Treball de recerca

Estudi sobre compostos que

poden ajudar a prevenir o

tractar la diabetis tipus II i la

obesitat

Jordi Del Pozo Rodríguez

2º Batxillerat Científic Tecnològic

Tutores: Lourdes Corcoy i Laia Miret

Abreviatures BSA: bovine serum albumin

Mfn2: Mitofusina 2

C1: Compost 1

C2: Compost 2

C3: Compost 3

DNA: Àcid desoxiribonucleic

DMEM: Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium

FBS: Fetal bovine serum (sèrum de fetus boví)

DMSO: Dimetilsulfóxid

PBS: Tampó salí fosfat

RLU: Unitats relatives de llum

RNA: Àcid ribonucleic

µL: Micro litres

rpm: Revolucions/minut

Sumari

El treball que he realitzat consisteix en comprovar si tres compostos poden tractar dues

malalties, la diabetis tipus II i la obesitat. Per fer-ho he necessitat d’un experiment que consistia en

comprovar si els compostos augmentaven la concentració d’una proteïna que es troba disminuïda

en aquestes malalties i que resulta necessària per les cèl·lules.

L’experiment consisteix en comparar la quantitat de proteïna que produeixen els tres

compostos (que anomenarem C1,C2 i C3) amb un compost (anomenat DMSO) que sabem que no

incrementarà la quantitat normal d’aquesta proteïna en les cèl·lules.

Per fer les pràctiques de l’experiment, he pogut disposar d’un laboratori del Parc Científic de

Barcelona on disposaven de material altament especialitzat per poder dur a terme

l’experimentació.

Agraïments

La realització d’aquest treball no hauria estat possible sense l’ajut fonamentalment de dues

persones: la meva tutora del treball de recerca a l’ institut, Lourdes Corcoy, i la meva tutora al Parc

Científic de Barcelona, Laia Miret. Sense elles dues no hagués pogut fer aquest treball, els estic molt

agraït per haver tingut confiança en mi, i per la paciència que han tingut a

l’hora de fer-me explicacions, el seu interès pel treball i l’ajut que m’han

donat a l’hora de buscar informació. Moltes gràcies per donar-me el

vostre suport sempre que l’he

necessitat.

També m’agradaria

mencionar dues entitats que són

el meu institut, L’IES Maria

Aurèlia Capmany, i el Parc

Científic de Barcelona, entitat a la qual estic també immensament agraït per haver-me deixat

utilitzar les seves instal·lacions. Em sento molt orgullós de que una entitat així, amb tecnologia

capdavantera a Europa, es trobi a Barcelona.

Moltes gràcies, a més, a la gent del meu voltant, els meus familiars i amics per ajudar-me en

tot el que heu pogut.

Índex 1)Introducció ............................................................................................................. 1

a. Què és la diabetis tipus II? ................................................................ 1

b. Què és l’obesitat? .................................................................................. 2

2)Antecedents............................................................................................................ 2

a. La Mitofusina 2 ...................................................................................... 3

3)L’experiment .......................................................................................................... 4

a. Hipòtesi de l’experiment ................................................................... 4

b. Cèl·lules HeLa ......................................................................................... 5

c. Cèl·lules HeLa M2P14 ........................................................................ 6

d. Plàsmid ...................................................................................................... 6

e. Formació d’un pl{smid ...................................................................... 7

f. Gen reporter luciferasa ....................................................................... 7

4)Procediment ........................................................................................................... 8

5)Material .................................................................................................................... 9

6)Inici de l’experimentació.................................................................................. 10

a. Preparació del medi ............................................................................ 10

b. Descongelació de les cèl·lules ....................................................... 11

c. Sembrem les cèl·lules en una placa.............................................. 13

d. Incubació de les cèl·lules amb els diferents compostos .... 17

e. Imatges de les cèl·lules ...................................................................... 19

f. Quantificació de luciferasa (luminòmetre) .............................. 21

7)Resultats finals: Luminescència ................................................................ 24

8)Anàlisi, conclusions i representació gràfica dels resultats .............. 25

9)Altre mètode per comprovar la producció de Mfn2 ........................... 26

10)Experimentacions futures per validar el compost ........................... 28

11)Annex ...................................................................................................................... 29

12)Vocabulari ............................................................................................................ 30

13)Bibliografia .......................................................................................................... 32

L’asterisc i el format en cursiva d’algunes paraules al llarg de tot el treball indiquen que estan presents al vocabulari.

1

Jo al Parc Científic de Barcelona

Esquema de la glucosa a la sang d’una

persona amb glucèmia i una altre amb

nivells normals de glucosa.

L’objectiu és aconseguir mantenir els nivells

normals de glucosa a la sang.

1. Introducció

La diabetis mellitus tipus II i l’obesitat

són malalties desafortunadament molt

esteses a la nostra societat i quan al

Parc Científic em van proposar

realitzar un treball d’investigació sobre

compostos que podrien ajudar a

tractar-les em va semblar haver trobat

el treball perfecte.

El fet de poder ajudar a persones a combatre aquestes malalties em fascinava, a més, treballar en

un laboratori em semblava un gran avanç de cara a la meva preparació per al futur, ja que

investigar el perquè de les coses o trobar solucions als problemes de la nostra societat, sempre ha

estat la branca en la qual jo volia treballar.

1.a Què és la diabetis tipus II?

La diabetis mellitus tipus 2 o diabetis tipus 2 (antigament anomenada diabetis de l’adult o diabetis

no insulinodependent, per diferenciar-la de la diabetis mellitus insulinodependent diabetis tipus 1),

és una malaltia caracteritzada pels alts nivells de glucosa en sang (és per tant una diabetis mellitus)

en un context de resistència a la insulina i deficiència relativa d’insulina. Tot i que inicialment sovint

es controla només incrementant l’exercici i amb una modificació de la dieta, quan la malaltia

progressa els medicaments són

necessaris.

2

Logotip del Parc científic de

Barcelona

Bàscula que mesura la

massa corporal

1.b Què és l’obesitat?

L'obesitat o adiposi és una malaltia crònica* causada per diversos

factors ( genètics, ambientals...) On la quantitat de greix acumulat

comporta risc per a la salut, reduint l'esperança de vida de l'individu. De

vegades es considerada com només un problema estètic, però

constitueix una veritable amenaça per a la nostra salut, ja que

incrementa les possibilitats de patir altres malalties com la diabetis, el

colesterol i la hipertensió.

2. Antecedents

El treball que realitzaré parteix d’una informació prèvia que m’ha

donat el Parc Científic de Barcelona.

El Parc va comprar una llibreria (conjunt) de 20000 compostos i va

decidir demanar col·laboració a la Universitat de Santiago de

Compostel·la. Per realitzar un “screening”, un procés mitjançant el

qual aconseguirien obtenir hits (compostos actius) que podrien

ajudar a tractar la diabetis de tipus II i/o obesitat. En aquest

screening es van obtenir 20 hits, els qual van tornar a ser validats en

el parc Científic mesurant l’activitat transcripcional dels compostos. L’experiment que he realitzat al

Parc Científic ha sigut analitzar 3 dels 20 hits incials, que anomenaré C1,C2 i C3 (el nom d’aquests

compostos és patrimoni del Parc Científic de Barcelona)

Gràcies a les investigacions realitzades en el laboratori del Parc Científic sé que quan una persona

pateix Diabetis Mellitus de tipus 2 i/o obesitat, per tant té resistència a la insulina, presenta

problemes funcionals als mitocondris, concretament en la proteïna Mitofusina 2.

3

Xarxa Mitocondrial: A la imatge es poden apreciar dos

mitocondris d’un mateix pacient, que ha de tenir

alguna malaltia com la diabetis tipus II o l’obesitat. Un

d’ells, el de l’esquerra, ha reduït molt els nivells de

Mfn2, mentre que el de la dreta encara no.

2.a La Mitofusina 2(que anomenarem Mfn2)

És una proteïna mitocondrial localitzada a la membrana, que és clau per a l’activitat correcte

dels mitocondris*, encara que es troba al mitocondri i que aquest orgànul consta de DNA propi la

seva activitat es regulada des del nucli. Al mitocondri és on es produeix la respiració cel·lular, és a

dir, on s’obté l’energia necessària per la cèl·lula per portar a terme diverses funcions. S’ha vist que

en pacients amb diabetis tipus 1 aquesta proteïna es troba més expressada dels valors normals i en

els de tipus 2 i obesitat es veu una menor expressió del gen* que codifica aquesta proteïna*.

Aquesta proteïna està implicada en la formació de xarxes mitocondrials o filaments

mitocondrials, de manera que quan disminueix la seva expressió, les xarxes poden arribar a

desaparèixer. També s'ha descobert que la Mfn2 potencia la funció oxidativa del mitocondri, de

manera que quan es reprimeix l'expressió de la proteïna disminueix la capacitat de la cèl·lula per

oxidar glucosa, el potencial de membrana mitocondrial i el consum d'oxigen per part de la cèl·lula.

La proteïna Mitofusina 2 s’expressa a partir del gen que la codifica, el gen Mfn2. Aquest gen conté

un element anomenat PROMOTOR,

que és una regió de DNA que controla

en quines condicions s’activa

l’expressió d’aquest gen* i es produeix

la proteïna. Per tant, si volem trobar

un compost que ajudi a tractar la

diabetis, haurà d’activar el promotor

de Mitofusina 2, és a dir, el nostre

objectiu es buscar un compost que

augmenti la producció de Mfn2, i així

aconseguirem que augmenti també la

capacitat d’oxidació del mitocondri.

4

3. L’experiment

Per poder realitzar aquest experiment he pogut disposar de les instal·lacions d’un laboratori del

Parc Científic de Barcelona (un espai de trobada entre universitat, empresa i societat que té com a

finalitat investigar, principalment en ciències de la vida) en què disposava de tot el material

necessari.

3.a Hipòtesi de l’experiment

Els compostos amb què experimentarem són capaços d’activar el promotor i augmentar la

producció de Mfn2 i per tant ajudar a tractar la diabetis i/o obesitat?

Per explicar l’experiment primer definiré quines seran les diferents variables:

La variable independent que és la que podem modificar serà el compost (C1,C2,C3), i la dependent

la variació en la producció de Mfn2. La resta de variables com la temperatura, la concentració de

diòxid de carboni ([CO2]), el pH... es mantindran constants durant tota l’experimentació. El nostre

control negatiu* a l’experiment serà un compost anomenat DMSO (dimetilsulfòxid). (Ja que sabem

que no augmentarà la quantitat de proteïna)

Per poder comprovar la nostra hipòtesi utilitzarem cèl·lules HeLa M2P14. Aquestes cèl·lules

provenen de les cèl·lules HeLa, però han estat modificades.

Esquema del promotor del gen

5

3.b Les cèl·lules HeLa Constitueixen un llinatge de cèl·lules epitelials

humanes procedents d'un carcinoma cervical. Al

1951 es practicà una intervenció quirúrgica a la

pacient Henrietta Lacks (HeLa), de la qui prové el

nom de la línia cel·lular, a la qui van extreure

cèl·lules tumorals d'un carcinoma de l'úter amb la

intenció d'avaluar-ne la malignitat.

Aquelles cèl·lules es deixaven cultivar tan bé, i

proliferaven tan fàcilment en cultius cel·lulars, que

des d'aleshores començaren a ser utilitzades a gran

escala en centres d’investigació. Ara es poden trobar

a quasi tots els laboratoris del món.

Henrietta Lacks

Imatges de les cèl·lules HeLa, a la

imatge del damunt es veuen

mitjançant un microscopi òptic i a

la de la dreta amb un microscopi

electrònic.

6

3.c Cèl·lules HeLa M2P14 ( les que utilitzarem) Per saber si els compostos activen el promotor de Mitofusina 2, necessitem un sistema que ens

permeti mesurar si els compostos són actius. En el laboratori on he fet les pràctiques es va construir

una línia cel·lular(cèl·lules HeLa M2P14) estable que conté un plàsmid que està format pel gen

reporter luciferasa unit al promotor de Mfn2.

3.d Plàsmid

Els plàsmids són unes seqüències de DNA extracromosòmic circular o linear que es repliquen o es

transcriuen de manera independent del DNA cromosòmic i que han estat introduïts a les cèl·lules.

Normalment contenen gens o conjunts de gens que li donen un avantatge selectiu, de manera que

s’utilitzen habitualment per multiplicar un gen que es vol expressar.

Plàsmid introduït en les

cèl·lules HeLa M2P14. Plàsmid

Esquema de la fusió del promotor amb el gen reporter que es troba al plàsmid

7

3.e Formació d’un plàsmid El gen o fragment de DNA que interessa ha de ser identificat, i aïllat. Aquesta acció la porten a

terme els anomenats enzims de restricció*. Aquests són capaços de reconèixer seqüències

concretes de DNA ( no més de 8 nucleòtids) i tallar la cadena de forma precisa ,actuen, per dir-ho

d’alguna forma, com una espècie de “tisores moleculars”. Després el fragment de DNA és introduït

a la cadena de DNA que ens interessa.

3.f Gen reporter (luciferasa)

Un gen reporter o indicador és un gen que està controlat pel promotor en estudi (en aquest cas pel

promotor de la Mfn2) i té una activitat fàcil de mesurar. En el nostre cas utilitzarem el gen

indicador LUCIFERASA.

No utilitzem el gen en estudi (Mfn2) perquè no podem

mesurar la seva activitat, en canvi sí que podem mesurar

l’activitat del gen de la luciferasa ja que aquesta proteïna

quan reacciona amb el seu substrat, la luciferina, emet

luminescència. Això fa que puguem quantificar si els

compostos que estem analitzant activen el promotor de la

proteïna Mitofusina2, ja que és el mateix que el de la

luciferasa, utilitzant un aparell anomenat luminòmetre*.

Reacció que mesurarem al luminòmetre.

Luminòmetre

Esquema de

la actuació

dels enzims

de restricció

Com podem veure en aquesta reacció

un dels productes és la llum (light en

anglés) per tant podem mesurar la

reacció utilitzant un luminòmetre.

8

A la natura podem trobar organismes que tenen

luciferasa, com les cuques de llum, que són capaces

de produir llum per elles mateixes.

4. Procediment

1. Preparar del medi

2. Descongelar les cèl·lules

3. Sembrar les cèl·lules en una placa de 12 pous

4. Incubar-les amb els compostos actius

5. Mesurar l’activitat de luminescència en el luminòmetre

6. Analitzar i treure conclusions sobre els resultats

7. En el cas que algun compost activés el promotor de Mfn2, el Parc Científic haurà de seguir

investigant per saber si en un futur podrà ser utilitzar com a fàrmac per tractar la diabetis

tipus II i la obesitat

Cuca de llum

9

5. Material

Pipetejador automàtic

Sistema d’aspiració de líquids

Càmera de Neubauer i

cobreobjectes

10

Campana amb el medi cel·lular

6. Inici de l’experimentació

6.a Preparem el medi

Per elaborar el nostre medi cel·lular necessitem:

DMEM 500 ml: El DMEM és una modificació de BME que conté una concentració 4 vegades

més alta d’aminoàcids i vitamines.

FBS 57,4 ml: El FBS és el sèrum més

extensament usat per al cultiu de cèl·lules

ja que és baix en anticossos i conté més

factors de creixement.

Penicil·lina/ Estreptomicina 5,74 ml: Les

penicil·lines són antibiòtics empleats

profusament en el tractament d'infeccions

provocades per bacteris sensibles.

L’estreptomicina és un inhibidor de la

síntesi de proteïnes. Actua fent que no es pugui sintetitzar la proteïna S12 a través de no

permetre que la subunitat del ribosoma bacterià S30 s’uneixi amb la part de RNA

transferència que li pertoca (formilmetionil-RNAt). Això evita la iniciació de la síntesi de

proteïna i condueix a la mort totes les cèl·lules microbianes.

Hepes 11,48 ml: HEPES és extensament

usat en cultius cel·lulars, en gran part

perquè és el millor mantenint el pH

fisiològic, tot i els canvis en la

concentració de diòxid de carboni

(produït per la respiració cel·lular).

Per aconseguir el medi agafem la

quantitat especificada de cada substància

i les introduïm en un recipient que podem

tancar i el barregem.

Medi cel·lular

11

6.b Descongelem les cèl·lules

Traiem les cèl·lules del congelador on es troben a una temperatura de – 80°C, i les escalfem

una mica introduint-les en un bany d’aigua a 40°C.

Hem de treure ràpidament les cèl·lules del bany perquè es podrien morir.

A continuació posem les cèl·lules amb 9 mL de medi en un falcon de 15 mL.

Després agafem el falcon (tub) amb les cèl·lules i el medi i el posem en una centrifugadora a

una velocitat de 1400 rpm (revolucions per minut) durant 3 minuts. D’aquesta manera

aconseguim mantenir separades les cèl·lules del medi.

Un cop ha acabat el procés de centrifugació absorbim el medi del falcon, d’aquesta manera

eliminem el DMSO* que és tòxic per a les cèl·lules. A continuació, afegim 10 mL de medi al

péllet (les cèl·lules) amb una pipeta i ho agitem, seguidament ho traslladem a una placa de

cultiu.

Bany d’aigua

Centrifugadora

12

Posem la placa a la incubadora perquè les cèl·lules creixin a 37 ºC i a un 5% de CO2

(condicions ideals perquè creixin les cèl·lules).

Incubador

Condicions en què es trobaran les

cèl·lules (37°C i 5% CO2)

13

6.c Sembrem les cèl·lules en una placa de 12 pous

Absorbim el medi.

Rentem les cèl·lules amb 5 mL de PBS* (una solució tampó* que ajuda a mantenir constant

el pH.).

Agitem la placa suaument per ajudar a desenganxar les cèl·lules de la paret de la placa.

Absorbim el PBS.

Afegim 1 ml de Tripsina* (trenquem els enllaços de les

proteïnes i així les cèl·lules es desenganxen de la

superfície de la placa).

Ho deixem 3 minuts a l’incubador a una temperatura

de 37°C i 5% de CO2.

14

Afegim 9 ml de medi per desactivar la tripsina (amb el pas del temps pot arribar a ser tòxica)

i passem les cèl·lules a un falcon de 15 ml.

Preparem la càmara de Neubauer posant el cobreobjectes a sobre.

La Càmera de Neubauer: és un instrument

utilitzat en medicina i biologia per realitzar el

recompte de cèl·lules en un medi líquid, que

pot ser un cultiu cel·lular, sang, orina....

Aquesta càmera de recompte està adaptada al

microscopi. Es tracta d'un portaobjectes que té

dues zones lleugerament deprimides i que en el fons de les quals s'ha marcat amb l'ajuda d'un

diamant una quadrícula de dimensions conegudes. Es cobreix la càmera amb un cobreobjectes

que s'adhereix per simple tensió superficial. Després s'introdueix el líquid, en el nostre cas el

medi, entre la càmera i el cobreobjectes. D’acord amb la quantitat de cèl·lules comptades,

coneixent el volum de líquid que admet el camp del reticle, es calcula la concentració de

cèl·lules per unitat de volum de la mostra líquida inicial.

La fórmula de valoració del nombre de cèl·lules

(vàlida universalment) és la següent:

Observem amb el microscopi i comptem

les cèl·lules.

Partícules per μl=partícules

comptades)/superfície(mm²)·profunditat

de la càmera(mm)· dilució

15

Amb la càmera de Neubauer el que farem és mesurar la concentració de cèl·lules que tenim

en 1 mL, amb això podem saber quants μL hem d’abocar de medi i de cèl·lules amb medi a

cada pou.

Agafem 15 μL de la solució cel·lular utilitzant la pipeta de 20 μL i els introduïm entre la

càmera de Neubauer i el cobreobjectes

Fem un recompte del número de cèl·lules amb la càmera de Neubauer, mitjançant el

microscopi. Es compten totes les cèl·lules des 4 quadrats més petits de color més fosc dels

costats del quadrat gran(el del centre no).

16

Càlculs

Dades: Volum1 Quadrat càmera de Neubauer=0.1µL, Cèl·lules Comptades= 89 cèl·lules

El nostre objectiu és aconseguir tenir per tant aplicarem els següents

factors de conversió per saber el volum en µL necessari:

A cada pou volem introduir un volum de 1mL (=1000µL) per tant:

1000µL-314µL =686µL de medi a cada pou

En resum el volum necessari a abocar a cada pou de la placa és:

686µL de medi

314µL de cèl·lules amb medi

Sembrem la placa de 12 pous (70.000

cèl·lules/pou):

Afegim a cada pou 686µL medi i 314µL

de cèl·lules amb medi utilitzant

micropipetes.

17

Distribució dels compostos a la placa de 12 pous

6.d Incubació de les cèl·lules amb els diferents compostos

A la placa de 12 pous sembrem les cèl·lules, ho

farem utilitzant els 12 pous. Distribuirem els

diferents compostos de 3 en 3 pous: és a dir que al

final hem de tenir 3 pous amb DMSO (que

utilitzarem com a valor basal en l’experiment,

sabem que no activarà el promotor, per tant és el

nostre control negatiu en l’experiment), 3 amb el

C1, 3 amb el C2 i 3 amb el C3. Tal com he dit abans

és molt important que la resta de variables com la

temperatura, pH , el material, el número de

cèl·lules es mantingui constant.

Ho fem mitjançant 4 eppendorfs en els quals es troben les diferents substàncies, i les ficarem

distribuint-les als pous com he explicat anteriorment.

Procediment:

Agafem 40µL de medi i els aboquem a 4 eppendorfs.

Posem el nom als eppendorfs DMSO, C1, C2, C3.

Afegim a cada eppendorf 10µL del compost que hem posat el nom, de manera que

finalment tenim 50µL.

Preparem 4 falcon, on fiquem a cada un 4 vegades 995µL és a dir 3980µL.

Posem el nom dels compostos a cada falcon, i afegim 20µL de la dissolució que conté el

medi i el compost que hem escrit.

18

Agafem les cèl·lules, absorbim el medi, i les rentem tirant 1mL de PBS a cada pou i

ràpidament l’absorbim també.

I a la placa on són les cèl·lules tirem 1000µL de cada compost als seus 3 pous corresponents,

quedant finalment 3 amb DMSO, 3 amb C1, 3 amb C2 i 3 més amb C3.

Placa cel·lular de 12 pous on estem rentant les cèl·lules amb PBS

19

6.e Imatges de les cèl·lules

Abans de quantificar la proteïna luciferasa observarem les cèl·lules al microscopi i farem algunes

fotos.

Hem de fer aquestes fotos per

comprovar que les cèl·lules estiguin en

bones condicions, també per observar

com estan constituïdes i veure la seva

estructura.

Augment del

microscopi:

100 augments

Augment del

microscopi:

100 augments

Augment del

microscopi:

200 augments

20

Després de comprovar que les cèl·lules

es troben en bones condicions,

quantificarem la proteïna luciferasa.

Augment del

microscopi:

200 augments

Augment del

microscopi:

400 augments

Augment del

microscopi:

400 augments

21

6.f Quantificació de la proteïna luciferasa amb el luminòmetre

Per determinar els compostos que activen el promotor de la Mitofusina2, Utilitzarem un

luminòmetre per mesurarem la producció de luciferasa, que serà equivalent a la producció de Mfn2

ja que el promotor de la luciferina està enganxat al de la Mfn2.

Una vegada ja hem incubat els compostos amb les cèl·lules durant 21 hores a 37°C, en una

placa de 12 pous mesurarem la luminescència.

Absorbim el medi de les cèl·lules i les rentem amb PBS.

Afegim a cada pou 100 µL de lysis buffer que trenca la membrana cel·lular per poder

quantificar la luciferasa i rasquem les cèl·lules amb la punta de la pipeta, amb això el que

pretenem aconseguir és que la proteïna que ens interessa(luciferasa) quedi fora de les

membranes cel·lulars i així la podem mesurar.

12 pous*100 µL lysis buffer a cada pou= 1200 µL lysis buffer, però en farem 1500 per tenir-

ne de més i no anar justos, hem de diluir el lysis buffer 5 vegades, per tant agafem 300µL de

lysis buffer i afegim 1200µL H2O.

Traspassem les cèl·lules de cada pou a un eppendorf.

L’agitem amb un vòrtex.

Imatge d’un vòrtex, aparell

on agitem les cèl·lules per

fer que quedin repartides

homogèniament per tot el

falcon.

22

I les centrifuguem a 50.000 rpm durant 30 segons

Agafem 10µL de cada extracte cel·lular i ho posem en tubs de plàstic.

Portem els tubs al luminòmetre, afegim 20 µL de luciferina (el substrat de la luciferasa) a

cada tub i els anem posant un per un al luminòmetre i mesurem(això ho hem de fer per els

12 tubs), d’aquesta manera sabrem si poden activar el promotor de Mfn2.

Imatges en què estic mesurant la

luminescència al luminòmetre

C2

C3

23

C1

C2

C3

Un cop obtinguts aquests resultats el

que farem és mesurar la quantitat de

proteïna present a cada pou.

Podem apreciar analitzant els

resultats que el C1 i el C2 podrien

activar el promotor de la Mfn2,

mentre que el C3 presenta uns valors

molt similars al nostre control negatiu

de l’experiment el DMSO.

RLU: Unitats relatives de llum

(unitats en què mesura el

luminòmetre)

DMSO

Resultats obtinguts al luminòmetre

24

7. Resultats finals: Luminescència

Compost

RLU

(Relative Light Unit)

Mitjana de cada comost ( Suma dels 3 valor quantificats pel luminòmetre de cada compost i divisió entre 3)

Increment respecte la quantitat de proteina que estaría present en el control negatiu (el DMSO) (Divisió entre la mitjana de el C1 el C2 o el C3 entre el la mitjana de les RLU del DMSO)

DMSO 154560

DMSO 209459 195735 1

DMSO 223186

C1.1 528110

C1.2 504091 510608 2,61

C1.3 499623

C2.1 507252

C2.2 664510 571040,7 2,92

C2.3 541360

C3.1 157556

C3.2 172176 194361 0,99

C3.3 253351

Analitzant la taula dels resultats obtinguts podem comprovar que els resultats de la columna

RLU de proteïna són molt similars entre el DMSO i el C3, i també hi ha similitud de valors entre els

dels compostos 1 i 2. Per tant, com que el compost 3 presenta uns resultats molt semblants al

nostre control negatiu el DMSO, descartem que pugui produir Mitofusina 2.

Per fer més visible els resultats, a la pàgina següent hi ha un gràfic que mostra el

increment de la quantitat de Mfn2 de cada compost (C1,C2 i C3) respecte el DMSO (control

negatiu).

25

Parc Científic de Barcelona

8. Anàlisi, conclusions i representació gràfica dels resultats

Finalment observant l’augment en la producció de Mfn2 dels compostos, podem afirmar que dos

d’aquests compostos (el C1 i el C2) podrien ajudar a tractar la diabetis tipus II i la obesitat, ja que

han incrementat la producció de la proteïna que hem comprovat mitjançant el luminòemtre,

quantificant la luciferasa. El C3 no ha produït cap

increment en la quantitat de Mfn2, d’altra banda el

Parc Científic continuarà realitzant experiments

sobre el C1 i el C2 per determinar si poden ajudar a

combatre aquestes malalties.

26

Kit (BCA PROTEIN ASSAY KIT 1

PIERCE)

Placa que es pot introduir a

l’espectrofotòmetre.

9. Altre mètode per comprovar la producció de Mfn2 Quantificació proteïna mitjançant: BSA PROTEIN ASSAY KIT 1 PIERCE

L’assaig BSA consisteix en un experiment per determinar la concentració de proteïna total

en una mostra. La concentració de la proteïna es mostra per un canvi de color en la solució, des del

verd fins al violeta, que és proporcional a la concentració de la proteïna i que pot ser mesurat

utilitzant tècniques colorimètriques. Per poder quantificar de forma estimada la proteïna es

necessita fer una recta patró que relacioni absorbància amb concentració de proteïna, per elaborar

aquesta recta s’ha d’utilitzar qualsevol solució que contingui proteïnes per utilitzar-la com a mostra,

normalment es fa servir BSA (bovine serum albumin). Coneixent la recta patró podem comparar

l’absorbància de les nostres mostres i obtenir la concentració de proteïna existent en elles.

27

Imatge d’un prisma, on es pot apreciar

clarament la descomposició d’un raig

de llum en els diferents colors. A partir

de la longitud d’ona del color de les

nostres mostres podrem saber la

quantitat que tenim de Mfn2.

Imatge d’un espectrofotòmetre:

instrument utilitzat per mesurar

la intensitat del color.

Durant l’assaig BSA tenen lloc dues reaccions fonamentals per mesurar la proteïna:

En la primera reacció els enllaços peptídics de la

proteïna redueixen el ió Cu2+ del sulfat de coure

a Cu1+ (la reacció depèn de la temperatura). La

quantitat de Cu1+ reduïda és proporcional a la

quantitat de proteïna present en la solució.

En la segona reacció dues molècules d’àcid bicinconinic

es quelaten (explicació a l’annex) amb un ió Cu1+, donant

lloc a un producte amb coloració violeta que absorbeix la

llum a una longitud d’ona de 562nm.

A partir de la intensitat del color violeta podrem

saber la quantitat de proteïna (Mitofusina 2),

present a les diferents mostres de cada compost

mitjançant un espectrofotòmetre*.

28

10. Experimentacions futures per validar el compost

Al Parc continuaran realitzant proves amb aquests compostos ( el C1 i el C2) com quantificar la quantitat de

RNA transcrita i comprovar la quantitat que pot ser ingerida pels humans, per determinar si podran ser

utilitzats en l’àmbit de la medicina.

Es continuarà investigant per determinar si aquests

compostos poden tractar aquestes malalties.

Amb el pas del temps, una vegada es comprovi definitivament que aquests compostos poden tractar

aquestes malalties seran distribuïts a la nostra societat (farmàcies...), per garantir una millor salut de la

població.

29

Annexos

Quelat

Complex metall-EDTA

Un quelat és un compost químic format per un ió metàl·lic lligat per

diversos lligams covalents a una estructura heterocíclica de

compostos orgànics com aminoàcids, pèptids o polisacàrids.

L'element lligat per un quelat queda impedit de seguir les reaccions

químiques que tindria en cas d'estar lliure.

Replicació, transcripció i traducció del

DNA

Replicació: Procés de duplicació (còpia) del DNA, que es dona al nucli.

Transcripció: És el pas de DNA a RNA missatger que es dona la nucli.

Traducció: Fabricació de proteïnes a partir del ARN missatger, procés que es dona al citoplasma

DNA

missa

tge

RNAmissatger

Proteïna

Expressió genètica

30

Vocabulari

PBS: Salino Protegit Fosfat (PBS abreujat) és una solució tampó d'ús general dins la bioquímica i altres

branques d'investigació biològica. Ajuda a mantenir constant el pH. Tripsina: La tripsina és una proteasa de serina trobada al sistema digestiu de molts vertebrats, actua com a

enzim i trenca les proteïnes que permeten les unions entre cèl·lules. Això és causat per la capacitat que té la

tripsina de trencar, com hem dit, els enllaços entre proteïnes. En el laboratori de cultiu de teixits, aquest

procés s’utilitza en la collita de les cèl·lules cultivades a plaques de petri.

DMSO: El dimetil sulfòxid (dimetilsulfòxid, DMSO, CH3SOCH3) és un líquid orgànic sense color que conté

sulfur, usat com a dissolvent orgànic industrial a partir de 1940, com criopreservant a partir de 1961 i com

un medicament (redueix el dolor i la inflamació).

Gen: és una unitat de DNA que codifica almenys una proteïna. L’expressió del gen està controlada pel seu

promotor, que és una altra seqüència de DNA situada abans del lloc d’inici de la transcripció de DNA del gen

d’interès.

Àcid bicinconinic: l’àcid més comunament empleat per bioquímics per determinar el nivell total de proteïna

en una solució. Procés en el què dues molècules de quelat d’àcid bicinconinic Cu1 més l’ ió, formant un

complex púrpura soluble en agua que absorbeix la llum en 562 nm.

Espectrofotòmetre: Instrument emprat per a mesurar la intensitat d'una determinada ratlla espectral d'un

espectre d'absorció o d'emissió.

Mitocondri: és un orgànul tancat per una membrana que es troba a la majoria de les cèl·lules eucariotes, els

mitocondris generen la major part dels subministraments de trifosfat d'adenosina (ATP) que necessita la

cèl·lula com a font d'energia química. A més a més de subministrar energia, els mitocondris estan implicats

en diferents processos, com ara la comunicació, la diferenciació, així com el cicle cel·lular i el seu

creixement.

Control negatiu: és alguna cosa que saps per endavant que no resultarà com l'estàs predient (que no

alterarà cap resultat en el que busques de l’experiment). Això serveix per demostrar que les variables que

obtens no són resultat de la metodologia que utilitzes. I a partir del resultats que doni aquest compararàs els

altres resultats.

pH: és un índex de la mesura de l'acidesa o alcalinitat d'una solució

31

Malaltia crònica: és una malaltia que no es cura en un temps curt

Enzims de restricció: són enzims que tallen fragments de DNA específicament per una seqüència concreta

Luminòmetre: Un fotòmetre sensible empleat per mesurar els nivells de llum molt baixos (com els produïts

en un processos luminescents)

Solucions tampó: són aquelles que no modifiquen gairebé el seu pH a l'afegir una petita quantitat d'àcid o

base o al diluir-les. Són molt importants per els processos químics i bioquímics ja que una modificació del pH

del medi on es realitza la reacció pot fer modificar el mecanisme de la reacció

Proteïna: són compostos orgànics fets d'aminoàcids arranjats en una cadena lineal i units per enllaços

peptídics entre els grups carboxil i amino de residus adjacents. La seqüència d'aminoàcids d'una proteïna és

definida per la seqüència d'un gen, que està codificada al codi genètic.

32

Bibliografia

Entitats

Parc Científic de Barcelona (IRB Barcelona)

Llibres

Colberg Sheri,PHD. Diabetes y ejercicio físico. Jesús Domingo. España.

Clínica Universitaria de Navarra. Obesidad. Raquel Lòpez Varela. León (España)

American Diabetes Association Inc. Diabetes de la A a la Z. Beatriz Magri. Alexandria,

Virginia, Nueva York.

Campillo Álvarez, José Enrique. El Mono Obeso. España

Salvador Rodríguez, Javier. La Diabetes. Manuales de Bolsillo Everest.

Premsa

Manuel S|nchez, Carlos. “Las células inmortales de Henrietta Lacks”. ABC (XL SEMANAL).

02/05/10. Página 60

Internet

Salino Protegit Fosfat. 19/08/10.

http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/es/Phosphate_buffered_saline

Sociedad Española de Medicina Estética. La Mitofusina 2 está implicada en la

fisiopatología de la diabetes.

http://www.seme.org/area_seme/actualidad_articulo.php?id=4

Vídeos online

“Contaje de células con cámara de Neubauer”

http://www.youtube.com/watch?v=TmPOmi2NHb0

“Tripsinización y pase de mantenimiento de células de mamífero”

http://www.youtube.com/watch?v=dfRNGHXyl3M&feature=related

“Plasmid Cloning” http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o

33

Enciclopèdies

Online: http://es.wikipedia.org/

Electròniques:Enciclopèdia Encarta 2009 (Microsoft)

Documents

Apartat 2.3 del document: Unió del gen amb un Plàsmid. http://www.xtec.es/iesrovira-

forns/documents/proteina.pdf

Tesis doctoral: Francesc X. Soriano Zaragoza. “REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DEL GEN DE MITOFUSINA 2 EN MÚSCULO ESQUELÉTICO” Barcelona, 2004.