.2 Estudio radiológico 105

4.2.2 Estudio de biomarcadores 107

4.2.3 Inflamación 113

4.2.4 Estudio de fármacos. Estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 128

4.2.4.1 Evolución del peso de los animales 128




4.2.4.5 Inflamación 138

4.3 MODELO DE ARTROSIS PROVOCADA POR LA TRANSECCIÓN DEL

LIGAMENTO CRUZADO ANTERIOR (ACLT) 145




4.3.2 Estudio de biomarcadores 155

4.3.3 Inflamación 158

4.3.4 Estudio de fármacos. Estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 171

4.3.4.1 Evolución del peso de los animales 171




4.3.4.5 Inflamación 179

5. DISCUSIÓN 191

Índice

V

6. CONCLUSIONES 203

7. BIBLIOGRAFÍA 205

Índice

VI

Índice de figuras

VII

INTRODUCCIÓN

1: Factores de riesgo implicados en la génesis de la artrosis 2

2: Representación gráfica de la anatomía de la rodilla humana sana 7

3: Esquema de la membrana sinovial de la articulación de una rodilla sana 8

4: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con O-safranina, de la membrana sinovial de

una rodilla de ratón CBA de 11 semanas de edad 8

5: Gráficos de la degradación que sufre el cartílago articular durante la progresión de la artrosis 13

6: Gráfico del cartílago articular presente en la articulación de la rodilla sana 15

7: Agrecano de cartílago bovino fetal 20

8: Localización esquemática de los epítopos del procolágeno tipo II con los aminoácidos que

componen los epítopos de detección para cada biomarcador derivado del colágeno tipo II 24

9: Opciones farmacológicas para el tratamiento de la artrosis 29

10: Opciones terapéuticas no farmacológicas 29

11: Ejemplos de modelos animales de artrosis utilizados en investigación 38

12: Ratones STR/ort 39

13: Estaño-protoporfirina IX (SnPP) 43

MATERIALES Y MÉTODOS

14: Esquema de la distribución de los grupos de ratones Balb/c para el estudio de la progresión

de la artrosis en el modelo de artrosis inducida por colagenasa intra-articular 53

15: Esquema de la distribución de los grupos de ratones CBA y STR/ort para el estudio de la

progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort 54

16: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de la progresión de la artrosis

en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort 54

17: Esquema de la distribución de los grupos de ratones STR/ort para el estudio de los efectos

de los fármacos estaño prototoporfirina IX (SnPP) y BIS069 sobre la progresión de la artrosis

en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort 55

18: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de los efectos de

los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 sobre la progresión de la

Índice de figuras

VIII

artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort 57

19: Aparato de anestesia inhalatoria del Servei Central de Suport a la Investigació (SCIE)

de la Universitat de València, utilizado para realizar la cirugía 58

20: Fotografías de los procedimientos quirúrgicos de la transección del ligamento cruzado

anterior (ACLT) 58

21: Fotografías, tomadas a través de la lupa binocular, que muestran los procedimientos

quirúrgicos de la ACLT 59

22: Fotografía de los procedimientos quirúrgicos de la ACLT 60

23: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar para el estudio de la progresión

de la enfermedad en el modelo de artrosis inducida por ACLT 61

24: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar sometidas a ACLT para el

estudio de los efectos de los fármacos SnPP y BIS069 sobre la progresión de la artrosis

en este modelo 62

25: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de los ratones STR/ort

tras su sacrificio 64

26: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de las ratas Wistar sometidas

a ACLT 67

27: Grados del sistema de evaluación de la histopatología del cartílago artrósico

de la OARSI 69

28: Esquema de los grados de degradación del cartílago según el sistema de

evaluación histopatológica del cartílago artrósico descrito por la OARSI. 70

29: Descripción de los estadios del sistema de evaluación de la histopatología

del cartílago artrósico de la OARSI 71

30: Esquema del proceso seguido para la homogeneización de rodillas de ratones STR/ort

y Balb/c 76

RESULTADOS

Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular

31: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina, de rodillas

de ratones Balb/c 8 días tras la inyección de colagenasa 87

Índice de figuras

IX

32: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina, de rodillas

de ratones Balb/c 8 días y 36 días tras la inyección de colagenasa 88

33: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con O-safranina, de rodillas de

ratones Balb/c 36 días tras la inyección de colagenasa 89

Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort

34: Gráficas de la progresión de los pesos de ratones CBA y STR/ort 92

35: Patas traseras de ratones STR/ort de 11 semanas de edad 94

36: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina y con O-safranina,

de falanges de ratones STR/ort de 15 semanas de edad 95


de tobillos de ratones STR/ort de 15 semanas de edad 97


de rodillas de ratones STR/ort de 15 semanas de edad 98

39: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con O-safranina, de rodillas de ratones

CBA de 11 semanas de edad 100


STR/ort de 7 semanas de edad 101



42: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con O-safranina y eosina/hematoxilina,

de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanas de edad 102



44: Puntuación, según el sistema de evaluación histopatológica de la OARSI, del cartílago

de ratones STR/ort y CBA a lo largo del estudio de la progresión de la artrosis 104

45: Radiografías de rodillas de ratones STR/ort y CBA 106

46: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de

ratones STR/ort y ratones CBA 108

47: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratones STR/ort y ratones

CBA de 11 semanas de edad 109

Índice de figuras

X

48: Niveles de metaloproteinasa 3 (MMP3) en el suero de ratones STR/ort

y ratones CBA 110

49: Niveles de osteocalcina (OC) en el suero de ratones STR/ort y ratones CBA 111

50: Niveles de RANKL en el suero de ratones STR/ort y ratones CBA 112

51: Niveles de interleucina-1ß (IL-1ß) en el suero de ratones STR/ort de

diferentes edades 114

52: Niveles de interleucina-1β (IL-1ß) en el suero de ratones STR/ort y ratones CBA 114

53: Niveles de interleucina 17 (IL-17) en el suero de ratones STR/ort de


54: Niveles de interleucina 17 (IL-17) en el suero de ratones STR/ort y CBA 116

55: Niveles de factor de necrosis tumoral α (TNFα) en el suero de ratones STR/ort de


56: Niveles de factor de necrosis tumoral α (TNFα) en el suero de ratones CBA

y STR/ort de 11 semanas de edad. 118

57: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratones STR/ort de


58: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratones STR/ort y CBA a las

11 semanas de edad 120

59: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal de

homogeneizado de pata de ratones STR/ort y CBA de diferentes edades 122

60: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2)

en cortes histológicos de rodillas de ratones CBA y STR/ort 123

61: Western blot para hemo oxigenasa 1 (HO-1) en fracción microsomal de

homogenado de pata de ratones STR/ort y CBA de diferentes edades 125

61: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a hemo oxigenasa 1 (HO-1)

en cortes histológicos de rodillas de ratones CBA y STR/ort 126

62: Micrografía de la inmunohistoquímica frente a hemo oxigenasa 1 (HO-1) de rodilla

de ratón STR/ort de 11 semanas de edad 127

63: Gráficas de la progresión de los pesos de ratones STR/ort tras cuatro semanas de

tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 129

64: Radiografías de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanas de edad tratados

Índice de figuras

XI

durante cuatro semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 130

65: Estudio histopatológico del cartílago de ratones STR/ort de 11 semanas de edad

tras 4 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 132

66: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en suero

de ratones STR/ort tratados y sin tratar con las moléculas en estudio 133

67: Niveles de metaloproteinasa 3 (MMP3) en el suero de ratones STR/ort tratados

con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 135

68: Niveles de osteocalcina (OC) en el suero de ratones STR/ort tratados con estaño

protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 136

69: Niveles de RANKL en el suero de ratones STR/ort tratados con estaño


70: Niveles de interleucina 1ß (IL 1ß) en el suero de ratones STR/ort tratados con

estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas 138

71: Niveles de interleucina 17 (IL 17) en el suero de ratones STR/ort tratados con


72: Niveles de factor de necrosis tumoral α (TNFα ) en el suero de ratones STR/ort tratados


73: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratones STR/ort tratados con



homogeneizado de pata de ratones STR/ort y CBA de 11 semanas de edad tratados


75: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en

cortes histológicos de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanas tratados con estaño


76: Fotografías de rodillas sanas de rata Wistar realizadas a través de la lupa binocular 146

77: Fotografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado

anterior (ACLT) y la rodilla contralateral intacta, realizadas a través de la lupa binocular,

transcurridas 10 semanas desde la cirugía 147

78: Radiografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento

cruzado anterior (ACLT) a diferentes tiempos de supervivencia 148

Índice de figuras

XII

79: Fotografías de cortes parafinados, teñidos con eosina/hematoxilina y O-safranina,

de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior

(ACLT) y sacrificadas 24 horas tras la cirugía (tiempo 0) 150



(ACLT) y sacrificadas 24 horas tras la cirugía (tiempo 0) 150


de los cóndilos femorales de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección

del ligamento cruzado anterior (ACLT) y sacrificadas 24 horas tras la cirugía (tiempo 0) 151



(ACLT) y sacrificadas 10 semanas tras la cirugía 152

83: Fotografía de corte parafinado, teñido con eosina/hematoxilina, de la membrana

sinovial de una rodilla de rata Wistar sometida a la transección del ligamento

cruzado anterior (ACLT) transcurridas 10 semanas desde la cirugía 153

84: Puntuación del estudio histopatológico según los criterios de la OARSI de las

articulaciones de las ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado

anterior (ACLT) 154

85: Niveles de C-telopéptido terminal del colágeno tipo II (CTX-II) en el suero de ratas

Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 156

86: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de ratas

Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 157

87: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratas Wistar sometidas a la

transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 158

88: Niveles de interleucina 1β (IL-1ß) en homogeneizado de patas de ratas Wistar

sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 160

89: Niveles de factor de necrosis tumoral (TNFα) en suero de ratas Wistar


90: Niveles de factor de necrosis tumoral (TNFα) en homogeneizado de patas

de ratas Wistar transcurridas 10 semanas desde la transección del ligamento

cruzado anterior (ACLT) 162

Índice de figuras

XIII

91: Niveles de interleucina 17(IL 17) en homogeneizado de patas de ratas Wistar


92: Niveles de interleucina 6 (IL-6) en suero de ratas Wistar sometidas a la


93: Niveles de interleucina 6 (IL-6) en homogeneizado de patas de ratas Wistar


94: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratas Wistar sometidas a la


95: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en los homogeneizados de rodillas de ratas

Wistar, transcurridas 10 semanas de la transección del ligamento

cruzado anterior (ACLT) 167


homogeneizado de pata de ratas Wistar, transcurridas 10 semanas desde el

inicio del estudio 169

97: Micrografías de inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en cortes

histológicos de rodillas de ratas Wistar, transcurridas 10 semanas

desde el inicio del estudio 170

98: Gráfica de la progresión de los pesos de ratas Wistar sometidas a la transección del

ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP)

y BIS069 durante 10 semanas 172

99: Radiografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento

cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069

durante 10 semanas 173

100: Evaluación histopatológica del cartílago articular, según los criterios de la OARSI,

de rodillas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT)

y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 174

101: Niveles de C-telopéptido del colágeno tipo II (CTX-II) en el suero de ratas Wistar

sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño

protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 176

102: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero

de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT)

Índice de figuras

XIV

y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 177 103: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratas Wistar sometidas a la

transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tratadas con estaño protoporfirina IX

(SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 178

104: Niveles de interleucina-1β (IL-1β) en homogeneizado de patas de ratas Wistar

sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas

con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 180

105: Niveles de factor de necrosis tumoral α (TNF α) en el suero de ratas Wistar



106: Niveles de factor de necrosis tumoral α (TNF α) en homogeneizado de patas de

ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y

tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 182



con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas 183

108: Niveles de interleucina 6 (IL-6) en sueros de ratas Wistar sometidas a la

transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX





110: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratas Wistar sometidas a la

transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX


111: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el homogeneizado de rodillas de ratas

Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con

estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 187

112: Western blot para ciclooxigenasa-2 (COX-2) en homogeneizado de pata de

ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y

tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas 188

Índice de figuras

XV

113: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2)

en cortes histológicos de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del

ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX


Índice de figuras

XVI

XVII

ABREVIATURAS

ACL: ligamento cruzado anterior

ACLT: transección del ligamento cruzado anterior

AINE: antiinflamatorio no esteroide

ARNm: ácido ribonucleico mensajero

BSA: albúmina de suero bovino

C.A.M. concentración alveolar mínima

COMP: proteína oligomérica de la matriz del cartílago

COX-2: ciclooxigenasa-2

COXIB: inhibidor selectivo de la COX-2

CTX-II: C-telopéptido terminal del colágeno II

D.O.I.: densidad óptica integrada

DMSO: dimetil sulfóxido

DTT: DL-Ditiotreitol

EDTA: ácido etilendiaminotetraacético

EGTA: ácido etilenglicol tetraacético

ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay

FACIT: fibril associated collagens with interrupted triple helices

GAG: glicosaminoglicanos

HA: ácido hialurónico

HELIX-II: colágeno tipo II helicoidal

HEPES: ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperacinil]- etanosulfónico

HO-1: hemo oxigenasa-1

IMC: índice de masa corporal

IGF-1: factor de crecimiento insulínico tipo 1

IL-1β: interleucina 1β

IL-17: interleucina 17



iNOS: óxido nítrico sintasa inducible

KS: keratán sulfato

XVIII

ME: matriz extracelular

MMP: metaloproteinasas de matriz

mPGES: PGE sintasa microsomal

MS: membrana sinovial

NO: óxido nítrico

NOS: óxido nítrico sintasa

NF-κB: factor de transcripción nuclear κB

O: osteofito

OARSI Osteoarthritis Research Society International

OC: osteocalcina

OPG: osteoprotegerina

PBS: tampón fosfato salino

PGE2 : prostaglandina E2

PIICP: propéptido C-terminal del colágeno tipo II

PIINP: propéptido N-terminal del colágeno tipo II

PLA2 : fosfolipasa A2

PMSF: fluoruro de fenil metil sulfonilo

PVDF: difluoruro de polivinilideno

RANK: receptor activador del factor de transcripción nuclear κB

RANKL: ligando del receptor activador del factor de transcripción nuclear κB

RIA: radioinmunoensayo

SDS: dodecilsulfato sódico

SnPP: estaño protoporfirina IX

SYSADOA: fármaco de acción sintomática lenta para el tratamiento de la artrosis

TEMED: N,N,N’,N’-tetrametileno-diamina

TGFβ: factor de crecimiento transformante β

TNFα: factor de necrosis tumoral α

1. INTRODUCCIÓN

Introducción. Artrosis

1

1.1 ARTROSIS

1.1.1 Patología humana

El término artrosis (osteoartritis, en terminología anglosajona) engloba las

artropatías no inflamatorias. La artrosis es tan antigua como la existencia del ser

humano, ya que en el hombre de Neanderthal se han encontrado signos de artrosis

en rodillas y columna vertebral.

La patología que nos ocupa es una de las afecciones de mayor prevalencia

entre la población adulta. A partir de los 60 años, el 80% de la población

occidental presenta signos radiológicos de artrosis en alguna articulación aunque

sólo manifieste la sintomatología dolorosa un 25% de los afectados.

La artrosis se define como una enfermedad lentamente progresiva,

habitualmente monoarticular, que afecta principalmente a pequeñas articulaciones

de las manos y los pies y a las grandes articulaciones de carga como son la cadera

(coxartrosis) o la rodilla (gonartrosis). Se caracteriza clínicamente, como se verá

más adelante, por el dolor, la deformidad de las articulaciones y la consecuente

limitación de la movilidad (Poole et al., 2007; Sharma y Kapoor, 2007).

Los diferentes factores de riesgo a destacar en el desarrollo de la artrosis

se muestran en la figura 1 aunque es la edad el factor de riesgo de mayor

importancia. Aún no están claramente dilucidados los mecanismos por los que el

proceso de envejecimiento es responsable de la aparición de la artrosis (van der

Kraan y van den Berg, 2008). Otro factor de riesgo destacable es la obesidad, ya

que el deterioro de las articulaciones por la acumulación de lesiones mecánicas se

ve agravado al aumentar significativamente las fuerzas de carga sobre el cartílago

articular (Pottie et al., 2006).


2

El envejecimiento articular sano conlleva la fibrilación del cartílago

articular de los cóndilos femorales y la aparición de osteofitos en las regiones

marginales de la articulación. Todos estos procesos de envejecimiento sano se

observan también en la artrosis, pero lo que realmente diferencia un

envejecimiento articular sano de un proceso artrósico es el contenido y

distribución de agua y proteoglicanos en el cartílago.

En la artrosis, los procesos catabólicos y anabólicos se incrementan de

forma importante aunque la calidad de los compuestos sintetizados y la capacidad

de ensamblaje de los componentes de la matriz difieren de la de un cartílago sano

como veremos más adelante (Munuera, 1997; Poole et al., 2007).

En las articulaciones sinoviales la relación entre los factores biológicos y

biomecánicos coexisten estrechamente y, por tanto, la alteración de uno de ellos

induce la alteración del otro provocando, en último término, la artrosis (Sánchez y

Martin, 1987). La biomecánica de la articulación se basa en mecanismos activos y

pasivos que colaboran entre sí con el fin de atenuar las fuerzas de compresión que

se dan sobre la articulación de la rodilla de forma natural. El mecanismo pasivo

que soporta la compresión es, principalmente, el hueso subcondral y los

Figura 1: Factores de riesgo implicados en la génesis de la artrosis.IMC: índice de masa corporal.

· Genética· Sexo· Raza· Edad

· Obesidad (IMC>30)· Traumatismos· Hábitos tóxicos· Aumento de la densidad mineral ósea· Comorbilidad (infecciones, endocrinopatías, metabolopatías)

Factores no modificables Factores modificables

Figura 1: Factores de riesgo implicados en la génesis de la artrosis.IMC: índice de masa corporal.








3

mecanismos activos serían, por un lado, los músculos que absorben la energía del

movimiento y, por otro, el movimiento articular que distribuye las fuerzas de

compresión (Sánchez y Martin, 1987).

En la génesis de la artrosis encontramos una degeneración producto de la

fatiga articular. La fractura es la estrategia de los componentes de la articulación

sinovial para absorber las fuerzas de compresión en una rodilla envejecida o

sometida a un esfuerzo extremo. Las microfracturas ocurren a lo largo de la vida

del individuo de forma subclínica en el hueso trabecular de los cóndilos

femorales. La acumulación de estas microfracturas en el hueso trabecular provoca

una esclerosis o endurecimiento del hueso subcondral, haciendo que éste pierda su

flexibilidad, dejando así de ser el mayor amortiguador pasivo de las cargas sobre

la articulación. La insuficiente amortiguación provoca un incremento de la presión

sobre el cartílago por parte del hueso subcondral forzando a las moléculas de agua

a salir del cartílago hacia el líquido sinovial. La progresiva deshidratación de la

matriz provoca que el cartílago articular pierda las propiedades biomecánicas que

le confería el agua. Junto con las moléculas de agua, la matriz del cartílago

comienza a perder, por el exceso de compresión, los glicosaminoglicanos de las

capas más superficiales. De forma secundaria a la pérdida de agua y componentes

de la matriz extracelular se produce la muerte de los condrocitos superficiales,

iniciándose así toda una cascada de degradación enzimática de la matriz

extracelular del cartílago articular provocada por la dispersión de los componentes

lisosómicos de los condrocitos. Una vez la superficie del cartílago ha quedado

dañada, aumentan rápidamente las fuerzas de fricción entre el cartílago articular

de la tibia y el fémur acelerando la destrucción del cartílago (Kapandj, 2001;

Munuera, 1997; Owen et al., 1984).


4

La liberación al líquido sinovial de los glicopolisacáridos resultantes de la

degradación del cartílago provoca consecuentemente la sinovitis o reacción

inflamatoria del sinovio. La respuesta reparatoria de la articulación es la

formación de acúmulos de matriz extracelular y condrocitos en la periferia de la

articulación, con la finalidad de estabilizar el movimiento de la articulación y

evitar un mayor desgaste por fricción de las superficies de cartílago femoral y

tibial. Estas formaciones son los denominados osteofitos (Menkes y Lane, 2004;

van der Kraan y van den Berg, 2007).

Etiología

Según su etiología se diferencian dos tipos de patología: la artrosis

primaria en la cual no se conoce ninguna alteración articular preexistente que

pueda condicionar la aparición de la enfermedad; y la artrosis secundaria que

aparece como consecuencia de un claro antecedente traumático, como una fractura

o luxación. Aunque la etiología de la artrosis es multifactorial, se apunta al factor

mecánico como causa principal de la artrosis (Hunter y Felson, 2006).

Implicaciones clínicas

La característica principal y más recurrente del cuadro clínico de la artrosis

es el dolor. En la génesis del dolor están implicados por igual la inflamación

sinovial y de las partes blandas de la articulación, los componentes de la cápsula

articular, la afectación de las superficies del cartílago articular que se encuentran

en fricción continua durante el movimiento, y la contractura muscular que suele

acompañar a la degeneración de la articulación sinovial.


5

El dolor artrósico se define por ser más intenso al comenzar la marcha,

disminuye en intensidad con el movimiento y se agrava sustancialmente al

finalizar el movimiento.

Otra característica clínica de la artrosis es la limitación del movimiento que se

debe tanto a las fibrosis y adherencias sinoviales a la cápsula articular, como a los

rozamientos óseos entre los osteofitos marginales. La destrucción ósea, la

aparición de osteofitos y las fibrosis que aparecen en la membrana sinovial y

cápsula articular, originan las características deformidades de las articulaciones

afectadas de artrosis, que, en el caso de las articulaciones interfalángicas se

denominan nódulos de Heberden y de Bouchard (Munuera, 1997).

1.1.2 Anatomía de la articulación

La articulación (del latín articulatio, unión) se define como la estructura

que une dos o más huesos en el sitio en el que coinciden.

Existen diferentes tipos de articulación, las articulaciones inmóviles o

ligeramente móviles se denominan sinartrosis, dentro de esta categoría

encontramos las sincondrosis (donde los huesos están unidos por cartílago hialino

como en el caso de las vértebras), las sindesmosis (los huesos están unidos por

tejido conjuntivo denso, un ejemplo son las suturas craneales) y las sinostosis (los

huesos están en contacto directo permitiendo su crecimiento pero no el

movimiento como la fusión de los huesos mandibulares). Y, por último, las

articulaciones móviles se denominan diartrosis o articulaciones sinoviales (gr.

Syn, juntas, lat. Ovum, huevo) que serán objeto de estudio en la presente tesis.


6

1.1.2.1 Articulación sana

Como ya se ha mencionado, la articulación sinovial es la única que

permite un libre movimiento entre dos huesos, donde los extremos o epífisis de

los huesos implicados están recubiertos de cartílago hialino y lubricados por el

líquido sinovial. Pertenecen a este grupo de articulaciones las interfalángicas, la

de la cadera y la rodilla, entre otras. Este tipo de articulación es la que aparece

más frecuentemente afectada por la artrosis. Como ya se ha mencionado, esta

enfermedad afecta a gran variedad de articulaciones aunque las más afectadas

suelen ser la articulación de la cadera y la de la rodilla. Dado que en los modelos

animales que se han estudiado en la presente tesis se ha evaluado la progresión de

la enfermedad en la articulación de la rodilla, procederemos a describir más

detalladamente la articulación de rodilla sana.

En la figura 2 observamos las estructuras que componen la articulación de

la rodilla en diferentes orientaciones para poder identificar las estructuras

anatómicas de las que hablaremos más adelante. Al cartílago hialino que recubre

las epífisis de los huesos largos implicados en la articulación y está implicado en

el desplazamiento de los huesos en la articulación se le denomina cartílago

articular, que será descrito detalladamente en posteriores apartados. La

articulación sinovial está protegida por la cápsula articular que se fusiona con él

periostio de los huesos que componen la unión a suficiente distancia de ésta para

no limitar el movimiento. La cápsula se compone externamente por una capa

fibrosa de tejido conectivo continuación de los periostios y su interior está

recubierto de forma intermitente por la membrana sinovial. En la figura 3

podemos apreciar la disposición de la membrana sinovial en una rodilla sana que

recubre completamente las superficies de cartílago en contacto, protegiéndolas y


7

lubricándolas para amortiguar las fuerzas de fricción que afectan a la articulación

(Kapandj, 2001).

La membrana sinovial

La membrana sinovial mide unos 35 µm de grosor y forma pliegues que se

proyectan hacia el interior de la articulación, también llamados vellosidades

sinoviales (fig 4). Estas vellosidades aumentan en número y tamaño con la edad

llegando a presentar zonas cartilaginosas en su interior durante el envejecimiento

(Kapandj, 2001).

En la figura 4 podemos observar la membrana sinovial de la rodilla de un

ratón CBA de 11 semanas de edad, que no padece artrosis, donde se pueden

distinguir algunas vellosidades sinoviales, así como los diferentes tipos celulares

Fémur Fémur

Tibia Tibia

TibiaPeroné

Peroné

Cartílagoarticular

Cartílagoarticular

RótulaCóndilos femorales

ANATOMÍA DE LA RODILLA

Fémur

Figura 2: Representación gráfica de la anatomía de la rodilla humana sana.En el gráfico se distinguen las principales estructuras anatómicas que componen la articulación sinovial en diferentes orientaciones. (imagen modificada de www.eorthopod.com)

Fémur Fémur

Tibia Tibia

TibiaPeroné

Peroné

Cartílagoarticular

Cartílagoarticular

RótulaCóndilos femorales

ANATOMÍA DE LA RODILLA

FémurFémurFémur FémurFémur

TibiaTibia TibiaTibia

TibiaTibiaPeronéPeroné

PeronéPeroné

CartílagoarticularCartílagoarticular

CartílagoarticularCartílagoarticular

RótulaRótulaCóndilos femoralesCóndilos femorales

ANATOMÍA DE LA RODILLAANATOMÍA DE LA RODILLA

FémurFémur

Figura 2: Representación gráfica de la anatomía de la rodilla humana sana.En el gráfico se distinguen las principales estructuras anatómicas que componen la articulación sinovial en diferentes orientaciones. (imagen modificada de www.eorthopod.com)


8

que confieren a la membrana sinovial sus principales características. Las células

que componen la membrana sinovial son células de tipo fibroblástico, que se

encuentran en la superficie, llamadas sinoviocitos y poseen un abundante retículo

endoplásmico como corresponde a su función primordial, la síntesis y secreción

del colágeno, proteoglicanos y del resto de componentes del líquido sinovial.

Membrana sinovial

Figura 3: Esquema de la membrana sinovial de la articulación de una rodilla sana. En el gráfico podemos observar la disposición de la membrana sinovial que recubre y lubrifica la articulación sinovial de la rodilla humana.(imagen modificada de www.eorthopod.com)

Membrana sinovialMembrana sinovialMembrana sinovial

Figura 3: Esquema de la membrana sinovial de la articulación de una rodilla sana. En el gráfico podemos observar la disposición de la membrana sinovial que recubre y lubrifica la articulación sinovial de la rodilla humana.(imagen modificada de www.eorthopod.com)

Figura 4: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina (20X) de la membrana sinovial de una rodilla de ratón CBA de 11 semanas de edad. En las micrografías se observan las microvellosidades sinoviales (*) así como las diferentes disposiciones celulares que conforman la membrana sinovial sana.

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*

*

* Figura 4: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina (20X) de la membrana sinovial de una rodilla de ratón CBA de 11 semanas de edad. En las micrografías se observan las microvellosidades sinoviales (*) así como las diferentes disposiciones celulares que conforman la membrana sinovial sana.

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9

También se encuentran formando parte de la membrana macrófagos, que

presentan un voluminoso aparato de Golgi y son responsables de la eliminación de

los restos del desgaste en el interior de la articulación. Todos estos tipos celulares

son nutridos por una vasta red de capilares (Gerwin et al., 2006).

El líquido sinovial

La función primordial de la membrana sinovial es la síntesis y reabsorción

del líquido sinovial. Este fluido viscoso aporta lubricación a las superficies

articulares, previene el contacto entre las superficies, aporta nutrientes a las

células del cartílago articular y elimina productos de desecho. La membrana

sinovial, como ya se ha mencionado, posee una rica vascularización y,

aproximadamente, la mitad de los capilares presentan aberturas hacia el interior de

la cavidad articular. El líquido sinovial es un ultrafiltrado de plasma a través de la

matriz molecular de ácido hialurónico. El exudado lubricante que baña las

superficies articulares está compuesto por agua, solutos de la sangre, ácido

hialurónico y lubricina que le proporcionan las propiedades lubricantes, y las

glicoproteínas que se encuentran normalmente en el cartílago. En el fluido

sinovial sano también se pueden observar eventualmente pequeñas cantidades de

linfocitos y monocitos (Altman, 2007). Los desechos del metabolismo articular se

eliminan por los capilares linfáticos una vez el transudado de los capilares

sanguíneos se ha vertido hacia la cavidad articular y ha cumplido su función. Esta

circulación ocurre gracias a los cambios de presión provocados por la flexión de la

articulación (Owen et al., 1984; Gerwin et al., 2006; Sandell et al., 2007).


10

El cartílago

Como ya se ha mencionado anteriormente, las epífisis de los huesos

implicados en la articulación se encuentran recubiertas de cartílago de tipo hialino

llamado cartílago articular.

El cartílago es una forma especializada de tejido conjuntivo compuesto por

los condrocitos distribuidos de forma dispersa y la matriz extracelular que los

contiene. Este tejido no posee vascularización ni inervación nerviosa y sus

células, los condrocitos, se sitúan en cavidades o lagunas y se nutren por difusión

a través de la matriz extracelular.

Tipos de cartílago

Se distinguen tres tipos de cartílago según la proporción de fibras de

colágeno y elastina que poseen en su matriz extracelular: elástico, fibrocartílago

e hialino.

El cartílago elástico es el tipo menos común y se encuentra únicamente

en el oído externo, las paredes del conducto auditivo externo y la trompa de

Eustaquio, la epiglotis y en pequeños fragmentos del cartílago de la laringe. Los

condrocitos están alojados en lagunas agrupados por grupos isogénicos de dos a

cuatro células y la matriz extracelular se compone de fibras de elastina muy

ramificadas que le confieren gran flexibilidad.

El fibrocartílago es una forma transicional entre el hueso y el tejido

conectivo fibroso denso de los tendones y ligamentos. Los condrocitos se

encuentran rodeados de poca matriz extracelular y se encuentran dispuestos en

filas entre fibras de colágeno I. La matriz extracelular es rica en

glicosaminoglicanos como el condroitín sulfato y el dermatán sulfato.


11

El cartílago hialino es la variedad principal y está presente en los anillos

traqueales, la nariz, la laringe, en la unión de las costillas al esternón y constituye

la matriz extracelular del cartílago articular. Es un tejido de apariencia blanca

azulosa traslúcida. El colágeno secretado por los condrocitos constituye el 40%

del peso seco de la matriz cartilaginosa. El colágeno tipo II es el predominante y

se organiza como una red laxa por toda la matriz del cartílago hialino. Los

condrocitos se encuentran en lagunas recubiertas por la cápsula pericelular de un

grosor de 1 a 3 µm y formadas por una malla de fibras similar a la lámina basal.

En esta capa pericelular están localizados los colágenos minoritarios y se

cree que posee una función protectora en los cartílagos sometidos a compresión o

tensión mecánica. Una especialización del cartílago hialino es el cartílago

articular, que será descrito detalladamente en otro apartado dado que es el tejido

más gravemente afectado en el proceso artrósico (Kapandj, 2001).

1.1.2.2. Articulación artrósica

Como ya se ha descrito anteriormente, el principal factor implicado en el

proceso artrósico es la sobrecarga mecánica durante largos periodos de tiempo. La

artrosis de rodilla, gonartrosis, tiene un peor pronóstico que la artrosis de cadera,

coxartrosis, por la presión a la que está sometida de forma continua. La

biomecánica de la rodilla demuestra que la mayor parte de las presiones se

transmiten en la articulación a través del cóndilo femoral al platillo tibial medial,

de forma que el compartimiento que más desgaste presenta es la parte medial del

platillo tibial de la articulación. Por tanto, el desgaste del cóndilo medial junto con

el platillo medial tibial provoca una alteración del eje biomecánico del miembro,

desplazándose las presiones medialmente y agravando la destrucción ósea. Así se

cierra el círculo presión-erosión-presión (Munuera, 1997; Kapandj, 2001).


12

En la figura 5 se muestra un esquema de la progresión que sigue el

cartílago articular en el desarrollo de la artrosis, siendo el desencadenante, como

veremos más adelante, una acumulación de lesiones mecánicas del cartílago

articular que conllevan un debilitamiento del cartílago, patente en la pérdida de

proteoglicanos y condrocitos de la matriz que acaban por deteriorar la superficie

articular, pudiendo llegar a aparecer regiones donde el cartílago ha desaparecido

por completo y queda al descubierto el hueso subcondral. La erosión entre las

superficies en contacto entra entonces en una dinámica destructiva y dolorosa.

La anatomía patológica de la rodilla artrósica indica que, a escala

macroscópica, el cartílago articular se presenta amarillento, opaco, rugoso y

menos elástico que el cartílago sano. Aparecen frecuentemente fisuras en la

superficie, provocando en los casos más avanzados de la enfermedad el

desprendimiento y la pérdida de fragmentos completos de cartílago, dejando como

cicatriz ulceraciones que pueden llegar al hueso subcondral en estadios más

avanzados de la enfermedad (Stevens y Lowe, 2001; Owen et al., 1984).

A nivel microscópico, se aprecia la erosión de la matriz extracelular en la

superficie del cartílago y la pérdida de condrocitos, observándose al microscopio

lagunas condrocitarias vacías en la capa más superficial. En las capas más

profundas se observan, por contra, lagunas de mayor tamaño que pueden contener

diez o más condrocitos, lo que demuestra la división de los condrocitos con una

finalidad reparadora (Stevens y Lowe, 2001).

Por lo que respecta a las lesiones óseas, se observan osteofitos en

posiciones marginales de la articulación con la posible función de estabilizar la


13

Lesión mecánica del cartílago del cóndilo femoral

Erosión de la superficiedel cartílago articular con pérdida de proteoglucanosy condrocitos

Pérdida de fragmentosde cartílago

Desaparición del cartílago

A B

C D

El hueso subcondral queda al descubiertoE

Figura 5: Gráficos de la degradación que sufre el cartílago articular durante la progresión de la artrosis. (A) Una acumulación de lesiones mecánicas sobre el cartílago articular de los cóndilos femorales provoca (B) una erosión progresiva del cartílago que conlleva una pérdida de componentes de la matriz extracelular y de condrocitos superficiales. (C) El debilitamiento de la matriz del cartílago provoca una ruptura de la superficie del cartílago articular que puede llegar en estadios más avanzados de la enfermedad (D) a la desaparición de regiones del cartílago dejando el hueso subcondral al descubierto (E). (F) Rodilla artrósica. (imagen modificada de www.eorthopod.com)

F

Lesión mecánica del cartílago del cóndilo femoral

Erosión de la superficiedel cartílago articular con pérdida de proteoglucanosy condrocitos

Pérdida de fragmentosde cartílago

Desaparición del cartílago

A B

C D

El hueso subcondral queda al descubiertoE

Figura 5: Gráficos de la degradación que sufre el cartílago articular durante la progresión de la artrosis. (A) Una acumulación de lesiones mecánicas sobre el cartílago articular de los cóndilos femorales provoca (B) una erosión progresiva del cartílago que conlleva una pérdida de componentes de la matriz extracelular y de condrocitos superficiales. (C) El debilitamiento de la matriz del cartílago provoca una ruptura de la superficie del cartílago articular que puede llegar en estadios más avanzados de la enfermedad (D) a la desaparición de regiones del cartílago dejando el hueso subcondral al descubierto (E). (F) Rodilla artrósica. (imagen modificada de www.eorthopod.com)

F


14

articulación dañada y retrasar así la degradación del cartílago (van der Kraan y

van den Berg, 2007; Menkes y Lane, 2004). La esclerosis subcondral es visible al

microscopio, donde se observan laminillas de tejido óseo superpuestas bajo la

placa ósea subcondral.

El estudio anatomopatológico del sinovio revela una fibrosis en estadios

avanzados de la artrosis que, junto con la fibrosis de la cápsula articular, limitan

los movimientos articulares minimizando los daños por fricción. La sinovitis es

común en fases muy avanzadas de la patología donde existe afectación de la zona

subcondral y se basa en una inflamación del sinovio con infiltrados de células

mononucleares (Kapandj, 2001; Stevens y Lowe, 2001). La sinovitis en la artrosis

es una inflamación crónica producida por la concentración excesiva en el líquido

sinovial de restos de polisacáridos productos de la degradación del cartílago

articular en la progresión de la artrosis (Sánchez y Martin, 1987).

Además, se ha observado que los sinoviocitos presentan alteraciones

ultraestructurales, como un retículo endoplásmico rugoso aumentado con un

aparato de Golgi disminuido, así como un aumento en el número de lisosomas

como adaptación al aumento de actividad secretora de dichas células (Lorenz y

Richter, 2006). El líquido sinovial cambia de color pasando de transparente a

amarillento y la densidad de células asciende de 20-200 a valores de 200-2000

células/mm3 apareciendo células inflamatorias (Sánchez y Martin, 1987). Los

niveles de colesterol y fosfolípidos en el líquido sinovial sano son similares a los

encontrados en el suero, mientras que en articulaciones afectadas de artrosis

aparecen elevados los niveles de colesterol, fosfolípidos y triglicéridos (Lorenz y

Richter, 2006; Gerwin et al., 2006)


15

1.1.3 El cartílago articular

El cartílago articular (fig. 6)

se encuentra recubriendo todas las

superficies de los huesos que

componen la articulación donde

pueda existir algún tipo de contacto

durante el movimiento completo de

ésta y, por tanto, debe generar el

mínimo rozamiento y ser muy

resistente a la carga, ya que debe

soportar fuerzas de compresión,

tensión y cizalla. Más del 70% del

cartílago articular es agua que se encuentra unida reversiblemente a los elementos

de la matriz extracelular del cartílago. Gracias a esta característica, el cartílago

articular actúa como una esponja dejando escapar el agua cuando se le comprime

y la reabsorbe cuando cesa la presión, lo que le confiere un papel amortiguador y

protector de los componentes de la articulación (Munuera, 1997; Sánchez y

Martin, 1987). Se trata de un tejido hipocelular, ya que los condrocitos

representan únicamente el 1-2% del volumen total. El 50% del peso en seco

corresponde al colágeno tipo II, el 40% a un proteoglicano llamado agrecano y el

10% restante del peso del cartílago en seco corresponde a pequeños

proteoglicanos de gran importancia implicados también en la estructura de la

matriz y otros colágenos minoritarios tipo VI, IX, X y XI (Sandell et al., 2007;

Ham y Cormack, 1984).

Cartílago articular

Figura 6: Gráfico del cartílago articular presente en la articulación de la rodilla sana.El gráfico muestra todas las superficies de la articulación que se encuentran recubiertas por cartílago articular. (imagen modificada de www.eorthopod.com)

Cartílago articularCartílago articularCartílago articular

Figura 6: Gráfico del cartílago articular presente en la articulación de la rodilla sana.El gráfico muestra todas las superficies de la articulación que se encuentran recubiertas por cartílago articular. (imagen modificada de www.eorthopod.com)


16

Estructura del cartílago articular

Pese al escaso grosor del cartílago articular (unos 7 mm en articulaciones

humanas) y a su aparente homogeneidad, se pueden diferenciar cuatro regiones

según la composición celular y la disposición de las fibras de colágeno.

En la capa superficial los condrocitos están aplanados y dispuestos de

forma paralela a la superficie del cartílago junto con las fibrillas de colágeno. En

esta capa existe una elevada concentración de decorina, un proteoglicano de bajo

peso molecular, pero en cambio la concentración de agrecano es muy baja.

La capa media posee los condrocitos en su forma redondeada envueltos

en haces radiales de gruesas fibrillas de colágeno. La cantidad de condrocitos

disminuye con la profundidad en el cartílago articular. Disminuye la

concentración de colágeno tipo II respecto de la capa superficial.

En la capa profunda, la densidad de células disminuye aún más y se

encuentran agrupadas en columnas o racimos y presentan una morfología

hipertrófica llegando a doblar el volumen celular de los condrocitos de la capa

superficial. La concentración de agrecano es máxima, mientras que la cantidad de

colágeno disminuye. Los haces de colágeno II aumentan de grosor y están

dispuestos de forma radial.

La zona más profunda está ocupada por la capa calcificada donde se

encuentra principalmente colágeno tipo X y los condrocitos se muestran

hipertróficos. La zona calcificada actúa como amortiguador mecánico entre el

cartílago articular no calcificado y el hueso subcondral. Esta capa persiste

mientras existe el fenómeno de osificación endocondral a medida que se reabsorbe

la placa de crecimiento.


17

De forma paralela a como ocurre con la densidad celular, la concentración

de agua disminuye con la profundidad representando en la capa superficial un 70-

80% del peso total y únicamente un 65-70% en la zona profunda.

Las propiedades biomecánicas características del cartílago articular se las

confiere la red de colágeno fibrilar que proporciona la fuerza tensil. Los

proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados a grandes cantidades de agua le

confieren gran resistencia a la deformación por compresión, cualidades todas

importantes para el funcionamiento normal de la articulación sinovial (Kapandj,

2001; Owen et al., 1984; Windle, 1997).

Composición del cartílago articular

Colágeno

Representa el 25% del total de las proteínas del organismo. Existen 18

tipos diferentes de moléculas de colágeno y todos se caracterizan por poseer una

estructura de triple hélice y formar parte integral de la matriz extracelular.

Los tipos I, II y III constituyen el 80-89% del colágeno total del animal. Se

sintetizan como un procolágeno de triple hélice continua. Extracelularmente, las

peptidasas del procolágeno convierten éste en monómeros de colágeno de triple

hélice flanqueadas por dos regiones cortas no helicoidales. Los monómeros se

ensamblan de forma espontánea en fibrillas tras haber sido eliminados los

propéptidos. Otros colágenos conocidos como FACIT (Fibril Associated

Collagens with Interrupted Triple helices) como los tipos IX, XII y XIV se

asocian a las fibrillas modificando sus posibilidades de interacción con la matriz

(Alberts et al., 2002; Sandell et al., 2007).


18

Glicosaminoglicanos (GAG)

Los GAG están formados por largas cadenas no ramificadas de

polisacáridos, compuestas a su vez por unidades repetidas de disacáridos. Estas

cadenas son altamente hidrofílicas y pueden, por tanto, unir gran cantidad de

moléculas de agua y adoptar conformaciones muy extendidas, ocupando un

enorme volumen con relación a su masa. En el cartílago articular, los GAG no

representan más del 10% del peso total pero, debido a su capacidad de retener

moléculas de agua, ocupan prácticamente la totalidad de la matriz extracelular.

Las características que confieren los GAG a la matriz del cartílago

articular permiten, no sólo la difusión de moléculas solubles importantes para la

nutrición de los condrocitos sino que constituyen un soporte mecánico esencial

para el desarrollo de las funciones de la articulación.

Los glicosaminoglicanos se distinguen por el tipo de azúcares que poseen,

el tipo de unión entre estos restos y la presencia de los grupos sulfato. El tipo de

GAG de mayor importancia estructural en el cartílago articular es el ácido

hialurónico y se trata de un disacárido de glucuronato y N-acetilglucosamina sin

sulfatar. El condroitín sulfato es un disacárido de glucuronato de N-

acetilgalactosamina. Por epimerización del glucuronato del condroitín sulfato en

iduronato se obtiene el dermatán sulfato. Y, por último, el keratán sulfato se

caracteriza por ser un disacárido de galactosa y N-acetilglucosamina, mientras que

el heparán sulfato contiene iduronato y N-acetilglucosamina.

Aunque todos los tipos de GAG están presentes en la matriz del cartílago

articular, el glicosaminoglicano más abundante es el ácido hialurónico. Se trata

del GAG de estructura más sencilla aunque difiere en algunas características

importantes con la mayoría de los GAG como, por ejemplo, en el hecho que el

ácido hialurónico es el único que no forma proteoglicanos y es el único que no


19

está sulfatado. Mientras el resto de glicosaminoglicanos son sintetizados

intracelularmente y liberados por exocitosis, el ácido hialurónico es sintetizado

por un complejo enzimático integrado en la membrana celular del condrocito

(Alberts et al., 2002; Sandell et al., 2007).

Proteoglicanos

Están constituidos por un GAG que representa un 95% de la molécula,

unido covalentemente a una proteína central (5%). Los proteoglicanos y los

glicosaminoglicanos también se asocian a proteínas fibrosas como el colágeno

formando redes proteicas extremadamente complejas características del cartílago

articular. El principal proteoglicano del cartílago es el agrecano, que se une al

ácido hialurónico en la matriz extracelular para formar grandes complejos visibles

al microscopio electrónico (fig 7). El agrecano es una molécula de 225-250 kDa y

está compuesto por una proteína central con más de 100 cadenas de GAG unidas.

La mayoría de GAG unidos al agrecano son condroitín sulfato y, en menor

proporción, el keratán sulfato. El agrecano se encuentra normalmente en la matriz

del cartílago articular como un gran agregado de más de 200 moléculas unidas a

una molécula simple de ácido hialurónico mediante una pequeña glicoproteína

visible al microscopio electrónico (Alberts et al., 2002; Sandell et al., 2007).

El conocimiento exhaustivo de la composición de la matriz del cartílago ha

permitido la identificación de marcadores moleculares en suero que pueden

utilizarse para diagnosticar alteraciones en el metabolismo del cartílago y

procesos degenerativos como la artrosis, enfermedad objeto del presente estudio.


20

Figura 7: Agrecano de cartílago bovino fetal. A: micrografía electrónica del complejo del agrecano. B: esquema del complejo del agrecano. Imagen modificada de Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 2002.

Figura 7: Agrecano de cartílago bovino fetal. A: micrografía electrónica del complejo del agrecano. B: esquema del complejo del agrecano. Imagen modificada de Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 2002.

Condrocitos

Los condrocitos provienen de la familia de células del tejido conjuntivo,

junto con los fibroblastos y los osteocitos. Todas estas formas celulares son

interconvertibles entre sí con un medio extracelular adecuado. La formación y

proliferación del cartílago articular se produce gracias a la acción de los

condrocitos, que regulan el crecimiento y remodelación de la matriz extracelular

que los contiene. Se trata de células especializadas en la síntesis y excreción de

colágeno tipo II principalmente. Se encuentran ocupando al completo lagunas del

cartílago. Su núcleo es irregular, con la cromatina condensada y en el citoplasma

se observa un gran retículo endoplásmico característico de células secretoras. El

número de mitocondrias en el citoplasma es relativamente bajo, lo que demuestra


21

que el condrocito obtiene la energía principalmente de la glucólisis de las

partículas de glucógeno que se observan también en el citoplasma (Sandell et al.,

2007; Windle, 1997).

Por tanto, la matriz extracelular se construye de la siguiente forma, los

proteoglicanos son secretados por los condrocitos en su forma monomérica, se

unen al ácido hialurónico en el medio extracelular formando agregados, que a su

vez forman enlaces con fibras de colágeno, formando así una gran red

tridimensional de características inigualables por otros tejidos del organismo.

Además de estos componentes, los condrocitos sintetizan e incorporan a

su superficie celular condronectina, que se une específicamente al colágeno tipo II

y a los glicosaminoglicanos y cuya función parece ser la de facilitar la unión del

resto de componentes a la membrana de la célula (Sandell et al., 2007).

1.1.3.1 Propiedades biomecánicas de la articulación

Las dos funciones principales del cartílago articular son: transmitir y

amortiguar las cargas ejercidas sobre la articulación, donde se encuentran

implicados también el hueso subcondral y el trabecular subyacente, y minimizar el

rozamiento en el contacto entre superficies articulares opuestas.

El mecanismo pasivo que atenúa las fuerzas de compresión es

principalmente el hueso subcondral y los mecanismos activos serían, por un lado

los músculos que absorben la energía del movimiento y por otro el movimiento

articular que distribuye las fuerzas de compresión (Sánchez y Martin, 1987; Owen

et al., 1984).

El cartílago articular posee propiedades viscoelásticas, lo que le permite,

en presencia de una carga constante, sufrir una deformación en dos fases, una

rápida inicial y otra lenta y progresiva hasta alcanzar un equilibrio. Este


22

mecanismo de viscoelasticidad está basado fundamentalmente en el flujo de

líquido intersticial de la matriz del cartílago y en el movimiento de las

macromoléculas que conforman la matriz del cartílago articular.

Las fuerzas ejercidas durante el reposo, la marcha o el salto oscilan entre

cero y n veces el peso del cuerpo. Al aumentar la fuerza, aumenta el área de

contacto entre las superficies cartilaginosas hasta que se llega a deformar e incluso

fracturar el hueso subcondral. Los tejidos que componen la articulación son más

resistentes cuanto más alejados se encuentran de la superficie articular; así, desde

la zona superficial va aumentando en la capa subcondral y alcanzando su máxima

resistencia en el hueso compacto. Esta graduación de resistencias asegura una

amortiguación eficaz del impacto.

1.1.3.2 Biomarcadores

Dado que el cartílago es capaz, en las primeras fases de la enfermedad, de

repararse aportando nuevas células y nuevos componentes a la matriz extracelular

se debería desarrollar una metodología de diagnóstico precoz que se sirva de la

capacidad reparadora del cartílago articular para enlentecer o atenuar los estragos

de la degradación de la articulación. Por ello, actualmente, gran parte de los

esfuerzos en la investigación para el tratamiento de la artrosis se centra en la

caracterización de biomarcadores que sirvan de pronóstico del desarrollo de la

patología.

Un biomarcador se define como una molécula, cuyas concentraciones en

los fluidos del organismo (líquido sinovial, sangre u orina) permita prever el

estado metabólico de la articulación (Kong et al., 2006). Los biomarcadores que

se encuentran actualmente en estudio se pueden clasificar como los implicados en

el anabolismo y los resultantes del catabolismo articular. Algunos de los


23

marcadores del anabolismo son la fosfatasa alcalina ósea producida por los

osteoblastos y requerida para la mineralización del cartílago articular, la

osteocalcina (OC), o aquellos biomarcadores derivados de la síntesis del colágeno

tipo II, como los propéptidos N- y C- terminales (PIICP, PIIANP y PIIBNP)

(Charni-Ben Tabassi et al., 2008; Bay-Jensen et al., 2008), productos liberados

tras la acción de las peptidasas sobre el procolágeno. El equilibrio entre los

biomarcadores del anabolismo óseo y los resultantes del catabolismo articular

permite conocer el ritmo de degradación-reparación de nueva matriz extracelular

(Goldring y Goldring, 2007). Los marcadores relacionados con el catabolismo

articular los podemos dividir entre aquellos relacionados con la afectación de los

glicosaminoglicanos que conforman el cartílago articular y aquellos derivados de

la degradación del colágeno tipo II. Entre los componentes de la matriz

extracelular del cartílago que se han estudiado figuran el ácido hialurónico (HA)

(Elliott et al., 2005; Criscione et al., 2005), la proteína oligomérica de la matriz

del cartílago (COMP) (Dickinson et al., 2003; Hedbom et al., 1992), el keratán

sulfato (KS), el neoepítopo del agrecano CS846 y la osteocalcina (OC). De todos

estos biomarcadores se ha observado no sólo que presentan variabilidad

circadiana en sus niveles y su excreción es dependiente del ejercicio físico (Kong,

et al., 2006), sino que muchos de ellos aparecen elevados en personas con

evidencias radiológicas de una próxima artrosis como son COMP, KS, HA y OC

(Glasson et al., 2007; Wakitani et al., 2007; DeLaurier et al., 2002).

Por último, aquellos biomarcadores basados en la destrucción del colágeno

tipo II (fig. 8) serían los neoepítopos del segmento helicoidal del colágeno tipo II

(Helix-II) (Charni et al., 2005), el C-telopéptido terminal del colágeno II (CTX-II)

(Charni et al., 2005; Meulenbelt et al., 2006) y el extremo C-terminal del


24

propéptido resultante de la digestión del colágeno tipo II por colagenasas (C1,C2)

(Garnero, 2007).

Todos ellos se encontrarían elevados en procesos artrósicos avanzados

como respuesta a la destrucción del colágeno tipo II del cartílago articular

(DeLaurier et al., 2002; Bay-Jensen et al., 2008; Kong et al., 2006; Meulenbelt et

al., 2006; Fernandes et al., 2007). La desventaja que presentan los biomarcadores

séricos relacionados con el colágeno es que muestran el estado de todo el

N-propéptido N-telopéptido Triple hélice C-telopéptido C-propéptido

PIINP PIICP

Sitio de unión de la colagenasa

fragmento 3/4 fragmento 1/4

Figura 8: Localización esquemática de los epítopos del procolágeno tipo II con los aminoácidos que componen los epítopos de detección para cada biomarcador derivado del colágeno tipo II. La colagenasa genera dos fragmentos que son ¾ y ¼ de la molécula de procolágeno. El neoepítopo del fragmento ¾ es reconocido por el anticuerpo C1,C2 y C2C y el correspondiente al fragmento ¼ es detectado por la secuencia del telopéptido C-terminal del colágeno tipo II (CTX-II). El epítopo HELIX-II (colágeno tipo II helicoidal) reconoce el colágeno tipo II fibrilar. Los propéptidos resultantes de la acción de las proteasas sobre el procolágeno descubren los neoepítopos PIINP (propéptido N-terminal del colágeno tipo II) y PIICP (propéptido C-terminal del colágeno tipo II).(imagen modificada de Rousseau et al., 2007)


PIINP PIICP




PIINP PIICP



Figura 8: Localización esquemática de los epítopos del procolágeno tipo II con los aminoácidos que componen los epítopos de detección para cada biomarcador derivado del colágeno tipo II. La colagenasa genera dos fragmentos que son ¾ y ¼ de la molécula de procolágeno. El neoepítopo del fragmento ¾ es reconocido por el anticuerpo C1,C2 y C2C y el correspondiente al fragmento ¼ es detectado por la secuencia del telopéptido C-terminal del colágeno tipo II (CTX-II). El epítopo HELIX-II (colágeno tipo II helicoidal) reconoce el colágeno tipo II fibrilar. Los propéptidos resultantes de la acción de las proteasas sobre el procolágeno descubren los neoepítopos PIINP (propéptido N-terminal del colágeno tipo II) y PIICP (propéptido C-terminal del colágeno tipo II).(imagen modificada de Rousseau et al., 2007)


25

colágeno tipo II del organismo y por tanto puede ser difícil adjudicar una

alteración de los valores a un proceso artrósico (Williams y Spector, 2008).

Estos biomarcadores representan en los fluidos biológicos, en mayor o

menor medida, el estado de las articulaciones. En el individuo sano presentan

niveles basales en suero, líquido sinovial y orina que se ven alterados en respuesta

a una disfunción del metabolismo óseo, pero todos ellos deben ser perfectamente

caracterizados para dotarles de valor diagnóstico (Kong et al., 2006).

Actualmente, uno de los biomarcadores mejor descrito es el COMP, una

proteína pentamérica de 524 kDa de la familia de las tromboespondinas, que es

sintetizada por los condrocitos y está presente en cartílago, sinovio y tendones

(Svensson et al., 2002; Sharif et al., 2006; Williams et al., 2006).

Esta proteína posee dominios de unión al colágeno I, II y IX y, por tanto,

está implicada en el mantenimiento de la integridad de la red que conforma el

colágeno en el cartílago articular. Se ha descrito que sus niveles séricos pueden

aumentar hasta seis veces los niveles basales (Williams y Spector, 2008), aunque

cuando el biomarcador aumenta en esta proporción, el cartílago articular ya se

encuentra gravemente dañado.

Otro de los biomarcadores más estudiado es el CTX-II, que da información

sobre la afectación del colágeno tipo II. A pesar de los inconvenientes del estudio

de marcadores de degradación del colágeno, éste ha demostrado ser un indicador

válido del estadio de la enfermedad. De hecho, se ha demostrado que pacientes

que presentan niveles de COMP elevados en etapas iniciales de la enfermedad,

progresan en la patología elevando sustancialmente los niveles de CTX-II

(Williams y Spector, 2008; Posey y Hecht, 2008; Andersson et al., 2006).

Todo ello sería coherente con la progresión de la enfermedad, ya que la

artrosis se inicia por una pérdida de proteoglicanos y componentes de la matriz


26

extracelular y es posteriormente cuando se produce la colagenolisis (Wakitani, et

al., 2007).

1.1.3.3 Inflamación en la artrosis

La artrosis ha sido considerada tradicionalmente como un tipo de

artropatía no inflamatoria debido a la ausencia de neutrófilos en el líquido sinovial

artrósico y a la falta de manifestaciones sistémicas de inflamación. Sin embargo,

se ha asociado a signos y síntomas característicos de un proceso inflamatorio

como es el dolor articular o la rigidez muscular (Felson, 2006; Hunter y Felson,

2006).

Recientemente, se ha descrito que los condrocitos pueden responder

directamente a las perturbaciones biomecánicas como las que ocurren en la

artrosis, incrementando la síntesis de citocinas inflamatorias, aunque éstas

también pueden ser sintetizadas por estructuras anexas como la membrana

sinovial. También es conocido que, como respuesta a un traumatismo, se activa la

expresión génica global, dando como resultado un incremento en la expresión de

mediadores inflamatorios, proteinasas implicadas en la degradación del cartílago y

factores de respuesta al estrés (Goldring y Goldring, 2007).

Se ha estudiado la sinovitis asociada a la artrosis, como respuesta a la

liberación al espacio sinovial de gran cantidad de restos de la degradación del

cartílago articular. Dado que actualmente está demostrada la presencia en el

infiltrado sinovial de linfocitos B y T acompañados de una sobreexpresión de

mediadores inflamatorios (Goldring y Goldring, 2007; Hunter y Felson, 2006), se

ha postulado que el papel de la inflamación sinovial podría ser favorecer el

reequilibrio entre actividades anabólicas y catabólicas del condrocito en el


27

remodelado de la matriz extracelular del cartílago (Goldring y Goldring, 2007;

Loeser, 2006).

La población de sinoviocitos, durante el proceso de degradación del

cartílago en la artrosis, produce prostaglandina E2 (PGE2), y las citocinas

proinflamatorias interleucina 1β (IL-1β) y el factor de necrosis tumoral α

(TNFα), que estimulan una cascada de activación de diversos mediadores

inflamatorios (Hikiji et al., 2008; Samuels et al., 2008; Felson et al., 2000b;

Felson et al., 2000a; Hardy et al., 2002).

La IL-1β es sintetizada por los condrocitos a concentraciones capaces de

inducir la expresión de colagenasas, prostaglandinas, metaloproteinasas de matriz

(MMPs), agrecanasas y otros genes implicados en el catabolismo (Goldring, 2000;

Goldring y Goldring, 2007). Algunos estudios indican que IL-1β y TNFα

incrementan la síntesis de PGE2 por acción de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), PGE

sintasa microsomal (mPGES) y la fosfolipasa A2 (PLA2) y aumentan la

producción de óxido nítrico (NO) vía la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS)

(Hardy et al., 2002). Estudios in vitro realizados en cultivos primarios de

condrocitos han demostrado que IL-1β puede aumentar tanto PGE2 como sus

receptores según el estado metabólico de la célula. En cambio, se ha postulado

que TNFα no posee la capacidad de incrementar ni la expresión de PGE2 ni de sus

receptores (Alvarez-Soria et al., 2007). IL-1β induce también la diferenciación de

los osteoblastos en osteoclastos por medio de la PGE2 (Hikiji et al., 2008). Los

osteoblastos artrósicos producen niveles de PGE2 superiores a los encontrados en

rodillas sanas (Goldring y Goldring, 2007; Hikiji et al., 2008). En el cartílago,

PGE2 puede desempeñar un doble papel, por un lado incrementar el catabolismo

óseo aumentando la producción de metaloproteinasas y de IL-1β; y, por otro lado,


28

ejercer efectos protectores sobre el metabolismo del cartílago (Alvarez-Soria, et

al., 2007). La IL-1β también induce otras citocinas proinflamatorias como la IL-6,

la IL-17 y IL-18 (Fernandes et al., 2002).

La citocina proinflamatoria IL-17, a su vez, también estimula la

producción de otras citocinas proinflamatorias con efectos sobre los condrocitos

similares a la IL-1β (Lubberts et al., 2005; Vernal et al., 2008; Goldring y

Goldring, 2007). Trabajos recientes indican que la IL-17 está presente en el

líquido sinovial en la artritis reumatoide (AR) y es responsable del daño óseo, ya

que induce la expresión de RANK (Bezerra et al., 2005), responsable de la

diferenciación de osteoclastos, y por tanto, del catabolismo óseo (Vernal et al.,

2008; Lubberts et al., 2005; Koenders et al., 2006). Diversos estudios clínicos han

demostrado que la IL-17 induce la secreción de IL-6 en sinoviocitos de rodillas

con artritis reumatoide, provocando un círculo de inflamación sinovial,

degradación del cartílago e inhibición de la proliferación de condrocitos (Gaffen,

2004). Aunque existen pocos estudios sobre el posible papel de la IL-17 en la

artrosis, sí podemos encontrar algún estudio en artrosis mandibular y se le ha

relacionado, como ya se había descrito para AR, con la inducción de la

osteoclastogénesis, de citocinas proinflamatorias, metaloproteinasas y, por tanto,

con la destrucción del cartílago y el hueso articular (Vernal et al., 2008; Koenders

et al., 2005; Gaffen, 2004).

1.1.4. Tratamientos actuales de la artrosis

La artrosis es una de las enfermedades que más consultas de atención

primaria ocasiona y uno de los problemas de salud pública más importantes en la

actualidad. El tratamiento del paciente se aborda combinando medidas


29

farmacológicas (Zhang et al., 2008) (fig. 9) y no farmacológicas (Zhang et al.,

2007) (fig. 10).

En el tratamiento de la artrosis existen unos objetivos directos (aliviar el

dolor y evitar la progresión de la enfermedad) y otros indirectos como la

regeneración del cartílago, prevención del remodelado del hueso subcondral y de

la sinovitis secundaria (Samuels et al., 2008).

El uso del paracetamol fue recomendado para el tratamiento de la

sintomatología de la artrosis, ya que se demostró que 1g/día tenía los mismos

efectos que 1,2- 2,4 g/día de

ibuprofeno en el tratamiento

de pacientes con artrosis de

rodilla o cadera. Otro

beneficio es que el

paracetamol es mejor tolerado

que el ibuprofeno. Por ello, el

paracetamol es el fármaco de

Figura 10: Opciones terapéuticas no farmacológicas

OPCIONES TERAPÉUTICAS NO FARMACOLÓGICAS

· Educación· Apoyo emocional· Actuación sobre factores de riesgo· Higiene postural y ahorro articular· Termo e hidroterapia· Programa de ejercicios· Tai Chi· Medidas de órtesis

Figura 10: Opciones terapéuticas no farmacológicas

OPCIONES TERAPÉUTICAS NO FARMACOLÓGICAS

· Educación· Apoyo emocional· Actuación sobre factores de riesgo· Higiene postural y ahorro articular· Termo e hidroterapia· Programa de ejercicios· Tai Chi· Medidas de órtesis

Figura 9: Opciones farmacológicas para el tratamiento de la artrosis

OPCIONES FARMACOLÓGICAS

AnalgésicosParacetamol

Agentes tópicosCapsaicina

Antiinflamatorios no esteroides Inhibidores selectivos de la COX-2Inhibidores no selectivos de la

COX-2Inyecciones intraarticulares

GlucocorticoidesÁcido hialurónico

Analgésicos opioidesTramadol

Fármacos de acción sintomática lenta Condroitín sulfatoSulfato de glucosaminaDiacereínaÁcido hialurónico

Terapias experimentalesInhibidores de metaloproteinasas

Figura 9: Opciones farmacológicas para el tratamiento de la artrosis

OPCIONES FARMACOLÓGICAS

AnalgésicosParacetamol

Agentes tópicosCapsaicina

Antiinflamatorios no esteroides Inhibidores selectivos de la COX-2Inhibidores no selectivos de la

COX-2Inyecciones intraarticulares

GlucocorticoidesÁcido hialurónico

Analgésicos opioidesTramadol

Fármacos de acción sintomática lenta Condroitín sulfatoSulfato de glucosaminaDiacereínaÁcido hialurónico

Terapias experimentalesInhibidores de metaloproteinasas


30

primera elección para el tratamiento del dolor moderado en pacientes de artrosis

(Zhang et al., 2008).

Por otro lado, la acción tópica de sustancias como la capsaicina ha

demostrado proporcionar alivio del dolor articular en el proceso artrósico (Zhang,

et al., 2008; Sarzi-Puttini et al., 2005).

Sin embargo, son los antiinflamatorios no esteroides (AINE) los que

presentan mejores resultados en el tratamiento del dolor artrósico. Se ha descrito

que la administración de Artrotec® (una combinación de diclofenaco y

misoprostol), a dosis de 75 mg dos veces al día daba mejores resultados que 4000

mg/día de paracetamol (Simon y Strand, 2007). Es sabido que los AINE reducen

el dolor y la inflamación y poseen efectos antipiréticos, pero no han demostrado

inhibir la destrucción del cartílago articular, ni la formación de osteofitos, ni

protegen el cartílago de lesiones mecánicas o inflamatorias durante la progresión

de la enfermedad. Sin embargo, el tratamiento profiláctico con AINE ha

demostrado reducir la formación ósea heterotópica tras la cirugía de reemplazo

articular (Zhang et al., 2008).

Los AINE más usados en el tratamiento de la artrosis son los inhibidores

selectivos de la COX-2 (COXIB), ya que tienen una eficacia similar a los

inhibidores no selectivos de la COX-2 pero provocan menos alteraciones

gastrointestinales. De entre ellos cabe destacar celecoxib, ya que provoca un alivio

sintomático de la artrosis, artritis reumatoide y espondilitis anquilosante sin

aumentar el riesgo cardiovascular asociado a los inhibidores no selectivos de la

COX-2 (Zhang et al., 2008; Zhang et al., 2007).

La terapia intraarticular es una técnica sencilla que permite la

administración de sustancias como el ácido hialurónico o los glucocortocoides. Se

ha demostrado que el ácido hialurónico intraarticular reduce los niveles de IL-6 en


31

el líquido sinovial, aunque no parece afectar a la IL-8 o TNF-α (Goldberg y

Buckwalter, 2005; Zhang et al., 2007). También se ha observado que suprime la

expresión de la MMP-3 en la membrana sinovial, aunque no altera sus niveles en

el cartílago. Otra de las opciones para el tratamiento de pacientes con una

importante inflamación articular es la administración intraarticular de

glucocorticoides, ya que inhiben la síntesis de prostaglandinas y reducen la

actividad de enzimas como la colagenasa (Gerwin et al., 2006). Normalmente se

usan en su forma cristalina para prolongar su permanencia en la articulación

(Neustadt y Altman, 2007).

Si el paciente artrósico persiste en sus dolores tras el tratamiento con

paracetamol, AINE y COXIB a dosis máximas, se debe considerar el uso de

analgésicos opioides como tramadol. El tramadol se une a los receptores opioides

µ y es un inhibidor de la recaptación de serotonina y noradrenalina, lo que

proporciona un importante alivio sintomático del dolor (Zhang et al., 2007; Simon

y Strand, 2007).

Los fármacos de acción sintomática lenta para el tratamiento de la artrosis

(SYSADOA), son compuestos que se prescriben como medicamentos, aunque en

otros países se consideren nutracéuticos. Estos compuestos, en su mayoría

presentes de forma constitutiva en nuestro organismo, no tienen un efecto

inmediato como es el caso de los AINE, y su eficacia clínica sobre los síntomas se

observa a partir de las dos semanas de administración continuada. No obstante,

tras la supresión del tratamiento con SYSADOA, se observa un efecto remanente

de varios meses de duración. Estos compuestos se utilizan como terapia de base

para la artrosis. De entre ellos es de destacar el condroitín sulfato, polisacárido

presente en el cartílago articular que actúa como antiinflamatorio, estimulando la

Introducción. Modelos animales

32

síntesis de proteoglicanos y ácido hialurónico endógenos, y disminuyendo la

actividad catabólica de los condrocitos (Isasi et al., 2004; Zhang et al., 2007).

1.2 MODELOS ANIMALES

En palabras de P H Pritzker “un modelo animal para una enfermedad

humana puede ser definido como un grupo de animales que poseen de forma

heredada, naturalmente adquirida o experimentalmente inducida, características

útiles para la experimentación científica que se parecen a uno o más aspectos de

la patología humana” (Pritzker, 1994).

Por tanto, la utilización de modelos animales tiene la finalidad de

desarrollar un sistema que nos permita comprender el mecanismo básico de la

patología, de forma que, empleando el modelo experimental de forma sistemática,

se pueda llegar a un mejor conocimiento de las bases biológicas y patofisiológicas

de la enfermedad (Zúñiga et al., 2008). En general, el modelo será más útil cuánto

mayor sea su semejanza con la patología humana, aunque lo más común es

encontrar modelos que representen una o varias características de la patología. Por

tanto, para una visión global de la enfermedad, debería emplearse más de un

modelo experimental para obtener resultados más concluyentes (van der Kraan y

van den Berg, 2008).

Aunque existen grandes detractores de la experimentación animal y, en la

actualidad, se han desarrollado gran variedad de métodos alternativos a la

utilización de animales de laboratorio, no existen métodos in vitro que puedan

sustituir los resultados obtenidos in vivo, ya que los modelos animales permiten

obtener resultados globales que muestran la respuesta de todo un organismo

(Zúñiga et al., 2008). Además, en el caso de la artrosis, se hace realmente

complicado poder experimentar con muestras humanas, ya que no es posible


33

obtener muestras hasta que el tejido se encuentra gravemente dañado. Por tanto, se

pierde la oportunidad de estudiar los procesos previos de desgaste y degeneración

que conlleva la enfermedad.

Deben tenerse en cuenta los inconvenientes que presenta la

experimentación animal, como son las dificultades metodológicas, económicas y

éticas. Por tanto, siempre debe realizarse el diseño experimental con suma cautela

y responsabilidad, siguiendo el postulado de las 3Rs de Russell y Burch basado en

la Reducción, Refinamiento y Reemplazo, siempre que sea posible.

Los modelos animales pueden clasificarse como inducidos, generados por

modificación genética, espontáneos, negativos y huérfanos. Los modelos

inducidos son aquellos en los que, a un animal sano se le induce

experimentalmente una enfermedad, como podría ser el caso de la artrosis

inducida por colagenasa intraarticular o la artrosis provocada por la transección

del ligamento cruzado anterior que se estudian en esta Tesis. Los generados por

modificación genética son aquellos en los que la ingeniería genética ha

manipulado los animales para obtener una cualidad digna de estudio, como ocurre

en los animales transgénicos o knock-out. Los modelos espontáneos se han

obtenido a partir de la selección de individuos de una cepa que presentan la

característica de la patología a estudiar y al realizar los posteriores cruzamientos

entre estos individuos, se obtiene una cepa consanguínea que presenta en mayor o

menor proporción el rasgo a estudiar. En la presente Tesis se ha estudiado el

modelo de artrosis espontánea desarrollada por la cepa de ratones STR/ort. Los

modelos negativos son aquellos que permiten estudiar cepas de animales que no

son capaces de desarrollar una cierta enfermedad. Y, por último, los modelos

animales huérfanos presentan enfermedades que ocurren de forma natural en


34

distintas especies animales pero que no se conoce aún la patología humana

equivalente.

Por todas las variables mencionadas y por muchas otras que se irán

enunciando a lo largo de este apartado, escoger el modelo experimental adecuado

supone un dilema importante y, en el caso de los modelos experimentales de

artrosis aún se agrava más, ya que la artrosis es una enfermedad con una

patogénesis poco descrita. Problemas prácticos como la disponibilidad de los

animales, el tiempo que tardan los individuos en desarrollar la patología o la

proporción con que ocurre en la cepa, el cómodo manejo del animal o el

mantenimiento de éstos pueden resultar factores limitantes para el estudio de un

modelo animal en concreto (van der Kraan y van den Berg, 2008; Pritzker, 1994).

Además, en el momento de escoger el modelo experimental debe tenerse

en cuenta la finalidad para la que va a ser destinado. Si el objetivo primordial es el

estudio de la patogénesis o de la progresión de la enfermedad, debe emplearse un

modelo que represente la mayor parte de los items que caracterizan la patología.

Si por el contrario, se pretende estudiar los efectos de un determinado

fármaco sobre un aspecto concreto de la enfermedad, se debe optar por aquel

modelo que esté mejor caracterizado y posea un alto grado de reproducibilidad en

la vía implicada. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que dicho modelo puede no

estar representando todos los aspectos de la enfermedad (Pritzker, 1994). Un

ejemplo de modelo validado para el estudio farmacológico de sustancias

implicadas en el dolor artrósico, es el modelo inducido por iodoacetato

intraarticular, aunque este modelo no sería válido para el estudio de la patogénesis

de la enfermedad (Ameye y Young, 2006).


35

1.2.1 Modelos animales de artrosis

La artrosis aparece en todo tipo de animales. Además de la especie

humana la padecen elefantes, perros, caballos, ratones, ballenas, tortugas y aves

entre otros. Pero, aunque todas estas especies puedan desarrollar la artrosis de

forma espontánea durante su proceso de envejecimiento, no se pueden considerar

modelos animales aptos para estudio.

Tal y como describe Pritzker (1994), existen distintos estadios en el

desarrollo de un modelo para el estudio de la artrosis. En primer lugar, la

patología debe identificarse o inducirse en un grupo de animales; en segundo

lugar, debe comprobarse la disponibilidad de ejemplares que desarrollan la

patología. Una vez asegurada la disponibilidad de animales con la enfermedad

claramente diagnosticable, se debe realizar una caracterización funcional y

estructural para determinar las similitudes y diferencias con la artrosis humana. Es

en este momento cuando el modelo queda disponible para realizar estudios de

patogénesis o terapéuticos.

Los modelos animales de artrosis pueden dividirse en dos grandes grupos,

los inducidos experimentalmente y los de animales que desarrollan

espontáneamente la enfermedad. En la figura 11 se muestran algunos ejemplos de

modelos animales de artrosis estudiados actualmente. Los modelos inducidos

experimentalmente se podrían dividir según la patogénesis de la enfermedad, en

los manipulados genéticamente (como podrían ser los ratones IL-6(-/-) o la gran

batería de ratones knock out para componentes de la matriz extracelular,

metaloproteinasas o citocinas (Singer et al., 1995); los manipulados a nivel

mecánico, donde se altera la estabilidad de la articulación, (como el modelo

inducido por la transección del ligamento cruzado anterior); y los intervenidos

estructuralmente por enzimas o sustancias bioquímicas, (como el modelo inducido


36

por inyección intra-articular de colagenasa o papaína (Pritzker, 1994; Piscaer et

al., 2008)). En los modelos inducidos biomecánica o estructuralmente, cabe la

posibilidad de provocar una artrosis monoarticular o poliarticular. La ventaja de

los modelos inducidos monoarticulares es que están perfectamente definidas las

lesiones, la severidad de éstas y la progresión de la enfermedad, quedando como

control la articulación contralateral. El inconveniente es que se trata de una

agresión realizada a una articulación sana, por tanto el desarrollo de la artrosis que

se observará será la de una artrosis secundaria monoarticular similar a las artrosis

secundarias a un traumatismo en humanos (Pritzker, 1994).

Además, los modelos inducidos experimentalmente permiten aislar el

factor edad que tanto afecta en la enfermedad de artrosis (Setton et al., 1999).

El caso de los modelos espontáneos de artrosis es completamente

diferente, ya que, el hecho de que la artrosis se produzca por una serie de

alteraciones que causan una degeneración articular progresiva, hace realmente

difícil distinguir aquellas características asociadas al envejecimiento de aquellas

asociadas a la artrosis (Lorenz y Richter, 2006). En la presente Tesis se ha

realizado el estudio de la cepa de ratones STR/ort que, como se describe en el

próximo apartado, desarrollan de forma espontánea la patología. La ventaja del

estudio de este tipo de modelos radica en el hecho de que no sólo muestran una

lesión localizada, sino que el desarrollo de la artrosis poliarticular va asociado a

una serie de factores sistémicos y a la afectación de las estructuras anexas a la

articulación, como respuesta compensatoria a la degradación articular.


37

1.2.2 Modelos estudiados

En la presente Tesis se han estudiado tres modelos animales de artrosis.

Uno espontáneo y dos inducidos: un modelo por inducción bioquímica y otro por

inducción quirúrgica.

Como modelo de desarrollo espontáneo escogimos la cepa de ratones

STR/ort. De entre los modelos inducidos existentes en la bibliografía escogimos el

modelo de artrosis por inyección intraarticular de colagenasa en ratones Balb/c y

la artrosis provocada por la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) en

rata Wistar.

1.2.2.1 Modelo de artrosis inducida por inyección intraarticular de

colagenasa en ratones Balb/c

Este modelo de artrosis inducida utiliza colagenasa bacteriana inyectada en

el espacio sinovial de la rodilla del animal. Este enzima afecta a las estructuras

articulares que contienen colágeno tipo I, como los tendones, ligamentos y

menisco, causando una distensión de las estructuras anexas a la articulación que le

confieren estabilidad. Esta prolongada inestabilidad es la que provoca en último

término una degeneración del cartílago homóloga a la que ocurre en el cartílago

artrósico (Rudolphi et al., 2003). El enzima se ha demostrado que posee efectos

mínimos sobre el cartílago articular, rico en colágeno tipo II resistente a la

digestión de este enzima (Botter et al., 2008; Pritzker, 1994). Existen autores que

defienden que la colagenasa empleada en este tipo de experimentos sí que puede

degradar in vitro el cartílago articular (Kikuchi et al., 1998), aunque mucho más

rápidamente de lo que ocurriría in vivo, ya que el organismo posee maquinaria que

le protege de la actividad de la colagenasa (van der Kraan et al., 1989).


38

Mod

elos

esp

ontá

neos

Mod

elos

tran

sgén

icos

Mod

elos

indu

cido

s

Ratón DBA/1 Desarrollo de la enfermedad a Holmdahl, R., et al.,partir de los 4 meses de edad. 1992Sólo la desarrollan los machos.

Ratón STR/ort Desarrollan la enfermedad el 85% Mason, R.M., et al., de los machos. 2001

Macaco Rhesus Desarrollo de la enfermedad a Pritzker, K.P., et al.,partir de los 5 años de edad. 1989

Gen Col2a1 Deleción espontánea. Pace, J.M., et al.,Defectos en el C-propéptido 1997

ADAM-15 Knockout. Majumdar, M.K., Pérdida de proteoglicanos et al.,2007

MMP-14 Knockout. Holmbeck, K., et al.,Desarrollo óseo anormal, 1999Hiperplasia sinovial

Inyección intraarticular Inhibición de la glicolisis Gustafson, S.B., et al.,de iodoacetato sódico en condrocitos 1992

Pérdida de proteoglicanos

Inyección intraarticular Inestabilidad articular provocada van der Kraan, P.M., de colagenasa por la degradación del colágeno I et al., 1990

Formación de osteofitos

ACLT Inestabilidad articular Brandt, K.D., et al., Aplicable a muchas especies 1991 Desarrollo de la enfermedad apartir de las 2 semanas

Mod

elos

indu

cido

squ

ímic

a o

mec

ánic

amen

te

Figura 11: Ejemplos de modelos animales de artrosis utilizados en investigación.

Mod

elos

esp

ontá

neos

Mod

elos

tran

sgén

icos

Mod

elos

indu

cido

s

Ratón DBA/1 Desarrollo de la enfermedad a Holmdahl, R., et al.,partir de los 4 meses de edad. 1992Sólo la desarrollan los machos.

Ratón STR/ort Desarrollan la enfermedad el 85% Mason, R.M., et al., de los machos. 2001

Macaco Rhesus Desarrollo de la enfermedad a Pritzker, K.P., et al.,partir de los 5 años de edad. 1989

Gen Col2a1 Deleción espontánea. Pace, J.M., et al.,Defectos en el C-propéptido 1997

ADAM-15 Knockout. Majumdar, M.K., Pérdida de proteoglicanos et al.,2007

MMP-14 Knockout. Holmbeck, K., et al.,Desarrollo óseo anormal, 1999Hiperplasia sinovial

Inyección intraarticular Inhibición de la glicolisis Gustafson, S.B., et al.,de iodoacetato sódico en condrocitos 1992

Pérdida de proteoglicanos

Inyección intraarticular Inestabilidad articular provocada van der Kraan, P.M., de colagenasa por la degradación del colágeno I et al., 1990

Formación de osteofitos

ACLT Inestabilidad articular Brandt, K.D., et al., Aplicable a muchas especies 1991 Desarrollo de la enfermedad apartir de las 2 semanas

Mod

elos

indu

cido

squ

ímic

a o

mec

ánic

amen

te

Figura 11: Ejemplos de modelos animales de artrosis utilizados en investigación.


39

Figura 12: Ratones STR/ort.(Imagen obtenida de www.harlan.com)Figura 12: Ratones STR/ort.(Imagen obtenida de www.harlan.com)

Este modelo de inducción por colagenasa intraarticular ha sido utilizado en

gran variedad de animales como conejos (Kikuchi et al., 1998), en combinación

con modelos espontáneos, como es el caso de los ratones C57Bl6, que poseen un

cartílago articular de grosor reducido, en ratones deficientes en IL-6 (de Hooge et

al., 2005) o en ratones sin ninguna alteración genética como son los Balb/c

(Rudolphi et al., 2003).

La afectación en este modelo se centra primordialmente en la articulación

femorotibial, siendo de destacar la formación de osteofitos como mecanismo

compensatorio a la desestabilización de la articulación (van der Kraan et

al.,1989).

1.2.2.2 Modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratón STR/ort

La cepa de ratones STR/ort (fig12) fue

aislada por el Dr. George E. Jay en 1951 como

un mutante de pelaje moteado (blanco y rojizo)

en la generación F29 procedente de unos

progenitores STR/1N (Jaeger et al., 2008).

Los ratones STR/ort se caracterizan por su

tendencia a sufrir una obesidad independiente

de la dieta y de factores hormonales, siendo su tamaño corporal mayor al resto de

cepas de ratones utilizados habitualmente para experimentación.

No se ha demostrado una correlación entre la obesidad y el desarrollo de la

enfermedad en los ratones STR/ort (Walton, 1979). Además, esta cepa tiene una

elevada susceptibilidad de padecer patologías periodontales, una elevada

prevalencia de hepatomas, niveles bajos de hemoglobina y desarrollan de forma


40

espontánea una degeneración articular similar a la encontrada en pacientes

humanos artrósicos (Jaeger et al., 2008). Las lesiones anatomopatológicas de la

articulación de la rodilla de los ratones STR/ort incluyen la pérdida de cartílago

hialino, la formación de osteofitos y la calcificación y osificación del ligamento

cruzado anterior. Estas características son similares a las encontradas en las

gonartrosis de pacientes humanos. A partir de las 20 semanas de edad, el 85% de

los ratones STR/ort desarrollan la enfermedad y lo hacen en mayor proporción e

intensidad los machos que las hembras. Las hembras y los machos STR/ort no

sólo difieren en la severidad de la enfermedad sino que presentan una expresión

articular de citocinas diferente (Mahr et al., 2003; Mason et al., 2001).

Estudios en los que se analizaba la expresión de los genes para la IL-1α y

β, IL-6, factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) y factor de crecimiento

transformante beta (TGFβ), demostraron que todos los genes estudiados estaban

presentes en los condrocitos de rodillas de ratones STR/ort. Sin embargo, estos

genes no aparecían expresados en ratones CBA de la misma edad (Jaeger et al.,

2008).

El estudio de la matriz extracelular del cartílago tibial medial de ratones

STR/ort demostró una progresiva desorganización de la red de proteoglicanos y la

pérdida de función de la matriz de colágeno, contribuyendo a la aparición de un

cartílago típicamente artrósico donde se encuentran alteradas las propiedades

bioquímicas y biofísicas de la matriz extracelular del cartílago articular (Mason et

al., 2001).

La degradación del cartílago de rodillas de ratones STR/ort aparece en

primer lugar en el menisco tibial medial y, según progresa la enfermedad se

incrementa la pérdida de cartílago, dando como resultado una pronunciada

inestabilidad de la articulación de la rodilla y una deformación progresiva. Este


41

proceso conlleva una subluxación medial de la rótula. Los autores han concluido

que la degeneración del cartílago en la región medial del cóndilo tibial de los

ratones STR/ort se desarrolla espontáneamente por una patogénesis desconocida y

esta degradación es la responsable de la subluxación secundaria de la rótula y los

consecuentes cambios patológicos del cartílago articular característicos de la

artrosis.

Los cambios en la expresión de citocinas y factores de crecimiento han

sido determinados en las fases tempranas de la enfermedad en el modelo en ratón

STR/ort. Estudios previos han identificado un incremento en la cantidad de

proteoglicanos en el cartílago tibial en ratones STR/ort de 16-19 semanas de edad

y un incremento paralelo en la expresión de ARNm de agrecanos, comparados

con los niveles encontrados en ratones CBA de la misma edad que no desarrollan

artrosis (Chambers et al., 2002). Este aumento va seguido de un incremento en la

expresión de MMPs, enzimas responsables de la degradación del cartílago, lo que

conlleva una pérdida de componentes de la matriz extracelular del cartílago.

Se han encontrado tres MMPs con actividad colagenasa en el cartílago

artrósico de ratones STR/ort: la colagenasa 1 (MMP-1), la colagenasa 2 o

colagenasa neutrofílica (MMP-8) y la colagenasa 3 (MMP-13). La MMP-13 tiene

una mayor especificidad frente al colágeno II que la MMP-1. En roedores aparece

predominantemente la MMP-13, aunque se ha propuesto que la MMP-1 podría ser

mayoritaria durante la embriogénesis (Flannelly et al., 2002).


42

1.2.2.3 Modelo de artrosis provocada por la transección del ligamento

cruzado anterior en rata Wistar

Es conocido que la ruptura del ligamento cruzado anterior provoca una

artrosis prematura en humanos. La lesión del ligamento cruzado anterior

incrementa la movilidad anteroposterior de la articulación, provocando constantes

subluxaciones entre el fémur y la tibia e incrementa la rotación interna entre estas

estructuras. Por tanto, la ausencia del eje que representa el ligamento cruzado

anterior aumenta la fricción entre las superficies articulares y constituye un riesgo

importante de padecer artrosis

Basándose en uno de los factores de riesgo de padecer una artrosis

secundaria en la patología humana, se ha desarrollado el modelo animal basado en

la transección experimental del ligamento cruzado anterior. También se desarrolla

actualmente este modelo en combinación con una meniscectomía parcial que

agrava la inestabilidad articular (Hill et al., 2005; Appleton et al., 2007b)..

Este modelo experimental se ha desarrollado tradicionalmente en perros y

cabras (Setton et al., 1999; Matsuhashi et al., 2008), que permiten obtener gran

cantidad de cartílago para analizar y proporcionan un modelo altamente

representativo de la artrosis humana. Pero, debido a la dificultad para

experimentar con estas especies animales, se ha desarrollado esta cirugía para

conejos (Matsuhashi et al., 2008; Calvo et al., 2007; Calvo et al., 2004) y ratas

(Appleton et al., 2007a; Appleton et al., 2007b), lo que permite estudiar mayor

cantidad de animales y el desarrollo de la patología es más rápido debido a su

menor esperanza de vida (Pritzker, 1994).

Este modelo representa de forma fiable tanto los cambios histológicos y

morfológicos, incluyendo la fibrilación de la superficie articular, como la pérdida

de proteoglicanos. Permite observar también el incremento de proliferación


43

Figura 13: Estaño protoporfirina IX (SnPP)Figura 13: Estaño protoporfirina IX (SnPP)

celular del cartílago y la formación de osteofitos (Setton et al., 1999; Hayami et

al., 2006; Lorenz y Richter, 2006).

De hecho, este modelo ha sido empleado recientemente (Appleton et al.,

2007b) para realizar un estudio sobre la expresión diferencial de genes en el

cartílago artrósico, con la finalidad de poder establecer unos criterios génicos en la

patogénesis de la artrosis humana.

1.3 FÁRMACOS ENSAYADOS

Los modelos de artrosis escogidos para realizar la presente Tesis fueron,

en primer lugar, puestos a punto en nuestro laboratorio, y en segundo lugar, se

analizó la expresión de las diferentes variables implicadas en el desarrollo de la

enfermedad.

Los modelos con los que se consiguieron resultados más fácilmente

cuantificables fueron utilizados para ensayar dos fármacos y poder evaluar sus

efectos sobre el desarrollo de la artrosis.

1.3.1 Estaño-protoporfirina IX (SnPP)

La enzima hemo oxigenasa es la

principal enzima implicada en el catabolismo

del grupo hemo. Degrada el grupo hemo

dando como resultado biliverdina, hierro y

monóxido de carbono (CO). Existe una

isoforma inducible (HO-1) en respuesta a

estrés oxidativo, hipoxia, metales pesados o


44

citocinas; y una isoforma constitutiva (HO-2) (Alcaraz et al., 2003; Soares y

Bach, 2009).

SnPP (fig 13) es un potente inhibidor de la actividad de la hemo oxigenasa.

Debido a su acción inhibitoria sobre el metabolismo del grupo hemo, se ha

demostrado su utilidad en el tratamiento de las ictericias neonatales,

principalmente, en el caso de la ictericia isoinmune por incompatibilidad feto-

materna y la hiperbilirrubinemia no conjugada de Crigler-Najjar. Las

metaloporfirinas, en concreto SnPP, constituyen una alternativa terapéutica

prometedora frente a las ictericias (Drummond y Kappas, 1981).

Se ha observado que diversas metaloporfirinas, entre ellas SnPP, inhiben

las tres isoformas de la oxido nítrico sintasa (NOS) (Wolff y Lubeskie, 1996).

Estudios realizados con modelos animales de artritis reumatoide han

demostrado que la utilización de SnPP previene la aparición de la sintomatología

de la enfermedad y que posee una acción terapéutica antiinflamatoria, reduciendo

los niveles de citocinas proinflamatorias como TNF-α y IL-1β y disminuyendo la

expresión de COX-2 (Devesa et al., 2005b; Devesa et al., 2005a).

Estudios anteriores indican que SnPP puede tener propiedades

antiinflamatorias (Jozkowicz y Dulak, 2003) y destacan el interés que posee la

evaluación de los efectos de este fármaco sobre el proceso inflamatorio asociado a

la artrosis y la degradación articular.

1.3.2 BIS069

BIS069 es un polisacárido semisintético procedente de extractos vegetales

cedido para su estudio por la empresa farmacéutica Bioibérica. En estudios sobre

cultivos primarios de condrocitos humanos, BIS069 ha demostrado poseer

capacidad condroprotectora. Resultados in vitro preliminares han sugerido que


45

BIS069 ayuda a equilibrar el metabolismo del cartílago artrósico activando el

reemplazo de componentes de la matriz extracelular de la matriz del cartílago

(comunicación personal del laboratorio). Se ha sugerido que el polisacárido que se

ha testado en esta Tesis también posee efectos antiinflamatorios sobre algunos de

los mediadores implicados en el proceso artrósico.


46

2. OBJETIVOS

Objetivos

47

2. OBJETIVOS

Tradicionalmente se han empleado los modelos animales para estudiar los

efectos de fármacos susceptibles de ser empleados en el tratamiento de las

enfermedades humanas. La artrosis es una de las enfermedades de mayor

prevalencia entre la población anciana y se caracteriza por una degradación

articular progresiva acompañada de sinovitis que afecta de forma importante la

calidad de vida del paciente. Cada modelo animal representa una o varias

características de la enfermedad, por tanto para realizar un estudio completo de los

efectos de fármacos deben emplearse diferentes modelos experimentales.

SnPP es un potente inhibidor competitivo de la hemo oxigenasa-1 y ha

sido usado para el tratamiento de la hiperbilirrubinemia neonatal. En modelos

animales de artritis reumatoide ha demostrado poseer un importante efecto

antiinflamatorio y condroprotector de la articulación.

BIS069 es un fármaco cedido por la empresa Bioibérica para ser evaluado

en modelos animales de artrosis basándose en resultados previos obtenidos en

estudios in vitro.

Por todo ello, los objetivos planteados en esta Tesis son:

1.- Poner a punto tres modelos animales de artrosis: artrosis inducida por

inyección intraarticular de colagenasa en ratones Balb/c, artrosis espontánea en

ratones STR/ort y artrosis provocada por la transección del ligamento cruzado

anterior en rata Wistar.

2.- Caracterizar la evolución de la enfermedad, la expresión de diversos

biomarcadores de la degradación articular y la producción de los mediadores

Objetivos

48

inflamatorios que pueden participar en la artrosis, así como realizar un

seguimiento de la degradación del cartílago articular mediante estudio histológico.

3.- Estudiar los efectos de SnPP y BIS069 en aquellos modelos experimentales

que hayan demostrado ser adecuados para realizar la evaluación farmacológica de

dichos fármacos sobre los parámetros estudiados anteriormente.

3. MATERIAL Y MÉTODOS

Material y métodos

49

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. MATERIALES Y REACTIVOS

3.1.1 MATERIAL Y PRODUCTOS PARA MICROCIRUGÍA

Bisturí microcirugía estéril (04-1015, Lawton); sutura de ácido poliglicólico 4/0,

19 mm; tijeras microcirugía (05-0030, Lawton); porta-agujas vascular (25-0216,

Lawton); costótomo (38-0100, Lawton); retractores del iris (60-1215, Graefe);

pinza vascular (09-0351, Graefe). Isoflurano; butorfanol; Lupa binocular (Leica);

colagenasa tipo VII, Clostridium histolyticum (C2399, Sigma); jeringa Hamilton

(701LT, Hamilton).

3.1.2 PRODUCTOS PARA HISTOLOGÍA E INMUNOHISTOQUÍMICA

Parafina PF 56-58ºC (253211.1211, Panreac); Osteosoft (1.01728.1000, Merck);

hematoxilina Gill nº 2 (GHS216, Sigma); xileno (141769.2711, Panreac); etanol

absoluto (121086.1212, Panreac); tolueno (131745.0314, Panreac); medio de

montaje no acuoso DPX (25525.1608, Panreac); paraformaldehido (P6148,

Sigma). Agente bloqueante de la peroxidasa (S2001, Dako); medio de montaje

acuoso (Dako); cromógeno líquido diaminobenzidina + sustrato (K3467, Dako);

avidina/peroxidasa (P0364, Dako); inmunoglobulina policlonal anti-conejo

producida en cerdo (E0353, Dako); suero de cabra (G9023, Sigma).

3.1.3 PRODUCTOS PARA WESTERN BLOT

Tween20 (P9416, Sigma); reactivos de detección para western blotting por

quimioluminiscencia (RPN2106, GE Healthcare); tinción Ponceau (81462,

Fluka); fluoruro sódico (S7920, Sigma); ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)

Material y métodos

50

(E5134, Sigma); ortovanadato sódico (S6508, Sigma); DL-ditiotreitol (D9779,

Sigma); ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) (E3889, Sigma); molibdato sódico

(S6646, Sigma); N,N,N’,N’-tetrametileno-diamina (TEMED) (T9281, Sigma);

acrilamida/bisacrilamida 30% (A3574, Sigma)

3.1.4 PRODUCTOS PARA RADIOINMUNOENSAYO (RIA)

Líquido de centelleo Optiphase Hisafe 2 (Wallac), líquido de centelleo Optiphase

Supermix (Wallac); [5,6,8,11,12,14,15(n)-3H] Prostaglandina E2 (TRK43,

Amersham); anticuerpo anti-prostaglandina E2 producido en ratón (P5164,

Sigma).

3.1.5 ELISA EMPLEADOS

MMP3 (total) (10-0,156 ng/mL)(MMP300, Quantikine, R&D Systems) ; IL-6

(8000-62 pg/mL)(88-7064-22, eBiosciences) ; IL-17 (350-10,9 pg/mL)(M1700,

Quantikine, R&D Systems) ; proteína oligomérica de la matriz del cartílago

(COMP) (0,9-0,055 U/L)(A-COMP.96, MDbiosciences) ; ácido hialurónico

(1600-50 ng/mL)(H-1200, Echelon) ; telopéptido C-terminal del colágeno tipo II

(CTX-II)(247,6-6,3 pg/mL)(serum pre-clinical Cartilaps, 3CAL4000, Nordic

biosciences); TNFα (2700-33,3 pg/mL)(DuoSet, R&D Systems); IL1β (2000-24,7

pg/mL)(DuoSet, R&D Systems). Mouse Bone Panel 2B (40000-9,8 pg/mL;

)(MBN2B-41K, Lincoplex KIT, Linco)

3.1.6 ANTICUERPOS

Anticuerpo policlonal anti-hemo oxigenasa-1 de humano producido en conejo

(SPA-896, Stressgen); anticuerpo policlonal anti-COX-2 de ratón producido en

Material y métodos

51

conejo (160116, Cayman); IgG de cabra anti-IgG de conejo marcada con

peroxidasa (P0448, Dako)

3.1.7 TAMPONES EMPLEADOS

WESTERN BLOT

Tampón electroforesis: glicina (14,4 g/l); trizma base (3 g/l); dodecilsulfato

sódico (SDS) 20% (5 ml/l); H2O (1000 ml)

Tampón transferencia: glicina (2,88 g/l g/l); trizma base (0,6 g/l); SDS 20% (0,5

ml/l); H2O (1000 ml)

Tampón fosfato salino (PBS) 0,02M (pH 7,4): fosfato mono-potásico (KH2PO4)

(1,09 g/l); fosfato sódico hidratado (Na2HPO4 x 12H2O) (21,9 g); cloruro sódico

(NaCl) (9 g); H2O (1000 ml)

RIA

Tampón A1 (pH 7,4): NaH2PO4 x 2H2O (1,19 g/l); Na2HPO4 (4,6 g/l); albúmina

de suero bovino (BSA) (5,1 g/l); azida sódica (0,1%)

Tampón B1 (pH 7,4): tampón A1 + NaCl (9 g/l)

Carbón activo-Dextrano: dextrano (0,5 g); carbón activo (1 g); tampón A1 (100

ml).

HOMOGENIZACIÓN DE TEJIDOS

Tampón de inhibidores pH 8,0: ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperacinil]-

etanosulfónico (HEPES) (10mM); EDTA (1mM); EGTA (1mM); cloruro potásico

(KCl) (10 mM); ditiotreitol (DTT) (1 mM); fluoruro sódico (NaF) (5 mM);

ortovanadato sódico (Na3VO4) (1 mM); molibdato sódico (Na2MoO4) (10 mM);

Material y métodos

52

leupeptina (1 µg/ml), aprotinina (0,1 µg/ml); fluoruro de fenil metil sulfonilo

(PMSF) (0,5 mM).

3.2 MODELOS ANIMALES DE ARTROSIS EMPLEADOS

Como ya hemos enunciado en la Introducción de la presente Tesis, se han

estudiado 3 modelos animales que representan diferentes aspectos de la

enfermedad de artrosis que padece la especie humana. A continuación se explicará

cada uno de los modelos empleados así como el diseño experimental que se ha

seguido para su estudio.

3.2.1 MODELO DE ARTROSIS INDUCIDA POR LA INYECCIÓN

INTRAARTICULAR DE COLAGENASA EN RATÓN BALB/C

El primer modelo animal de artrosis estudiado fue el de artrosis inducida

por inyección intraarticular de colagenasa, para el cual empleamos ratones Balb/c

(Harlan, Europa).

Se emplearon un total de 21 ratones balb/c hembras de 10 semanas de

edad, a los cuales se les realizaron 2 inyecciones intraarticulares en los días –1 y

–3 en la rodilla izquierda únicamente, dejando la rodilla derecha libre del enzima

para control del estado de la rodilla no artrósica de la misma edad.

Se inyectaron las rodillas izquierdas con 1,25U de colagenasa tipo VII

procedente de Clostridium histolyticum en 10 µl de suero fisiológico estéril, en

cada una de las dosis. Anestesiado el ratón con isoflurano inhalatorio, y una vez

rasurada la rodilla, se procede a la inyección intraarticular para la cual se empleó

una jeringa Hamilton de 10 µl (701LT) tipo “luer tip” usando una aguja biselada

de 26G. La inyección intraarticular se realiza atravesando el ligamento principal

con la aguja manteniendo la rodilla del ratón flexionada unos 15º y realizando una

Material y métodos

53

palpación continua de las estructuras de la articulación para evitar dañar el

cartílago articular con la aguja.

3.2.1.1 Diseño experimental

Para realizar un seguimiento de la progresión de la artrosis en este modelo

experimental, los ratones se sacrificaron a diferentes tiempos, como muestra la

figura 14, y se les realizó extracción de sangre a tiempo final para realizar el

control de biomarcadores de degradación de cartílago. Las rodillas (inyectadas y

no inyectadas) se seccionaron con un costótomo y se prepararon para el posterior

estudio histológico.

En este caso compararemos la progresión de la artrosis que se desarrolla en

la rodilla inyectada con colagenasa, a los tres tiempos estudiados, con las rodillas

sin inyectar, que no deben desarrollar la patología.

3.2.2 MODELO DE DESARROLLO ESPONTÁNEO DE LA ARTROSIS

EN RATÓN STR/ort.


7

7

7

Balb/c1 día

21 días

36 días

Figura 14: Esquema de la distribución de los grupos de ratones Balb/c para el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular.

7

7

7

Balb/c1 día

21 días

36 días

7

7

7

Balb/c1 día

21 días

36 días

Figura 14: Esquema de la distribución de los grupos de ratones Balb/c para el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular.

Material y métodos

54

Para el estudio del proceso artrósico en el modelo de desarrollo espontáneo

de la enfermedad se utilizaron 40 ratones macho STR/ort de 7 semanas de edad

que fueron repartidos en 4 grupos de 10 animales, que se sacrificaron a diferentes

tiempos (7, 9, 11 y 15 semanas de edad) según recoge la figura 15, con la

finalidad de estudiar los posibles cambios bioquímicos y anatomopatológicos que

ocurren durante la progresión de la artrosis. Como animales control de la misma

edad y sexo pero sin la capacidad de desarrollar la artrosis, se utilizaron 20 ratones

macho CBA de 7 semanas de edad.

A todos los animales se les realizó una extracción de sangre cada 15 días

por punción en el plexo submandibular con la finalidad de estudiar en suero

posibles biomarcadores de la enfermedad y mediadores inflamatorios

5 10

5 10

5 10

5 10

CBA STR/ort7 semanas

9 semanas

11 semanas

15 semanas

Figura 15: Esquema de la distribución de los grupos de ratones CBA y STR/ort para el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.

5 10

5 10

5 10

5 10


9 semanas

11 semanas

15 semanas

5 10

5 10

5 10

5 10


9 semanas

11 semanas

15 semanas

Figura 15: Esquema de la distribución de los grupos de ratones CBA y STR/ort para el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.

edad(semanas)

7 9 11 13 15

PesarExtracción sangreSacrificio (7 semanas)

Pesar


PesarPesarExtracción sangreSacrificio (15 semanas)

Pesar


Pesar

PesarExtracción sangre

Figura 16: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.

edad(semanas)

7 9 11 13 15


Pesar



Pesar


Pesar


edad(semanas)

7 9 11 13 15


Pesar



Pesar


Pesar


Figura 16: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.

Material y métodos

55

característicos de la patología degenerativa. Todos los animales fueron pesados

semanalmente. El esquema del plan de trabajo seguido se resume en la figura 16.

3.2.2.2 Estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP)

y BIS069 en el modelo de artrosis espontánea en ratón STR/ort

Para el estudio de los efectos de los fármacos SnPP y BIS069 sobre el

desarrollo de la artrosis en el modelo animal de desarrollo espontáneo de la

enfermedad se utilizaron 74 ratones macho STR/ort (Harlan, Europa) de 7

semanas de edad. Los animales se distribuyeron según indica la figura 17. El

primer grupo de 10 ratones STR/ort se sacrificó a tiempo 0 (7 semanas de edad)

para obtener los datos de los animales antes de comenzar el experimento. A los

grupos de ratones STR/ort, de 17 ratones cada uno, que recibieron los tratamientos

se les administró diariamente durante 4 semanas los fármacos en estudio.

Figura 17: Esquema de la distribución de los grupos de ratones STR/ort para el estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 administrados durante 4 semanas sobre la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.

10

17

17

10

10

10

Sacrificados a tiempo 0

Administración intraperitoneal SnPP(12 mg/Kg/día)

Administración oral BIS069 ( 80 mg/Kg/día)

Administración intraperitoneal 1%DMSO+suero fisiológico

Administración oralagua

Animales sin tratar

Nº animales

Figura 17: Esquema de la distribución de los grupos de ratones STR/ort para el estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 administrados durante 4 semanas sobre la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.

10

17

17

10

10

10






Animales sin tratar

Nº animales

10

17

17

10

10

10






Animales sin tratar

Nº animales

Material y métodos

56

La administración de SnPP se realizó por vía intraperitoneal a la dosis de

12 mg/Kg/día, inyectando 0,2 ml por administración diaria. La protoporfirina se

preparó diariamente en 1% de dimetil sulfóxido (DMSO) en suero fisiológico

estéril. Para conseguir una suspensión fina y homogénea es necesario sonicar el

preparado durante una hora.

El fármaco BIS069 se administró por vía oral a la dosis de 80 mg/Kg/día

en un volumen de 0,2 ml de agua corriente en cada administración. La dosis se

preparó diariamente en la misma agua con la que se les mantiene estabulados.

Los grupos “vehículo”, de 10 ratones STR/ort cada uno, recibieron durante

4 semanas los vehículos en los que se encontraban disueltos los fármacos. En un

caso se administró intraperitonealmente 1% de DMSO en suero fisiológico estéril

y en el otro 0,2 ml por vía oral de agua corriente, para someterlos a la misma

manipulación y estrés que a los animales del grupo tratado.

Por último, existe otro grupo de 10 animales, los ratones “control” a los

cuales no se les administra ninguna sustancia y se utilizarán como control del

desarrollo espontáneo de la enfermedad.

Los animales fueron pesados semanalmente como control del estado de

bienestar y se les realizó extracción de sangre por punción en el plexo

submandibular cada 15 días siguiendo el plan de trabajo descrito en la figura 18.

Material y métodos

57

BIS069 (80 mg/Kg/día) oral

edad(semanas)

7 8 9 10 11


PesarPesarExtracción sangre

PesarPesarExtracción sangreSacrificio

Figura 18: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 sobre la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.

SnPP (12 mg/Kg/día) i.p.

BIS069 (80 mg/Kg/día) oral

edad(semanas)

7 8 9 10 11




edad(semanas)

7 8 9 10 11




Figura 18: Esquema del plan de trabajo seguido para realizar el estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 sobre la progresión de la artrosis en el modelo de desarrollo espontáneo en ratones STR/ort.

SnPP (12 mg/Kg/día) i.p.

Material y métodos

58

3.2.3 MODELO DE ARTROSIS PROVOCADA POR LA TRANSECCIÓN

DEL LIGAMENTO CRUZADO ANTERIOR EN RATA WISTAR

Para la preparación de la cirugía, los

animales fueron anestesiados en un ambiente estéril

con isoflurano inhalatorio a la dosis de 1,5 C.A.M.

(Concentración Alveolar Mínima) y el grado de

anestesia se evaluó controlando la respuesta refleja

(fig 19). Se les administró Butorfanol subcutáneo a

la dosis de 2 mg/Kg como analgésico, antes de

comenzar la cirugía. Una vez anestesiadas las ratas

se les rasuró la rodilla a operar y con povidona

yodada se desinfectó el campo quirúrgico. Para

facilitar la cirugía se utilizó una lupa binocular

previamente limpiada con etanol.

La incisión de

la piel, de unos 10mm,

se realiza con bisturí

por la cara interna de la

articulación y en

paralelo al ligamento

principal (fig 20A). A

continuación, se realiza

una disección roma de

la piel y se accede a la

Figura 19: Aparato de anestesia inhalatoria del Servei Central de Suport a la Investigació (SCIE) de la Universitat de València utilizado para realizar la cirugía.

Figura 19: Aparato de anestesia inhalatoria del Servei Central de Suport a la Investigació (SCIE) de la Universitat de València utilizado para realizar la cirugía.

A

B

Figura 20: Fotografías de los procedimientos quirúrgicos de la ACLT. A: se realiza una incisión en la piel; B: a la cápsula articular se accede por una incisión de unos 3 mm lateral al ligamento principal.

A

B

AA

BB

Figura 20: Fotografías de los procedimientos quirúrgicos de la ACLT. A: se realiza una incisión en la piel; B: a la cápsula articular se accede por una incisión de unos 3 mm lateral al ligamento principal.

Material y métodos

59

cápsula articular por una incisión de 4 mm junto al ligamento principal sin dañar

ninguna de sus fibras (fig 20B). El tejido sinovial se pinza junto con la rótula con

el fin de dejar al descubierto la cavidad articular (fig 21A).

A B

C

Figura 21: Fotografías tomadas a través de la lupa binocular que muestran losprocedimientos quirúrgicos de la ACLT. A: con ayuda de los separadores se abre lacápsula articular; B: con un separador de microcirugía se aísla el ligamento cruzadoanterior para seccionarse con una aguja hipodérmica; C: se comprueba que el ligamentocruzado anterior ha quedado seccionado.

Material y métodos

60

Con un separador de microcirugía

se procede a aislar el ligamento cruzado

anterior para ser seccionado completamente

con el bisel de una aguja hipodérmica de

25G 5/8’ (fig 21B)’. Tras comprobar que la

transección del ligamento ha sido completa

(fig 21C), se procede a suturar la cápsula

articular con 3 puntos de cirujano con

suturas de ácido poliglicólico de 4/0 y,

posteriormente, se sutura la piel con suturas

de 3/0 (fig 22). La cicatriz se limpia con

povidona yodada y se retira la anestesia

inhalatoria. A las ratas se les mantiene

sobre una manta calefactora hasta que

recobran completamente la movilidad. Se limpiaron las heridas con povidona

yodada durante los tres días posteriores a la operación.


Para el estudio de la progresión de la artrosis en el modelo que nos ocupa

en este apartado, se utilizaron 25 ratas Wistar macho (Harlan, Europa) de 150 g

que fueron repartidas en 3 grupos antes de ser operadas (fig 23).

La transección del ligamento cruzado anterior se realizó únicamente de la

rodilla derecha de los animales. A 4 animales de cada grupo de estudio se les

realizaron en las rodillas izquierdas operaciones simuladas donde se anestesiaba a

los animales, se les administraba la analgesia, se realizaba la incisión de la piel, la

de la cápsula articular y una vez se dejaba al descubierto el ligamento cruzado

Figura 22: Fotografía de losprocedimientos quirúrgicos de laACLT. Se sutura por capas con suturasde ácido poliglicólico.

Material y métodos

61

anterior para ser seccionado, se suturaba por capas y se mantenía al animal sobre

la manta calefactora hasta que estuviera completamente despierto.

Las ratas se estabularon de dos en dos para asegurar la libre movilidad de

los animales, con comida y bebida ad libitum hasta el momento de su sacrificio.

Para el estudio de la progresión de la enfermedad, un grupo de 5 animales

fue sacrificado a las 24 horas tras la cirugía, considerándolo como tiempo 0. Otro

grupo de 10 animales fue sacrificado a las 6 semanas de la operación y al resto de

ratas se les mantuvo estabuladas hasta la décima semana postcirugía.

Antes de ser sacrificadas, las ratas se anestesiaron con isoflurano, y se les

realizó una extracción de sangre por punción cardiaca. Posteriormente, aún

anestesiadas con isoflurano se sacrificaron por dislocación cervical. Todos los

animales fueron pesados semanalmente.

5

10

10

Ratas operadas ACLT. t 0 (24h)

Ratas operadas ACLT. t 6 semanas


Nº animales

Figura 23: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar para el estudio de la progresión de la enfermedad en el modelo de artrosis inducida por la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT).

5

10

10




Nº animales

5

10

10




Nº animales

Figura 23: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar para el estudio de la progresión de la enfermedad en el modelo de artrosis inducida por la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT).

Material y métodos

62

3.2.3.2 Estudio de los efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP)

y BIS069 en el modelo de artrosis provocada por la transección del ligamento

cruzado anterior en rata Wistar

A 30 ratas Wistar se les realizó la cirugía de la transección del ligamento

cruzado anterior con el fin de provocar el desarrollo de la artrosis en la rodilla

operada. Tras una semana de recuperación postcirugía, en la cual se les realizaron

las curas necesarias para una correcta cicatrización, comenzó el tratamiento.

Como describe la figura 24, un grupo de 10 ratas operadas recibió SnPP,

otro grupo de 10 ratas recibió el tratamiento con BIS069 y 10 ratas Wistar

operadas se reservaron como grupo control.

Todos los animales se estabularon de dos en dos para facilitar su libre

movilidad durante las 10 semanas que duró el experimento, con comida y bebida

ad libitum.

La administración diaria de la protoporfirina se realizó durante 10 semanas

a la dosis de 12 mg/Kg/día intraperitonealmente. SnPP se preparó diariamente

siguiendo el mismo protocolo que se siguió en el experimento de los ratones

10

10

10

Ratas control (ACLT)

Ratas ACLT. Administración intraperitoneal SnPP (12 mg/Kg/día) durante 10 semanas

Ratas ACLT. Administración oral BIS069 (90 mg/Kg/día) durante 10 semanas

Nº animales

Figura 24: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) para el estudio de los efectos de los fármacos SnPP y BIS069 sobre la progresión de la artrosis en el modelo de ACLTen rata Wistar.

10

10

10

Ratas control (ACLT)

Ratas ACLT. Administración intraperitoneal SnPP (12 mg/Kg/día) durante 10 semanas

Ratas ACLT. Administración oral BIS069 (90 mg/Kg/día) durante 10 semanas

Nº animales

Figura 24: Esquema de la distribución de los grupos de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) para el estudio de los efectos de los fármacos SnPP y BIS069 sobre la progresión de la artrosis en el modelo de ACLTen rata Wistar.

Material y métodos

63

STR/ort.

Al otro grupo de tratamiento de 10 ratas Wistar operadas se les administró

BIS069 diariamente vía oral a la dosis de 90 mg/Kg/día. La solución se preparó

diariamente siguiendo el mismo protocolo que en el experimento con los ratones

STR/ort.

Los animales fueron pesados semanalmente.

Al finalizar el experimento, tras ser anestesiadas con isoflurano inhalatorio

se les realizó una extracción de sangre por punción intracardiaca. A continuación,

fueron sacrificadas por dislocación cervical. A todos los animales se les

amputaron las rodillas (tanto operadas como no operadas), que se destinaron al

estudio histológico y al estudio de biomarcadores de degradación de cartílago y

mediadores inflamatorios.

3.3 PROCESADO DE MUESTRAS

3.3.1. Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular en ratón

Balb/c. Estudio de la evolución de la artrosis

En el estudio de la progresión de la artrosis por inyección intraarticular en

ratones balb/c, los animales se desangran por punción cardiaca bajo anestesia

inhalatoria con isoflurano, justo antes de ser sacrificados por dislocación cervical.

A todos los animales del estudio se les seccionan las rodillas con un costótomo,

tanto las inyectadas como las no inyectadas, y se fijan inmediatamente en

paraformaldehido al 4% en PBS. Posteriormente, se inicia el proceso de inclusión

de las muestras en parafina para realizar el estudio histológico.

Material y métodos

64

3.3.2 Modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratón STR/ort

3.3.2.1 Estudio de la evolución de la artrosis

En el momento del sacrificio los ratones se desangran por punción

cardiaca y posteriormente se les somete a una dislocación cervical. Las patas se

diseccionan inmediatamente con un costótomo, se limpian en suero fisiológico a

4ºC, y, tras ser radiografiadas, las patas derechas se congelan a –80ºC para

posteriormente homogeneizarlas y medir mediante western blot, ELISA y

radioinmunoensayo diferentes marcadores de la enfermedad; las patas izquierdas

se fijan en paraformaldehido al 4% en PBS para su posterior estudio histológico e

inmunohistoquímico. En la figura 25 se esquematiza el proceso que siguen las

muestras obtenidas a partir de los ratones STR/ort.

- Patas Radiografías

-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero ELISA

Radioinmunoensayo

-Pata izquierda

-Pata derecha

Histología

Homogenado

InmunohistoquímicaTinciones químicas

ELISARadioinmunoensayoWestern blot

Figura 25: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de los ratones STR/ort tras su sacrificio. El diagrama muestra los destinos que siguen cada una de las muestras para su posterior análisis y estudio.

- Patas Radiografías


Radioinmunoensayo

-Pata izquierda

-Pata derecha

Histología

Homogenado

InmunohistoquímicaTinciones químicas


- Patas Radiografías- Patas Radiografías


Radioinmunoensayo-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero ELISA

RadioinmunoensayoELISARadioinmunoensayo

-Pata izquierda

-Pata derecha

-Pata izquierda

-Pata derecha

Histología

Homogenado

Histología

Homogenado

Histología

Homogenado

InmunohistoquímicaTinciones químicasInmunohistoquímicaTinciones químicas



Figura 25: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de los ratones STR/ort tras su sacrificio. El diagrama muestra los destinos que siguen cada una de las muestras para su posterior análisis y estudio.

Material y métodos

65

3.3.2.2 Efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069

Los ratones STR/ort, tras 4 semanas de tratamiento con SnPP (12

mg/Kg/día) y con BIS069 (80 mg/Kg/día), se sacrifican por dislocación cervical

tras una extracción de sangre por punción cardiaca. La distribución de las

muestras para su posterior estudio es el que indica la figura 25 también. Las

rodillas de los ratones se diseccionan inmediatamente con un costótomo. Se

elimina la piel y se limpian las muestras en suero fisiológico a 4ºC.

Las rodillas derechas se van a homogeneizar y, por tanto, se congelan a –

80ºC para su posterior procesamiento y, las rodillas izquierdas se introducen en

paraformaldehído al 4% en PBS a 4ºC, comenzando así el proceso de inclusión en

parafina para el estudio histológico.

Las rodillas izquierdas, una vez fijadas se radiografían para obtener un

control del progreso de la enfermedad.

3.3.3 Modelo de artrosis por transección del ligamento cruzado anterior en

rata Wistar

3.3.3.1 Estudio de la evolución de la artrosis

A las ratas anestesiadas con isoflurano se les realizó una extracción de

sangre por punción intracardiaca y, posteriormente, se les sacrificó por

dislocación cervical. Inmediatamente tras su sacrificio, se diseccionaron las patas

con un costótomo para su posterior procesado. Las patas de la mitad de los

animales de cada grupo (operadas y no operadas) se destinan a estudio histológico

e inmunohistoquímico, por tanto se fijan directamente en paraformaldehido al 4%

en PBS para su posterior inclusión en parafina. Las patas de la otra mitad de los

animales de cada grupo se destinan a la determinación de mediadores en el

Material y métodos

66

homogenado, por tanto, se congelan inmediatamente a –80ºC. Los 4 animales a

los cuales se les realizó la operación simulada en la rodilla izquierda fueron

distribuidos al azar entre el grupo de animales destinados a histología y los

destinados a estudios de expresión proteica y determinación de mediadores, según

indica el esquema de la figura 26.

3.3.3.2 Efectos de los fármacos estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069

Para realizar el estudio de los posibles efectos de las moléculas a estudio

sobre el modelo de artrosis por ACLT en rata Wistar, las muestras obtenidas de

dichos animales se distribuyen como indica la figura 26 .

Inmediatamente tras su sacrificio, se diseccionan las patas (operadas y no

operadas) con un costótomo para su posterior procesado. Las patas de la mitad de

los animales de cada grupo (operadas y no operadas) se destinan a estudio

histológico e inmunohistoquímico, por tanto se fijan directamente en

paraformaldehido al 4% en PBS para su posterior inclusión en parafina. Las patas

de la otra mitad de los animales de cada grupo se van a homogeneizar, por tanto,

se congelan inmediatamente a –80ºC.

Material y métodos

67

3.4 TÉCNICAS EMPLEADAS

3.4.1 Estudio radiológico

Las rodillas de todos los ratones, una vez eliminada la piel se fijan en

paraformaldehído al 4% en PBS a 4ºC, como ya se ha mencionado. Las rodillas de

todos los animales se radiografían en posición lateral sobre una placa radiológica

a una distancia de 90 cm de la fuente de rayos X. El análisis radiográfico de las

patas artrósicas se realizó con un aparato de rayos X (Univet LX160, Multimage,

Italy) con KW de exposición durante 0,01s.


Radioinmunoensayo

- Patas

- Pata izquierda

-Pata derecha OPERADA

SIN OPERAR

OPERACIÓN SIMULADA

Histología

Homogenado

Figura 26: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de las ratas Wistar sometidas a ACLT tras su sacrificio. El diagrama muestra los destinos que siguen cada una de las muestras para su posterior análisis y estudio.


Radioinmunoensayo

- Patas

- Pata izquierda


SIN OPERAR

OPERACIÓN SIMULADA

Histología

Homogenado


Radioinmunoensayo-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero-Extracción de sangre porpunción intracardíaca Suero ELISA

RadioinmunoensayoELISARadioinmunoensayo

- Patas

- Pata izquierda


SIN OPERAR

OPERACIÓN SIMULADA

- Patas

- Pata izquierda

-Pata derecha OPERADAOPERADA

SIN OPERAR

OPERACIÓN SIMULADA

SIN OPERAR

OPERACIÓN SIMULADA

Histología

Homogenado

Histología

HomogenadoHomogenado

Figura 26: Esquema del procesado de las muestras obtenidas de las ratas Wistar sometidas a ACLT tras su sacrificio. El diagrama muestra los destinos que siguen cada una de las muestras para su posterior análisis y estudio.

Material y métodos

68

3.4.2 Estudio histológico

El estudio histológico de la progresión de la enfermedad en cada uno de

los modelos animales se llevó a cabo siguiendo el sistema de evaluación de la

histopatología del cartílago artrósico descrita por la OARSI (Osteoarthritis

Research Society International) (Pritzker et al., 2006). Este sistema de evaluación

histopatológica de la artrosis se ha basado en el sistema de puntuación histológica

desarrollado por Mankin en 1971 (Mankin et al., 1971). El Sistema Mankin ha

sido revisado y modificado por muchos autores, ya que se ha cuestionado la

reproducibilidad y validez de este método (Ostergaard et al., 1997; Ostergaard et

al., 1999). Por ello, en el año 1998 un grupo de expertos de la OARSI estableció

un nuevo sistema de evaluación histopatológica basándose en los conocimientos

sobre la enfermedad que existían hasta el momento. Por razones prácticas, se

decidió concentrar el sistema de puntuación en un único tejido diana, el cartílago

articular.

En el sistema de evaluación de la histopatología del cartílago artrósico de

la OARSI se evalúan 3 parámetros (Pritzker et al., 2006):

El grado se define como la progresión de la enfermedad en la profundidad

del cartílago. Es un índice de la severidad de la progresión del proceso artrósico.

Este parámetro asume que la afectación de las capas más profundas del cartílago

implica un estadio más avanzado de la enfermedad y es un buen indicador del

desarrollo de la artrosis. Los grados se clasifican del 0-6 donde 0 indica un

cartílago ausente de características artrósicas. Los grados 1-4 implican una

afectación únicamente del cartílago articular, mientras que los grados 5 y 6 poseen

el hueso subcondral también afectado. Los grados se pueden subdividir en

subgrados según las características y los gráficos que se muestran en las figuras

27 y 28.

Material y métodos

69

Figura 27: Grados del sistema de evaluación de la histopatología del cartílago artrósico de la OARSI.

El estadio representa la proporción de la superficie articular afectada por

la artrosis comparada con la superficie total del cartílago articular. La progresión

de la artrosis se inicia por una lesión focal provocada en la zona de la superficie

del cartílago articular que sufre la mayor parte de las fuerzas mecánicas. Pero con

el avance de la enfermedad, las lesiones artrósicas van ocupando toda la superficie

articular hasta que todo el cartílago articular se ve afectado. Los estadios se

clasifican del 0-4, donde el estadio 0 representa un cartílago sin ninguna zona

dañada y el 4 supone más de un 50% de la superficie articular dañada (fig. 29).

DeformaciónRemodelación ósea

6.0 Osteofitos marginales6.5 Osteofitos marginales y centrales

GRADO 6

UlceraciónAparición de cartílago calcificado

5.0 Superficie ósea intacta5.5 Presencia de tejido reparador

GRADO 5

Pérdida de matriz del cartílagoPérdida de porciones de ME profunda

4.0 Exfoliación superficial4.5 Excavación de las capas medias

GRADO 4

Fisuras verticalesNuevas formaciones de colágeno

3.0 Fisuras simples3.5 Fisuras ramificadas

GRADO 3

Superficie discontinua Desorientación de las columnas de las lagunas condrocitarias

2.0 Fibrilación superficial2.5 Abrasión superficial con pérdida de matriz

extracelular

GRADO 2

Superficie intactaProliferación celular (clusters)

1.0 Células intactas1.5 Muerte celular

GRADO 1

Superficie intactaCartílago intacto

No hay subgradosGRADO 0

CRITERIOSUBGRADO

DeformaciónRemodelación ósea

6.0 Osteofitos marginales6.5 Osteofitos marginales y centrales

GRADO 6

UlceraciónAparición de cartílago calcificado

5.0 Superficie ósea intacta5.5 Presencia de tejido reparador

GRADO 5

Pérdida de matriz del cartílagoPérdida de porciones de ME profunda

4.0 Exfoliación superficial4.5 Excavación de las capas medias

GRADO 4

Fisuras verticalesNuevas formaciones de colágeno

3.0 Fisuras simples3.5 Fisuras ramificadas

GRADO 3

Superficie discontinua Desorientación de las columnas de las lagunas condrocitarias

2.0 Fibrilación superficial2.5 Abrasión superficial con pérdida de matriz

extracelular

GRADO 2

Superficie intactaProliferación celular (clusters)

1.0 Células intactas1.5 Muerte celular

GRADO 1

Superficie intactaCartílago intacto

No hay subgradosGRADO 0

CRITERIOSUBGRADO

Material y métodos

70

Grado 1.0 Grado 1.5 Grado 2.0 Grado 2.5

Grado 3.5Grado 3.0 Grado 4.0 Grado 4.5

Grado 5.5Grado 5.0 Grado 6.0 Grado 6.5

Grado 0

Figura 28: Esquema de los grados de degradación del cartílago según el sistema de evaluación histopatológica del cartílago artrósico descrito por la OARSI. Esquema modificado de Pritzker et al., 2006.

Material y métodos

71

Figura 29: Descripción de los estadios del sistema de

evaluación de la histopatología del cartílago

artrósico de la OARSI.

La puntuación del estado de la

articulación tras este estudio de la

histología de articulación se obtiene de la

fórmula: puntuación = grado x estadio.

Este sistema de puntuación establece un

rango de afectación entre 0-24, donde 0 corresponde a una articulación libre de

características de artrosis y 24 el estado más avanzado de la enfermedad (más del

50% de la superficie articular se encuentra afectada en un grado 6).

Por tanto, todos los estudios histológicos llevados a cabo en la presente

Tesis se calificarán como GnEn (grado n, estadio n) y Pn (puntuación n) siguiendo

los criterios establecidos por la OARSI y mencionados anteriormente.

3.4.2.1 Inclusión de las articulaciones en parafina

Las patas de los animales se diseccionan, como ya se ha comentado

anteriormente, con un costótomo y las articulaciones de los animales se aíslan en

primer lugar eliminando la piel y cortando la tibia y el fémur a unos 5mm de la

articulación. En el caso de la articulación de rata se disecan los restos de tejido

muscular de forma que el hueso quede lo más aislado posible. Se fija la

articulación en paraformaldehido al 4% en PBS a 4ºC durante una semana. La

descalcificación del hueso se realiza con una incubación en Osteosoft en agitación

a temperatura ambiente durante 8 días en el caso de los ratones y de 12 días en el

caso de las ratas. Los restos del descalcificante se eliminan con una serie de

lavados con PBS en agitación a temperatura ambiente. El tejido se deshidrata con

> 50 %ESTADIO 4

25 – 50 %ESTADIO 3

10 – 25 %ESTADIO 2

< 10 %ESTADIO 1

No se observa actividad artrósica

ESTADIO 0

% DE AFECTACIÓN

> 50 %ESTADIO 4

25 – 50 %ESTADIO 3

10 – 25 %ESTADIO 2

< 10 %ESTADIO 1

No se observa actividad artrósica

ESTADIO 0

% DE AFECTACIÓN

Material y métodos

72

alcoholes de concentración creciente (30%, 50%, 70%, 95%, 100%) en agitación

y en hielo para evitar el endurecimiento de la muestra. Una vez deshidratada

completamente la muestra, se procede a los baños de tolueno en agitación a

temperatura ambiente. Se realizan cambios de tolueno hasta que el tejido queda

completamente transparente y en ese momento se transfiere la articulación a un

primer baño de parafina durante una noche para que se evaporen los restos de

tolueno que puedan quedar en la muestra y entonces, se cambia la muestra a un

segundo baño de parafina nueva, libre de tolueno. En esta parafina se pueden

almacenar en forma sólida las muestras hasta su fundición y encastrado en

bloques para ser cortados en el microtomo. El estudio histológico se realizó

utilizando el microscopio Nikon Eclipse E600FN (Nikon Instruments).

3.4.2.2 Tinciones químicas

Las tinciones químicas de los cortes parafinados de rodillas permiten

observar la estructura microscópica de las mismas, así como evaluar el grado de

afectación de la superficie articular a lo largo de la progresión de la enfermedad.

3.4.2.2.1 Eosina/hematoxilina

Los cortes de 5 µm se desparafinan con xileno y posteriormente las

muestras se rehidratan con una batería de etanoles decreciente (100%, 95%, 70%,

50%, 30%, agua destilada). El tejido articular se tiñe con hematoxilina durante 1

minuto y tras lavar abundantemente los restos de hematoxilina con agua corriente

se tiñen los citoplasmas con eosina al 1% durante 10 segundos. Los cortes se

lavan cuidadosamente hasta eliminar todos los restos de tinción y se deshidratan

de nuevo con diferentes baños en etanol de graduación creciente. Tras el baño con

Material y métodos

73

etanol absoluto, los cortes se lavan con xileno y se montan con el medio de

montaje no acuoso DPX.

3.4.2.2.2 O-safranina

Los cortes se desparafinan y rehidratan con xileno y posteriormente las

muestras se rehidratan con una batería de etanoles decreciente (100%, 95%, 70%,

50%, 30%, agua destilada). Las muestras se tiñen con O-safranina al 0,1% durante

10 min. Posteriormente, los cortes se lavan con abundante agua ultrapura hasta

eliminar completamente los restos de tinción y seguidamente se procede a

deshidratar los cortes para poder realizar el montaje de las preparaciones con el

medio de montaje no acuoso DPX.

La O-safranina permite observar la concentración de proteoglicanos de la

matriz del cartílago siendo la intensidad de coloración proporcional a la cantidad

de proteoglicanos presentes en el cartílago articular.

3.4.2.3 Inmunohistoquímica

Los cortes, en primer lugar, se desparafinan con 2 baños de xileno de 5

minutos. Una vez desparafinados, se procede a la rehidratación del tejido con una

batería de baños de etanol de concentración decreciente de 5 minutos cada uno,

desde el alcohol absoluto al agua destilada. Posteriormente, los cortes se lavan tres

veces con PBS (5 minutos cada vez). Se procede a inactivar la peroxidasa

endógena con una incubación de 10 minutos con 1 gota del agente comercial para

bloquear la peroxidasa. Se lavan los restos de agua oxigenada con 3 lavados de 5

minutos con PBS para posteriormente bloquear el tejido con suero de cabra

diluido 1:10 en PBS durante 15 min. El bloqueo se elimina con PBS-Tween 20.

Material y métodos

74

Los anticuerpos primarios utilizados se diluyen en PBS-Tween 20 a la

dilución recomendada por el fabricante y se incuban durante 2 horas a temperatura

ambiente. Tras la incubación con el anticuerpo primario los cortes se lavan con

PBS-Tween20 abundantemente. Los anticuerpos secundarios utilizados están

biotinilados y son específicos en cada caso para los anticuerpos primarios. Se

utilizan diluidos a 1:250 en PBS-Tween 20, y tras una incubación de 30 min a

temperatura ambiente, se lavan de nuevo los cortes con PBS-Tween 20. Con la

finalidad de potenciar la señal se incuban los cortes con avidina/peroxidasa

diluida 1:1000 en PBS-Tween 20 durante 30 min. Nuevamente se lavan los restos

de avidina y se incuban las preparaciones con el sustrato DAB en oscuridad

durante 10-20 minutos. Una vez los cortes han desarrollado color se lavan con

agua destilada abundantemente hasta eliminar completamente el sustrato y se

contrastan los núcleos con hematoxilina diluida 1:10 en agua destilada durante

10s. Se lavan finalmente los cortes con agua corriente y se montan las

preparaciones con un medio de montaje acuoso.

3.4.3 Estudio de mediadores

Para realizar el estudio de mediadores, tanto inflamatorios como de

degradación articular, cada tipo de muestra biológica debe ser procesada de forma

que se obtengan los concentrados de proteínas y componentes celulares donde

posteriormente se podrán realizar mediciones de diferentes marcadores de la

progresión de la artrosis.

Material y métodos

75

3.4.3.1 Homogeneización de rodillas de animales de experimentación

3.4.3.1.1 Rodillas de ratones STR/ort y ratones balb/c

El protocolo de homogeneización de patas de ratón se resume en la figura

30. Tras el sacrificio del animal, las patas son congeladas a –80ºC hasta su

utilización. Una vez descongeladas, se trabaja sobre hielo para evitar la

degradación de los tejidos. A las patas se les elimina cuidadosamente la piel y las

uñas antes de ser cortadas con tijeras en fragmentos de menor tamaño y

transferidas a tubos cónicos de vidrio pyrex. A los fragmentos obtenidos se les

añade 1 ml de tampón de inhibidores a 4ºC para bloquear la actividad de las

proteasas presentes en el tejido y se homogeniza con un polytron en 3 ciclos de 10

segundos a 4ºC. El homogenado se centrifuga a 2500 rpm durante 10 minutos a

4ºC. El sobrenadante resultante se alícuota en tubos Eppendorf que serán

congelados a –80ºC.

Material y métodos

76

Tejidodisgregado

1 ml Tampón deinhibidores Homogeneizar

3 x 10 seg.Centrifugar 2500 rpm 10 min

PROTEINA TOTAL

Sonicar 3 x 10 segCentrifugar 9000g 15 min

FRACCIÓN S9

Utracentrifugar100000 g90 min

FRACCIÓNCITOSÓLICA

FRACCIÓNMICROSOMAL

Resuspender el pelletcon 50µl de tampónde inhibidores

* Todo el proceso se realiza a 4ºC

Figura 30: Esquema del proceso seguido para la homogeneización de rodillas de ratones STR/ort y Balb/c. En el gráfico se describen los procedimientos seguidos para conseguir las diferentes fracciones proteicas a partir del tejido de animales para realizar posteriormente el estudio de biomarcadores de degradación del cartílago y de los mediadores inflamatorios implicados en el proceso artrósico.

Tejidodisgregado

1 ml Tampón deinhibidores

Tejidodisgregado

1 ml Tampón deinhibidores Homogeneizar

3 x 10 seg.Centrifugar 2500 rpm 10 min

PROTEINA TOTAL


FRACCIÓN S9



FRACCIÓNMICROSOMAL


Homogeneizar3 x 10 seg.Homogeneizar3 x 10 seg.

Centrifugar 2500 rpm 10 min

PROTEINA TOTAL



FRACCIÓN S9



FRACCIÓNMICROSOMAL


FRACCIÓN S9



FRACCIÓNMICROSOMAL


FRACCIÓN S9

FRACCIÓN S9





FRACCIÓNMICROSOMAL


FRACCIÓNMICROSOMAL


* Todo el proceso se realiza a 4ºC

Figura 30: Esquema del proceso seguido para la homogeneización de rodillas de ratones STR/ort y Balb/c. En el gráfico se describen los procedimientos seguidos para conseguir las diferentes fracciones proteicas a partir del tejido de animales para realizar posteriormente el estudio de biomarcadores de degradación del cartílago y de los mediadores inflamatorios implicados en el proceso artrósico.

Material y métodos

77

La fracción S9 de la proteína total del tejido se obtiene de sonicar las

alícuotas de sobrenadante durante 3 ciclos de 10 segundos en hielo, y

posteriormente se centrifuga a 9000 g durante 15 min a 4ºC.

3.4.3.1.2 Rodillas de rata Wistar

En el caso de las ratas Wistar sometidas a la cirugía de transección del

ligamento cruzado anterior no se podía utilizar el procedimiento seguido en el

caso de las rodillas de ratones para homogeneizar la articulación, debido a la gran

cantidad de tejido óseo del que se partía.

De igual forma que se realizó en el caso de los ratones, tras el sacrificio de

las ratas, las articulaciones se obtuvieron cortando el fémur y la tibia a unos 5 mm

de la articulación y, como se ha mencionado anteriormente, se diseccionaron los

músculos circundantes a la articulación. Las muestras de tejido se congelaron a

–80ºC inmediatamente.

Para la homogeneización de las articulaciones se utilizó un aparato de

pulverización a temperaturas criogénicas (Freezer/Mill G750). Las muestras se

disponen dentro de unos cilindros de plástico transparente equipados con unos

émbolos de acero inoxidable que golpearán contra los extremos del cilindro

también de acero inoxidable. Estos tubos con las muestras se introducen en el

aparato, quedando inmersas en nitrógeno líquido donde serán pulverizadas por

efecto del martilleo del émbolo.

El polvo resultante se extrae cuidadosamente de los cilindros y se

transfiere a un tubo cónico pyrex, donde se le añade 2 ml de tampón de

inhibidores y se agita vigorosamente en un vórtex para asegurar una mezcla

completa del tejido y el tampón. El homogenado obtenido se sonica a 4ºC en 3

ciclos de 10 seg. Nuevamente, se agita en un vórtex y se incuba 10 min a 4ºC. Los

Material y métodos

78

tubos se centrifugan a 2500 rpm durante 10 min a 4ºC y se recoge el

sobrenadante.

Como en el caso de las articulaciones de ratón, de la proteína total

obtenida de la homogeneización se extrae la fracción S9 por sonicación y

centrifugación a 9000g y de ésta las fracciones citosólica y microsomal por

ultracentrifugación. La proteína obtenida en cada fracción se cuantifica

igualmente siguiendo el método de Bradford.

3.4.3.2 Obtención de suero

La sangre de los animales se incuba en un baño a 37ºC en agitación

durante 30 min y posteriormente se centrifugan los tubos a 3000 rpm durante 15

min a 4ºC. El suero resultante se distribuye en alícuotas y se congela a –80ºC

para su posterior utilización.

3.4.4 Técnicas bioquímicas

3.4.4.1 Radioinmunoensayo (RIA)

La técnica de radioinmunoensayo está basada en la formación específica

de los complejos antígeno-anticuerpo. Combina la especificidad de las reacciones

inmunes con la sensibilidad de los métodos radioisotópicos y se puede usar para

cualquier sustancia que se comporte como antígeno, es decir, que sea capaz de

producir anticuerpos. Debido a la elevada especificidad de las uniones, esta

técnica se puede emplear para medir compuestos biológicos que se encuentren en

muy baja concentración indetectables por la técnica de ELISA. El RIA se basa en

la competición entre un antígeno no marcado (Ag) y una cantidad determinada del

antígeno marcado radiactivamente (Ag*), por los sitios de unión a un anticuerpo

Material y métodos

79

(Ac) a concentración fija, ya que ambos (Ag) y (Ag*) se comportan de igual

manera frente al anticuerpo. La curva de calibrado se realiza con cantidades

conocidas de antígeno libre y cantidades fijas de anticuerpo y antígeno marcado,

de esta forma se determina la cantidad de antígeno marcado unido al anticuerpo

respecto de la cantidad conocida de antígeno libre en cada caso.

Los tubos con las diferentes condiciones se preparan a temperatura

ambiente y en un lugar acondicionado para el trabajo con radiactividad. Todos los

puntos se preparan por duplicado, incluidos los tubos totales (radiactividad total),

los tubos NSB “non specific binding” (unión inespecífica) y los tubos B0 (unión

máxima específica). Tras la preparación de los tubos (cuadro) se agitan

vigorosamente y se incuban toda una noche a 4ºC. Posteriormente, se les añade el

carbón activo-dextrano a todos los tubos que lo requieran para precipitar el

complejo y se vuelven a agitar en un vórtex. Se incuban con el carbón activo-

dextrano 10 min a 4ºC antes de su centrifugación a 2200 rpm durante 15 min a

4ºC. Del sobrenadante obtenido de la centrifugación se transfieren 400 µl a un vial

de centelleo con 3 ml de líquido de centelleo (Optiphase, Wallac) preparado

recientemente (170 ml de Supermix + 830 ml de High Safe). La mezcla se agita

por inversión y las cuentas se miden en el contador de centelleo Microbeta Trilux

(Wallac, Turku, Finland). TUBO

Vol (µl)

TAMPÓN

A1

TAMPÓN

B1

MUESTRAS/

PATRÓN

Anti-

PGE2

PGE2

tritiado

CARBÓN ACTIVO-

DEXTRANO

TOTALES 400 100 NO NO 100 NO

NSB 200 100 NO NO 100 200

B0 100 100 100 100 100 200

PATRÓN NO 100 100 100 100 200

MUESTRA Completar 100 100 100 100 200

Material y métodos

80

3.4.4.2 Inmunodetección por Western blot

Las proteínas contenidas en la muestra se separan en geles de

poliacrilamida-SDS (dodecilsulfato sódico) mediante electroforesis donde se

obtienen bandas de proteína según su peso molecular. Las bandas de proteína, a su

vez, se transfieren a membranas que permiten su inmunodetección.

El protocolo comienza con la preparación de la muestra con una cantidad

conocida de proteína (30 µg) que se diluye 1:1 en tampón de muestra

desnaturalizante y se hierve durante 5 min. El porcentaje de acrilamida del gel

determina el tamaño del poro de la matriz por donde va a correr la mezcla de

proteínas, y por tanto el rango de proteínas que serán separadas más

eficientemente. Según el peso molecular de la proteína que se pretenda estudiar,

se escogerá un porcentaje u otro de acrilamida. Las bandas de proteína del gel se

transfieren a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF, Amersham), tras

ser activadas con metanol durante 30 segundos y posteriormente lavadas con agua

y tampón de transferencia. Una vez transferidas las bandas, la membrana se tiñe

con “solución Ponceau” durante 1 min para comprobar que la transferencia ha

sido completa. Tras lavar la membrana con PBS-Tween 20 (0,1%)

abundantemente, se bloquea con 3% de leche desnatada en polvo en PBS-Tween

20 durante toda una noche a 4ºC para luego ser lavadas con abundante PBS-

Tween 20 hasta eliminar los restos del bloqueo. Posteriormente, se procedió a la

inmunodetección de diferentes anticuerpos preparados en PBS-Tween 20 con 2%

BSA a la dilución indicada por el fabricante. Los anticuerpos secundarios

empleados fueron específicos para el primario a detectar y estaban marcados con

peroxidasa. La detección de la banda seleccionada se realizó por un sistema de

quimioluminiscencia intensificada con el reactivo de detección que contiene

luminol y peróxido de hidrógeno. La peroxidasa unida al anticuerpo secundario

Material y métodos

81

cataliza, en presencia del peróxido de hidrógeno, la oxidación del luminol

pasando éste a emitir quimioluminiscencia, que se detecta con un sistema

computerizado (UV Transiluminador, AutochemiTM System, UVP® Bioimaging

System) que registra la secuencia de imágenes del desarrollo del marcaje (García-

Segura et al., 1996).

3.4.4.3 Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)

La técnica de ELISA es utilizada para la detección de sustancias que

presentan propiedades antigénicas como son las proteínas o moléculas pequeñas

como la glucosa o el ácido hialurónico.

El antígeno a cuantificar se une a un anticuerpo específico al que se unirá,

por su región constante, un anticuerpo secundario. Este anticuerpo secundario

puede estar conjugado con un enzima capaz de catalizar una reacción

colorimétrica (ELISA directo) o, bien necesitar de una segunda incubación con el

enzima que proporcionará la reacción colorimétrica (ELISA indirecto)

El protocolo experimental habitual es, en un primer lugar realizar la

incubación del anticuerpo primario (o anticuerpo de recubrimiento) en la placa

multipocillo donde quedarán adheridos. Tras lavar la placa, habitualmente con

PBS, se bloquea con 2% BSA en PBS-Tween20. Una vez eliminados los restos de

PBS-BSA se procede a incubar la placa con el antígeno problema (suero,

homogeneizado). Los restos de muestra biológica se eliminan y los pocillos se

lavan de nuevo. Según el ELISA que se realice, se prosigue con la incubación del

anticuerpo secundario o con el conjugado de anticuerpo secundario y enzima. La

reacción colorimétrica se inicia cuando se incuba con el sustrato del enzima y se

mide la densidad óptica del producto originado en la reacción a la longitud de

onda apropiada en cada caso en un espectofotómetro (García-Segura et al., 1996)

Material y métodos

82

3.4.4.4 Inmunoensayo de biomarcadores por la técnica de Multiplex de

Luminex

La técnica del Multiplex se utilizó, en nuestro caso, para medir

osteocalcina y RANKL, marcadores del metabolismo óseo presentes en suero de

ratón STR/ort que se encuentran en proporciones indetectables para la técnica de

ELISA.

3.4.4.4.1 Fundamento de la técnica

Los inmunoensayos de biomarcadores Multiplex de Luminex® se basan en

la tecnología xMAP® la cual utiliza microesferas de poliestireno que contienen

distintas proporciones de dos fluorocromos en su interior que al ser excitadas por

el láser del citómetro de flujo emiten señales diferentes, siendo así posible separar

las distintas poblaciones de microesferas por composición de fluorocromos. Con

distintas proporciones de los dos fluorocromos que componen cada microesfera se

puede llegar a distinguir 100 grupos de éstas. La superficie de cada población de

microesferas está recubierta con un anticuerpo prefijado al cual se unirá el analito

a estudio. Posteriormente, se utiliza un anticuerpo secundario frente al analito

marcado con fluorescencia. La cuantificación de las moléculas a medir se realiza

basándose en los principios de la tecnología láser. Se utiliza un citómetro de 2

láseres donde uno, el rojo, discrimina las poblaciones de microesferas y el otro el

verde, discrimina intensidad de fluorescencia, siendo ésta proporcional a la

cantidad de analito unido a la microesfera.

3.4.4.4.2 Protocolo

Los sueros, antes de su utilización, se centrifugaron a 1000 g durante 10

min. Tras reconstituir todos los reactivos según las indicaciones del fabricante, se

Material y métodos

83

hidrató la placa con tampón durante 10 min y se eliminaron los restos de tampón

para proceder a poner la curva estándar, los controles de calidad internos y las

muestras de suero a estudio. A continuación se añade a cada pocillo la mezcla de

microesferas marcadas con los anticuerpos para la osteocalcina y el RANKL y el

anticuerpo secundario de detección. La placa se incuba durante toda una noche a

4ºC en agitación. Los pocillos se lavan 3 veces con el tampón de lavado,

eliminando los restos de tampón entre lavado y lavado por filtración por vacío. Se

añade a cada pocillo un volumen fijo de estreptavidina-ficoeritrina junto con un

cóctel comercial que contiene los anticuerpos de detección para cada microesfera

utilizada. Se incuba la placa durante 30 min en oscuridad y en agitación a

temperatura ambiente, y de nuevo se lavan los pocillos por filtración por vacío. Al

pocillo seco se le añaden 100 µl de líquido del sistema y, en oscuridad se agita

durante 10 min para resuspender las microesferas y asegurar una distribución

homogénea de éstas en el pocillo para, posteriormente introducir la placa en el

citómetro de flujo que aspira la mitad del volumen de la muestra y contará las

primeras 50 de las microesferas que pasen por el lector.

Material y métodos

84

4. RESULTADOS

Resultados

85

4. RESULTADOS

El grado de desarrollo de artrosis en cada uno de los modelos

experimentales se estudió tanto a nivel histológico como radiológico. Para evaluar

los daños ocasionados sobre el cartílago articular con la progresión de la

enfermedad, se empleó el sistema de evaluación histopatológica descrito por la

OARSI (Pritzker et al., 2006).

Posteriormente, se midieron variables importantes para el estudio de la

evolución de la enfermedad en cada uno de los modelos, como son los

biomarcadores de degradación del cartílago o los mediadores inflamatorios

implicados en el proceso artrósico.

La caracterización de la progresión de la enfermedad en cada uno de los

modelos experimentales desarrollados, nos permitió evaluar su posible utilidad

para testar los efectos de los fármacos SnPP y BIS069. Por tanto, aquellos

modelos que demostraron una buena reproducibilidad y representaban

características de la enfermedad suficientemente cuantificables como para poder

evaluar los efectos de los fármacos se emplearon en una segunda fase de

experimentos para realizar un estudio farmacológico de SnPP y BIS069.

Resultados. Modelo de artrosis inducida por colagenasa intraarticular

86

4.1 MODELO DE ARTROSIS INDUCIDA POR COLAGENASA

INTRAARTICULAR

4.1.1 DEGRADACIÓN ARTICULAR

En el modelo de la artrosis inducida por colagenasa, se provoca la

degradación del cartílago articular de forma local en sólo una de las rodillas del

animal, por tanto tenemos la posibilidad de comparar los efectos de la colagenasa

sobre la rodilla inyectada con el estado de la articulación en ausencia de la acción

del enzima.

En primer lugar evaluaremos el modelo para determinar las posibilidades

que presenta de cara a su posterior utilización en el testado de fármacos.

4.1.1.1 Estudio histológico

Como ya hemos mencionado en el apartado de material y métodos, el

estudio histológico se realizó únicamente en la articulación de la rodilla, a los

diferentes tiempos de supervivencia a los que se planteó el estudio.

Tinciones químicas

Cabe destacar, en primer lugar, que en una gran proporción de las rodillas

inyectadas con colagenasa no se observó, a ninguno de los tiempos estudiados,

ninguna degradación del cartílago concordante con la artrosis (G0E0; P0).

Únicamente algunos individuos desarrollaron una degradación articular con

alguna similitud a la encontrada en humanos, aunque con algunas diferencias que

más tarde comentaremos.

En la figura 31 observamos cortes histológicos teñidos con

eosina/hematoxilina de rodillas de ratón Balb/c transcurridos 8 días de la


87

inyección de colagenasa intraarticular. En las imágenes observamos, no sólo una

membrana sinovial (MS) desarrollada y rica en infiltrado celular como respuesta a

la agresión enzimática a la que se ha sometido la rodilla, sino que aparece una

zona del platillo tibial con una importante pérdida de componentes de la matriz

del cartílago debida a la acción de la colagenasa. También cabe destacar de la

figura 31A la formación de un osteofito periférico de grandes dimensiones (G6E1;

P6).

La formación del osteofito ha sido rápida, ya que en sólo 8 días la

actividad proliferativa de los condrocitos del cartílago articular ha dado como

fruto un osteofito marginal de considerables dimensiones, como respuesta a la

grave agresión que supone la actividad enzimática de la colagenasa. En la figura

Figura 31: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina a 10x (A) y 40x (B) de rodillas de ratones balb/c 8 días tras la inyección de colagenasa. A : se observa una leve pérdida de componentes de la matriz extracelular del cartílago y destaca la aparición de un osteofito (O) en desarrollo. La membrana sinovial (MS) se presenta desarrollada y con una importante infilt ración de células inflamatorias. B: En el osteofito en desarrollo se puede apreciar una activa pro liferación celu lar pero con una composición de la matriz extracelular pobre en proteoglicanos. Se distingue la capa más externa con un mayor número de condrocitos.

TIBIABA TIBIA

MS MS

O O

Figura 31: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina a 10x (A) y 40x (B) de rodillas de ratones balb/c 8 días tras la inyección de colagenasa. A : se observa una leve pérdida de componentes de la matriz extracelular del cartílago y destaca la aparición de un osteofito (O) en desarrollo. La membrana sinovial (MS) se presenta desarrollada y con una importante infilt ración de células inflamatorias. B: En el osteofito en desarrollo se puede apreciar una activa pro liferación celu lar pero con una composición de la matriz extracelular pobre en proteoglicanos. Se distingue la capa más externa con un mayor número de condrocitos.

TIBIABA TIBIA

MS MS

O O


88

31B se observa el osteofito en crecimiento, donde destacan los agregados

celulares rodeados por una pobre matriz extracelular. Es de destacar que la

aparición en este modelo experimental de artrosis de un osteofito a tiempos tan

cortos del experimento no es en respuesta a una dislocación articular, puesto que

no existe dislocación ni en la articulación femororrotuliana ni en la femorotibial,

sino que su formación es únicamente una reacción celular a la agresión enzimática

a la que se ha sometido la articulación. La actividad de la colagenasa intraarticular

sigue desarrollando sus efectos a lo largo del tiempo. En la figura 32 observamos

la comparación entre el cartílago del platillo tibial de articulaciones de rodillas

inyectadas con el enzima 8 días (G1E4; P4) ó 36 días (G1,5E3; P4,5) tras la

inyección. La degradación de la matriz del cartílago es progresiva, aunque en

ninguno de los casos aparece erosión de la superficie en contacto como cabría

esperar en estos estadios de la enfermedad. A los 36 días de la inyección de

Figura 32: Fotografías de cortes parafinados teñidos eosina/hematoxilina. A : rodilla de ratón balb/c 8 d ías tras la inyección de colagenasa (40x): es patente una leve pérd ida de proteoglicanos en la superficie del cartílago art icular junto con un aumento de la cantidad de condrocitos. B: rodilla de ratón balb/c 36 días tras la inyección con colagenasa (40x). La pérdida de componentes de la matriz extracelu lar es severa aunque no aparece erosionada la superficie del cart ílago. Existe una pérdida local de condrocitos (*) rodeada de un área con mayor densidad celular. La membrana sinovial (MS) está ampliamente desarrollada y rica en células inflamatorias.

A BTIBIA TIBIA

MS

*

Figura 32: Fotografías de cortes parafinados teñidos eosina/hematoxilina. A : rodilla de ratón balb/c 8 d ías tras la inyección de colagenasa (40x): es patente una leve pérd ida de proteoglicanos en la superficie del cartílago art icular junto con un aumento de la cantidad de condrocitos. B: rodilla de ratón balb/c 36 días tras la inyección con colagenasa (40x). La pérdida de componentes de la matriz extracelu lar es severa aunque no aparece erosionada la superficie del cart ílago. Existe una pérdida local de condrocitos (*) rodeada de un área con mayor densidad celular. La membrana sinovial (MS) está ampliamente desarrollada y rica en células inflamatorias.

A BTIBIA TIBIA

MS

*

A BTIBIA TIBIA

MS

*


89

colagenasa la pérdida de componentes de la matriz extracelular del cartílago

articular es prácticamente completa.

Transcurridos 36 días de la inyección intra-articular de colagenasa, las

rodillas de los ratones presentan una severa pérdida de componentes de la matriz

extracelular del cartílago del platillo tibial, así como la existencia de osteofitos

marginales y centrales, aunque éstos ya no tienen el aspecto que se observó a los 8

días de la inyección.

En la figura 33 se aprecia un osteofito marginal y uno central rodeados de

zonas de gran pérdida de componentes del cartílago aunque sin erosión de la

superficie articular. El osteofito marginal formado en los primeros días tras la

agresión enzimática (fig. 33B), ha perdido con el paso de los días gran cantidad de

células, quedando únicamente matriz extracelular pobre en proteoglicanos, como

demuestra la tinción de O-safranina. El osteofito central es prácticamente acelular

y posee únicamente matriz de colágeno.

Figura 33: Fotografías de cortes parafinados teñidos O-safranina a 4x (A) y 40x (B) de rodillas de ratón balb/c 36 días tras la inyección de colagenasa. A: en la micrografía se observan osteofitos marginales y centrales (O). B: la imagen a más aumentos revela un pérdida importante de células y de componentes de la matriz del cartílago.

A B

O

O

O

Figura 33: Fotografías de cortes parafinados teñidos O-safranina a 4x (A) y 40x (B) de rodillas de ratón balb/c 36 días tras la inyección de colagenasa. A: en la micrografía se observan osteofitos marginales y centrales (O). B: la imagen a más aumentos revela un pérdida importante de células y de componentes de la matriz del cartílago.

A B

O

O

O

A B

O

O

O

A B

O

O

O


90

A los 36 días de la inyección intraarticular de colagenasa seguían sin

observarse las características típicas de la artrosis humana, como son la

dislocación de la articulación femororrotuliana, seguida de la femorotibial, la

erosión de las superficies del cartílago articular que soportan mayor rozamiento y

su previa pérdida de proteoglicanos. Sin embargo, sí que se observaron hitos

importantes de la progresión de la artrosis como es la formación de osteofitos,

pero estas formaciones no ocurrieron con la suficiente incidencia como para

considerar que este modelo de artrosis sea el modelo adecuado para representar

los procesos involucrados en dicha enfermedad.

El estudio de los cortes histológicos siguiendo el sistema de la OARSI de

evaluación de la histopatologíca de la artrosis reveló las siguientes puntuaciones:

4.1.1.2 Estudio de biomarcadores

En el suero de ratones balb/c inyectados intraarticularmente con

colagenasa se midieron por ELISA diferentes marcadores de la degradación del

cartílago como HA, CTX-II o COMP, pero no se pudieron obtener niveles

cuantificables por dicha técnica a ninguno de los tiempos de supervivencia

P6 G6E1Con colagenasa. Día 36

P6 G6E1Con colagenasa. Día29

P6 G6E1Con colagenasa. Día 8

P1 G1E1Sin colagenasa. Día 36

P0 G0E0Sin colagenasa. Día 8

P GnERODILLA


91

estudiados. Por tanto, no ha sido posible cuantificar por medio de biomarcadores

la progresión de la enfermedad.

Dada la baja incidencia de ratones que desarrollan la enfermedad, la

levedad con que ocurre y la dificultad para cuantificar en suero biomarcadores de

la degradación del cartílago, descartamos el modelo de artrosis inducida por

colagenasa intraarticular para el estudio de posibles efectos de moléculas

experimentales sobre el desarrollo de la artrosis.

Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort

92

4.2 MODELO DE ARTROSIS ESPONTÁNEA EN RATONES STR/ort

En este modelo animal

se realizó un seguimiento del

peso a lo largo del estudio,

para poder comparar la

progresión del peso de los

animales que debían

desarrollar la artrosis de forma

espontánea (STR/ort), con el

peso de la cepa que no

desarrolla artrosis (CBA). En

las gráficas de la figura 34

observamos cómo el peso de

los ratones CBA prácticamente

no aumenta a lo largo de

cuatro semanas, mientras lo

ratones STR/ort incrementan

su peso notablemente. Estos resultados nos confirman la capacidad de esta cepa

para desarrollar una obesidad independiente de la dieta.

4.2.1 Degradación articular

Dado que los ratones STR/ort desarrollan de forma espontánea artrosis en

sus articulaciones, nos dispusimos a realizar el estudio histológico de la

progresión de la enfermedad, en las articulaciones de mayor prevalencia de

artrosis en humanos.

7 8 9 10 1110

20

30

40

CBA

peso

(g)

Edad (semanas)

7 8 9 10 1110

20

30

40

STR/ort

peso

(g)

Figura 34: Gráficas de la progresión de los pesos de ratones CBA y STR/ort.

7 8 9 10 1110

20

30

40

CBA

peso

(g)

Edad (semanas)

7 8 9 10 1110

20

30

40

STR/ort

peso

(g)

Figura 34: Gráficas de la progresión de los pesos de ratones CBA y STR/ort.


93


Se realizó el estudio histológico previo de las articulaciones

interfalángicas, la articulación del tobillo y la articulación de la rodilla, con la

finalidad de escoger la articulación más adecuada para estandarizar el futuro

estudio de la progresión de la artrosis y de los efectos de moléculas

experimentales sobre dicha patología.

Una vez escogida la articulación objeto de nuestro estudio, se realizó el

estudio inmunohistoquímico y la medición de biomarcadores y mediadores

inflamatorios.

4.2.1.1.1 Articulaciones interfalángicas

Dado que en humanos las articulaciones interfalángicas son las más

frecuentemente afectadas por la artrosis, nos dispusimos a realizar un estudio

histopatológico de dichas articulaciones, empleando las tinciones químicas con

eosina/hematoxilina y O-safranina.

La articulación interfalángica es una articulación sinovial susceptible de

padecer artrosis, siendo frecuente el desarrollo de nódulos de Heberden en las

articulaciones distales y de Bouchard en las proximales, característicos de la mano

artrósica. En el caso de los ratones STR/ort no se observó macroscópicamente el

desarrollo de los nódulos anteriormente citados, aunque sí deformaciones de las

falanges como muestra la figura 35. El estudio histológico de las articulaciones

interfalángicas (fig. 36) reveló que existe una severa alteración del cartílago

articular similar a la encontrada en la artrosis humana y coherente con las

deformaciones macroscópicas encontradas en las articulaciones interfalángicas de

las patas traseras de algunos de los ratones STR/ort.


94

Todas estas características específicas de la artrosis hacen que dicha

articulación pueda ser una buena candidata para el estudio comparativo a lo largo

del desarrollo de la patología y para la evaluación de fármacos en estudio, pero

existen limitaciones. En primer lugar, la deformidad de las falanges de las patas

de los ratones STR/ort y su consecuente degradación del cartílago articular

observado en los cortes histológicos, ocurren con frecuencia muy baja, y en

segundo lugar, el estudio de los dedos de las patas de ratón es complicado por

dificultades técnicas asociadas a su pequeño tamaño como, por ejemplo, la escasa

disponibilidad de muestra y la dificultad para realizar adecuadamente los cortes

histológicos.

Figura 35: Patas traseras de ratones STR/ort. A: Fotografía de la pata trasera de un ratón STR/ort con deformaciones de las falanges características de la artrosis. B: radiografía de la pata trasera de un ratón STR/ort donde se observa dislocaciones de varias articulaciones interfalángicas.

A B

Figura 35: Patas traseras de ratones STR/ort. A: Fotografía de la pata trasera de un ratón STR/ort con deformaciones de las falanges características de la artrosis. B: radiografía de la pata trasera de un ratón STR/ort donde se observa dislocaciones de varias articulaciones interfalángicas.

A BA B


95

Figura 36: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina (A y B) y coneosina/hematoxilina (C y D) de falanges de ratones STR/ort de 15 semanas de edad. A:se observan las dos articulaciones interfalángicas presentes en un dedo trifalángico (4x). B:las articulaciones no se presentan dislocadas pero sí que aparece el cartílago dañado conpérdida de matriz extracelular (10x). C: la matriz extracelular del cartílago de unaarticulación interfalángica proximal muestra una alteración en su composición (20x). D: enotra articulación interfalángica proximal aparece una acusada pérdida de condrocitos delcartílago articular así como una membrana sinovial (MS) rica en infiltrado inflamatorio(20x).

BA

C D

MS


96

4.2.1.1.2 Articulación del tobillo

La articulación del tobillo aparece, a nivel macroscópico, frecuentemente

deformada y/o dislocada en los ratones STR/ort (fig. 35). Por este motivo nos

propusimos realizar el estudio histológico previo de los tobillos de los ratones. En

la figura 37A observamos la gran cantidad de pequeños huesos que componen la

articulación del tobillo del ratón, aunque a más aumentos (37B , 37C y 37D) no se

observa degradación en ninguna de las articulaciones que la componen. Por tanto,

descartamos la articulación del tobillo como control del desarrollo de la artrosis en

ratones STR/ort. Las dislocaciones observadas en algunos de los ratones pueden

deberse, por tanto, a movimientos compensatorios para minimizar los

movimientos de las articulaciones dolorosas, como las interfalángicas o las de la

rodilla.


97

Figura 37: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina (A) ycon O-safranina (B, C y D) de tobillos de ratones STR/ort de 15 semanas de edad. A:se observa multitud de articulaciones que componen el tobillo del ratón (4x). B, C: lasarticulaciones no presentan ninguna característica de la artrosis (10x). D: la matrizextracelular del cartílago articular no presenta alteraciones en su composición (20x).

BA

C D


98

4.2.1.1.3 Articulación de la rodilla

La articulación de la rodilla es otra de las que más frecuentemente se

encuentran afectadas en pacientes artrósicos humanos, por tanto realizamos un

estudio histológico previo para evaluar su utilidad en los próximos objetivos de la

presente tesis.

En ratones STR/ort no se observa macroscópicamente inflamación o

dislocación de la articulación de la rodilla, aunque el estudio histológico reveló

que la rodilla era la articulación que más frecuentemente aparecía dañada y más

severamente. En la figura 38 se observa microscópicamente la dislocación

ocasionada por la degradación del cartílago articular, que confiere la estabilidad al

movimiento de la articulación sana.

Figura 38: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 4x (A) y coneosina/hematoxilina a 10x (B) de rodillas de ratones STR/ort de 15 semanas de edad.A: se observa una severa dislocación de la articulación de la rodilla. B: la degradación de lasuperficie del cartílago articular se hace patente junto con una importante pérdida decondrocitos.

BA


99

En los estudios presentados en los apartados anteriores se muestran las

diferentes articulaciones del ratón STR/ort, que se estudiaron a fin de decidir la

articulación que servirá para comparar los procesos que suceden durante el

desarrollo de la artrosis y su posible tratamiento con moléculas experimentales.

Por todos los motivos anteriormente expuestos, de ahora en adelante, los

estudios que se realizarán en ratones STR/ort se centrarán en las rodillas del

animal.

En primer lugar, se estudiaron los ratones CBA que no desarrollan artrosis

y que se estabularon en idénticas condiciones que los ratones STR/ort, como

referencia del estado de la articulación de la rodilla en ausencia de artrosis. El

estudio histológico mediante tinciones químicas de las rodillas de los ratones

CBA indica que en ninguna de las edades estudiadas, existe degradación en el

cartílago articular coherente con la enfermedad de artrosis (G0E0, P0).

En la figura 39 podemos observar una articulación de ratón CBA de 11

semanas de edad que no presenta dislocación, ni aparente pérdida de componentes

del cartílago articular, ya que la tinción de safranina no denota una pérdida de

coloración en ninguna de las superficies articulares. A más aumentos (fig 39B) no

se observan desgarros de la superficie del cartílago articular ni pérdida de

condrocitos. Por tanto, el estudio de las articulaciones de ratones CBA, aún en los

animales de más edad, nos indica que son articulaciones sanas, carentes de

características artrósicas.

En este punto, nos dispusimos a llevar a cabo el estudio longitudinal de la

progresión de la artrosis en ratones STR/ort. El estudio histológico llevado a cabo

empleando tinciones químicas nos reveló una marcada progresión de las

características más importantes de la enfermedad.


100

En la figura 40 observamos cortes histológicos teñidos con O-safranina de

rodillas de ratones STR/ort a tiempo inicial del experimento, 7 semanas de edad,

con el fin de evaluar la degradación del cartílago articular. Al inicio del

experimento, cuando los animales son relativamente jóvenes, no se observa

dislocación de la rótula ni afectación de las superficies del cartílago articular. Por

tanto, los animales poseen, a tiempo 0 del experimento, rodillas aparentemente no

artrósicas.

Como ya se describió en el apartado de Material y métodos, los ratones

STR/ort se sacrificaron a diferentes tiempos a fin de poder estudiar los posibles

cambios histológicos a lo largo de la evolución de la enfermedad. Así, los

animales de 9 semanas de edad (fig. 41) aún no presentaban dislocación rotuliana

pero sí un marcado deterioro del cartílago articular patente en la pérdida de

coloración de la tinción de O-safranina de las superficies articulares. No aparece

tampoco pérdida de condrocitos ni erosión de la matriz del cartílago.

Figura 39: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 10x (A) y 40x(B) de rodillas de ratones CBA de 11 semanas de edad. En las micrografías no seobserva ninguna característica fisiopatológica de la artrosis como puede ser la alteración enla composición de proteoglicanos del cartílago o la discontinuidad de la superficie articular.

FÉMUR FÉMUR

RÓTULA RÓTULA A B


101

Figura 40: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 10x(A) y20x(B) de rodillas de ratones STR/ort de 7 semanas de edad. A: Se puede observar queno existe dislocación de la rótula (R). B: La superficie del cartílago articular de la rótula sepresenta prácticamente sin alteraciones y existe una aparente homogeneidad de loscomponentes de la matriz extracelular.

A B

R R

FÉMUR

Figura 41: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 20x (A) y 40x(B) de rodillas de ratones STR/ort de 9 semanas de edad. A: se observa una importantepérdida de proteoglicanos en las diferentes capas del cartílago articular. A más aumentos (B)se observan algunas lagunas condrocitarias vacías por la muerte de los condrocitos que lasocupaban.

FÉMUR FÉMUR

RÓTULA RÓTULA

BA


102

El estudio histopatológico continúa con rodillas de ratones STR/ort de ll

semanas de edad (fig. 42), y en ellos se observan ya, de forma patente, todas las

características de la rodilla artrósica. En la figura 42A se observa una marcada

dislocación de la rótula, así como una formación periférica coherente con un

osteofito, creado probablemente con la finalidad de estabilizar la articulación

gravemente dañada por el aumento de las fuerzas de fricción entre las superficies

articulares, dado el desplazamiento de la rótula respecto del fémur. En la fig 42B,

a más aumentos, se observa cómo el incremento de la fricción ha ocasionado

graves pérdidas celulares, siendo los más afectados los condrocitos más

periféricos y una importante erosión de la matriz del cartílago articular. Los

cambios en la coloración de la tinción de O-safranina de la matriz del cartílago

observados en las rodillas de ratones 2 semanas más jóvenes no se observan, en

este caso, probablemente porque el cartílago pobre en proteoglicanos que

Figura 42: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 4x (A) y coneosina/hematoxilina a 20x (B) de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanas de edad. A:aparece una dislocación de la rótula (R) respecto del fémur (F) característico de ladesestabilización de la articulación durante el proceso artrósico. También se observa unincipiente osteofito (*). B: se hace presente una importante erosión de la superficie delcartílago articular de la rótula (R) con pérdida de condrocitos y una alteración de lacomposición de la matriz extracelular.

A

R

F

*

RB


103

observábamos anteriormente se ha erosionado y ha desaparecido de la superficie

articular.

Hasta este momento, sólo aparecía dañada de forma importante la

articulación femororrotuliana pero, cuatro semanas más tarde, cuando los ratones

STR/ort alcanzan la edad de 15 semanas, observamos (fig. 43) afectada ya la

articulación femorotibial. En la micrografía 43A se observa una leve dislocación

coherente con la encontrada en la articulación femororrotuliana, con

desplazamiento del menisco medial. Además la articulación presenta una pérdida

completa de componentes de la matriz extracelular del cartílago del platillo tibial

medial, que se hace patente por la pérdida de coloración de safranina de la zona.

La pérdida de proteoglicanos se agrava con una pérdida de gran parte del

cartílago en la zona de mayor contacto, como muestra la figura 43B, entre el

menisco medial y el platillo tibial medial.

Figura 43: Fotografías de cortes parafinados teñidos con O-safranina a 4x (A) y 20x (B)de rodillas de ratones STR/ort de 15 semanas de edad. A: Se hace presente una dislocaciónmedial de la tibia (T) respecto del fémur (F) con una severa afectación del menisco medial(MM) patente en la pérdida de componentes de la matriz extracelular. La membrana sinovial(MS) aparece desarrollada B: la superficie articular del cóndilo femoral (F) se observa unacompleta pérdida de proteoglicanos con fibrilaciones y la desaparición de los condrocitos delas capas más superficiales. La degradación del cartílago se hace patente también en elmenisco medial (MM).

MM

MM

ML

F

T

MS

T A B


104

Con este estudio histológico a lo largo de 8 semanas de la vida de los

ratones STR/ort se ha podido observar la degradación secuencial de la articulación

de la rodilla, similar a la descrita en pacientes artrósicos. La comparación con las

rodillas de ratones CBA, que no desarrollan artrosis, demostró que la degradación

articular observada no era únicamente la provocada por la edad del animal, sino

que es representativa de la patología objeto de la presente tesis.

La evaluación de los cortes histológicos de las rodillas de los animales de

este estudio según los criterios descritos por la OARSI (fig. 44) demostró un

incremento paulatino de la puntuación del daño articular en las rodillas de los

ratones STR/ort. Este incremento en la puntuación no ocurre en las rodillas de

ratones CBA de la misma edad.

Por tanto, concluimos que el modelo de desarrollo espontáneo de artrosis

en ratones STR/ort es un modelo animal apto para el estudio de posibles nuevos

fármacos para el tratamientos de la artrosis, ya que la degradación articular,

7.5 10.0 12.5 15.00

5

10

15

20

25CBASTR/ort

edad (semanas)

punt

uaci

ón (U

A)

Figura 44: Puntuación según el sistema de evaluación histopatológica de la OARSI del cartílago de ratones STR/ort y CBA a lo largo del estudio de la progresión de la artrosis

7.5 10.0 12.5 15.00

5

10

15

20

25CBASTR/ort

edad (semanas)

punt

uaci

ón (U

A)

Figura 44: Puntuación según el sistema de evaluación histopatológica de la OARSI del cartílago de ratones STR/ort y CBA a lo largo del estudio de la progresión de la artrosis


105

siguiendo el sistema de puntuación histopatológica de la artrosis descrito por la

OARSI, posee unos valores suficientemente elevados como para considerar que la

enfermedad se ha desarrollado en los ratones STR/ort a las edades estudiadas y, la

enfermedad se desarrolla en un 80-90% de los animales estudiados.

4.2.1.2 Estudio radiológico

Además del estudio histológico se realizó un estudio radiológico de la

articulación de la rodilla para comprobar su grado de afectación durante el

proceso artrósico. Dado el pequeño tamaño de la articulación del ratón, el análisis

de la imagen es difícil. Tal y como se observa en la figura 45, las rodillas de los

ratones CBA a las 11 semanas edad presentan una articulación normal, donde se

aprecian claramente las delimitaciones de los cóndilos femorales y del platillo

tibial sin ningún indicio de dislocación. Sin embargo, los ratones STR/ort poseen

rodillas típicamente artrósicas. En la figura 45B se aprecian las superficies del

cartílago articular levemente desdibujadas aunque sin rastros de dislocación aún.

A las 11 semanas de edad (fig. 45C) las rodillas de los ratones STR/ort

presentan la superficie articular discontinua, que se agrava notablemente a las 15

semanas de edad cuando la articulación se presenta dislocada y con gran cantidad

de artefactos en la cápsula articular provenientes de la erosión del cartílago

articular y una pronunciada sinovitis.


106

CBA 11 semanas

STR/ort 7 11 15 semanas

A

B C D

Figura 45: Radiografías de rodillas de ratones STR/ort y CBA. A: rodilla de ratón CBA de11 semanas de edad donde se observan perfectamente delimitados los cóndilos femorales yplatillo tibial; B: rodilla de ratón STR/ort de 7 semanas de edad sin ninguna alteraciónradiológica aparente. C: rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad con indicios deafectación de la superficie del cartílago articular; D: rodilla de ratón STR/ort de 15 semanas deedad donde se observa la articulación dislocada y con una severa alteración del cartílago.

Resultados. Modelo de artrosis espontánea en ratones SR/ort

107

4.2.2 Estudio de biomarcadores

El estudio histológico de la progresión de la artrosis en ratones STR/ort y

su comparación con el estado de las articulaciones de rodilla de ratones CBA que

no desarrollan artrosis, se completó con la medición de posibles biomarcadores

locales de la progresión de la enfermedad (en homogenados de tejidos de pata) y

sistémicos (en suero), con la finalidad de evaluar de una forma global los procesos

que ocurren durante el desarrollo de la enfermedad en el modelo de desarrollo

espontáneo de artrosis en ratones STR/ort.

Proteína Oligomérica de la Matriz del Cartílago (COMP)

Se midieron los niveles de COMP en el suero de ratones STR/ort y ratones

CBA por la técnica de ELISA, utilizando el kit comercial de MDbiosciences

siguiendo las indicaciones del fabricante. Se compararon los niveles obtenidos en

los sueros extraídos cada dos semanas, durante las cuatro semanas que duró el

experimento (fig. 46).

El estudio de los niveles de COMP en suero muestra que los niveles

obtenidos en ratones STR/ort están significativamente elevados, respecto de los

niveles encontrados en ratones CBA que no desarrollan artrosis. También se

observa en la gráfica un leve pero progresivo aumento de los niveles de COMP

con la edad, tanto en los CBA como en los ratones STR/ort. Los niveles elevados

de COMP en ratones STR/ort respecto de los encontrados en animales que no

desarrollan artrosis son característicos de la cepa (Jaeger et al., 2008). La

presencia de esta proteína en el suero se ha propuesto como un biomarcador de la

degradación del cartílago en la artrosis humana (Vilim et al., 2002).


108

Ácido Hialurónico (HA)

El ácido hialurónico es uno de los glicosaminoglicanos de mayor

importancia en el cartílago articular y su presencia en suero se ha sugerido como

biomarcador de la progresión de la artrosis (Pavelka et al., 2004). Los niveles de

HA se midieron utilizando un ELISA de Echelon, según las instrucciones del

fabricante, en el suero de ratones STR/ort y ratones CBA a las 11 semanas de

edad (fig. 47), transcurridas las cuatro semanas que duró el experimento. Los

resultados obtenidos sugieren que no existen diferencias entre los niveles

presentes en ratones STR/ort y los niveles en ratones CBA. De forma contraria a

cómo ocurría en el biomarcador COMP, el ácido hialurónico no parece ser

Figura 46: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) enel suero de ratones STR/ort y ratones CBA. Se compararon los sueros de ratonesCBA y STR/ort a tres tiempos del desarrollo del experimento. Media ±ε. * test de Student. p<0,05.

edad (semanas) 7 9 11

1.5

2.0

2.5CBASTR/ort

** *

U/L


109

representativo de la degradación patente en el cartílago de ratones STR/ort. Por

tanto, no consideramos que el ácido hialurónico sea un biomarcador apto para la

evaluación de los efectos de tratamientos con fármacos experimentales sobre la

progresión de la enfermedad en ratones STR/ort.

Metaloproteinasa de matriz 3 (MMP3)

La metaloproteinasa 3 es uno de los enzimas implicados en la destrucción

del cartílago articular durante la progresión de la artrosis. Sus niveles están

relacionados con el estrechamiento del espacio articular en la rodilla artrósica

Figura 47: Niveles de ácido hialurónico en el suero de ratones STR/ort yratones CBA de 11 semanas de edad. Se compararon los niveles de ácidohialurónico en sueros de ratones CBA y STR/ort tras 4 semanas de estudio y nose observaron diferencias significativas entre ratones artrósicos y ratones que nodesarrollan la enfermedad. Media ±ε.

11 semanas de edad

CBA STR/ort

0

10

20

30

ng/m

L


110

(Lohmander et al., 2005; Samuels et al., 2008; Tchetverikov et al., 2005). Por

ello, se midieron los niveles de MMP3 utilizando un ELISA de R&D Systems en

el suero de ratones STR/ort y ratones CBA para observar las posibles diferencias

entre animales que desarrollan artrosis y los que no desarrollan ningún tipo de

degeneración articular. Se compararon las medidas obtenidas en los sueros

extraídos cada dos semanas a lo largo de las cuatro semanas que duró el

experimento (fig. 48).

Los resultados muestran cómo en las dos primeras semanas de estudio los

niveles de MMP3 están significativamente incrementados en el suero de los

edad (semanas)

Figura 48: Niveles de metaloproteinasa 3 (MMP3) en el suero de ratonesSTR/ort y ratones CBA. Se compararon los sueros de ratones CBA y STR/ort a trestiempos a lo largo del desarrollo del experimento.** test de student p<0,01 STR/ortvs CBA. ## test de Dunett p<0,01; 11 semanas vs 9 y 7 semanas

7 9 110.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

CBASTR/ort

* *

* *

##ng/m

L


111

ratones STR/ort respecto de los ratones CBA. Los niveles de la metaloproteinasa

se normalizan en la última semana del experimento, probablemente porque la

actividad destructiva del enzima se haya paralizado o estabilizado a estos tiempos

del estudio.

Osteocalcina (OC)

Esta proteína es un marcador del metabolismo óseo y su incremento en

suero se ha relacionado con la progresión radiológica de la artrosis de rodilla

(Bruyere et al., 2003). Por tanto, encontramos interesante estudiar las posibles

diferencias existentes entre ratones que desarrollan de forma espontánea la artrosis

y ratones que, a la misma edad, no desarrollan procesos artrósicos (ratones CBA).

Los niveles de osteocalcina se midieron en el suero de ratones CBA y

11 semanas de edad

Figura 49: Niveles de osteocalcina (OC) en el suero de ratones STR/ort yratones CBA. Se compararon los niveles de OC en los sueros de ratones STR/ort yCBA de 11 semanas de edad. Media ± ε. * test de student p<0,05.

CBA STR/ort0

50000

100000

150000

200000

250000

*

pg/m

L


112

ratones STR/ort utilizando la técnica Luminex, aunque por limitación de muestra

sólo se pudo medir los niveles de osteocalcina a tiempo final del experimento. Los

ratones STR/ort presentan, a la edad de 11 semanas, niveles de osteocalcina

aumentados respecto de los ratones CBA (fig. 49), lo que sugiere que la

osteocalcina puede ser un biomarcador candidato para el estudio del pronóstico de

la artrosis.

Ligando del Receptor Activador del NF-κB (RANKL)

Dado que el sistema Osteoprotegerina/RANK/RANKL desempeña un

importante papel en el remodelado óseo, y se ha propuesto como biomarcador en

la artrosis de rodilla (Pilichou et al., 2008), procedimos a medir los niveles del

ligando soluble del receptor activador del NF-κB (RANKL) en suero, utilizando

11 semanas de edad

Figura 50: Niveles de RANKL en el suero de ratones STR/ort y ratones CBA. Se compararon los niveles de RANKL en los sueros de ratones STR/ort y CBA de 11 semanas de edad. Media ± ε. ** test de student p<0,01

CBA STR/ort0

50

100

150

200

250

**pg/m

L


113

la técnica de Luminex. De nuevo, por limitación de la muestra sólo se pudieron

cuantificar los niveles de RANKL a tiempo final. Se compararon los niveles

obtenidos en el suero, de ratones STR/ort con los obtenidos en suero de ratones

CBA, ambos de 11 semanas de edad (fig. 50). En el suero de los ratones STR/ort

aparecen significativamente disminuidos los niveles de RANKL respecto de los

valores obtenidos en ratones CBA, sugiriendo una alteración en el sistema

OPG/RANK/RANKL en la progresión de la artrosis en ratones STR/ort.

4.2.3 Inflamación

Para evaluar el grado de inflamación relacionado con la degradación

articular propia de la artrosis, nos dispusimos a medir diferentes mediadores

inflamatorios implicados en el proceso artrósico en ratones STR/ort, que

desarrollan la enfermedad y en ratones CBA, que no padecen la patología.

Interleucina-1β (IL-1β)

La citocina proinflamatoria IL-1β se midió en el suero extraído de los

ratones STR/ort cada 2 semanas durante las 8 semanas que duró el experimento de

observación del progreso de la enfermedad. Se utilizó para medir los niveles de

IL-1β un kit de ELISA de R&D Systems.

El estudio de la expresión de IL-1β durante la progresión de la artrosis en

ratones STR/ort durante ocho semanas demuestra que no existe un incremento

progresivo dependiente de la edad sino que los niveles oscilan a lo largo de la

evolución de la enfermedad (fig. 51).

También se midieron los niveles de IL-1β en suero de los ratones STR/ort

de 11 semanas, para compararlos con los obtenidos en ratones CBA de la misma

edad (fig. 52). En el estudio comparativo de los niveles de IL-1β a las 11 semanas


114

edad (semanas)

Figura 51: Niveles de interleucina-1ß (IL-1ß) en el suero de ratones STR/ortde diferentes edades. Se compararon los niveles de IL-1ß en los sueros de ratonesSTR/ort a diferentes edades. Media ± ε.

7 9 11 150

500

1000

1500

pg/m

L

11 semanas de edad

Figura 52: Niveles de interleucina-1ß (IL-1ß) en el suero de ratones STR/ort yratones CBA. Se compararon los niveles de IL-1ß en los sueros de ratones STR/orta las 11 semanas de edad con los niveles en ratones CBA de la misma edad. Media ±ε. * test de student p<0,05

CBA STR/ort0

500

1000

1500

2000

2500

*

pg/m

L


115

de edad se observa una disminución en el suero de ratones STR/ort en

comparación con los obtenidos en el suero de ratones CBA.

Interleucina 17 (IL-17)

También se midió en suero la citocina proinflamatoria IL-17 para estudiar

su posible implicación en el desarrollo de la artrosis en ratones STR/ort, a lo largo

de las 8 semanas que duró el experimento de observación del proceso degradativo

de la artrosis. Para su medición se utilizó un ELISA de R&D Systems siguiendo

las indicaciones del fabricante.

edad (semanas)

Figura 53: Niveles de interleucina 17 (IL-17) en el suero de ratones STR/ortde diferentes edades. Se compararon los niveles de IL-17 en los sueros de ratonesSTR/ort a diferentes edades. Media ± ε. * test de student p<0,05; 15 semanas vs 7semanas

7 9 11 150

10

20

*

pg/m

l


116

El estudio de la citocina IL-17 mostró un incremento progresivo de los

niveles en suero a lo largo del experimento (fig. 53), lo que puede justificar la

progresión del componente inflamatorio observada en el estudio histológico de la

evolución de la artrosis en ratones STR/ort.

También se midieron los niveles de la IL-17 en el suero de ratones CBA de

11 semanas y se compararon con los obtenidos en los ratones STR/ort de la misma

edad (fig. 54), y se observó que los niveles de la citocina aparecían disminuidos

en el suero de los ratones que desarrollan la artrosis de forma espontánea en

comparación con los ratones CBA.

11 semanas de edad

Figura 54: Niveles de interleucina 17 (IL-17) en el suero de ratones STR/ort yCBA. Se compararon los niveles de IL-17 en los sueros de ratones STR/ort a las11 semanas de edad con los niveles en ratones CBA de la misma edad. Media ± ε

CBA STR/ort0

5

10

15

20

25


117

Factor de Necrosis Tumoral α (TNFα )

El factor de necrosis tumoral es una citocina implicada tanto en las

reacciones de inflamación de fase aguda como en la inflamación crónica. Aunque

la artrosis es una patología caracterizada por la degradación paulatina del cartílago

articular y su componente inflamatorio involucrado es minoritario, pensamos que

sería interesante cuantificar los niveles de TNFα en el suero de los ratones

STR/ort a lo largo del desarrollo de la patología. Por tanto, utilizamos un ELISA

de R&D Systems y, siguiendo las indicaciones del fabricante, cuantificamos los

niveles de TNFα existentes en el suero de ratones STR/ort a lo largo del

desarrollo de la artrosis (fig. 55).

edad (semanas)

Figura 55: Niveles de TNFα en el suero de ratones STR/ort dediferentes edades. Se estudió los niveles del factor de necrosis tumoral a lolargo del desarrollo de la artrosis en ratones STR/ort. Media ± ε. * test de student p<0,05; 11 semanas vs 7 semanas

7 9 11 150

100

200

300

400

500

600

700 *

pg/m

L


118

Observamos cómo existe un incremento significativo durante las 4

primeras semanas (de la 7 a la 11) aunque decaen los niveles más tarde,

probablemente porque ya ha finalizado la fase inflamatoria en la que estaría

implicado el TNFα .

También comparamos los niveles de TNFα existentes en el suero de

ratones STR/ort con los encontrados en suero de ratones CBA a la edad de 11

semanas (fig. 56). En la gráfica no se observan diferencias entre los niveles de

TNFα en el suero de ratones que padecen artrosis respecto de los ratones CBA

que están carentes de la degradación articular que conlleva la artrosis.

11 semanas de edad

Figura 56: Niveles de TNFα en el suero de ratones CBA y STR/ort de 11semanas de edad. Se compararon los niveles del factor de necrosis tumoral entrelos ratones que no desarrollan artrosis y aquellos que desarrollan de formaespontánea la enfermedad. Media ± ε.

CBA STR/ort0

100

200

300

400

500

600

700

pg/m

L


119

Prostaglandina E2 (PGE2)

La PGE2 se midió en el suero de ratones STR/ort por radioinmunoensayo

empleando el protocolo explicado en el apartado de material y métodos. Se

compararon los resultados obtenidos en los sueros extraídos cada dos semanas de

los ratones STR/ort, con la finalidad de estudiar los niveles de PGE2 durante el

desarrollo de la artrosis en dichos animales (fig. 57).

En los resultados obtenidos no se observó un patrón de aumento

progresivo de los niveles de PGE2 como cabría esperar, sino que la prostaglandina

se encontraba mucho más elevada en el suero de los ratones STR/ort durante las

cuatro primeras semanas del experimento y sus niveles disminuían muy

significativamente a partir de la semana 11 de edad.

Se compararon también los niveles de PGE2 en el suero de ratones STR/ort

edad (semanas)

Figura 57: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratonesSTR/ort de diferentes edades. Se midieron los niveles de PGE2 en el suero deratones STR/ort durante 8 semanas. Media ± ε. ** test de Dunett p<0,01; 11 y 15semanas vs 7 semanas

7 9 11 150

25

50

75

** **

pg/m

L


120

de 11 semanas de edad con los niveles obtenidos en los sueros de ratones CBA de

la misma edad (fig. 58). En este caso se observó una disminución significativa de

los niveles de la prostaglandina en los sueros de ratones enfermos de artrosis. De

nuevo, encontramos en la cepa de ratones STR/ort una disminución de niveles de

marcadores proinflamatorios respecto de animales que no desarrollan la

enfermedad, a la semana 11 de edad.

11 semanas de edad

Figura 58: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratonesSTR/ort y CBA a las 11 semanas de edad. Se compararon los niveles de PGE2 enlos sueros de ratones STR/ort de 11 semanas de edad con los ratones CBA de lamisma edad. Media ± ε. ** test de student p<0,01.

CBA STR/ort0

25

50

75

**

pg/m

L


121

Ciclooxigenasa 2 (COX-2)

Para evaluar la implicación de la COX-2 en el proceso inflamatorio

coexistente con la degradación articular que se desarrolla de forma espontánea en

este modelo animal, la COX-2 se midió utilizando tanto la técnica de western blot

a partir del extracto de proteína microsomal obtenido de los homogenados de

rodillas de ratones STR/ort y CBA, como por inmunohistoquímica sobre tejido

parafinado.

En la gráfica de la figura 59A se muestran las bandas obtenidas en el

western blot para COX-2. Los resultados obtenidos del densitometrado de las

bandas correspondientes a la COX-2, normalizados respecto de los valores

obtenidos del densitometrado de la banda de actina se muestran en la figura 59B.

En ella observamos cómo los niveles de COX-2 en la cepa de ratones

STR/ort disminuyen progresivamente con el paso del tiempo y la progresión de la

enfermedad. Los niveles de COX-2 a la edad de 11 semanas son

significativamente mayores en el caso de los ratones STR/ort que en los ratones

CBA.

La inmunohistoquímica para COX-2 (fig. 60) se realizó para corroborar

los resultados obtenidos por la técnica de inmunodetección por western blot y con

el fin de conocer su localización. De nuevo se compararon los resultados

obtenidos en las rodillas de ratones STR/ort a diferentes edades, con los obtenidos

en ratones CBA que no desarrollan la artrosis y se observó que la expresión de la

COX-2 se reduce con el paso del tiempo y el deterioro de la articulación de los

ratones STR/ort.

El marcaje por inmunohistoquímica de COX-2 aparece tanto en los

condrocitos superficiales del cartílago articular como en los sinoviocitos que

constituyen la membrana sinovial. El recuento de condrocitos positivos para la


122

inmunotinción demuestra una reducción significativa del número de células que

expresan COX-2 en el cartílago articular con la progresión de la enfermedad en

los ratones STR/ort (fig. 60E). Mientras que la expresión de COX-2 en rodillas de

ratones CBA es significativamente superior al número de condrocitos que

expresan COX-2 en ratones STR/ort de la misma edad (fig. 60F).

Figura 59: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal dehomogeneizado de pata de ratones STR/ort y CBA de diferentes edades. A: Imagen delwestern blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado alvalor de la actina obtenido en cada caso. Media ± ε. * test de student p<0,05; STR/ort vs CBA11 semanas de edad. ## test de Dunett p<0,01; 15 semanas vs 7 semanas

11 7 11 150

1000

2000

3000

4000

5000

6000CBASTR/ort

*

##

Den

sida

d óp

tica

inte

grad

a(D

OI)

11 7 11 15

cepa edad (semanas)

CBA STR/ort

edad (semanas)

A

B


123

Figura 60: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) encostes histológicos de rodillas de ratones CBA y STR/ort. A: articulación femororrotulianade ratón CBA de 11 semanas de edad donde se observa una intenso marcado de condrocitospositivos frente a COX-2; B: rodilla de ratón STR/ort de 7 semanas de edad con gran númerode condrocitos positivos para COX-2; C: rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad conun número bastante reducido de condrocitos del cartílago articular marcados para COX-2; D:rodilla de ratón STR/ort de 15 semanas de edad donde se observa la articulación dislocada, unasevera alteración del cartílago pero sin condrocitos positivos para la inmunohistoquímica deCOX-2. E: Número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 en rodillas deratones STR/ort de diferentes edades. t de Student * p<0,05; *** p<0,001 F: Comparación delnúmero de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 obtenidas en rodillas deratones STR/ort y en ratones CBA de 11 semanas de edad. *** t de Student p<0,001.

CBA 11 semanas

ASTR/ort 7 11 15 semanas

B C D

CBA STR/ort0

50

100

150

200

250

***

nºce

l pos

itiva

s C

OX-

2

7 11 150

50

100

150

*

***

nºce

l pos

itiva

s C

OX-

2

F E

edad (semanas) 11 semanas de edad


124

Hemo oxigenasa-1 (HO-1)

Dado que posteriormente se empleará como tratamiento experimental un

potente inhibidor de la HO-1, la estaño protoporfirina IX (SnPP), se decidió

estudiar la expresión de dicho enzima en las rodillas de los ratones STR/ort y

CBA. Por tanto, se midió la expresión de HO-1 como marcador de estrés

oxidativo en la progresión de la artrosis en este modelo experimental.

De nuevo, este mediador se estudió por la técnica de western blot (fig 61)

y mediante inmunohistoquímica sobre tejido parafinado (fig 62).

La gráfica de la figura 61B muestra los valores del densitometrado de las

bandas de HO-1 obtenidas por western blot, normalizados respecto de los valores

de actina de cada muestra. Los niveles de HO-1 no parecen variar a lo largo del

proceso artrósico en ratones STR/ort. La comparación de los niveles del enzima

en rodillas de ratones CBA y STR/ort de 11 semanas de edad no denota ninguna

diferencia aunque sí que aparece una reducción significativa en la expresión de

HO-1 en las rodillas de ratones STR/ort de 7 y 15 semanas en comparación con

los niveles hallados en ratones CBA


125

11 7 11 15

cepa edad (semanas)

CBA STR/ort

Figura 61: Western blot para hemo oxigenasa 1 (HO-1) en fracción microsomal dehomogenado de pata de ratones STR/ort y CBA de diferentes edades. A: Imagen delwestern blot para HO-1; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado alvalor de la actina obtenido en cada caso. Media ± ε. * t de Student p<0,05; 11 semanas vs 7semanas.

edad (semanas)

11 7 11 150

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000CBASTR/ort

*

Den

sida

d óp

tica

inte

grad

a(D

OI)

A

B


126

Figura 61: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a hemooxigenasa-1 (HO-1) en costes histológicos de rodillas de ratones CBA y STR/ort. A: articulación femororrotuliana de ratón CBA de 11 semanas de edad con un importante número de condrocitos positivos para HO-1; B: rodilla de ratón STR/ort de 7 semanas de edad con células marcadas frente HO-1; C: rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad con un número bastante reducido de condrocitos del cartílago articular marcados para HO-1; D: rodilla de ratón STR/ort de 15 semanas de edad con una importante erosión del cartílago pero prácticamente sin condrocitos positivos para HO-1. E: Número de células positivas en la inmunohistoquímica para HO-1 en rodillas de ratones STR/ort de diferentes edades. test de Student *** p<0,001; F: Comparación del número de células positivas en la inmunohistoquímica para HO-1 obtenidas en rodillas de ratones STR/ort y en ratones CBA de 11 semanas de edad. *** test de Dunett p<0,001.

CBA 11 semanas

A


B C D

E

edad (semanas)

7 11 15

0102030405060708090

******

nºce

l pos

itiva

s H

O-1

F

11 semanas de edad

CBA STR/ort0

50

100

150

200

250

***nºce

l pos

itiva

s H

O-1

Figura 61: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a hemooxigenasa-1 (HO-1) en costes histológicos de rodillas de ratones CBA y STR/ort. A: articulación femororrotuliana de ratón CBA de 11 semanas de edad con un importante número de condrocitos positivos para HO-1; B: rodilla de ratón STR/ort de 7 semanas de edad con células marcadas frente HO-1; C: rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad con un número bastante reducido de condrocitos del cartílago articular marcados para HO-1; D: rodilla de ratón STR/ort de 15 semanas de edad con una importante erosión del cartílago pero prácticamente sin condrocitos positivos para HO-1. E: Número de células positivas en la inmunohistoquímica para HO-1 en rodillas de ratones STR/ort de diferentes edades. test de Student *** p<0,001; F: Comparación del número de células positivas en la inmunohistoquímica para HO-1 obtenidas en rodillas de ratones STR/ort y en ratones CBA de 11 semanas de edad. *** test de Dunett p<0,001.

CBA 11 semanas

A

CBA 11 semanasCBA 11 semanas

A


B C D

STR/ort 7 11 15 semanasSTR/ort 7 11 15 semanas

B C D

E

edad (semanas)

7 11 15

0102030405060708090

******

nºce

l pos

itiva

s H

O-1

E

edad (semanas)

7 11 15

0102030405060708090

******

nºce

l pos

itiva

s H

O-1

F

11 semanas de edad

CBA STR/ort0

50

100

150

200

250

***nºce

l pos

itiva

s H

O-1

F

11 semanas de edad

CBA STR/ort0

50

100

150

200

250

***nºce

l pos

itiva

s H

O-1


127

Los resultados del

recuento de condrocitos

positivos para HO-1 de

la superficie del cartílago

articular no se

corresponde con los

resultados obtenidos con

la técnica del Western

blot. Esta diferencia se

podría explicar por el

hecho de que la mayor

parte de las células

positivas para HO-1 aparecen en la membrana sinovial, como muestra la figura 62

y, por tanto, no aparecen en el recuento de condrocitos positivos para este enzima.

MS

Figura 62: Micrografía de la inmunohistoquímica frente HO-1 de rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad

MS

Figura 62: Micrografía de la inmunohistoquímica frente HO-1 de rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas de edad


128

4.2.4 Estudio de fármacos. Estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069

El modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratones STR/ort ha

quedado validado por el estudio histológico y el estudio de niveles de

biomarcadores de degradación del cartílago y de mediadores inflamatorios. Por

tanto, dado que el modelo animal de artrosis es reproducible y presenta

características similares a las encontradas en la patología humana, nos propusimos

testar los posibles efectos de fármacos experimentales sobre la progresión de la

enfermedad.

Como ya se ha expuesto en el apartado de material y métodos, los

fármacos que nos dispusimos a estudiar son SnPP y BIS069. Los ratones STR/ort

se trataron diariamente durante 4 semanas con cada uno de los fármacos. SnPP se

administró intraperitonealmente a la dosis de 12 mg/kg/día en una suspensión

homogénea en 1% DMSO y BIS069 se administró por vía oral a 80 mg/kg/día

disuelto en agua. De nuevo se realizó el estudio histológico y el seguimiento de

sus posibles efectos sobre los biomarcadores de degradación del cartílago y sobre

los mediadores inflamatorios.

4.2.4.1 Evolución del peso de los animales

De igual forma que se procedió en el estudio de la progresión de la artrosis

en el modelo de desarrollo espontáneo de la enfermedad de los ratones STR/ort, se

realizó un seguimiento semanal de los pesos de los animales para evaluar la

influencia de los fármacos sobre el estado general de salud de los animales y se

observó que los animales tratados con SnPP presentaban un incremento del peso

levemente superior al de los animales sin tratar (fig. 63). Sin embargo, los ratones

tratados con BIS069 estabilizaron su peso sin presentar prácticamente incremento

a lo largo de las cuatro semanas que duró el tratamiento.


129


Las radiografías de las rodillas de los ratones STR/ort tratados con SnPP y

BIS069 (fig. 64) muestran unas articulaciones en un estadio más temprano de la

enfermedad. En el caso de los ratones tratados con SnPP no aparece dislocada la

articulación, pero sí desdibujada, denotando una degradación del cartílago

articular. En cambio la rodilla del ratón tratado con BIS069 no aparece dañada

aunque sí levemente dislocada.

7 8 9 10 1110

20

30

40

Controlpe

so (g

)

Edad (semanas)

7 8 9 10 1110

20

30

40

SnPP

peso

(g)

7 8 9 10 1110

20

30

40

BIS069

peso

(g)

Figura 63: Gráficas de la progresión de los pesos de ratones STR/ort tras cuatrosemanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069.


130

Figura 64: Radiografías de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanasde edad tratados durante cuatro semanas con estaño protoporfirinaIX (SnPP) y BIS069. A: rodilla de ratón STR/ort de 11 semanas sintratar; B: rodilla de ratón STR/ort tratado con SnPP donde no parecedislocada la articulación aunque sí aparece levemente afectada lasuperficie articular; C: rodilla de STR/ort tratado con BIS069 y se observauna articulación exenta de características artrósicas a nivel radiológico.

STR/ort SnPP BIS069

B C

A

STR/ort 11


131


Se realizó el estudio histológico de las rodillas de los ratones STR/ort que

habían recibido los tratamientos con SnPP y BIS069, para evaluar los efectos de

estos fármacos sobre la degradación del cartílago en este modelo experimental. El

estudio histológico se llevó a cabo empleando el sistema de evaluación

histopatológico del cartílago descrito por la OARSI (fig. 65).

En las imágenes de los cortes histológicos teñidos con eosina/hematoxilina

de las rodillas de los animales tratados, observamos cómo la erosión de la

superficie del cartílago es menor (G1E2; P2) a la que se observa en la imagen del

ratón STR/ort control (G4E4; P16). Por tanto, a nivel histológico, tanto el

tratamiento con SnPP como con BIS069 parece estar protegiendo el cartílago

articular de la degradación articular observada en el modelo de artrosis espontánea

en ratones STR/ort.


132

STR/ort SnPP BIS0690

10

20

Punt

uaci

ón (U

A)

Figura 65: Estudio histopatológico del cartílago de ratones STR/ort de 11 semanas deedad sometidos al tratamiento con SnPP y BIS069 durante 4 semanas. A: articulaciónfemororrotuliana de ratón STR/ort de 11 semanas de edad, donde se observa una importantedegradación del cartílago; B: rodilla de ratón STR/ort tras 4 semanas de tratamiento con SnPP;C: rodilla de ratón STR/ort tras 4 semanas de tratamiento con BIS069; D: puntuación obtenidatras el estudio de los cortes histológicos según el sistema de evaluación histopatológica de laOARSI.

STR/ort Control

A

B C

STR/ort SnPP BIS069

D

4 semanas de tratamiento


133


Proteína Oligomérica de la Matriz del Cartílago (COMP)

Dado que los estudios sobre la progresión de la artrosis en ratones STR/ort

mostraron unos niveles de COMP elevados respecto a los resultados obtenidos en

el suero de ratones CBA que no desarrollan artrosis y que su incremento se veía

aumentado con el tiempo, se procedió a estudiar los efectos de los fármacos sobre

los niveles de la proteína oligomérica del cartílago. Se compararon los niveles de

COMP de los ratones STR/ort tratados con los fármacos, con los niveles de

COMP de ratones STR/ort sin tratar de la misma edad (fig. 66).

edad (semanas)

Figura 66: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) ensuero de ratones STR/ort tratados y sin tratar con moléculas a estudio. Secompararon los niveles encontrados en sueros de ratones STR/ort a tres tiempos deltratamiento con los niveles correspondientes a los ratones STR/ort sin tratar. Media ± ε.

7 9 111.5

2.0

2.5CONTROLSnPPBIS069

U/L


134

La medición se realizó en los sueros extraídos cada 2 semanas a lo largo de

las 4 semanas que duró el tratamiento. En la gráfica no se observa ningún efecto

significativo de los tratamientos sobre los niveles de COMP en suero, a ninguno

de los tiempos estudiados.

Metaloproteinasa 3 (MMP3)

También se estudiaron los efectos sobre los niveles de MMP3, que puede

ser un biomarcador de la progresión de la enfermedad en este modelo

experimental, a lo largo de las 4 semanas que duraron los tratamientos.

En el estudio, anteriormente mencionado, sobre la progresión de la artrosis

en ratones STR/ort se observó que los niveles de la MMP3 aparecían aumentados

las dos primeras semanas pero en la última semana los niveles se estabilizaban

(fig. 47). A tiempo 0 (7 semanas de edad), medimos los niveles basales de MMP3.

En la figura 67 podemos observar que a las 2 semanas de tratamiento (9 semanas

de edad) se observa una disminución en los niveles de esta proteína en suero para

los dos tratamientos. A las 4 semanas del tratamiento (11 semanas de edad) los

niveles del grupo control están muy reducidos y ya no se observan diferencias

significativas con los grupos tratados.


135

Osteocalcina (OC)

Dado que los estudios sobre la progresión de la artrosis en ratones STR/ort

demostraron que dicho biomarcador se encontraba elevado en ratones que

desarrollan de forma espontánea la artrosis respecto de los niveles encontrados en

ratones que no presentan esta patología, se evaluaron los posibles efectos del

tratamiento con SnPP y BIS069 sobre los niveles de osteocalcina. Se compararon

los valores obtenidos en el suero de ratones STR/ort sin tratar de 11 semanas de

edad, con los obtenidos en los sueros de ratones tratados durante 4 semanas (fig.

68).

edad (semanas)

Figura 67: Niveles de metaloproteinasa 3 (MMP3) en el suero de ratones STR/ort tratados con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. Se compararon los sueros de ratones STR/ort sin tratar con los sueros de los ratones tratados durante cuatrosemanas a tres tiempos del desarrollo del experimento. Media ± ε. * test de student p<0,05; tratamientos vs control.

7 9 110.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

CONTROLSnPPBIS069

*

*

ng/m

L


136

Los resultados mostraron que el tratamiento con SnPP durante 4 semanas

disminuye significativamente los niveles en suero de osteocalcina respecto de los

ratones STR/ort de la misma edad que no fueron tratados. La administración de

BIS069 redujo los niveles de osteocalcina en ratones STR/ort pero no alcanzó

significación estadística.


Figura 68: Niveles de osteocalcina (OC) en el suero de ratones STR/orttratados con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatrosemanas. Se compararon los niveles de OC en los sueros de ratones STR/ort sintratar con los ratones tratados durante cuatro semanas con SnPP y BIS069. Media± ε. * test de student p<0,05; SnPP vs control.

CONTROL SnPP BIS0690

50000

100000

150000

200000

250000

*

pg/m

L


137

Ligando del Receptor Activador del NF-κB (RANKL)

Como ya se ha mostrado, la evaluación de los niveles de RANKL en

ratones STR/ort en comparación con los encontrados en ratones CBA, libres de

padecer la patología de la artrosis, demostró que dicho parámetro se encontraba

alterado en animales enfermos. Por ello, se estudiaron también los efectos de los

tratamientos experimentales sobre los niveles de RANKL en el suero de ratones

STR/ort tras cuatro semanas de administración de las moléculas (fig. 69). Como

muestra la gráfica, no se observan variaciones en los niveles de RANKL en el

suero de ratones tratados con SnPP y BIS069 durante 4 semanas.


Figura 69: Niveles de RANKL en el suero de ratones STR/ort tratados conestaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante cuatro semanas. Secompararon los niveles de RANKL en los sueros de ratones STR/ort sin tratarcon los tratados durante cuatro semanas con los fármacos a estudio. Media ± ε.


25

50

75

100

125

pg/m

L


138

4.2.4.5 Inflamación

También se evaluaron los posibles efectos de los tratamientos

experimentales sobre los mediadores inflamatorios implicados en el desarrollo de

la artrosis en ratones STR/ort.

Interleucina 1β (IL 1β)

Se midió la citocina proinflamatoria, IL 1β, tras haber finalizado el

tratamiento de los ratones STR/ort con los fármacos a estudio (fig 70), aunque

recordemos que en el estudio de los mediadores inflamatorios implicados en la

progresión de la artrosis en ratones STR/ort se observaron unos valores en los


Figura 70: Niveles de interleucina 1ß (IL 1ß) en el suero de ratones STR/orttratados durante 4 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. Secompararon los niveles de IL 1ß en los sueros de ratones STR/ort de 11 semanasde edad con los animales de la misma edad tras haber sido tratados con dichosfármacos. Media ± ε. ** t de Student p<0,01.


1000

2000 **

pg/m

L


139

ratones artrósicos inferiores a los de los ratones CBA (fig. 51).

En los resultados obtenidos tras los tratamientos observamos un

incremento significativo de los niveles de dicha citocina en el suero de ratones

STR/ort tras la administración de SnPP, recobrando valores similares a los

encontrados en el suero de ratones CBA de la misma edad. También se observó

un incremento, aunque en menor medida, de los niveles de IL 1ß en el suero de

ratones STR/ort tratados con BIS069.

Interleucina-17 (IL-17)

Se midieron por ELISA los niveles de la citocina proinflamatoria, IL-17,

en el suero de ratones tratados con las moléculas a estudio durante cuatro semanas

y se compararon con los niveles obtenidos en sueros de ratones STR/ort de la

misma edad que no habían sido tratados (fig. 71), con el fin de observar los

posibles efectos de los tratamientos sobre otro de los mediadores inflamatorios.

En los estudios sobre el desarrollo de la artrosis en ratones STR/ort se

observó que los niveles de IL-17 aumentaban progresivamente con la evolución

de la enfermedad sugiriendo la participación de esta citocina en el proceso

inflamatorio relacionado con la progresión de la artrosis en ratones STR/ort. Los

resultados obtenidos demuestran una reducción importante de los niveles de la

citocina IL-17, provocada por ambos tratamientos. Por tanto, podríamos suponer

que los tratamientos en estudio reducirían el componente inflamatorio mediante la

intervención sobre la interleucina-17.


140

Factor de Necrosis Tumoral α (TNFα )

También se estudiaron los efectos de estos fármacos sobre los niveles de

TNFα en el suero de los ratones STR/ort empleando la técnica de ELISA.

En la figura 72 se puede observar que ambos tratamientos provocan una

leve disminución de los niveles de esta citocina proinflamatoria tras el tratamiento

durante 4 semanas con BIS069, aunque no es significativa estadísticamente.


Figura 71: Niveles de interleucina 17 (IL 17) en el suero de ratones STR/orttratados con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. Se compararon losniveles de IL 17 en los sueros de ratones STR/ort de 11 semanas de edad con losratones STR/ort tratados durante cuatro semanas con los fármacos. Media ± ε.


10

20

pg/m

L


141


La prostaglandina E2 se midió de nuevo por radioinmunoensayo en el

suero de ratones STR/ort tratados con los fármacos en estudio durante cuatro

semanas y en el suero de ratones STR/ort sin tratar de la misma edad (fig. 73), con

el fin de estudiar los posibles efectos de los tratamientos sobre la PGE2. En la

gráfica se observa como ninguno de los dos tratamientos es capaz de alterar los

niveles de PGE2 tras cuatro semanas de administración.


Figura 72: Niveles de Factor de Necrosis Tumoral α (TNFα ) en el suero deratones STR/ort tratados con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. Secompararon los niveles de TNFα en los sueros de ratones STR/ort de 11 semanasde edad con los ratones STR/ort tratados durante cuatro semanas con los fármacos.Media ± ε.

STR/ort SnPP BIS0690

100200300400500600700800

pg/m

l


142


El estudio de los niveles de la COX-2 se realizó por western blot a partir

de la fracción microsomal del homogeneizado de rodillas de ratones STR/ort, tras

haber recibido cuatro semanas de tratamiento con SnPP y BIS069. La figura 74

muestra los valores obtenidos del densitometrado de las bandas de COX-2

normalizados con los valores obtenidos del densitometrado de las bandas de

actina.


Figura 73: Niveles de prostaglandina E2 (PGE2) en el suero de ratonesSTR/ort tratados con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durantecuatro semanas. Se compararon los niveles de PGE2 en los sueros de ratonesSTR/ort de 11 semanas de edad con los ratones de la misma edad tratados durantecuatro semanas con BIS069. Media ± ε.


10

20

pg/m

L


143

En la gráfica se observa cómo los niveles de COX-2 aparecen

significativamente aumentados en los valores obtenidos de las rodillas de ratones

STR/ort tratado con SnPP. Los valores de COX-2 tras el tratamiento con BIS069

se muestran levemente elevados respecto de los animales sin tratar. La

inmunohistoquímica para COX-2 (fig. 75) no muestra diferencias significativas en

la expresión de la COX-2 tras ambos tratamientos.

Figura 74: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal dehomogenado de pata de ratones STR/ort y CBA de 11 semanas de edad tras 4semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. A: Imagendel western blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una veznormalizado al valor de la actina obtenido en cada caso. Media ± ε. ** test de studentp<0,01; SnPP vs control.

CBA CONTROL SnPP BIS0690

50010001500200025003000350040004500

**

Den

sida

d óp

tica

inte

grad

a(D

OI)

CBA STR/ort SnPP BIS069


A

B


144

STR/ort SnPP BIS069

STR/ort Control

A

B C

Control SnPP BIS0690

25

50

75

100

nº c

el p

ositi

vas

CO

X-2

D


Figura 75: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) encortes histológicos de rodillas de ratones STR/ort de 11 semanas de edad tras haberrecibido 4 semanas de tratamiento con SnPP y BIS069. A: articulación femororrotuliana deun ratón STR/ort control donde se observan los condrocitos positivos frente a COX-2; B: rodillade ratón STR/ort de tras la administración de SnPP durante 4 semanas con gran número decondrocitos positivos para COX-2; C: rodilla de ratón STR/ort tras el tratamiento con BIS069durante 4 semanas con un menor número de condrocitos del cartílago articular marcados paraCOX-2; D: comparación del número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2en rodillas de ratones STR/ort sin tratar y tratados.

Resultados. Modelo de artrosis provocada por ACLT

145

4.3 MODELO DE ARTROSIS PROVOCADA POR LA TRANSECCIÓN

DEL LIGAMENTO CRUZADO ANTERIOR (ACLT)

4.3.1. Degradación articular

En el modelo de artrosis por transección del ligamento cruzado anterior en

rata Wistar, estudiamos la progresión de la artrosis desde el tiempo 0 del

experimento (24 horas postcirugía) hasta 10 semanas tras la cirugía. Como en los

anteriores modelos, realizaremos un estudio histológico inicial que

complementaremos con la medición de biomarcadores de degradación articular y

de mediadores inflamatorios. En este caso estudiaremos únicamente la

articulación femorotibial y no la femororrotuliana, ya que es la articulación más

afectada por la transección del ligamento cruzado anterior que une y estabiliza el

fémur y la tibia.

Tras el sacrificio de los animales, algunas rodillas se intervinieron

quirúrgicamente para separar el fémur y la tibia con la precaución de no afectar

las superficies de cartílago articular. Tanto los cóndilos femorales como el platillo

tibial de rodillas sin operar y de rodillas sometidas a la transección del ligamento

cruzado anterior, se fotografiaron para obtener una primera información del estado

de la rodilla tras las 10 semanas que duró el estudio de la progresión de la artrosis

en este modelo experimental

Las rodillas izquierdas, que permanecieron intactas en las ratas Wistar a las que se

les practicó la ACLT se fotografiaron (fig. 76) y se pudo observar que las

superficies del cartílago articular de los cóndilos femorales se presentan libres de

erosión y con un aspecto brillante. El platillo tibial también aparece intacto, así

como el ligamento cruzado anterior que no ha sido seccionado, que presenta un

color brillante nacarado.


146

La fotografía de la rodilla sometida a la transección del ligamento cruzado

anterior 10 semanas después de la cirugía (fig. 77), muestra una erosión del

cartílago en la zona medial de los cóndilos femorales que aparece como una

pérdida de la coloración nacarada del cartílago articular. Además, en el platillo

tibial (fig 77B y C) se observa una pérdida del brillo del cartílago articular,

probablemente por la pérdida de componentes de la matriz extracelular y destacan

dos nuevas formaciones de distinta coloración en la región medial de ambos

platillos que, observadas a más aumentos (fig. 77C) son tridimensionales. Estas

formaciones podrían ser osteofitos similares a los encontrados en la artrosis

humana para estabilizar la articulación.

Figura 76: Fotografías de rodillas de rata Wistar sana realizadas a través de la lupa binocular transcurridas las 10 semanas del estudio de la progresión de la artrosis. A, B:las imágenes muestran las superficies de los cóndilos femorales y del platillo tibial intactos. El ligamento cruzado anterior aparece señalado con * y se puede apreciar el brillo nacarado característico del ligamento sano en B.

FÉMUR TIBIA

*

BA

Figura 76: Fotografías de rodillas de rata Wistar sana realizadas a través de la lupa binocular transcurridas las 10 semanas del estudio de la progresión de la artrosis. A, B:las imágenes muestran las superficies de los cóndilos femorales y del platillo tibial intactos. El ligamento cruzado anterior aparece señalado con * y se puede apreciar el brillo nacarado característico del ligamento sano en B.

FÉMUR TIBIA

*

BA

FÉMUR TIBIA

*

BA


147


Las rodillas de ratas Wistar sometidas a las transección del ligamento

cruzado anterior fueron radiografiadas para poder evaluar a nivel macroscópico el

daño producido por el desarrollo de la artrosis en este modelo experimental. En la

A

Figura 77: Fotografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y la rodilla contralateral intacta realizadas a través de la lupa binocular transcurridas las 10 semanas del estudio de la progresión de la artrosis. A: fotografía de los cóndilos femorales donde aparece en la superficie de la zona medial del cóndilo una leve erosión del cartílago. En el platillo tibial aparecen dos formaciones nuevas de cartílago (B) que, observadas a más aumentos (C) se asemejan a los osteofitos característicos en la artrosis humana. El ligamento cruzado anterior (*) aparece cicatrizado y contraído.

*

B

C

A

Figura 77: Fotografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y la rodilla contralateral intacta realizadas a través de la lupa binocular transcurridas las 10 semanas del estudio de la progresión de la artrosis. A: fotografía de los cóndilos femorales donde aparece en la superficie de la zona medial del cóndilo una leve erosión del cartílago. En el platillo tibial aparecen dos formaciones nuevas de cartílago (B) que, observadas a más aumentos (C) se asemejan a los osteofitos característicos en la artrosis humana. El ligamento cruzado anterior (*) aparece cicatrizado y contraído.

*

B

C


148

figura 78 observamos la rodilla de una rata Wistar sin haber sido intervenida, que

presenta perfectamente delimitadas las superficies articulares. Sin embargo, 24 h

tras la transección del ligamento cruzado anterior (tiempo 0) se observa una

importante sinovitis, como respuesta a la agresión mecánica a la que se le ha

sometido. Transcurridas 6 semanas de la cirugía, la sinovitis ha remitido

parcialmente pero las superficies de los cóndilos femorales aparecen erosionadas

de forma importante y la articulación se encuentra levemente dislocada. La

imagen radiográfica de una rodilla típicamente artrósica es la correspondiente a la

rodilla operada de ACLT 10 semanas postcirugía. La hendidura entre los cóndilos

femorales y el platillo tibial prácticamente ha desaparecido, denotando la pérdida

de gran parte del cartílago. Además, se pueden observar formaciones osificadas

coherentes con osteofitos.

0 6 10

10

AC

LT

si

n op

erar

Figura 78: Radiografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) a diferentes tiempos de supervivencia.En las radiografías se observa una rodilla intacta en el caso de la rodilla de rata Wistar sin operar 10 semanas tras el inicio del estudio y cómo las rodillas operadas sufren un progresivo deterioro con el paso de las semanas.

0 6 10

10

AC

LT

si

n op

erar

0 6 10

10

AC

LT

si

n op

erar

Figura 78: Radiografías de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) a diferentes tiempos de supervivencia.En las radiografías se observa una rodilla intacta en el caso de la rodilla de rata Wistar sin operar 10 semanas tras el inicio del estudio y cómo las rodillas operadas sufren un progresivo deterioro con el paso de las semanas.


149


Compararemos el grado de afectación de la articulación femorotibial

operada, con el estado de la rodilla contralateral que mantiene el ligamento

cruzado anterior intacto. Para ello realizaremos el estudio histopatológico

siguiendo las indicaciones de la OARSI.

4.3.1.2.1 Tinciones químicas

Las rodillas de rata Wistar sometidas a la ACLT muestran, como cabría

esperar, transcurridas 24 horas de la operación, el ligamento cruzado anterior

seccionado completamente y contraído formando una cicatriz (fig. 79) rica en

infiltrado leucocitario. En las articulaciones femorotibiales de todos los

ejemplares estudiados, aparece la membrana sinovial desarrollada y con un

importante infiltrado inflamatorio, como respuesta a la agresión que supone la

cirugía (fig. 80).

Por el contrario, la intervención desestabilizadora que supone el cercenar

el ligamento cruzado anterior, que a las 24 horas ha provocado una respuesta

inflamatoria importante, no ha afectado a las superficies del cartílago articular,

como muestra la figura 81. Estos datos sugieren que la desestabilización de la

articulación femorotibial provoca la erosión del cartílago articular a lo largo del

tiempo y no como causa de la manipulación quirúrgica. En las micrografías de la

figura 81 no se observa ni erosión de la superficie del cartílago ni una pérdida de

proteoglicanos de éste. Por tanto, concluimos que a tiempo 0 del estudio las

rodillas de rata Wistar no presentan las características propias de la degradación

articular que conlleva la artrosis.

A las 6 semanas de la intervención se sacrifica otro grupo de ratas Wistar

como se explicó en el apartado de Material y métodos, y se realiza el estudio


150

histológico de dichas rodillas. Se observa la progresiva degradación del cartílago

articular y un aumento en la erosión de las superficies articulares que se hacen

TIBIA

FÉMUR

ACL

*

TIBIA

FÉMUR

ACL*

A B

Figura 79: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina (A) y O-safranina (B) de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamentocruzado anterior (ACL) y sacrificadas 24 horas tras la cirugía (tiempo 0). En ambasmicrografías se observa el ligamento cruzado anterior seccionado y contraido formando unacicatriz. También se puede observar la membrana sinovial (*) con infiltrado leucocitario.

ACL

TIBIA

FÉMUR

MS

A

ACL

TIBIA

FÉMUR

MS

B

Figura 80: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina (A) y O-safranina (B) de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamentocruzado anterior (ACL) y sacrificadas 24 horas tras la cirugía (tiempo 0). Se puedeobservar el ligamento cruzado anterior seccionado y la membrana sinovial (MS) másdesarrollada y con un infiltrado leucocitario notable, coherente con una sinovitis.


151

mucho más patentes al final del estudio, cuando han transcurrido 10 semanas

desde la transección del ligamento cruzado anterior.

A tiempo final del estudio de la evolución de la artrosis en el modelo de

ACLT en rata Wistar, observamos (fig. 82) la cicatriz tibial dejada por el corte del

ligamento que unía la tibia y el fémur levemente reducida, y una membrana

sinovial ampliamente desarrollada, aunque con menor infiltrado inflamatorio que

a las 24 horas de la cirugía. También observamos el menisco medial gravemente

afectado por la erosión provocada por la desestabilización de la articulación

femorotibial, que implica no sólo la pérdida de proteoglicanos de la matriz

extracelular del cartílago, como muestra el cambio de coloración en la tinción con

O-safranina, sino la erosión de la superficie con una importante pérdida de

condrocitos.

Figura 81: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina (A) yO-safranina (B) de los cóndilos femorales de rodillas de rata Wistar sometidas a latransección del ligamento cruzado anterior y sacrificadas 24 horas tras la cirugía(tiempo 0). En la micrografía A no se observa ninguna agresión de la capa más superficialdel cartílago articular ni pérdida de células y en la tinción con safranina no se observacambios de coloración del cartílago articular debidos a la pérdida de componentes de lamatriz extracelular.

BA


152

Las rodillas sometidas a la operación simulada donde únicamente se les

realizaban las incisiones pero sin seccionar el ligamento cruzado anterior, no

mostraron ningún tipo de alteración de la articulación, ni degradación del cartílago

articular. Sin embargo, sí presentaron una inflamación de la membrana sinovial

similar a la encontrada en los animales operados, probablemente como respuesta

inflamatoria a la agresión quirúrgica.

Hay que prestar una especial atención a los cambios histopatológicos que

sufre la membrana sinovial, a lo largo de la progresión de la artrosis en el modelo

que en este apartado estudiamos. La membrana sinovial, como ya hemos descrito

anteriormente, a las 24 horas de la intervención, aparece ampliamente desarrollada

y rica en infiltrado. Es decir, presenta características más propias de una sinovitis

que de un proceso artrósico. En cambio, al final del estudio la membrana sinovial

Figura 82: Fotografías de cortes parafinados teñidos con eosina/hematoxilina (A) yO-safranina (B) de rodillas de rata Wistar sometidas a la transección del ligamentocruzado anterior y sacrificadas 10 semanas tras la cirugía. En las micrografías seobservan lesiones en el cartílago articular del menisco medial (MM) y del platillo tibial,además de la membrana sinovial (MS) ampliamente desarrollada y vascularizada.Trancurridas 10 semanas desde la cirugía se distingue claramente la cicatriz formada en ellugar de inserción del ligamento cruzado anterior (*).

MM

MS

TIBIAA

MM MS

TIBIA B

* *


153

se observa inflamada aunque no en el grado que presentaba inicialmente, teniendo

un aspecto más coherente con la artrosis descrita en humanos.

Otro hecho a destacar es el incremento de la vascularización de la

membrana en los tiempos finales del experimento. Como muestra la figura 83, la

aparición de vasos en todas las membranas sinoviales de ratas Wistar estudiadas

es abundante en número y todos ellos presentan un calibre considerable. La

membrana sinovial ampliamente vascularizada puede ser la respuesta a una

inflamación crónica, como es el proceso degradativo que conlleva la artrosis.

Como ya se expuso en la introducción, la degradación del cartílago

articular produce la liberación de gran cantidad de componentes de la matriz

extracelular y restos celulares que activan el proceso inflamatorio de la membrana

sinovial. Por tanto, en el modelo de artrosis provocada por la transección del

ligamento cruzado anterior, se observa no sólo la degradación del cartílago

articular propia de la artrosis sino la progresión que sigue la membrana sinovial en

la patología que intenta representar este modelo.

*

*

*

*

*

Figura 83: Fotografía de corte parafinadoteñido con eosina/hematoxilina de lamembrana sinovial de una rodilla de rataWistar sometida a ACLT transcurridas 10semanas desde la cirugía. En la imagen seobserva, además del infiltrado linfocitario, unincremento de la vascularización (*) de lamembrana sinovial.


154

En este modelo también se realizó la evaluación histopatológica definida

por la OARSI de las rodillas sometidas a ACLT y se comparó la puntuación con

la obtenida de rodillas sin operar (fig. 84).

Las puntuaciones obtenidas a lo largo de la progresión de la enfermedad en

las articulaciones sometidas a ACLT demostraron que este modelo experimental

desarrolla una degradación articular similar a la artrosis humana.

Además, este modelo posee un desarrollo de la patología en todas las

rodillas operadas y con la suficiente gravedad como para poder evaluar la

progresión de la artrosis. Por todo lo expuesto anteriormente, consideramos que

este modelo era adecuado para realizar el estudio de la evaluación de los posibles

efectos de fármacos experimentales para el tratamiento de la artrosis.

0 2 4 6 8 100

10

20Sin operarOperada

Punt

uaci

ón (U

A)

Semanas tras la cirugía

0 2 4 6 8 100

10

20Sin operarOperada

Punt

uaci

ón (U

A)

Semanas tras la cirugía

Figura 84: Puntuación del estudio histopatológico según los criterios de la OARSI de las articulaciones de las ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior


155

4.3.2. Estudio de biomarcadores

Con el fin de evaluar el progreso de la degradación articular, tras la

transección quirúrgica del ligamento cruzado anterior, además de realizarse el

estudio histológico e inmunohistoquímico, se midieron en suero los niveles de

biomarcadores de degradación del cartílago, como son el C-telopéptido del

colágeno tipo II (CTX-II), la proteína oligomérica de la matriz del cartílago

(COMP) y el ácido hialurónico (HA). Estos biomarcadores pueden ayudar a

determinar las similitudes de este proceso experimental con la degradación

articular desarrollada en humanos.

C-telopéptido del colágeno tipo II (CTX-II)

Para medir los niveles del C-telopéptido del colágeno tipo II en el suero de

rata Wistar se utilizó el ELISA comercial de Cartilaps®, siguiendo las

indicaciones del fabricante.

Se cuantificaron los fragmentos resultantes de la degradación del colágeno

tipo II en el suero de animales a tiempo 0 del experimento, es decir, 24 horas tras

haber sido sometidos a la cirugía y a las 6 y 10 semanas postcirugía.

En los resultados obtenidos (fig. 85) se observa un aumento progresivo de

los niveles de CTX-II, que indican un aumento de la degradación del cartílago

articular con el paso del tiempo. A las 10 semanas tras la cirugía, el incremento de

los niveles del biomarcador es significativo respecto de los animales recién

operados, que representarían nuestras condiciones iniciales del experimento. Estos

datos, coherentes con la degradación del cartílago observada en el estudio

histológico, demuestran que el modelo de artrosis provocada por la transección

del ligamento cruzado anterior presenta incrementos en los niveles del

biomarcador CTX-II similares a los descritos en la patología humana.


156

Proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP)

Otro de los biomarcadores de gran importancia que se midieron en el

presente estudio fue la proteína oligomérica de la matriz del cartílago. Esta

medición se realizó en suero con un ELISA comercial de MDbiosciences,

siguiendo las indicaciones del fabricante.

De nuevo, se compararon los niveles obtenidos en ratas Wistar a tiempo 0

del experimento (24 h tras la cirugía) con los obtenidos en suero de ratas

sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior 6 ó 10 semanas tras la

cirugía (fig. 86).

Figura 85: Niveles de C-telopéptido terminal del colágeno tipo II(CTX-II) en elsuero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior(ACLT). Se compararon los niveles presentes a las 24h (tiempo 0) de la cirugía conlos obtenidos a las 6 y 10 semanas de la transección. Media ± ε * test de Dunett p<0,05; 10 semanas postcirugía vs tiempo 0

Semanas postcirugía

0 6 100

10

20

30

40

50

60

70 *

pg/m

L


157

Los resultados mostraron un incremento significativo a las 6 semanas tras

la cirugía en comparación con los niveles obtenidos 24 h después de la cirugía.

Dichos niveles se mantuvieron elevados transcurridas 10 semanas del inicio del

experimento, de forma significativa respecto de los niveles obtenidos a las 6

semanas. Los resultados demuestran que la transección del ligamento cruzado

anterior provoca una degradación de la matriz del cartílago articular que puede ser

seguida mediante la determinación de los niveles séricos de COMP, de forma

similar a la descrita en la artrosis humana, aunque los niveles medidos son muy

reducidos.

Figura 86: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Se compararon los niveles en suero a tiempo 0 (24h tras la cirugía) con los niveles a las 6 ó 10 semanas de la cirugía.Media ± ε. ** Test de Dunett. p<0,001; 6 y 10 semanas postcirugía vs tiempo 0.


0 6 100.000.050.100.150.200.250.300.350.40

* ** *ng

/mL

Figura 86: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Se compararon los niveles en suero a tiempo 0 (24h tras la cirugía) con los niveles a las 6 ó 10 semanas de la cirugía.Media ± ε. ** Test de Dunett. p<0,001; 6 y 10 semanas postcirugía vs tiempo 0.


0 6 100.000.050.100.150.200.250.300.350.40

* ** *ng

/mL


158

Ácido hialurónico (HA)

En el suero de ratas sometidas a la transección del ligamento cruzado

anterior también se midieron los niveles de ácido hialurónico, componente de gran

importancia en el cartílago, con un ELISA comercial de Echelon biosciences.

Los valores de HA obtenidos en sueros de ratas Wistar sometidas a la

ACLT (fig. 87) no presentan ninguna modificación por la progresión de la

enfermedad, siendo los valores muy similares al principio y al final del estudio.

4.3.3 Inflamación

Como ya se ha observado en el estudio histológico de la progresión de la

enfermedad en el modelo de artrosis producida por la transección del ligamento

Figura 87: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratas Wistarsometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Secompararon los sueros a las 24h de la cirugía (tiempo 0) con los niveles obtenidos alas 6 y 10 semanas tras la ACLT. Media ± ε.


0 6 100

1000

2000

3000

ng/m

L


159

cruzado anterior en rata Wistar, el componente inflamatorio está presente desde

las 24 horas posteriores a la cirugía. Destacan la sinovitis y el importante

infiltrado leucocitario que aparece inmediatamente tras la sección del ligamento.

Por tanto, creímos conveniente realizar un estudio de los principales

mediadores inflamatorios.


Dado que los niveles de IL-1β eran indetectables por la técnica de ELISA

en el suero de las ratas Wistar operadas de ACLT, se optó por medir los niveles de

IL-1β en el homogenado de tejidos de la articulación de la pata. De esta forma se

compararon los niveles obtenidos en homogenado de patas sin operar, patas

sometidas a la operación simulada y las patas operadas de ACLT (fig. 88).

En la gráfica podemos observar cómo existe un aumento importante de los

niveles de IL-1β local en las patas sometidas a la ACLT respecto de aquellas sin

operar. Es de destacar el caso de las rodillas sometidas a la operación simulada

que presentan niveles elevados de IL-1β aún transcurridas 10 semanas de la

operación. En la cirugía simulada, únicamente se accedía a la cápsula articular sin

seccionar el ligamento cruzado anterior, por tanto la inflamación que representan

los niveles de IL-1β locales elevados corresponden a la agresión que puede

suponer la manipulación quirúrgica y no el proceso degradativo que conlleva el

cercenar el ligamento cruzado anterior.


160

Figura 88: Niveles de IL-1ß en homogenado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Se compararon los niveles obtenidos en patas de ratas sin operar con las sometidas a una operación simulada ylas sometidas a la ACLT transcurridas 10 semanas de la ACLT. Media ± ε. * test de Dunnett p<0,05; operada vs sin operar.

sin opera

r

operació

n simulad

a

operada

0

100

200

300

400

500

600

700 *pg

/mL


161

Factor de Necrosis Tumoral α (TNF α)

Los niveles de TNFα se midieron por la técnica de ELISA tanto en suero

(fig. 89 ) como en homogeneizado de rodilla de rata Wistar (fig. 90).

En la medición de los niveles en suero se compararon los valores

obtenidos a las 24 horas de la intervención (tiempo 0) con los obtenidos a las 6 y

10 semanas tras la ACLT .

En la gráfica podemos observar cómo el proceso inflamatorio relacionado

con el desarrollo de la artrosis, en el modelo de transección del ligamento cruzado

anterior en rata Wistar, no se corresponde con aumentos en los niveles séricos de

Figura 89: Niveles de TNFα en suero de ratas Wistar sometidas a la transeccióndel ligamento cruzado anterior (ACLT). Se comparan entre los niveles obtenidosen ratas a tiempo 0 (24h tras la transección) con los niveles obtenidos 6 ó 10 semanaspostcirugía. Media ± ε.


0 6 100

100

200

pg/m

L


162

TNFα , no observándose ninguna diferencia entre los resultados obtenidos a las

24 horas de la cirugía y los correspondientes a ratas tras 10 semanas de la ACLT.

En la medida de los niveles de TNFα en homogeneizado de pata se

compararon los niveles presentes en las patas operadas con los niveles en las patas

sometidas a la cirugía simulada y las patas no operadas (fig. 90 ).

A diferencia de lo observado en suero, los niveles locales de TNFα sí

presentan un leve incremento, no significativo, de los niveles en patas de ratas

operadas tras 10 semanas de desarrollo de la artrosis.

Figura 90: Niveles de TNFα en homogenado de patas de ratas Wistartranscurridas 10 semanas desde la transección del ligamento cruzado anterior(ACLT). Se compararon los niveles obtenidos en patas de ratas sin operar, sometidasa una operación simulada y las sometidas a la ACLT. Media ± ε.

sin opera

r

operació

n simulad

a

operada

0100200300400500600700800900

pg/m

L


163


Dado que la citocina proinflamatoria IL-17 parece estar implicada en el

desarrollo del proceso inflamatorio en la artrosis, estudiamos los cambios en los

niveles de esta citocina durante la progresión de la artrosis en este modelo

experimental. Para su cuantificación se utilizó la técnica de ELISA y se empleó un

kit comercial de eBiosciences, siguiendo las indicaciones del fabricante.

En el suero de los animales no hubo niveles detectables ni a las 6 ni a las

10 semanas. Por tanto, se muestran los resultados obtenidos a nivel local en

Figura 91: Niveles de IL 17 en homogeneizado de patas de ratas Wistartranscurridas 10 semanas de la transección del ligamento cruzado anterior(ACLT). Se han comparado los niveles obtenidos en patas de ratas sin operar,sometidas a una operación simulada y las sometidas a la ACLT. Media ± ε. * test deDunnett p<0,05; operada vs sin operar.

sin opera

r

operació

n simulad

a

operada

0

10

20

30 *

pg/m

l


164

Figura 92: Niveles de IL-6 en suero de ratas Wistar sometidas a latransección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Se compararon losniveles obtenidos a diferentes tiempos tras la cirugía para estudiar loscambios en los niveles de IL-6 a lo largo de la progresión de la artrosis.Media ± ε.


0 6 100

100

200

300

400

500

600

700

pg/m

l

homogeneizado de rodillas de rata Wistar, transcurridas las 10 semanas que duró

el estudio de la progresión de la artrosis (fig. 91). Se observó que los niveles

aumentaban levemente en las rodillas sometidas a la operación simulada, mientras

que el incremento de la citocina proinflamatoria en las rodillas ACLT era

aproximadamente del 100% respecto de los niveles presentes en las rodillas sin

operar.


La IL-6 también parece estar implicada en la inflamación asociada a la

progresión de la artrosis, por tanto nos dispusimos a medirla tanto a nivel


165

sistémico (suero) como local (homogeneizado de pata), empleando un ELISA

comercial de Peprotech.

En el estudio de IL-6 en suero (fig. 92), observamos cómo los niveles

aumentan progresivamente desde los presentes en animales 24 horas tras la

cirugía hasta 10 semanas después. Estos resultados confirman la presencia del

proceso inflamatorio subyacente a la degradación articular, inducido en este

modelo experimental.

Los niveles obtenidos a nivel local (fig. 93) demuestran que tanto la

cirugía simulada como la ACLT inducen un incremento significativo de los

Figura 93: Niveles de IL-6 en homogeneizado de patas de ratas Wistar transcurridas 10 semanas de la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Se compararon los niveles de la citocina en patas de ratas sin operar con los presentes en rodillas sometidasa la operación simulada y a la ACLT. Media ± ε. ** test de Dunnett p<0,01; op. simulada y operada vs sin operar.

sin opera

r

operació

n simulad

a

operada

0

250

500

750 ** **

pg/m

l


166

niveles de IL-6 respecto de la rodilla sin intervenir. Lo que indicaría que la

intervención quirúrgica, y no la transección del ligamento cruzado anterior estaría

induciendo la respuesta inflamatoria mediada por la IL-6.


Los niveles de PGE2 se midieron por radioinmunoensayo. En primer lugar

se estudió en el suero de ratas Wistar, para comparar los valores presentes en

suero a las 24 horas de la cirugía, 6 semanas ó 10 semanas tras la transección del

ligamento cruzado anterior (fig. 94). En la gráfica observamos cómo, desde un

nivel basal, a las 24 horas de la intervención, los niveles de PGE2 aumentan

Figura 94: Niveles de prostagladina E2 (PGE2) en el suero de ratas Wistarsometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT). Secompararon los sueros de ratas a tiempo 0 (24h tras la ACLT) con ratas operadastras 6 ó 10 semanas de la intervención. Media ± ε. test de Dunnett p<0,05; * 6 y10 semanas vs tiempo 0; # 10 semanas vs 6 semanas


0 6 100

100

200

*

#*

pg/m

L


167

progresivamente con el paso del tiempo y la progresión de la enfermedad. Los

niveles de PGE2 que aparecen a las 10 semanas de la transección del ligamento

cruzado anterior son significativamente mayores que los que encontramos a

tiempo 0 y a las 6 semanas.

Cuantificamos también los niveles de PGE2 en el homogeneizado de

rodillas de rata Wistar para estudiar los efectos de la ACLT a nivel local (fig. 95).

En la gráfica observamos el nivel basal de PGE2 correspondiente a las

patas sin operar y cómo este nivel se ve levemente incrementado por la operación

simulada, donde aparece una leve respuesta inflamatoria. Es de destacar el

importante aumento de PGE2 en las patas sometidas a la ACLT respecto de las

rodillas intactas.

Figura 95: Niveles de prostagladina E2 (PGE2) en los homogeneizados derodillas de ratas Wistar transcurridas 10 semanas de la transección delligamento cruzado anterior (ACLT). Se observa un incremento de los niveles deprostaglandina local en las rodillas sometidas a la ACLT en comparación con lasrodillas sin operar. Media ± ε.

sin opera

r

operacio

n simulad

a

operada

0

10

20

30

40

pg/m

L


168


Los niveles locales de COX-2 se midieron los homogeneizados de patas de

rata Wistar por las técnicas de Western blot y en cortes histológicos de la

articulación femorotibial por inmunohistoquímica.

Los resultados del western blot se presentan en la figura 96A. Los valores

del densitometrado de las bandas se normalizaron frente a la densidad óptica

obtenida de la banda de actina (fig. 96B). En la gráfica podemos observar que los

niveles basales de COX-2 no parecen aumentar tras la operación simulada,

mientras que aparece un incremento muy significativo en los niveles de COX-2 10

semanas tras la transección del ligamento cruzado anterior.

La inmunohistoquímica para COX-2 corroboró los resultados obtenidos

por western blot (fig. 97). El número de condrocitos positivos en la superficie del

cartílago articular fue significativamente mayor en las articulaciones sometidas a

operación simulada y las sometidas a la transección del ligamento cruzado

anterior que en el cartílago de rodillas sin operar.


169

Sin op. Sim operada

A

B

sin operar simulada operada0

50

100

150 **

Den

sida

d óp

tica

inte

grad

a(IO

D)

10 semanas tras la operación

Figura 96: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal de homogeneizado de pata de ratas Wistar 10 semanas tras el inicio del estudio. A: Imagen del western blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado al valor de la actina obtenido en cada caso. Transcurridas las 10 semanas tras la cirugía, los niveles de COX-2 han aumentado significativamente. ** test de Dunett p<0,01.

Sin op. Sim operada

A

B


50

100

150 **

Den

sida

d óp

tica

inte

grad

a(IO

D)


Sin op. Sim operada Sin op. Sim operada

A

B

A

B


50

100

150 **

Den

sida

d óp

tica

inte

grad

a(IO

D)


Figura 96: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en fracción microsomal de homogeneizado de pata de ratas Wistar 10 semanas tras el inicio del estudio. A: Imagen del western blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado al valor de la actina obtenido en cada caso. Transcurridas las 10 semanas tras la cirugía, los niveles de COX-2 han aumentado significativamente. ** test de Dunett p<0,01.


170

Operada

Sin operar Operación simulada

A

B C

sin operar op simulada operada0

25

50

75

100

****

**

nºce

l pos

itiva

s C

OX-

2

D

10 tras la cirugía

Figura 97: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en costes histológicos de rodillas de ratas Wistar 10 semanas tras el inicio del estudio. A: articulación femorotibial de rata Wistar sometida a ACLT; B: rodilla de rata Wistas sin operar; C: rodilla de rata sometida a una operación simulada; D: número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 en rodillas de ratas Wistar . * test de Dunett p<0,05; ** test de Dunett p<0,01.

Operada


A

B C


25

50

75

100

****

**

nºce

l pos

itiva

s C

OX-

2

D

10 tras la cirugía

Operada


A

B C


25

50

75

100

****

**

nºce

l pos

itiva

s C

OX-

2

D

Operada


Operada Operada

Sin operar Operación simuladaSin operar Operación simulada

A

B C


25

50

75

100

****

**

nºce

l pos

itiva

s C

OX-

2

D


25

50

75

100

****

**

nºce

l pos

itiva

s C

OX-

2

D

10 tras la cirugía

Figura 97: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en costes histológicos de rodillas de ratas Wistar 10 semanas tras el inicio del estudio. A: articulación femorotibial de rata Wistar sometida a ACLT; B: rodilla de rata Wistas sin operar; C: rodilla de rata sometida a una operación simulada; D: número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 en rodillas de ratas Wistar . * test de Dunett p<0,05; ** test de Dunett p<0,01.


171

4.3.4 Estudio de fármacos. Estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069

Según el estudio histológico anteriormente expuesto y el análisis de

biomarcadores de la degradación del cartílago, el modelo de artrosis provocada

por la transección del ligamento cruzado anterior en rata Wistar puede ser un

modelo apto para el estudio de nuevos posibles tratamientos de la enfermedad.

Por tanto, nos dispusimos a testar los fármacos estudiados anteriormente

en el modelo de desarrollo espontáneo de la artrosis en ratones STR/ort, en el

presente modelo experimental de artrosis.

4.3.4.1 Evolución del peso de los animales

Para evaluar los efectos de los fármacos sobre la salud de los animales,

éstos fueron pesados semanalmente a lo largo de las diez semanas que duró el

tratamiento (fig. 98) y se comprobó que ninguno de los dos tratamientos estaba

afectando el estado de salud de las ratas operadas de ACLT, ya que presentan un

incremento de pesos similar a las ratas control.


Los posibles efectos de los tratamientos con SnPP y BIS069 a nivel

macroscópico se evaluaron mediante estudio radiográfico (fig. 99). Las imágenes

de rodillas de ratas control muestran erosionada la superficie del cartílago

articular, tanto de los cóndilos femorales como del platillo tibial y una importante

sinovitis. Las rodillas de ratas tratadas con SnPP muestran erosionada la superficie

de los cóndilos femorales, aunque en menor medida que en las rodillas control y

no están presentes los signos de sinovitis. En la rodilla de las ratas tratadas con

BIS069 resalta la sinovitis, pero la degradación del cartílago articular es

significativamente menor que en la rodilla de las ratas sometidas a ACLT control.


172

Semanas de tratamiento

1 2 3 4 5 6 7 8 9200

300

400Control

peso

(g)

1 2 3 4 5 6 7 8 9200

300

400SnPP

peso

(g)

1 2 3 4 5 6 7 8 9200

300

400BIS069

peso

(g)

Figura 98: Gráfica de la progresión de los pesos de ratas Wistarsometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas.

Semanas de tratamiento

1 2 3 4 5 6 7 8 9200

300

400Control

peso

(g)

1 2 3 4 5 6 7 8 9200

300

400SnPP

peso

(g)

1 2 3 4 5 6 7 8 9200

300

400BIS069

peso

(g)

Figura 98: Gráfica de la progresión de los pesos de ratas Wistarsometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas.


173


Para evaluar los posibles efectos de los fármacos SnPP y BIS069, tras las

10 semanas de tratamiento se realizó un estudio histológico de las articulaciones.

En la figura 100 observamos las imágenes de cortes histológicos de

rodillas sometidas a ACLT. La figura 100A muestra la articulación femorotibial

de una rata control (sin tratamiento) con una importante erosión del cartílago

articular (G5E3; P15) a las 10 semanas de iniciar el estudio.

Los cortes de rodillas operadas tras las 10 semanas de tratamiento

demuestran una menor puntuación en la evaluación de la OARSI. Tras la

administración de SnPP (fig. 100B) el cartílago no presenta erosión del cartílago y

posee los condrocitos superficiales intactos (G1E1; P1).

Control SnPP BIS069

Figura 99: Radiografías de rodillas de rata Wistar 10 semanas tras la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas conestaño protoporfirina IX (snPP) y BIS069.

Control SnPP BIS069Control SnPP BIS069

Figura 99: Radiografías de rodillas de rata Wistar 10 semanas tras la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas conestaño protoporfirina IX (snPP) y BIS069.


174

ACLT SnPP BIS069


10

20

Punt

uaci

ón (U

A)

ACLT Control

A

B C

D


Figura 100: Evaluación histopatológica del cartílago articular según los criterios de la OARSI de rodillas de ratas Wistar sometidas a ACLT.


175

Aunque el sistema de evaluación de la OARSI no recoja este parámetro, es

de destacar también la presencia de sinovitis. Además, los animales tratados

presentan una importante reducción de la sinovitis que se observa en los animales

control.

En cambio, los animales que han sido tratados con BIS069 (fig. 100C)

presentan pequeñas fisuras en el cartílago con pérdida de algunos condrocitos

superficiales (G2E3; P6), y la disminución de la sinovitis es muy leve tras el

tratamiento. En la gráfica (fig. 100D) observamos la importante disminución entre

la puntuación del cartílago control y el cartílago procedente de animales que han

recibido los tratamientos.


Dado que el estudio de la progresión de la enfermedad en el modelo

experimental de artrosis provocada por la transección del ligamento cruzado en

rata Wistar presentó modificaciones evaluables de diversos biomarcadores de

degradación del cartílago, se procedió a medir los posibles cambios en los niveles

de éstos para conocer la implicación de los fármacos que se han testado y así

evaluar los efectos de dichos tratamientos sobre la progresión de la enfermedad.

C-telopéptido del colágeno tipo II (CTX-II)

Un parámetro de gran importancia para evaluar los posibles efectos

protectores de la SnPP y el BIS069 es el C-telopéptido del colágeno tipo II (CTX-

II), ya que es un marcador de la degradación del colágeno tipo II presente en el

cartílago articular. Por ello nos planteamos medir los niveles de CTX-II en el

suero de las ratas sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior


176

(control) y compararlo con los animales tratados (fig. 101). Para su medición se

empleó un ELISA de Cartilaps, según indicaba el fabricante.

En el estudio de la progresión de la artrosis en este modelo, el CTX-II

resultó ser un buen indicador de la degradación articular, con valores que

aumentan en relación con la progresión de la enfermedad (fig. 85). En la gráfica

podemos observar cómo únicamente el SnPP reduce significativamente los

niveles de CTX-II en suero tras 10 semanas de tratamiento, mientras que el

BIS069 no parece estar protegiendo al cartílago de su pérdida de colágeno.


Figura 101: Niveles de C-telopéptido terminal del colágeno tipo II(CTX-II) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras 10 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Se compararon los sueros de las ratas tratadas con los sueros de las ratas control 10 semanas tras la cirugía. Media ± ε. **Test de Dunnett p<0,01.


10

20

30

40

50

60

70

* *pg/m

L


Figura 101: Niveles de C-telopéptido terminal del colágeno tipo II(CTX-II) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras 10 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Se compararon los sueros de las ratas tratadas con los sueros de las ratas control 10 semanas tras la cirugía. Media ± ε. **Test de Dunnett p<0,01.


10

20

30

40

50

60

70

* *pg/m

L


177

Proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP)

Para medir los niveles de COMP en el suero de rata se utilizó un ELISA

comercial. La proteína oligomérica de la matriz del cartílago, en este modelo

animal experimental, ha resultado ser un buen biomarcador, ya que en el estudio

de la progresión de la enfermedad presentó un aumento significativo de sus

niveles con el empeoramiento de la artrosis (fig. 86).

Se compararon los niveles en el suero de ratas control con los obtenidos en

las ratas operadas a las que se les administró SnPP ó BIS069 durante 10 semanas

(fig. 102) y no se observaron diferencias en los niveles de COMP tras ambos

tratamientos.

Figura 102: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño-protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los sueros de las ratas tratadas con los de ratas operadas de la misma edad. Media ± ε. * Test de Dunett. p<0,05; SnPP vs control.


Control SnPP BIS069

0.010.060.110.160.210.260.310.36

U/L

Figura 102: Niveles de proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño-protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los sueros de las ratas tratadas con los de ratas operadas de la misma edad. Media ± ε. * Test de Dunett. p<0,05; SnPP vs control.


Control SnPP BIS069

0.010.060.110.160.210.260.310.36

U/L


178

Ácido hialurónico (HA)

La evaluación de los efectos de los tratamientos sobre la degradación del

cartílago articular durante la progresión de la artrosis se completó con la medida

de HA en suero. Se compararon, de nuevo, los niveles presentes en el suero de

ratas operadas sin tratamiento con las operadas y tratadas durante 10 semanas (fig.

103), para conocer los efectos que hayan podido tener los tratamientos con SnPP

ó BIS069 sobre la progresión de la artrosis en este modelo experimental. En los

resultados encontramos un aumento significativo en los niveles de HA en el suero

de ratas tratadas durante 10 semanas con BIS069.


Figura 103: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069.Media ± ε. **Test de Dunnett p<0,01.


1000

2000

3000 **

ng/m

L


Figura 103: Niveles de ácido hialurónico (HA) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069.Media ± ε. **Test de Dunnett p<0,01.


1000

2000

3000 **

ng/m

L


179

4.3.4.5 Inflamación

Dado que en el modelo de artrosis provocada por la transección del

ligamento cruzado anterior en rata Wistar se ha observado que el componente

inflamatorio está presente desde el inicio del proceso, nos dispusimos a estudiar

los posibles efectos de los fármacos testados sobre los mediadores inflamatorios

que se expresan en este modelo experimental.


Los niveles de IL-1β en el suero de las ratas Wistar sometidas a la

transección del ligamento cruzado anterior fueron indetectables para la técnica de

ELISA, por tanto se decidió medir los niveles en los homogeneizados de patas

usando un ELISA comercial. Y, así, comparamos los efectos de los tratamientos

administrados sobre la inflamación local (fig. 104).

En la figura observamos una ligera disminución, no significativa

estadísticamente, de los niveles de IL-1β en el caso de las ratas Wistar sometidas a

ACLT y tratadas con SnPP durante 10 semanas. La administración de BIS069 no

afecta los niveles de IL-1β en las rodillas de estos animales.


180

Factor de Necrosis Tumoral α (TNF α)

Los resultados obtenidos en el estudio de los niveles de TNFα en suero a

lo largo del desarrollo de la artrosis en este modelo experimental no mostraron

ninguna modificación con la progresión de la enfermedad (fig. 89). Por tanto,

como cabría esperar, el tratamiento con SnPP ó BIS069 no produjo ninguna

modificación de los niveles de TNFα en suero (fig. 105).

Dado que en el estudio de la influencia del TNFα sobre este modelo de

artrosis sólo apareció un leve incremento de los niveles de TNFα en la medición

sobre homogenados de rodillas de ratas transcurridas 10 semanas desde la

Figura 104: Niveles de IL 1ß en homogenado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε.



100

200

300

400

500

600

pg/m

L

Figura 104: Niveles de IL 1ß en homogenado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε.



100

200

300

400

500

600

pg/m

L


181

transección del ligamento cruzado anterior (fig. 90), nos dispusimos a medir los

niveles de TNF α en el homogenado de rodillas para comparar los resultados con

los obtenidos tras las 10 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX

(SnPP) ó BIS069 (fig. 106).

En la gráfica observamos que ambos tratamientos disminuían los niveles

de TNFα levemente aunque la administración de BIS069 lo hacía en mayor grado,

sin llegar a tener significación estadística.


Figura 105: Niveles de TNFα en suero de ratas Wistar operadas de ACLT tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069.Comparando los niveles obtenidos en ratas sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 10 semanas después de la cirugía con los sueros de ratas operadas de ACLT tras el tratamiento de 10 semanas con las moléculas a estudio. Media ± ε.


50

100

150

200

250

pg/m

L


Figura 105: Niveles de TNFα en suero de ratas Wistar operadas de ACLT tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069.Comparando los niveles obtenidos en ratas sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) 10 semanas después de la cirugía con los sueros de ratas operadas de ACLT tras el tratamiento de 10 semanas con las moléculas a estudio. Media ± ε.


50

100

150

200

250

pg/m

L


182


Dado que la IL-17 parece estar implicada en el proceso inflamatorio

asociado a la artrosis en este modelo experimental, nos dispusimos a evaluar si los

tratamientos con los fármacos en estudio tenían algún efecto sobre los niveles de

esta citocina proinflamatoria (fig 107). De nuevo, se realizaron las mediciones en

homogeneizado de pata dado que en el suero de los animales no eran detectables

sus niveles y, para ello se empleó un ELISA comercial.


Figura 106: Niveles de TNFα en el homogenado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los niveles presentes en patas de ratas tratadas con los niveles de las ratas control 10 semanas después de la ACLT. Media ± ε.


100200300400500600700800900

pg/m

L


Figura 106: Niveles de TNFα en el homogenado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los niveles presentes en patas de ratas tratadas con los niveles de las ratas control 10 semanas después de la ACLT. Media ± ε.


100200300400500600700800900

pg/m

L


183

Los resultados obtenidos revelaron una disminución de los niveles de la IL-17

asociada a ambos tratamientos, aunque sólo de forma significativa en los animales

tratados con SnPP durante 10 semanas.


Los posibles efectos de los fármacos en estudio sobre los niveles de IL-6

se evaluaron a nivel sistémico (suero) y a nivel local (homogeneizado de pata).

Los resultados obtenidos en suero demuestran que sólo el tratamiento con

SnPP durante 10 semanas es capaz de reducir significativamente los niveles de la

citocina (fig 108).


10

20

30

*

pg/m

l


Figura 107: Niveles de IL 17 en homogeneizado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras haber sido tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε. * Test de Dunnett p<0,05.


10

20

30

*

pg/m

l


Figura 107: Niveles de IL 17 en homogeneizado de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras haber sido tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε. * Test de Dunnett p<0,05.


184

En cambio, los niveles de IL-6 a nivel local no parecen estar modificados

por ninguno de los dos tratamientos (fig 109), presentando en ambos casos niveles

similares a los encontrados en las rodillas de los animales control de la misma

edad. Como se ha indicado con anterioridad, los niveles de esta citocina estarían

más relacionados con la respuesta inflamatoria producida por la intervención

quirúrgica y no como consecuencia de la progresión de la enfermedad (fig. 93).

Figura 108: Niveles de IL-6 en sueros de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε. * Test de Dunnett p<0,05.



250

500

750

*pg/m

l

Figura 108: Niveles de IL-6 en sueros de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε. * Test de Dunnett p<0,05.



250

500

750

*pg/m

l


185


Los posibles efectos antiinflamatorios de los tratamientos administrados

durante 10 semanas se evaluaron midiendo los niveles de PGE2 por

radioinmuniensayo en el suero de las ratas Wistar sometidas a ACLT (fig. 110).

En el estudio sobre la progresión de la artrosis en este modelo

experimental, observamos que la PGE2 era uno de los mediadores inflamatorios

que más se incrementaba con el paso del tiempo y la progresión de la enfermedad.

Por tanto, nos planteamos si PGE2 podría estar desempeñando un papel

importante en el proceso inflamatorio que acompaña a la artrosis en este modelo

(fig. 94-95).


100200300400500600700800900

pg/m

L


Figura 109: Niveles de IL-6 en homogeneizados de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε.


100200300400500600700800900

pg/m

L


Figura 109: Niveles de IL-6 en homogeneizados de patas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) y tratadas durante 10 semanas con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069. Media ± ε.


186

En la figura 110 podemos observar cómo ambos tratamientos disminuyen

muy significativamente los niveles de PGE2 en el suero de ratas Wistar sometidas

a ACLT y tratadas durante 10 semanas con los fármacos en estudio. Por tanto,

podríamos suponer que los efectos antiinflamatorios de dichos compuestos están

mediados por la PGE2 .

En la figura 111 se muestran los niveles de PGE2 presentes en el

homogenado de las rodillas operadas, comparando los niveles obtenidos en las

rodillas sometidas a ACLT sin recibir tratamiento con aquellas ratas operadas a

las que se les ha administrado durante 10 semanas los fármacos en estudio.

Figura 110: Niveles de prostagladina E2(PGE2) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Media ± ε. ** test de Dunett. p<0,01.



50

100

150

** **

pg/m

L

Figura 110: Niveles de prostagladina E2(PGE2) en el suero de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) ó BIS069 durante 10 semanas. Media ± ε. ** test de Dunett. p<0,01.



50

100

150

** **

pg/m

L


187

La gráfica muestra cómo a nivel local, los fármacos han ejercido también

su acción antiinflamatoria, reduciendo significativamente los niveles de la

prostaglandina tras ambos tratamientos.


La COX-2 se midió tanto por western blot en el homogenado de pata de

rata como por inmunohistoquímica en cortes histológicos de la articulación

femorotibial.


Figura 111: Niveles de prostaglandina E2(PGE2) en el homogenado de rodillas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los niveles locales de PGE2 en ratas tratadas durante 10 semanas con los niveles obtenidos en patas de ratas operadas 10 semanas después de la cirugía. Media ± ε. ** test de Dunett. p<0,01.


5

10

15

20

25

30

35

** **

pg/m

L


Figura 111: Niveles de prostaglandina E2(PGE2) en el homogenado de rodillas de ratas Wistar sometidas a la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tras el tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069 durante 10 semanas. Se compararon los niveles locales de PGE2 en ratas tratadas durante 10 semanas con los niveles obtenidos en patas de ratas operadas 10 semanas después de la cirugía. Media ± ε. ** test de Dunett. p<0,01.


5

10

15

20

25

30

35

** **

pg/m

L


188

Los resultados obtenidos por western blot muestran una reducción

significativa de los niveles de COX-2 tras las 10 semanas de tratamiento con

SnPP y BIS069. Esta reducción de los niveles de COX-2 es también observada en

la inmunohistoquímica para COX-2 (fig. 113), siendo en este caso también

significativa la reducción de condrocitos articulares positivos para el anticuerpo

para COX-2 tras ambos tratamientos.

control SnPP BIS069


50

100

150

* *

Den

sida

d óp

tica

inte

grad

a(D

.O.I.

)

A

B


Figura 112: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en homogenado de pata de ratas Wistar sometidas a ACLT tras 10 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. A: Imagen del western blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado al valor de la actina obtenido en cada caso. Tras el tratamiento con SnPP y BIS069 durante 10 semanas los niveles de COX-2 han disminuido significativamente. * test de Dunett p<0,05.

control SnPP BIS069


50

100

150

* *

Den

sida

d óp

tica

inte

grad

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.O.I.

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A

B


control SnPP BIS069control SnPP BIS069


50

100

150

* *

Den

sida

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inte

grad

a(D

.O.I.

)

A

B

A

B


Figura 112: Western blot para ciclooxigenasa 2 (COX-2) en homogenado de pata de ratas Wistar sometidas a ACLT tras 10 semanas de tratamiento con estaño protoporfirina IX (SnPP) y BIS069. A: Imagen del western blot para COX-2; B: valores del densitometrado de las bandas una vez normalizado al valor de la actina obtenido en cada caso. Tras el tratamiento con SnPP y BIS069 durante 10 semanas los niveles de COX-2 han disminuido significativamente. * test de Dunett p<0,05.


189

Control

SnPP BIS069

A

B C

Figura 113: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en costes histológicos de rodillas de ratas Wistar tras 10 semanas de tratamiento con estñoprotoporfirina IX (SnPP) y BIS069. A: articulación femorotibial de rata Wistar sometida a ACLT; B: rodilla de rata sometida a ACLT tras la administración de SnPP; C: rodilla de rata sometida a ACLT tras la administración de BIS069; D: número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 en cartílago de rodillas de ratas Wistar . ** test de Dunettp<0,01.

D



25

50

75

100

****

nºce

l pos

itiva

s C

OX-

2

Control Control

SnPP BIS069

A

B C

Figura 113: Micrografías de la inmunohistoquímica frente a ciclooxigenasa 2 (COX-2) en costes histológicos de rodillas de ratas Wistar tras 10 semanas de tratamiento con estñoprotoporfirina IX (SnPP) y BIS069. A: articulación femorotibial de rata Wistar sometida a ACLT; B: rodilla de rata sometida a ACLT tras la administración de SnPP; C: rodilla de rata sometida a ACLT tras la administración de BIS069; D: número de células positivas en la inmunohistoquímica para COX-2 en cartílago de rodillas de ratas Wistar . ** test de Dunettp<0,01.

D



25

50

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100

****

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l pos

itiva

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OX-

2

D



25

50

75

100

****

nºce

l pos

itiva

s C

OX-

2


190

5. DISCUSIÓN

Discusión

191

5. DISCUSIÓN

La artrosis es una de las enfermedades de mayor prevalencia entre la

población anciana. Es una enfermedad incapacitante y, por tanto, su diagnóstico

precoz es de gran importancia. El estudio de biomarcadores posee un gran interés

porque puede ayudar a establecer un diagnóstico más precoz, conocer mejor la

patología de la artrosis, identificar dianas moleculares para el desarrollo de

tratamientos más eficaces que los actuales, así como a seguir la evolución de la

enfermedad y el resultado de las intervenciones terapéuticas (Williams y Spector,

2008; Rousseau y Delmas, 2007).

Los modelos animales constituyen una importante herramienta para

conocer las bases del desarrollo de la enfermedad, estudiar los posibles

biomarcadores expresados a lo largo de la progresión de la artrosis y caracterizar

los efectos de nuevos fármacos.

En la presente Tesis se han puesto a punto 3 modelos experimentales de

artrosis con la finalidad de poder validarlos, para posteriormente ser empleados en

el estudio de los fármacos estaño proporfirina IX (SnPP) y BIS069.

El trabajo con animales de experimentación es delicado, laborioso y

requiere de una formación especializada. Es importante conocer y caracterizar

todos los parámetros de cada modelo que puedan servir para poder evaluar y

conocer la progresión de la enfermedad. Como ya se menciona en la introducción

de este trabajo, los modelos animales reproducen algunos de los aspectos de la

patología que representan, pero difícilmente reproducen todas las variables

implicadas en la etiopatogénesis y la progresión de la artrosis.

Los modelos desarrollados en esta Tesis intentan representar entre todos

ellos todo el abanico de características de la enfermedad. Así, en primer lugar, el

Discusión

192

modelo de artrosis inducida por la inyección intraarticular de colagenasa,

todo y siendo un modelo controvertido, lo escogimos con la finalidad de observar

un proceso artrósico relativamente rápido y poder estudiar el desarrollo de los

osteofitos, formaciones de gran importancia en la artrosis características de este

modelo.

Una de las limitaciones principales de este estudio fue el hecho de que, al

tratarse de una artrosis monoarticular, la liberación al suero de los diversos

biomarcadores de degradación del cartílago y los mediadores inflamatorios no era

detectable por las técnicas empleadas habitualmente en nuestro laboratorio. Dado

que este modelo no permitía realizar un seguimiento sistémico de la enfermedad y

que ésta no se desarrolló con la gravedad suficiente ni con la suficiente incidencia,

no creímos conveniente emplear este modelo experimental para ensayar los

fármacos que se estudian en esta Tesis.

El segundo modelo que se puso a punto fue el desarrollo espontáneo de

la artrosis en ratones STR/ort. Como se explica más adelante, se realizaron

estudios preliminares para poder reproducir la proporción de animales que

desarrollan la enfermedad y la gravedad de ésta. Este modelo, al tratarse de una

artrosis poliarticular, requirió de un estudio inicial de todas las articulaciones

candidatas a padecer una degradación evaluable, como se presenta en el apartado

de resultados. Este modelo consiguió reproducir una artrosis de rodilla que se

estimó susceptible de ser empleada para el estudio de los fármacos SnPP y

BIS069.

El último modelo desarrollado, la artrosis provocada por la transección

del ligamento cruzado anterior en rata Wistar, resultó un modelo muy

reproducible y con muestras de una desarrollo artrósico que englobaba tanto la

degradación articular como la inflamación asociada a ésta. Aunque se trataba de

Discusión

193

una artrosis provocada únicamente en una articulación, la degeneración era

suficientemente severa como para poder detectar en el suero de los animales gran

parte de los mediadores inflamatorios y biomarcadores de degradación del

cartílago característicos de la enfermedad.

MODELO DE ARTROSIS INDUCIDA POR LA INYECCIÓN

INTRAARTICULAR DE COLAGENASA EN RATÓN Balb/c

En los experimentos presentados en esta Tesis no se ha conseguido

reproducir la degeneración articular descrita en la bibliografía (Rudolphi et al.,

2003;Yeh et al., 2008;Kikuchi et al., 1998) aunque sí hemos podido realizar el

estudio de la formación de osteofitos marginales característicos de la artrosis

(Felson et al., 2005; van der Kraan y van den Berg, 2007). Se trata de un modelo

controvertido, ya que diversos autores han señalado que podría asemejarse más a

un modelo de artritis reumatoide (Kikuchi et al., 1998; van der Kraan et al., 1989)

que a un modelo de artrosis. Aunque los modelos de inducción de la artrosis por

sustancias químicas como papaína (Kikuchi et al., 1998) o iodoacetato (Janusz et

al., 2004) están siendo utilizados actualmente para el estudio de la progresión de

la artrosis, la inducción de la artrosis por colagenasa tiene bastantes detractores.

Estudios in vitro han confirmado que la colagenasa tipo IA únicamente actúa

sobre el colágeno tipo I presente en ligamentos y estructuras anexas de la

articulación, pero presenta una actividad muy baja sobre el colágeno tipo II

característico del cartílago articular (Botter et al., 2008). De esta forma, la

degradación del cartílago articular observada en el estudio presentado en esta

Tesis, sería consecuencia del debilitamiento de tendones y ligamentos que

mantienen las fuerzas biomecánicas de la articulación, aumentando el rozamiento

Discusión

194

y la erosión entre las superficies articulares. Por ello, la formación de osteofitos es

tan característica en este modelo experimental (Felson et al., 2005; van der Kraan

y van den Berg, 2007), ya que estas formaciones óseas en la periferia de la

articulación tienen como objeto estabilizar los movimientos erráticos de la

articulación y evitar una mayor degeneración articular.

Dado que se trata de una artrosis monoarticular y en este estudio no se ha

conseguido una degradación de la articulación lo suficientemente grave como para

obtener una respuesta sistémica cuantificable, este modelo sólo podría ser

utilizado para ensayar fármacos implicados en la protección de la matriz

extracelular del cartílago. Ya que, al no ser cuantificables en suero los mediadores

inflamatorios ni los biomarcadores de degradación del colágeno sólo se puede

hacer una evaluación de la patología a nivel histológico (Pritzker, 1994).

De acuerdo con los resultados de algunos autores, el modelo experimental

de artrosis inducida por colagenasa intraarticular podría reproducir mejor la

severidad de los caracteres típicos de la artrosis, si se utilizan ratones C57Bl/6 que

presentan menor densidad ósea o ratones deficientes para IL-6 (IL-6-/-) (de Hooge

et al., 2005).

MODELO DE ARTROSIS ESPONTÁNEA EN RATONES STR/ort

En el estudio realizado con la cepa de ratones STR/ort , no hemos tenido

acceso a los animales que habían desarrollado la artrosis a edades más tempranas,

ya que no está permitido suministrar animales enfermos. Por ello, la proporción de

individuos que desarrollaron la enfermedad durante nuestro estudio fue algo

inferior a la indicada en la bibliografía. No obstante, todos los animales que

Discusión

195

desarrollaron la artrosis lo hicieron con la gravedad esperada (Munasinghe et al.,

1995; Mahr et al., 2003; Jaeger et al., 2008).

También realizamos un seguimiento exhaustivo del estado de salud de los

animales, ya que la bibliografía indicaba que esta cepa era susceptible de padecer

otras patologías además de la artrosis, como enfermedades periodontales,

hepatomas,... (Jaeger et al., 2008). A ninguno de los individuos que participaron

en el estudio se les detectó ninguna de las patologías descrita, y el estudio

histológico postmortem de los hígados de los animales tampoco reveló la

presencia de hepatomas.

De acuerdo con la bibliografía (Chambers et al., 1997; Chambers et al.,

2001; Chambers et al., 2002), empleamos ratones CBA como animales control

para nuestro estudio. El estudio histológico siguiendo el sistema de evaluación

descrito por la OARSI demostró que la afectación articular encontrada en los

ratones STR/ort era significativamente mayor a la encontrada en las articulaciones

de los ratones CBA de igual edad y peso similar. También el estudio de los

biomarcadores de degradación del colágeno presentes en el suero de los animales

demostró que los ratones que desarrollan de forma espontánea la artrosis

presentan unos niveles elevados de COMP, MMP3 y OC en suero respecto a los

ratones CBA, mientras que los valores eran similares a los de los ratones CBA en

el caso del HA y menores para RANKL.

En cambio, en la cepa CBA los niveles de prácticamente todos los

mediadores inflamatorios estudiados aparecían elevados respecto de los animales

STR/ort. Estas discrepancias podrían ser debidas a las diferencias genéticas entre

ambas cepas de ratones y sugieren que la cepa CBA podría no ser un control

adecuado para el estudio del proceso inflamatorio en ratones STR/ort.

Discusión

196

Contrariamente a lo que ocurre con los valores de IL-1β, que no sufren

variaciones con la progresión de la enfermedad, se debe destacar la expresión de

las citocinas proinflamatorias IL-17 y TNFα. Ambas presentan un aumento

progresivo paralelo al incremento de la degradación articular, lo que sugiere su

implicación en la inflamación asociada a la artrosis. Por otro lado, los niveles

séricos de PGE2 disminuyen en las semanas 11 y 15 y la expresión de COX-2 en

condrocitos articulares también disminuye al final del estudio, indicando una

participación de esta prostaglandina en las fases más iniciales del proceso.

El estudio de la implicación de la hemo oxigenasa-1 en el proceso

artrósico demostró que los niveles encontrados en los ratones STR/ort fueron

significativamente menores a los encontrados en la cepa CBA, con una tendencia

a aumentar su expresión en la semana 11.

Dado que el estudio de la progresión de la artrosis en este modelo animal

desarrolló gran parte de las características de la artrosis humana decidimos testar

los fármacos SnPP y BIS069 en este modelo experimental.

MODELO DE ARTROSIS PROVOCADA POR LA TRANSECCIÓN DEL

LIGAMENTO CRUZADO ANTERIOR EN RATA Wistar

El modelo ACLT en rata Wistar ha demostrado ser un modelo

experimental robusto y con menor variabilidad, aunque es el modelo experimental

que más dedicación ha necesitado para su puesta a punto y validación dada la

dificultad de la microcirugía.

El modelo ha demostrado ser reproducible y la comprobación postmortem

demostró que en todos los casos el ligamento cruzado anterior aparecía

completamente seccionado y que las superficies del cartílago articular no estaban

Discusión

197

dañadas por la manipulación quirúrgica, sino como consecuencia de la

desestabilización de la articulación.

Este modelo experimental ha sido tradicionalmente realizado en perros

(Brandt et al., 1991) y conejos (Wu et al., 2008). Con frecuencia aparece

combinado con una meniscectomía (eliminación del menisco medial), que

ocasiona una desestabilización articular mucho más agresiva y permite el

desarrollo de la enfermedad en menos tiempo.

La elección de realizar la ACLT sin afectar los meniscos mediales tuvo su

origen en la artrosis secundaria a una lesión deportiva tan común como la ruptura

del ligamento cruzado anterior. Es bien conocido que esta lesión, común en

deportistas profesionales, provoca una importante erosión del cartílago articular

en la articulación de la rodilla. Por ello, y en un intento de reproducir la artrosis

secundaria a lesiones mecánicas, decidimos prolongar el tiempo de desarrollo de

la enfermedad sin aumentar la intervención sobre la articulación ni añadir el

efecto del ejercicio físico. De esta forma hemos podido observar, tanto en el

estudio histológico como en el estudio de los biomarcadores de degradación de

colágeno, que la degradación articular era similar a la encontrada en la

enfermedad desarrollada en humanos. También se ha conseguido reproducir, en

las 10 semanas que duró el estudio de la progresión de la enfermedad, la sinovitis

característica que aparece asociada a la artrosis.

El estudio en suero de los principales biomarcadores de degradación del

cartílago demostró que la degeneración articular era progresiva, y así lo

demostraba el incremento de los niveles séricos de CTX-II y COMP. Este

incremento de CTX-II y de COMP era coherente con la degradación del cartílago

observada en el estudio histológico. Sin embargo, no aparecen variaciones en los

niveles de HA en suero, lo que sugiere que dicha molécula no es un biomarcador

Discusión

198

apropiado en este modelo experimental, contrariamente a lo que se ha indicado en

la artrosis humana (Pavelka et al., 2004). Con este modelo hemos podido

corroborar que CTX-II y COMP serían unos biomarcadores válidos para el

diagnóstico precoz de la enfermedad ya que presentan un incremento progresivo

paralelo al deterioro articular, en la artrosis humana y en este modelo

experimental (Vilim et al., 2002; Sharif et al., 2006; Fernandes et al., 2007;

Charni-Ben et al., 2008).

La inflamación asociada a la artrosis se ha visto representada en este

modelo de forma similar a como ocurre en la artrosis humana. La operación

simulada, donde se sometía a la articulación a toda la manipulación quirúrgica a

excepción de la transección del ligamento cruzado anterior, ha permitido excluir

la reacción inflamatoria en respuesta a la agresión que supone la cirugía de la

asociada a la enfermedad como tal. Así, transcurridas 10 semanas de la cirugía,

encontramos elevados, a nivel local, IL-1β, TNFα, IL-17, IL-6, PGE2 y COX-2.

Aunque, a nivel sistémico, TNFα no modificó sus niveles a lo largo del desarrollo

de la enfermedad, IL-6 y PGE2 sí que presentaron un aumento progresivo paralelo

a la degradación de la articulación. El resto de citocinas también fueron medidas

en el suero de los animales pero no alcanzaron niveles detectables por la técnica

de ELISA.

Este modelo experimental, a lo largo de las 10 semanas que duró el

estudio, logró representar tanto la degradación articular como la sinovitis asociada

a la enfermedad y, por tanto, se consideró adecuado para realizar el estudio de los

fármacos SnPP y BIS069.

Discusión

199

ESTUDIO DE LOS FÁRMACOS ESTAÑO PROTORPORFIRINA IX

(SnPP) Y BIS069 EN MODELOS ANIMALES DE ARTROSIS

Cada uno de los modelos seleccionados para el estudio de los fármacos

presenta unas ventajas y unos inconvenientes. El modelo de artrosis espontánea en

ratones STR/ort tiene la ventaja de poder trabajar con animales pequeños que

permiten poder estudiar un mayor número de individuos. Pero presenta la

dificultad de ser una cepa que desarrolla de forma espontánea la enfermedad, lo

que implica una gran variabilidad entre individuos. El modelo de artrosis por

ACLT en rata Wistar es muy reproducible y representa tanto la degradación

articular como la inflamación asociada a ésta, aunque tiene varios inconvenientes.

El primero de ellos es la dificultad que conlleva realizar una cirugía y los cuidados

postquirúrgicos que permitan la supervivencia del animal al menos 10 semanas,

con la seguridad de que los resultados observados son únicamente consecuencia

de la desestabilización articular y no de ningún tipo de infección o secuela de la

manipulación. En segundo lugar, la limitación de espacio que supone trabajar con

animales de experimentación de tamaño medio y el hecho que la enfermedad

necesita de más tiempo para desarrollarse dado que la cepa posee una mayor

esperanza de vida. En último lugar, y no menos importante, es el hecho de que, al

tratarse de animales de mayor peso, es necesaria una mayor cantidad de fármaco

para realizar el estudio y podría llegar a ser una factor limitante.

Discusión

200

ESTUDIO DE LOS FÁRMACOS SnPP Y BIS069 SOBRE LA ARTROSIS

ESPONTÁNEA EN RATONES STR/ort

La administración de SnPP a la dosis de 12 mg/kg/día i.p. o de BIS069 (80

mg/kg/día, p.o.) durante cuatro semanas, disminuyó de forma significativa las

manifestaciones histológicas y radiológicas de la artrosis espontánea.

En el modelo de artrosis espontánea en ratones STR/ort, el tratamiento con

SnPP redujo significativamente los niveles séricos de los biomarcadores MMP3 y

OC, mientras que tras la administración de BIS069 únicamente disminuyeron

significativamente los niveles de MMP3. En cambio, los biomarcadores de

degradación del cartílago COMP y RANKL no modificaron sus niveles en suero

tras el tratamiento con ninguno de los dos fármacos.

También se estudiaron los efectos de estos fármacos sobre los mediadores

inflamatorios. El tratamiento con SnPP incrementó los niveles de IL-1β en suero y

la expresión de COX-2 en homogenado de pata y en condrocitos de la articulación

femororrotuliana. Sin embargo, no parece tener influencia sobre los niveles

séricos de TNFα ni PGE2. Además, los niveles séricos de la citocina

proinflamatoria IL-17 sufrieron una ligera disminución tras el tratamiento con

ambos fármacos.

BIS069 provocó un leve incremento en los niveles de IL-1β y una ligera

disminución de TNFα. En cambio, no afectó los niveles de PGE2 ni la expresión

de COX-2.

Discusión

201

ESTUDIO DE LOS FÁRMACOS SnPP Y BIS069 SOBRE LA ARTROSIS

PROVOCADA POR LA TRANSECCIÓN DEL LIGAMENTO CRUZADO

ANTERIOR EN RATA Wistar

La administración de SnPP (12 mg/kg/día/i.p.) o BIS069 (90 mg/kg/día

p.o.), durante 10 semanas, protegió frente al desarrollo de la lesión articular en el

modelo de transección del ligamento cruzado anterior en rata Wistar. Los

animales tratados mostraron un grado menor de afectación del cartílago y de

sinovitis, en comparación con el grupo control, con un efecto superior de SnPP

frente a BIS069.

El tratamiento con SnPP durante 10 semanas redujo significativamente los

niveles de CTX-II. Estos resultados son coherentes con el estudio histológico que

demuestra que el cartílago articular de las rodillas sometidas a ACLT tras el

tratamiento con SnPP presenta una puntuación significativamente menor que las

rodillas de aquellos animales que no han recibido el tratamiento. En cambio, los

niveles de HA no son modificados. Aunque se ha publicado que HA podría ser un

biomarcador en la artrosis humana (Pavelka et al., 2004), los estudios de la

progresión de la artrosis en este modelo indican que HA no es un biomarcador

adecuado para realizar un pronóstico de la enfermedad en este modelo

experimental, de forma similar a lo observado en el modelo de artrosis

espontánea.

En cambio, la administración de BIS069 durante 10 semanas no tuvo

ningún efecto sobre los niveles de CTX-II, ni COMP; pero sí incrementó

significativamente los niveles de HA. Estos resultados no son coherentes con la

menor puntuación obtenida en la evaluación histopatológica de la OARSI.

Discusión

202

Como ya se ha descrito anteriormente, este modelo experimental de

artrosis presenta una sinovitis similar a la encontrada en humanos. El tratamiento

con SnPP redujo significativamente los niveles séricos de IL-6 y PGE2 y los

niveles locales de IL-17, PGE2 y COX-2. Estos resultados de los efectos

antiinflamatorios de la SnPP coinciden con el estudio histológico donde se aprecia

una disminución de la sinovitis, así como una menor infiltración monocítica.

Los efectos antiinflamatorios de SnPP han sido descritos en modelos de

artritis reumatoide, como la artritis por colágeno en ratón y la artritis por

adyuvante en rata (Devesa et al., 2005b; Devesa et al., 2005a).

BIS069 también redujo de forma muy significativa los niveles de PGE2,

tanto a nivel sistémico como local, ello dependería de la reducción que produce en

la expresión de COX-2. El tratamiento con BIS069 provocó además una leve

reducción de las citocinas proinflamatorias IL-17 y TNFα.

Todo ello parece indicar que el tratamiento con SnPP parece estar

ejerciendo un efecto protector sobre la degradación del cartílago y un efecto

antiinflamatorio sobre la sinovitis asociada a la artrosis que padecen las ratas

sometidas a ACLT, mientras que BIS069 ha mostrado una menor efectividad

6. CONCLUSIONES

Conclusiones

203

6. CONCLUSIONES

1.- En el modelo experimental de artrosis inducida por la inyección intraarticular

de colagenasa, se ha observado el desarrollo prematuro de osteofitos en este

modelo animal en respuesta a la desestabilización articular provocada por la

degradación del colágeno tipo I presente en ligamentos y tendones. Sin embargo,

no se han detectado niveles séricos de biomarcadores de degradación del cartílago

ni mediadores inflamatorios. La gravedad de las lesiones del cartílago tras la

agresión enzimática no es representativa de la artrosis humana.

2.- El modelo experimental de artrosis espontánea en la cepa de ratones STR/ort

presenta signos radiológicos de artrosis, así como una degradación articular

evaluada histopatológicamente muy superior a la encontrada en ratones CBA, y

que aumenta progresivamente con el tiempo. Los niveles sistémicos de COMP,

MMP3 y RANKL son significativamente superiores a los presentes en los ratones

CBA, mientras que los niveles de OC se encuentran disminuidos

significativamente. IL-1β no parece estar implicada en el proceso inflamatorio en

este modelo experimental, mientras que IL-17, TNFα y PGE2 podrían ser

responsables de la respuesta inflamatoria en los ratones STR/ort.

3.- El modelo de transección del ligamento cruzado anterior en rata Wistar

demostró radiológica e histológicamente un desarrollo de la enfermedad coherente

con la artrosis humana, en todos los animales operados. Los niveles séricos de los

biomarcadores CTX-II y COMP incrementaron progresivamente con el desarrollo

de la enfermedad. El modelo representó la inflamación asociada a la artrosis, con

niveles elevados a nivel local de los mediadores inflamatorios IL-1β, TNFα, IL-

Conclusiones

204

17, IL-6, PGE2 y COX-2. A nivel sistémico, TNFα no modificó sus niveles pero

IL-6 y PGE2 sí que presentaron un aumento progresivo paralelo a la degradación

de la articulación.

4.- El tratamiento con SnPP administrado durante 4 semanas a los ratones STR/ort

protegió frente al desarrollo de la enfermedad. También redujo significativamente

los niveles sistémicos de MMP3 y OC, sin afectar los niveles séricos de COMP y

RANKL. SnPP disminuyó los niveles de IL-17 en el suero de los animales

tratados.

Los ratones STR/ort tratados con BIS069 durante 4 semanas presentaron

una menor degradación articular en comparación con el grupo control. La

administración de BIS069 disminuyó significativamente los niveles séricos de

MMP3 y en menor grado los de TNFα e IL-17.

5.- El tratamiento con SnPP o BIS069 durante 10 semanas en ratas Wistar tras la

ACLT produjo una menor degradación articular que en los animales control. SnPP

redujo significativamente los niveles séricos de CTX-II, IL-6 y PGE2 y los niveles

locales de IL-17, PGE2 y COX-2.

La administración de BIS069 durante 10 semanas incrementó

significativamente los niveles de HA, sin afectar los niveles de CTX-II ni de

COMP. Además, BIS069 redujo los niveles de PGE2, tanto a nivel sistémico

como local y produjo una leve reducción de las citocinas proinflamatorias IL-17 y

TNFα.

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