CLASE DE SNTESIS Y SECRECIN DE BIOPOLMEROS En esta clase conoceremos un ejemplo integrador de diversos conceptos aprendidos durante el desarrollo del curso BIO152-C, a travs del estudio de un biopolmero natural llamado mucina. El contexto fisiolgico que se presenta a continuacin es el sistema respiratorio en humanos.

El mucus (moco) es una secrecin heterognea, semi-fluda y semi-slida, con un nmero de propiedades reolgicas tales como: viscosidad, flujo de elasticidad, filancia, tixotropa y humedad. La reologa estudia cmo este tipo de materiales responden a una fuerza aplicada, en trminos de deformacin y flujo. La magnitud y forma de un espectro dado por un remetro permite conocer la estructura molecular y el grado de entrecruzamiento de los constituyentes del moco. Una de las propiedades reolgicas que puede ser medida en el moco nativo es la viscoelasticidad, la cual puede ser adecuadamente caracterizada por dos parmetros: elasticidad, que mide la capacidad de almacenar energa de las macromolculas que forman el moco y viscosidad, que mide la capacidad de disipar energa de las molculas. Para entender cmo la viscoelasticidad y otras propiedades reolgicas del moco varan, ha sido necesario caracterizar sus componentes. Composicin del moco respiratorio. La mucosa nasal est recubierta por una capa de moco que constituye una barreara permeable entre la mucosa y el aire inspirado que es el centro de todos sus intercambios metablicos. El tapiz mucoso est compuesto fundamentalmente de agua y moco. El moco se forma principalmente por el material de secrecin aportado por las clulas caliciformes de las clulas mucosas y glndulas submucosas. El agua proviene de las glndulas serosas por secrecin y de las clulas epiteliales por transudacin.

A pesar de lo complejo que es determinar los constituyentes del moco producido por los distintos epitelios, existen antecedentes que indican que el moco respiratorio normal inducido contiene: 96% de agua, el porcentaje restante incluye bio-slidos (incluyendo iones: Na+, Cl-, K+, otros componentes dialisables: fosfato, sulfato, etc.). El 4% de las biomolculas estn compuestas por alrededor de 200 molculas en expectorado y cerca de la mitad en secreciones de cultivos celulares. De esas, cerca de 180 en expectorado son verdaderamente detectadas en un escaner protemico. Las protenas encontradas se han clasificado de acuerdo a distintas categoras: mucinas (21-24%), enzimas antioxidantes (3-5%), inhibidores y proteasas (4-8%), otras enzimas (3-4%), respuesta inmune y defensa del husped (45 y 30%), protenas de citoesqueleto (10-11%), protenas que unen calcio (5-6%), protenas de membrana (5-10%) y otras (2-4%). El principal grupo de protenas detectado tiene que ver con la inmunidad innata y algunas de ellas incluyen: enzimas antibacteriales (lisozima y lactoferrina), protenas del plasma, albmina, etc.

En trminos del principal constituyente del expectorado, las mucinas ocupan el primer lugar en la lista y son clasificadas fuera del grupo de protenas de inmunidad innata como un grupo especial. Estas corresponden a una familia de polmeros poliinicos de alto peso molecular, que se encuentran ensamblados y azarosamente enrollados formando una red tridimensional de densidad variable. Varias teoras que involucran directamente a las mucinas han sido propuestas para explicar los cambios observados en las propiedades reolgicas del moco. Las mucinas son glicoprotenas complejas, tpicamente caracterizadas por pesos moleculares elevados (2-20 x 105 Da) y alto contenido de carbohidratos (50-90% del peso), que refleja el alto contenido de O-glicanes y un amplio nmero de aminocidos repetidos en bloques (tandem repeats, TR), en el eje proteico. Los

dominios TR le otorgan a las mucinas la caracterstica principal, que las distingue del resto de las glicoprotenas. Las mucinas se clasifican de acuerdo a su secuencia aminoacdica primaria, que est codificada por el gen MUC, localizado en los cromosomas 1,3 4, 7, 11, 12 19. Dentro de las mucinas epiteliales de las vas respiratorias las ms grandes y abundantes son las mucinas que forman gel, MUC5AC y MUC5B, que contribuyen a la lista tanto en expectorado como en cultivos celulares. En expectorado humano MUC5AC y MUC5B, estn presentes en proporciones similares y corresponden al 90% de las mucinas totales.

En cuanto a los elementos minerales la composicin inica del moco es muy parecida a la de la secrecin lacrimal. En lo que concierne a las concentraciones de iones sodio (Na+), cloro (Cl-) y calcio (Ca+2) son comparables a las del plasma. La concentracin de potasio (K+), sin embargo, es tres o cuatro veces ms elevada que en el plasma. El moco es hipertnico con relacin al plasma y tiene una presin osmtica de unos 0,314 osmoles y su composicin inica no experimenta cambios temporales.

El moco tambin contiene numerosos aminocidos que provienen principalmente de la degradacin de protenas extracelulares con una concentracin de 0,4 y 1,3 micromoles/mL (lisina, histidina, arginina, cido asprtico, treonina, serina, cido glutmico, prolina, glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina). El moco nasal es ms rico que el plasma en cido asprtico y cido glutmino (aminocidos cargados a pH neutro), y menos rico en alanina y valina. Contiene una cantidad de prolina ms elevada que otros tipos de moco.

Secrecin de moco. El moco normal de las vas respiratorias tiene dos capas (entre 5 -100 m de profundidad): la capa ms externa (llamada fase de gel), producido por las clulas mucosas y transportada por el batido de los cilios y la capa serosa interna (llamada fase de sol), que es una secrecin ms delgada que la capa externa, producido por las clulas serosas y en la cual los cilios se recuperan del batido ciliar activo. La velocidad de moco en la trquea es de ~ 4 mm por min.

En pacientes sanos pocas clulas mucosas son visibles a lo largo del epitelio, sin embargo el nmero de stas clulas y la cantidad de mucinas producidas por la superficie epitelial aumenta considerablemente durante la inflamacin de las vas areas. Los mediadores inflamatorios conocidos incluyen exposicin a inhaladores o alergenos, virus de la parainfluenza, lipopolisacridos bacteriales, elastasa de neutrfilo y mltiples citokinas. Inductores especficos de la secrecin de mucinas son los nucletidos ATP y UTP, que estimulan la liberacin de mucinas desde las clulas mucosas respiratorias por activacin del receptor especfico, P2u P2Y2. Ambos receptores responden de manera similar a ATP y a UTP aumentando la secrecin de mucinas en clulas epiteliales en cultivo, sin embargo slo UTP y no ATP aumenta la expresin de los genes de las mucinas ms abundantes en las vas respiratorias, MUC5AC y MUC5B. Hidratacin de Mucinas. Las mucinas son liberadas al medio extracelular mediante exocitosis y forman un hidrogel (mucus gel) slo despus de su hidratacin. La exocitosis es el mecanismo bsico de transporte de macromolculas y se realiza mediante la incorporacin de vesculas de secrecin a la membrana plasmtica. Este fenmeno se realiza por el proceso de fusin de membranas lipdicas. Cuando la fusin de las membranas es completa, se forma un poro de fusin a travs del cual ocurrira un intercambio inico entre el interior de la vescula secretora y el exterior de la clula. Segn este modelo, se producira la salida de calcio y la entrada de sodio, o algn otro catin monovalente, lo que aumentara la repulsin elctrica al interior del grnulo,

provocando la expansin volumtrica o hidratacin de las mucinas, hacia el espacio extracelular. Estudios realizados en mucinas de la trquea del conejo muestran que la hidratacin es un proceso que sigue un equilibrio de Donnan, donde la red del polmero funciona virtualmente como una membrana semipermeable a travs de la cual penetran iones libres y policationes que neutralizan y fijan las cargas polianinicas de las mucinas, determinando el grado de hidratacin de ellas.

Durante la exocitosis de grnulos de mucinas respiratorias el contenido de cada grnulo se hidrata rpidamente formando microesferas que quedan muy cercanas a la periferia de la clula secretora. A medida que transcurre el tiempo, ellas se desintegran y se mezclan unas con otras formando grandes agregados de moco. Esta caracterstica de los grnulos, de permanecer como microesferas durante la hidratacin exoctica, en adicin a las observaciones que indican que la hidratacin de las mucinas se rige por los mismos principios fsicos que gobiernan la hidratacin de geles polimricos sintticos, ha hecho posible determinar que el aumento en el radio del material secretado sigue una cintica de primer orden. Esta cintica establece que la variacin del radio en el tiempo [r(t)] del grnulo secretor, se relaciona con el radio inicial (ri = radio inicial del grnulo en el medio extracelular) y con el radio final (rf = radio final alcanzado por el grnulo, en el medio extracelular, antes de deformarse) mediante la ecuacin (1):

ecuacin (1) r(t) = rf - (rf - ri) e-t/ Por otra parte, de acuerdo a la teora de hidratacin de geles (Tanaka, 1979), existe una

relacin lineal entre el tiempo caracterstico de hidratacin (: tiempo en el que se ha alcanzado el 66% del radio final) y el radio final al cuadrado ([rf2]), donde el inverso de la pendiente de esta relacin corresponde al coeficiente de difusin D (D = capacidad de la red polimrica de expandirse en el solvente), descrito en la ecuacin (2):

ecuacin (2) D = (rf)2/t El coeficiente de difusin (D) es un parmetro extraordinariamente sensible para evaluar el

efecto de las condiciones del medio extracelular sobre la hidratacin de las mucinas. Estudios realizados en mucinas respiratorias muestran que un aumento en los niveles de calcio extracelular, a concentraciones similares a las encontradas en el moco de pacientes con fibrosis qustica (2 a 4 mM), pueden producir una disminucin en el coeficiente de difusin de la red de mucinas de hasta 4 veces, lo que resulta en una disminucin en la velocidad de hidratacin. El estudio de las patologas que afectan los epitelios mucociliados, demuestra la importancia fisiolgica de la relacin composicin inica-cantidad de agua que presenta el moco respiratorio. En el caso de la fibrosis qustica, se produce un desbalance inico, producto de las alteraciones en el transporte de cloruro y de sodio, que conllevan a una menor disponibilidad de agua, lo que resulta en un moco extremadamente viscoso. Dado que la hidratacin de este gel es un proceso que se rige por los principios de equilibrio de Donnan, existe por lo tanto, una relacin entre la composicin inica del medio y la disponibilidad de agua en el lumen, que determina las caractersticas viscoelsticas del moco que recubre la superficie del epitelio.